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INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO
EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI
FACULDADES IDEAU
RESISTÊNCIA DO HAEMONCHUS CONTORTUS À IVERMECTINA,
DORAMECTINA E ALBENDAZOL EM OVINOS
TRENTIN, Yngrid Kerllin¹
[email protected]
ZEIST, Rúbia¹
[email protected]
TONIOLO, Carina¹
[email protected]
CAPELETTO, Eduardo Lenon Cuzma¹
[email protected]
SILVA, Bruno Steffen¹
[email protected]
FACCIN, Angela²
[email protected]
RANGHETTI, Álvaro Luis²
[email protected]
ROSÉS, Thiago²
[email protected]
OLIVEIRA, Franciele de²
[email protected]
ARRUDA, Tiago Zart de²
[email protected]
OLIVEIRA, Daniela de
[email protected]
¹ Discentes do Curso de Medicina Veterinária, Nível 4 2016/2- Faculdade IDEAU – Getúlio Vargas/RS.
² Docentes do Curso de Medicina Veterinária, Nível 4 2016/2 - Faculdade IDEAU – Getúlio Vargas/RS.
RESUMO: As reivindicações do mercado consumidor, e as mudanças do setor agropecuário
alavancaram o crescimento da ovinocultura, principalmente nos anos de 1914 e 1918 onde o Rio Grande do Sul
passou a exportar grande quantidade de lã ovina em virtude da Primeira guerra Mundial. Um grande problema na
produção ovina são as parasitoses que acometem os animais ocasionando grandes perdas econômicas. O
Haemonchus contortus é um dos principais helmintos que acometem ovinos, principalmente em regiões
climáticas quentes e com umidade elevada. O presente trabalho teve o objetivo de estudar a resistência e a
suscetibilidade in vitro do Haemonchus contortus frente aos anti-helmínticos ivermectina, albendazol e
doramectina em ovinos. Utilizou-se para tanto, animais de três categorias, escolhidas conforme a idade dos
indivíduos formando-se três grupos distintos (G1, G2 e G3). Para o exame parasitológico de fezes (EPF)
empregou-se o método de Willis (1927), a contagem de ovos por grama de fezes (OPG) seguiu-se de acordo com
Gordon & Whitlock (1939) e a coprocultura com teste de eficácia anti-helmíntica, se deu segundo Ueno (1995)
utilizando-se como fármacos a ivermectina, o albendazol e a doramectina. Foi possível averiguar que animais do
grupo G1, não apresentaram o parasita em suas fezes, uma vez que haviam sido everminados, enquanto que os
animais do G2 apresentaram resistência a ivermectina e animais do G3, a ivermectina e ao albendazol. Os dois
grupos se mostraram sensíveis frente a doramectina. A associação de anti-helminticos pode ser uma solução na
diminuição da resistência parasitária.
Palavras-chave: ovinocultura, anti-helmínticos, parasita gastrointestinal.
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ABSTRACT: The demands of the consumer market and the changes in the agricultural sector boosted the
growth of sheep production, especially in the years 1914 and 1918, where Rio Grande do Sul began exporting
large quantities of sheep wool in the aftermath of the First World War. A major problem in sheep production is
the parasitic diseases that affect the animals causing great economic losses. Haemonchus contortus is one of the
main helminths that affect sheep, especially in hot and humid climatic regions. The present study had the
objective of studying the resistance and the in vitro susceptibility of Haemonchus contortus to the anthelmintics
ivermectin, albendazole and doramectin in sheep. Animals of three categories were chosen according to the age
of the individuals, forming three distinct groups (G1, G2 and G3). For parasitological examination of feces
(EPF), the method of Willis (1927) was used, egg count per gram of feces (OPG) was followed according to
Gordon & Whitlock (1939) and coproculture with efficacy test Antithrombin, was given according to Ueno
(1995) using ivermectin, albendazole and doramectin as drugs. It was possible to verify that animals of the G1
group did not present the parasite in their feces since they had been evermined, whereas the G2 animals showed
resistance to ivermectin and G3 animals, ivermectin and albendazole. Both groups were sensitive to doramectin.
The association of anti-helminths may be a solution in decreasing parasitic resistance.
Keywords: sheep industry, Antihelmintics, gastrointestinal parasite.
