lactose

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ”
Departamento de Ciências Biológicas
BIOQUÍMICA
ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS
DOCENTES:
Prof. Dr. Daniel Sherer de Moura
Profa. Dra. Helaine Carrer
Prof. Dr. Luiz Antônio Gallo
Prof. Dr. Luiz Carlos Basso
Técnica Responsável: Aline Borges
Piracicaba - SP
2015
SUMÁRIO
AULAS
pg
1. Colorimetria e Espectrofotometria
03
2. Determinação de Lactose no leite
07
3. Cromatografia em Papel de Filtro
11
4. Determinação do Teor de Caseína no leite (Reação do Biureto)
16
5. Determinação da Constante de Michaelis (Km) e da Velocidade máxima (Vm) para a
Invertase de Levedura
6. Reação de Hill (Fotólise da água)
19
23
2
COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA
1. OBJETIVOS
Dosagens de espécies químicas mediante a absorção de luz.
2. FUNDAMENTOS DO MÉTODO
A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento
analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a
absorção de energia radiante (luz).
A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória,
caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (, expressos em m ou nm) (Figura 1) e
que apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é
absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomos constituintes das moléculas.
Figura 1. Espectro de absorção de luz em diversos comprimentos de onda ().
Uma solução quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que é resultante da
absorção relativa dos vários comprimentos de onda que a compõem, que pode ser analisados
por um espectrofotômetro (Figura 2). Esta absorção, em cada comprimento de onda, depende
da natureza da substância, de sua concentração e da espessura da mesma que é atravessada pela
luz.
Figura 2. Componentes e funcionamento de um espectrofotômetro para análise da absorção de um determinado
comprimento de onda específico de uma solução.
3
A Lei de Lambert-Beer: a absorbância é proporcional à concentração da espécie
química absorvente, sendo constante o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo
feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade
ótica e concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e concentração.
c = concentração da espécie química absorvente
b = espessura atravessada pelo feixe luminoso
Io= intensidade de luz incidente
I = intensidade de luz emergente (transmitida)
I < Io
Io
(absorbância ou densidade ótica)
I
A Transmitância ou Transmissão (T%) corresponde a:
I
Io
I
T = 100 x
Io
100
T
Ab = D.O. = K.b.c =
log
I
T
como,
Io
, temos que :
=
Io
100
I
Io
portanto, log
T
100
=
I
logo,
100
=
log
T
Ab = log 100 - log T
Ab = 2 – log T
4
3. MATERIAL





Espectrofotômetro com cubetas
Micropipetas de 1 mL
Estante com tubos de ensaio
Alaranjado de Metila (10µg/mL)
Azul de Bromofenol (10µg/mL)
4. PRÁTICA
A. Coleta de dados para a construção do espectro de absorção:
 Alaranjado de Metila ou do Azul de Bromofenol (um composto para cada grupo).
Usando água destilada como referência, efetuar as leituras de Absorbância (ou D.O.) do
Alaranjado de Metila (nos seguintes comprimentos de onda: 400, 420, 440, 460, 480, 500,
520, 550, 600, 650 e 700 nm) ou Azul de Bromofenol (nos seguintes comprimentos de onda:
400, 440, 490, 520, 540, 565, 580, 590, 620, 660 e 700 nm)
Tabela 1. Dados de Transmitância e Absorbância do
Corante:
corante analisado pelo grupo
Alaranjado de Metila
(10 µg/mL)
λ
T
Ab
(nM)
(%)
(2-logT)
400
440
460
480
500
520
Azul de Bromofenol
(10 µg/mL)
λ
T
Ab
(nM)
(%)
(2-logT)
400
490
520
540
560
580
5
550
600
700
590
620
700
Gráfico 1. Espectro de absorção do corante
analisado.
6
B. Demonstração da Lei de Lambert-Beer:
Preparar 6 tubos de ensaio (enumerados de 0 a 5) conforme o quadro que se segue. O
tubo n 6 estará contendo solução do corante com concentração desconhecida, a qual deverá ser
determinada através da Lei de Lambert-Beer.
o
Tabela 2. Preparo dos padrões de corante e dados de Transmitância e Absorbância.
Tubo
(No)
0
1
2
3
4
5
6
Água
Corante*
(mL)
(mL)
5
0
4
1
3
2
2
3
1
4
0
5
5 mL da solução de
concentração desconhecida
[Corante]
(g/mL)
Transmitância
(T%)**
Absorbância
(Abs Ou D.O.)
Encontrar no gráfico
X =
* Alaranjado de Metila ou Azul de Bromofenol na concentração de 10 µg/mL.
** Leituras efetuadas no comprimento de onda que corresponde ao pico de absorção do composto ( máximo).
Gráfico 2. Correlação dos valores de Absorbância (Y) e Concentração do corante analisado (X).
7

Questionário:
1) Construir os gráficos do espectro de absorção do outro corante avaliado (Azul de
Bromofenol ou Alaranjado de Metila). Utilizar os dados obtidos em aula e do grupo ao lado
da bancada.
2) Explicar a importância de se obter este o pico de absorção de um composto químico para
quantificação por espectrofotometria.
3) Construir o gráfico com os dados da Tabela da 2ª Etapa da aula prática (observado pelo seu
grupo) utilizando papel milimetrado. Com o gráfico, considere que foram testadas em aula
mais três soluções de concentrações desconhecidas do corante analisado e foram obtidos os
seguintes valores de Transmitância (Tabela abaixo). Defina as concentrações desconhecidas
e indicar qual das amostras tem maior concentração de corante. (Indicar no Gráfico, no eixo
x, os pontos X, Y e Z).
Tubos
6
7
8
Corante
Água destilada
(mL)
(mL)
5 mL de solução X de corante
5 mL de solução Y de corante
5 mL de solução Z de corante
T% no λ max.
Ab. λ max.
Conc. Final
(µg/mL)
32,7
34,5
50,4
8
DETERMINAÇÃO DE LACTOSE NO LEITE
(MÉTODO DE SOMOGY & NELSON)
1. OBJETIVO
Determinar a concentração de lactose (açúcar redutor) no leite conservado em geladeira e
mantido à temperatura ambiente empregando o método de Somogyi &Nelson.
2. FUNDAMENTOS DO MÉTODO
Carboidratos que apresentam em sua estrutura molecular os grupos aldeído ou cetona
livres (no carbono 1), possuem poder redutor e são por isso denominados açucares redutores.
Geralmente, estes açúcares são monossacarídeos ou dissacarídeos que podem ser oxidados por
agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os íons férricos (Fe3+) e cúprico (Cu2+).
Estes íons, por sua vez, são reduzidos pela ação dos açúcares redutores (agentes redutores). No
açúcar, o carbono do grupo carbonila é oxidado a carboxila. É possível determinar a
concentração de um açúcar redutor pela medida da quantidade de agente oxidante que é
reduzido pela solução desse mesmo açúcar.
A lactose (Figura 1A) é o principal carboidrato do leite, produzida pela glândula
mamária, sendo ainda a principal fonte de energia dos recém nascidos. Além disso, a lactose é
um dissacarídeo redutor, que reduz o íon cúprico do Reativo de Somogyi a óxido cuproso, em
meio alcalino e a quente. Em seguida, o óxido cuproso reage com o ânion arseno-molibdato do
Reativo de Nelson produzindo um composto de coloração azul - óxido de molibdênio, Mo2O3,
com λ máx.= 540 nm (Figura 1B).
Dentro de certos limites, a intensidade da coloração azul é diretamente proporcional à
quantidade de lactose no leite. Essa intensidade de coloração pode ser medida utilizando-se um
espectrofotômetro, que detecta a absorção de luz pelo óxido de molibdênio.
Figura 1. (A) Estrutura molecular do dissacarídeo lactose (β-galactose 1,4  α-glicose), evidenciando o
carbono 1 contendo o grupo aldeído da glicose, envolvido em ligação hemiacetal (região redutora). (B)
Reações envolvidas no método de Somogyi & Nelson, mostrando a formação do óxido de molibdênio,
Mo2O3, um composto de coloração azul, com máx.= 540 nm.
Antes da reação quantitativa, a amostra de leite deve ser desproteinizada e clarificada,
mediante precipitação de interferentes com Ba(OH)2 e ZnSO4.