1 INTRODUÇÃO
A agricultura sofreu uma transição conceitual ao fim do século XIX, passando a ser
vista como uma prática de grande rentabilidade, que visa somar lucros e atender ofertas e
demandas estabelecidas pelo mercado consumidor. O emprego de novos planos econômicos
com o intuito de facilitar vendas do setor agropecuário, aliado às reivindicações do mercado
consumidor, possibilitou uma ampliação considerável do rebanho ovino brasileiro no século
seguinte. Em decorrência da Primeira Guerra Mundial (1914 - 1918) o mercado internacional
passou a exigir uma acentuada demanda de lã ovina principalmente oriunda do Rio Grande do
Sul, destacando essa cultura no estado (VIANA & WAQUIL et al. 2014; OSAKA et al. 2008;
SILVA et al. 2013).
Um dos maiores empecilhos na produção de ovinos são as parasitoses, que resultam
em inúmeras enfermidades. Essas parasitoses são responsáveis por grandes perdas na
produtividade, principalmente quanto a qualidade de sua matéria prima: a lã e a carne. Essas
perdas economicas são decorentes da complexidade no controle parasitário em razão da
escasses de informações quanto ao uso de drogas anti-parasitárias nesses animais. Algumas
vezes, esses parasitas são capazes de resistir ao efeito de medicamentos pelo uso escessivo
dos mesmos ou por não serem aplicados no período correto (ATAÍDE et al. 2013; OSAKA et
al. 2008; ABRÃO et al. 2009; CLIMENI et al. 2008; BORGES et al. 2015).
O Haemonchus contortus é um dos parasitas que mais acomete os rebanhos ovinos
brasileiros, com relevância epidemiológica por ser altamente patogênico e resistente a antihelminticos. O H. contortus é um nematóide que se encontra alojado no abomaso dos
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hospedeiros e se beneficia em locais onde o clima é quente e a taxa de uminade é acentuada.
Esse parasita pode provocar quadros severos de anemia, hipoproteinemia, infecções agudas
levando o animal a óbito. As perdas econômicas não ocorrem somente em virtude da morte
dos animais, mas também pelo declínio na produção leiteira, da carne e da lã (ATAÍDE et al.
2013; ANDRADE et al. 2014; CLIMENI et al. 2008; OSAKA et al. 2008; FERNANDES et
al. 2015; ANAYA et al. 2014).
O presente trabalho teve o objetivo de estudar a resistência e a suscetibilidade in vitro
do Haemonchus contortus frente aos anti-helmínticos ivermectina, albendazol e doramectina
em ovinos.
2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado em propriedades nos municípios de Barra do Rio Azul e
Itatiba do Sul, ao norte do Rio Grande do Sul. Ao total foram coletadas amostras fecais de 15
animais divididos conforme a idade, em três grupos diferentes. O clima da região é
característico de estações bem definidas, com invernos rigorosos e verões quentes que são
propícios para o desenvolvimento parasitário.
Animais do grupo 1 (G1), apresentavam 2 meses de idade, permaneciam em piquetes
durante o dia e a noite eram fechados em baias. Eram constantemente amamentados sendo
everminados logo após o nascimento.
Indivíduos do grupo 2 (G2), apresentavam 14 meses de idade, permaneciam em
piquetes em tempo integral, havendo contato com animais de outras espécies. Além da
pastagem, sua alimentação era suplementada com concentrado a base de milho uma vez ao dia
e não recebiam tratamento parasitário periodicamente. Na propriedade, não era realizada a
rotação de piquetes.
O grupo 3 (G3), era composto de animais mais velhos permanecendo em piquetes
durante o dia e em baias no período da noite. Estavam em contato com animais de outras
espécies alimentando-se de pasto verde. Não recebiam complemento alimentar e o tratamento
com drogas antiparasitárias era mais frequente do que em animais do G2. A rotação de
piquetes não era realizada na propriedade.
As fezes foram coletadas direto da ampola retal dos animais em luvas descartáveis e
em seguida refrigerados a uma temperatura de 4ºC graus para realização do exame
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parasitológico de fezes (EPF), contagem de ovos por gramas de fezes (OPG) e para o exame
coprológico de eficácia anti-helmíntica.
No exame parasitológico de fezes (EPF), segundo Willis (1927), pesou-se cerca de 3
gramas de fezes de cada indivíduo e com o auxílio de um bastão de vidro diluiu-se em 20 ml
de solução hipersaturada de cloreto de sódio até a mistura se comportar de forma homogênea.