9
3. MATERIAL









Espectrofotômetro
Centrífuga de mesa
Banho-maria (ebulição)
Balão volumétrico de 100 mL
Estante com 8 tubos de ensaio e 2 tubos de centrífuga
Micropipetas de 1mL
Hidróxido de bário 0,3N
Sulfato de zinco 5%
Reativo de Somogyi: dissolver 28 gramas de fosfato de sódio dibásico ou monoácido e
40 gramas de tartarato duplo de sódio e potássio em 700 ml de água. Adicionar 100 ml de
NaOH 1N. Gotejar, sob agitação constante, 80 ml de CuSO4.5H2O a 10%. Adicionar
180 gramas de sulfato de sódio anidro e completar a 1 litro. Deixar em repouso por 2 dias
e filtrar. Guardar em frasco escuro a cerca de 37ºC. Filtrar antes do uso.
 Reativo de Nelson: dissolver 50 gramas de molibdato de amônio em 900 ml de água
destilada. Cuidadosamente, adicionar 52 ml de ácido sulfúrico concentrado. Adicionar 3
gramas de arseniato dibásico de sódio dissolvido em 50 ml de água. Completar para 1
litro e manter em repouso em frasco escuro durante 2 dias antes de uso e filtrar.
 Padrão de lactose: dissolver 0,1 gramas de lactose pura em um litro de água. Esta solução
conterá 100 g/mL.
4. PRÁTICA
a) Preparar 5 tubos, adicionando lactose (100 g/mL) e água destilada conforme quadro
abaixo. Em seguida, acrescentar em cada tubo 1 mL do Reativo de Somogyi e agitar.
Deixar em banho-maria fervente por 5 minutos. Esfriar em água corrente.
b) Adicionar 1 ml do Reativo de Nelson e agitar. Completar o volume a 10 mL,
adicionando 7 ml de água destilada.
c) Fazer leitura em espectrofotômetro em 540 nm. Preencher a tabela abaixo:
Tabela 1. Preparo dos padrões de Lactose e obtenção dos dados de Transmitância, Absorbância e Δ
Absorbância.
ÁGUA
(ml)
0
1
2
3
1,0
0,7
0,4
0,1
Lactose
100
g/mL
(mL)
0
0,3
0,6
0,9
4
0
1,0
[Lactose]
(g/mL)
Reat.
Somogy
(mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Banho
Maria
Incubar a
100ºC por 5
min
TUBO
(No)
Reat.
Nelson
(mL)
Compl.
Vol.
(10 mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
7 mL
7 mL
7 mL
7 mL
1,0
7 mL
Transmit.
(T%)
Absorb.
 nm
 Absorb.
 nm
A. Preparo das Amostras de Leite
10
Cada grupo receberá 2 amostras de leite: uma armazenada em geladeira e outra mantida
à temperatura ambiente.
a) Transferir 2 mL da amostra de leite para balão volumétrico de 100 mL e completar o
volume com água destilada. Agitar bem.
b) Transferir 1 mL (com pipeta volumétrica) da solução diluída de leite para tubo de
centrífuga. Efetuar a remoção dos interferentes pela adição de 1,0 mL de ZnS04 a 5% (agitar) e
acrescentar 1,0 mL de hidróxido de bário 0,3N. Agitar. Completar a 10 mL adicionado 7 mL de
água destilada. Agitar. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos (3.000 rpm).
B. Determinação do Teor de Lactose no Leite
Volume
(mL)
Reat.
Somogy
(mL)
Banho
Maria
(min.)
Reat.
Nelson
(mL)
Água
destilada
(mL)
Leite
Ambiente
1,0
1,0
1,0
7 mL
Leite
Geladeira
1,0
1,0
100ºC por
5 min
Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite, preparando as amostras como
segue na tabela abaixo:
1,0
7 mL
Tubo
Transmit.
(T%)
Absorb.

nm

Absorb.
 nm
Gráfico 2. Correlação dos valores de Δ Absorbância (Eixo Y) e Concentração de Lactose (Eixo X).
11
[lactose]
(µg/mL)
 QUESTIONÁRIO:
1) Determine:
A) Concentração de Lactose no Leite Ambiente................... (μg/mL)
Leite Geladeira................ (μg/mL)
B) Teor de lactose no Leite ambiente: .....................% (m/v)
Leite geladeira: ......................% (m/v)
Demonstrar cálculo:
2) Por que a lactose é considerada um açúcar redutor?
3) Por que é necessário calcular o Δ Absorbância para cada tubo?
4) Comparar os teores de lactose no leite ambiente e geladeira.