Em seguida, transferiu-se o líquido para outro recipiente onde foi filtrado com uma gaze dupla
e uma peneira. Completou-se com solução de NaCl até a borda do recipiente sub-repondo
uma lâmina por 15 minutos, tempo suficiente para que os possíveis ovos de Haemochus
contortus subissem até a superfície e se acoplassem na lâmina. Decorrido esse tempo, a
lâmina foi retirada e rapidamente invertida de posição para que não houvesse a queda dos
possíveis ovos dos parasitas. Pingou-se um gota de lugol e acrescentou-se uma lamínula. As
amostras foram analisadas ao microscópio, conforme Figuras 1 A, 1 B, 1 C e 1 D.
Figura 1 A- pesagem das fezes para realização do experimento. Figura 1 B- fezes em diluição
com 20 ml de cloreto de sódio onde se obteve uma mistura de consistência homogênea.
Figura 1 C- lâminas em repouso após acréscimo da solução até a borda do recipiente onde
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permaneceram por 15 minutos. Figura 1 D- análise microscópica das amostras fecais
elaboradas pelo método de Willis. Fonte: ZEIST, 2016.
A contagem dos ovos por gramas de fezes (OPG) foi elaborado de acordo com o
método de Gordon & Whitlock (1939) pensando-se 2 gramas de fezes de cada indivíduo que
posteriormente foram diluídas em 58 ml de solução hipersaturada de cloreto de sódio até
obter-se um consistência homogênea. A mistura foi filtrada em outro recipiente com o auxílio
de uma gaze e algumas alíquotas da solução foram retiradas para preencher os dois lados da
câmara de McMaster. Após alguns minutos em repouso, analisou-se ao microscópio.
A resistência das larvas do nematoide gastrointestinal a alguns anti-helmínticos foi
avaliada a partir da técnica de coprocultura sugerida por Ueno (1995). Os testes preconizaram
a utilização dos mesmos princípios ativos no G1, G2 e G3, sendo eles, ivermectina e
doramectina de uso injetável e albendazol de uso oral. Para cada princípio ativo, utilizou-se
diferentes concentrações dos produtos (100%, 50%, 25%, 12,5% 6,25%) incluindo um grupo
controle de cada princípio ativo testado (0%), conforme figura 2 A . Após realizadas todas as
diluições dos fármacos, os recipientes permaneceram em repouso por 1 hora em bandejas
separados de acordo com o principio ativo e o grupo em estudo. Entre cada recipiente,
colocou-se papel toalha umedecido para que as amostras se mantivessem úmidas (figura 2 B).
Em seguida, acrescentou-se 2 gramas de serragem esterilizada sobre cada amostra e
umedeceu-se gazes que foram sobrepostas sobre os frascos.
Figura 2 A - recipientes separados de acordo com seu principio ativo em suas diferentes
diluíçoes, incluindo o grupo controle. Figura 2 B - fezes já em contato com o principio ativo
onde foram deixadas na bandeja repousando por 1 hora. O papel toalha entre cada recipiente
ajudou manter as amostras umidecidas. Fonte: ZEIST, 2016.
As amostras foram colocadas em uma estufa adaptada agrupadas conforme o princípio
ativo utilizado e mantidas a uma temperatura em torno de 34ºC graus com o auxílio de uma
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lâmpada incandescente de 70W, conforme mostra a figura 3 A. Nos primeiros 10 dias, as
amostras eram umedecidas duas vezes ao dia (pela manhã e pela noite) e nos últimos 5 dias do
estudo, passaram a ser umedecidas somente pela parte da noite, totalizando 15 dias de
coprocultura. A estufa foi recapada de papel alumínio para que as amostras pudessem se
manter mais aquecida e nela haviam três respiros que permitiam a passagem de ar garantindo
que as amostras permanecessem arejadas, visualizado na Figura 3 B.
Figura 3 A- amostras sendo colocadas na estufa caseira, agrupadas de acordo com o fármaco
em estudo. Figura 3 B- visão interna da estufa atravéz de um respiro. Fonte: TRENTIN, Y. K.
2016.
3 RESULTADOS E ANÁLISE
Dos três grupos de animais avaliados, o grupo 2 (G2) e grupo 3 (G3) apresentaram
ovos de Haemonchus contortus em suas fezes (conforme figura 4 A e 4 B). A presença do
nematódeo gastrintestinal não foi detectada em animais do grupo 1 (G1), uma vez que foram
everminados logo após o nascimento. A prevalência da parasitose no G2 foi elevada, embora
não tenha sido possível realizar a contagem de ovos por gramas de fezes (OPG). Todos os
animais da categoria estavam infestados pelo nematodeo, mas ainda não haviam desenvolvido
sinais clínicos. Em animais do G3 a infestação era amena, sendo que menos de 50% deles
apresentaram contaminação pelo parasita. Também não havia relatos de sintomatologia na
propriedade.
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Figura 4 A- ovos do H. contortus em animais do G2. Figura 4 B: ovos do H. contortus em
animais do G3. Fonte: ZEIST, 2016.
Não foi possível quantificar os ovos por gramas de fezes (OPG) em nenhuma das três
tentativas. Os animais agrupados no G1 não apresentaram o desenvolvimento da larva do H.
contortus em nenhuma das diluições testadas e nem em seu grupo controle, uma vez que
foram everminados após o nascimento. As amostras realizadas contendo fezes dos indivíduos
pertencentes ao G2 apresentaram resistência a ivermectina em ambas as diluições, resistêntes
também ao albendazol, porém em sua concentração máxima foi eficaz na sensibilização do
parasita. A doramectina foi o fármaco que melhor agiu no combate a parasitose, uma vez que
sensibilizou o parasita nas suas diversas diluições. A resistência também foi notável em
animais do G3 submetidos ao efeito da ivermectina e do albendazol. A doramectina teve
efeito positivo sensibilizando o nematóide em ambas às diluições testadas. O
desenvolvimento de larvas foi notável nos grupos controles de todos os princípios ativos,
conforme mostra a Tabela 1 e Tabela 2 e a Figura 5.
Figura 5 A - larva do H. contortus encontrada nas amostras de ivermectina, albendazol e nos
grupos controle sob análise microscópica. Fonte: TONIOLO, 2016.
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Tabela 1 - Avaliação de resistência anti-helmíntica do G2 perante aos fármacos testados nas
diferentes concentrações dos produtos.
Diluição do fármaco Ivermectina
Albendazol
Doramectina
controle
+
+
+
6,25%
+
+
-
12,5%
+
+
-
25%
+
+
-
50%
+
+
-
100%
+
-
-
Resistência (+); sensibilidade (-).
Tabela 2 - Avaliação de resistência anti-helmíntica do G3 perante aos fármacos testados nas
diferentes concentrações dos produtos.
Diluição do fármaco Ivermectina
Albendazol
Doramectina
controle
+
+
+
6,25%
+
+
-
12,5%
+
+
-
25%
+
+
-
50%
+
+
-
100%
+
+
-
Resistência (+); sensibilidade (-).
Esses estudos condizem com Pereira et al. (2008), que embora tenha realizado o teste
in vivo notou uma redução no número de ovos do nematoide gastrointestinal testados com
albendazol em 34% nos primeiros 7 dias após tratamento, 45% nos 14 dias após tratamento e
58% aos 21 dias. Neste experimento, o albendazol só foi eficaz na sua máxima concentração e
somente em animais pertencentes ao G2.
O albendazol age diretamente sobre os
microtúbulos desses helmintos impedindo que os mesmos se formem, alterando as células do
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intestino animal para que as vesículas, ali presentes, sejam incapazes de se redistribuir. Assim,
o parasita é erradicado do organismo. Além disso, os albendazois atuam no transporte da
glicose celular, impedindo que o verme consiga extrair a energia celular do hospedeiro a partir
do bloqueio enzimático de fumarato redutase (MELO, 2002). Quanto ao uso de ivermectina,
Pereira et al. (2008) percebeu que a redução de ovos de Haemonchus contortus foi de 28%
nos primeiros 7 dias após tratamento, e se manteve em 30% do 14º ao 21º dia após
tratamento. Já neste estudo, a ivermectina apresentou efeito negativo tanto nos animais do G2
quanto nos animais do G3.