12
CROMATOGRAFIA EM PAPEL DE FILTRO
1. OBJETIVO
Identificação de aminoácidos numa solução desconhecida por cromatografia em papel
filtro.
2. FUNDAMENTOS DO MÉTODO
Nesta aula prática a técnica de cromatografía em papel filtro será utilizada para análise
de aminoácidos em solução. De um modo geral, o termo cromatografía pode ser definido como
um procedimento bioquímico em que uma mistura de substâncias é separada pela carga,
tamanho, solubilidade ou outra propriedade de seus componentes, através de sua partição entre
uma fase móvel e uma fase estacionária.
O método de cromatografia em papel filtro será utilizado nesta aula para separação e
identificação de aminoácidos. Para entendermos tais fundamentos devemos considerar a
solubilidade dos aminoácidos num determinado solvente (variando em função da temperatura)
e a propriedade dos aminoácidos de se tornarem coloridos após reagirem com substâncias
específicas. Dependendo da estrutura molecular da cadeia lateral dos aminoácidos, estes
apresentarão diferentes solubilidades no solvente empregado, mantida a temperatura constante.
A capacidade de um determinado solvente (contido num recipiente) subir contra a força da
gravidade através de um papel absorvente é muito importante nesta técnica de cromatografia
em papel filtro, como mostrado na Figura 1. Conforme o solvente sobe pelo papel absorvente,
ele pode levar consigo diferentes aminoácidos a diferentes distâncias separando-os a partir de
uma mistura inicial de aminoácidos.
Figura 1. A migração da fase móvel (solvente) pelo papel filtro (fase estacionária) de modo ascendente
(representado por setas vermelhas) é importante na técnica cromatográfica. Soluções de aminoácidos
colocadas sobre a linha básica através de micropipetas serão transportadas pelo solvente a diferentes
alturas. Após pulverização com ninhidrina, o papel filtro apresentará manchas coloridas em diferentes
alturas, que representam os aminoácidos separados.
A partir da distância percorrida pelos aminoácidos desde a linha básica até o centro da
mancha formada após a pulverização com ninhidrina, podemos calcular o chamado fator de
retenção (Rf). Este pode ser definido como a relação existente entre a distância percorrida pelo
soluto – aminoácido (até o centro da mancha), pela distância total percorrida pelo solvente
(Figura 2). O valor de Rf revela a solubilidade de cada aminoácido no solvente empregado.
13
Figura 2. Soluções de aminoácidos a, b e c foram colocadas sobre a linha básica e percorreram as distâncias a’, b’
e c’, respectivamente. A distância d refere-se à distância percorrida pelo solvente. Assim, os fatores de
retenção para cada solução de aminoácido são: Rfa=a’/d; Rfb=b’/d; Rfc=c’/d.
A. Teoria sobre Rf (Equação de Martin e Synge)
Chama-se de Rf a relação:
onde: a = coeficiente de partição
As = área ocupada pelo soluto na fase estacionária
Al = área ocupada pelo soluto na fase móvel
3. MATERIAL









Papel Filtro (Whatmann);
Câmara cromatográfica;
Solvente (butanol, ácido acético e água na proporção de 4:1:1);
Solução de aminoácidos padrão (arginina, leucina e prolina);
Solução desconhecida (problema);
Secador de cabelo;
Lápis;
Solução alcoólica de ninhidrina a 0,3%;
Estufa.
14
4. PRÁTICA
1) Montar o cromatograma, ou seja, papel filtro (Whatmann) devidamente tratado
(adaptado ao tamanho da câmara cromatográfica) constituindo a fase estacionária.
2) Traçar uma linha horizontal a dois centímetros do bordo inferior do papel (linha básica)
sobre a qual, posteriormente, serão distribuídas “manchas” de solutos (aminoácidos).
3) Manter os cromatogramas dentro de recipientes hermeticamente fechados, denominados
câmaras cromatográficas (Figura 3).
4) Adicionar o solvente específico para cromatografia de aminoácidos (butanol, ácido
acético e água na proporção de 4:1:1), a uma altura menor do que dois centímetros.
5) Pipetar sobre a linha básica do cromatograma as soluções de aminoácidos padrão
(arginina, leucina e prolina) e a solução problema (contendo uma mistura de
aminoácidos desconhecidos) (Figura 3).
Figura 3. Distribuição das soluções de aminoácidos no
cromatograma sobre a linha básica (dois
centímetros acima do bordo inferior do papel).