Munõs et al. (2008), que também optou pela realização da técnica in vivo, adotou o
uso de doramectina e ivermectina em seu experimento, observando que os mesmos
apresentaram uma eficácia semelhante nos primeiros 21 dias após o tratamento porém,
decorrido esse período, a ivermectina diminuiu sua eficácia enquanto que a doramectina se
manteve persistente no combate aos helmintos. Neste estudo a doramectina foi pertinente,
sensibilizando o parasita em todas as suas diluições e em ambos os grupos (G2 e G3).
Segundo Melo et al. (2002), a ivermectina e a doramectina são endectocidas que agem no
organismo abrindo canais de cloro, nocivos aos helmintos. Além disso, elas impedem que o
parasita se reproduza no interior no hospedeiro e se nutra de suas reservas.
Moraes et al. (2007), averiguou que todos os animais submetidos a testes apresentaram
resistência ao principio ativo ivermectina enquanto que, das 9 propriedades avaliadas, o
tratamento com albendazol foi efetivo em apenas 3 delas. A resistência da ivermectina no
tratamento parasitário de rebanhos ovinos no estado é elevada, e tal sensibilidade pode estar
associada as diferentes proporções que o fármaco e seus análogos são aplicado no combate à
nematoides gastrintestinais (FORTES, 2013). Costa et al. (2011) também relatou a ineficácia
da ivermectina em seus estudos, onde houve redução de apenas 11% no OPG dos animais
tratados com o principio ativo. Embora esse experimento tenha sido realizado a partir da
técnica in vitro, os feitos da ivermectina foram semelhantes aos averiguados por Moraes et
al.(2007) e Costa et al. (2011).
Ramos et. al (2002) revela que das 65 propriedades estudadas, em 77% dos casos o H.
contortus resistiu aos efeitos da ivermectina, sobretudo, naquelas onde o fármaco era utilizado
várias vezes ao ano e 74% foram resistentes à ação do albendazol. A reaplicação de antihelmínticos em um curto espaço de tempo ocasiona o fracasso dessas drogas, uma vez que
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desencadeia o surgimento de cepas persistentes a sua ação (COSTA et al. 2011; MELO et al.
1998).
Holsback et al. (2013) associou mais de um princípio ativo para testar a eficácia contra
nematódeos gastrointestinais. Utilizando-se albendazol em conjunto com levamisol e
ivermectina houve uma diminuição satisfatória do OPG nos animais tratados. Segundo ele,
embora o albendazol seja comumente ineficaz no combate parasitário, aliado a outros
fármacos sua ação foi pertinente. Holsback et al. (2016), ao associar doramectina com
fenbendazole averiguou uma diminuição na quantidade parasitária de animais tratados
comparado aos grupos controle, porém a doramectina utilizada individualmente não foi capaz
de reduzir a quantidade de parasitas dos animais testados. Ao contrário dos resultados de
Holsback et al. (2013), a doramectina utilizada individualmente, neste estudo, teve resultado
positivo conseguindo combater o parasita. Essa queda parasitária ocasionada pelo consórcio
de anti-helmínticos proporciona menor contaminação dos animais quando os mesmos forem
expostos a pastagens vedadas (HOLSBACK, 2013).
Uma vantagem de se realizar testes in vitro é a rapidez com que se obtêm os
resultados, além de ter um custo relativamente baixo para a realização podendo ser facilmente
elaborado. Os testes in vivo, geralmente são mais trabalhosos porém, tem-se resultados mais
precisos quanto aos fármacos utilizados e ainda é possível averiguar o grau de infecção dos
animais (FORTES, 2013).
4 CONCLUSÃO
A partir do estudo realizado, podemos afirmar que a ivermectina e o albendazol tem
baixa eficiência contra o Haemonchus contortus, uma vez que o parasita se mostrou resistente
frente a esses fármacos na maioria das diluições. Já a doramectina, teve um resultado
satisfatório, pois conseguiu sensibilizar o nematoide gastrintestinal em todas as diluições
testadas. Uma alternativa possível para a realização da contagem de ovos por gramas de fezes
(OPG) seria a utilização de solução saturada de açúcar para essa técnica. Deve-se ter cuidado
com a taxa de umidade das amostras para evitar a presença de fungos e manter a temperatura
em 34º para que haja o desenvolvimento das larvas. O uso de novos princípios ativos ou a
associação de diferentes fármacos poderia auxiliar no combate a parasitas e diminuir a
resistência anti-helmíntica.
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