Arg
Leu
Pro
Mistura
6) Secar o cromatograma através da utilização de um secador de cabelo antes de ser
colocado na câmara cromatográfica. Este processo permite que o excesso das soluções
de aminoácidos colocadas no papel seja removido.
7) Manter o cromatograma por 15 minutos dentro da câmara cromatográfica, para que o
solvente suba contra a ação da gravidade.
8) Retirar o cromatograma da câmara e marcar com um lápis a altura que o solvente
atingiu;
9) Secar o cromatograma com um secador de cabelo por 5 min para a remoção do
solvente;
10) Pulverizar o papel com o reagente revelador ninhidrina a 0,3% em solução alcoólica;
11) Levar o cromatograma a uma estufa (temperatura de 60-65ºC) por 5 minutos, até o
aparecimento das manchas coloridas, que representam os aminoácidos separados.
12) Calcular os fatores de retenção (Rf) para cada aminoácido separado no papel filtro.
Cada aminoácido apresenta um Rf específico para um determinado solvente numa dada
temperatura. Como, cada aminoácido se desloca a uma determinada distância no
cromatograma, baseado em sua solubilidade no solvente. A determinação da
solubilidade de um determinado aminoácido depende diretamente da estrutura química
de sua cadeia lateral (R).
15
QUESTIONÁRIO:
1) Em relação à Aula Prática, responder:
A) Indicar ao lado o posicionamento dos aminoácidos
após a cromatografia.
B) Qual a coloração dos aminoácidos estudados em
classe na reação com a ninidrina? Por que ocorre
diferença na coloração da prolina?
Arg
Leu
Pro
Mistura
C) No sistema cromatográfico em sala, (fase móvel: butanol: ácido acético: água; fase
estacionária: celulose), qual o motivo de um aminoácido possuir maior Rf ou menor
Rf?
16
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CASEÍNA NO LEITE
(PELA REAÇÃO DO BIURETO)
1. OBJETIVO
Quantificar a concentração da proteína do leite utilizando Reativo de Biureto.
2. FUNDAMENTOS DO MÉTODO
A importância em se estudar a proteína caseína presente no leite, se relaciona com o fato
desta ser uma proteína bastante completa (alto valor biológico), pois ela possui todos os
aminoácidos essenciais (aqueles que sua síntese no organismo é inadequada para satisfazer as
necessidades metabólicas e que devem ser fornecidos como parte da dieta). Os aminoácidos
essenciais para os seres humanos são: treonina, triptofano, histidina, lisina, leucina, isoleucina,
metionina, valina e fenilalanina. Ausência ou inadequada ingestão de alguns desses
aminoácidos resulta em balanço nitrogenado negativo, perda de peso, crescimento menor em
crianças e pré-escolares e sintomatologia clínica.
A metodologia da Reação do Biureto, que é utilizada para a caracterização de proteínas,
pode ser empregada para a quantificação das mesmas mediante a colorimetria. O método se
baseia no fato de que as proteínas (nesse caso, a caseína) formam um complexo violeta com o
íon cúprico (Cu2+) em meio alcalino, e tal complexo apresenta um pico de absorção a 540 nm.
A coloração violeta apresentada pelo complexo é proporcional à concentração das proteínas na
amostra (leite). Essa reação é positiva para peptídeos constituídos de no mínimo três
aminoácidos; assim, a Reação do Biureto será negativa para dipeptídeos e aminoácidos livres.
Tal complexação também ocorre com o Biureto (H2N-CO-NH-CO-NH2), daí o nome da
reação. A Figura 1 apresenta a formação do complexo violeta, pela interação do íon cúprico
com duas cadeias polipeptídicas.
Figura 1. Formação do complexo violeta, pela interação do íon cúprico com duas cadeias polipeptídicas.
17
3. MATERIAL
 Espectrofotômetro (540 nm)
 Balão volumétrico com leite diluído (1 mL de leite desnatado e 9 mL de água
destilada 1:10)
 Estante com 6 tubos de ensaio (Reta Padrão) e 1 tubo de ensaio para amostra de leite
diluído (1:10)
 1 erlenmeyer com água destilada
 1 micropipeta de 1 mL
 1 Tubo de centrífuga de 15 mL (Tipo Falcon)
 Reagente do Biureto: Pesar 1.5 g de CuSO4.5H2O e 6g de tartarato duplo de sódio e
potássio, dissolvê-los em água destilada completando o volume a aproximadamente 500
ml. Juntar, sob agitação, 300 mL de NaOH 10% e completar a 1 litro.
 Padrão de Caseína (5 mg/mL) - dissolver 2,5g de caseína em 500 mL de NaOH 0,1 N.
4. PRÁTICA
1. Com a micropipeta transferir 1 ml do leite (1:10) para um tubo de centrífuga (Tipo
Falcon)
2. Em 7 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 6, pipetar os componentes conforme o quadro
abaixo.
3. Após a adição do Reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30
minutos. A coloração púrpura formada á indicativo da presença de proteínas.
4. Fazer leitura de Transmitância a 540 nm em espectrotofômetro e converter em
Absorbância com auxílio de tabela (Ab = 2 - log T).
5. Com os dados obtidos dos tubos 0 a 5, obter função da Reta na análise de correlação em
planilha eletrônica (Excel), utilizando os valores de  Absorbância (Y) e concentrações
de caseína expressas em mg/tubo (X).
6. Calcular a concentração de caseína no leite diluído (1:10) e concentração de caseína no
leite desnatado longa vida em g/100 mL de leite ( % ).
Tubo
(No)
0
1
2
3
4
5
Água
Destilada
Caseína
(10 mg/mL)
1,0
0
0,7
0,3
0,4
0,6
0,1
0,9
0
1,0
1 mL leite diluído (1:10)
Caseína
(mg/tubo)
Reativo
Biureto
x
4
4
4
4
4
4
Transmitância
(%)
Absorb.
540 nm
 Absorb.
540 nm
0
18
5. QUESTIONÁRIO - PROTEÍNA
1) Em relação à Aula Prática, responder:
a) Determinar o valor da concentração de caseína no leite através da equação da função
Reta Padrão em planilha eletrônica, dando o resultado em g/100 mL (m/v) (%) de leite.
b) Discutir o valor encontrado em relação ao valor nutricional do leite.
c) O que ocorre com a caseína do leite quando o valor de pH fica abaixo de 6,5?
2) Representar a ligação peptídica.
3) O que vem a ser a estrutura primária, secundária, terciária e quaternária de uma proteína?
4) Citar os tipos de ligação responsáveis pelas estruturas secundária e terciária de uma
proteína?
5) O que vem a ser desnaturação de uma proteína, e que agentes causam esta desnaturação?
6) Definir proteína simples e conjugada. Dê exemplos.
19
DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE MICHAELIS (Km)
E DA VELOCIDADE MÁXIMA (Vm) PARA A INVERTASE DE
LEVEDURA
1. OBJETIVO
Determinar os parâmetros Km e Vm da enzima invertase utilizando a sacarose como
substrato, mediante o estudo cinético da reação.
2. FUNDAMENTOS DO MÉTODO
As reações químicas conduzidas pelos organismos vivos são, na sua grande maioria,
catalisadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatíveis com as
exigências metabólicas.
A levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermédio da "invertase" hidrolisa a
sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose (Figura 1), açúcares esses
que são absorvidos pela célula. A membrana plasmática é impermeável à sacarose, e a levedura
acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma exoenzima) para a hidrólise ocorrer fora da
célula de levedura.
Figura 1. A molécula de sacarose hidrolisada pela enzima invertase da levedura produzindo açúcares
redutores (Glicose e Frutose).
No presente experimento a invertase será obtida de levedura de panificação (fermento
Fleischmann) e adicionada à sacarose (açúcar não redutor), cuja hidrólise resulta na formação
de açúcares redutores (glicose e frutose) que serão estimados pela Reação de SomogyiNelson.
Para tal se colocará a enzima frente à diferentes concentrações de substrato (sacarose),
resultando em diferentes velocidades de reação enzimática, permitindo, mediante um
tratamento matemático adequado, determinar graficamente os valores de Km e Vm.
20
3. MATERIAL










Espectrofotômetro
Estante com 8 tubos de ensaio (por grupo)
2 pipetas graduadas de 2 mL (por grupo)
1 pipeta graduada de 1 mL (por grupo)
1 pipeta volumétrica de 1 mL (por grupo)
Centrífuga e banho-maria para dosagem de açúcares redutores
4 g de fermento prensado tipo Fleischmann
Reagente de Somogyi
Reagente de Nelson
Padrão de açúcar redutor (100 ug de glicose por 2,5 mL)
 Substrato (sacarose 12,5 mM = 4,27 g/L)
4. PRÁTICA
A. Extração da enzima
Transferir 4 g de fermento de panificação para tubo de centrífuga, adicionar 20 mL de
água destilada e deixar em estufa a 37ºC por 30 minutos agitando casualmente. Centrifugar a
1.000 x g por 15 minutos recolhendo o sobrenadante que contém a enzima invertase. Fazer
uma diluição adequado para leitura (1:100; 1:200).
B. Ensaio enzimático
0
1
2
3
4
5
Água
dest.
(mL)
1,00
0,90
0,80
0,60
0,20
0,00
Sacarose
(mL)
(75 mM)
0,00
0,10
0,20
0,40
0,80
1,00
[S]
mM
Invertase
Diluída
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
1,5 mL de padrão contendo 60 µg de glicose
6
Reat.
Somogy
(mL)
1
1
1
1
1
1
1
INCUBAR A 100°C POR 5
MIN
Tu
bo
INCUBAR A 37°C POR 10
MIN
1ª ETAPA: A) Ensaio Enzimático e Reação de Dosagem de Açúcares Redutores
Reat.
Nelson
(mL)
1
1
1
1
1
1
Água
dest.
(mL)
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
1
4,5
T (%)
λ=530nm
Abs
λ=530nm
2ª ETAPA: Cálculo do 1/v e 1/[S]
Tubo
(No)
0
1
2
3
4
5
6
[S]*
mM
60 ug de glicose
-
1
[S]
mM
-
1
V
(ug AR/h)
-
-
-
-
 Abs.
530 nm
V
(ug AR/10min)
V**
(ug AR/h)
0
0
-
*[S] = Concentração de Substrato (sacarose) no meio de reação enzimática expressa em milimolaridade (mM);
**V = Velocidade de Reação Enzimática expressa em µg (micrograma) de glicose (açúcar redutor) formado por hora.
21
3ª ETAPA: Obter os Gráficos abaixo, indicando os Valores de Vm e Km da Invertase
Figura 1. Efeito da concentração do substrato sobre a
velocidade da reação.
Figura 2. Gráfico representando a recíproca da hipérbole.
Reação para dosagem de açúcares redutores
Tão logo termine o período de incubação acrescentar 1 mL do Reativo de Somogy (a
reação enzimática é paralisada pela desnaturação da invertase, quer pela ação do Cu ++ ou pela
alcalinidade do reagente).
Ferver os tubos em banho-maria por 10 minutos, resfriá-los e juntar 1 mL do Reativo
de Nelson. AGITAR BEM OS TUBOS.
Em seguida, completar o volume a 10 mL (adicionando 5,5 mL de água destilada),
agitar novamente a fazer leitura a 530 nm.
C. Coletar os dados, organizando-os conforme o quadro que se segue.
TUBO
(NO)
0
1
2
3
4
5
6
T%
530 nm
Abs. (2-logT)
530 nm
 Abs.
530 nm
[S]*
V**
1
[S]
1
V
-
-
-
-
* [S] = concentração de substrato (sacarose) no meio de reação enzimática expressa em milimolaridade mM.
** V = velocidade de reação enzimática expressa em g (micrograma) de glicose (açúcar redutor) formado por
hora.
22
5. QUESTIONÁRIO - ENZIMAS
1) Em relação à Aula Prática, responder:
a)
Completar a Tabela acima e utilizar os valores de  Abs. para calcular a velocidade da
reação enzimática em ug de açúcar redutor (AR) por hora, completando a Tabela
abaixo:
Tubo
(No)
[S]
mM
0
1
2
3
4
5
6
0
2
4
6
8
10
100 ug de
glicose
 Abs.
530 nm
V
(ug AR/15min)
V
(ug AR/h)
-
1
[S]
mM
1
V
(ug AR/h)
-
-
b) Calcular as velocidades de reação (V) para cada tubo, utilizando os dados de 1/V (eixo
Y) em função de 1/[S] (eixo X), obtendo a equação da Reta Padrão em planilha
eletrônica.
c) Com base na equação inversa da equação de Michaelis-Mentes, determinar
analiticamente os valores de Km e Vmax e discutir os seus significados bioquímicos.
2) Qual o conceito de “sitio ativo”?
3) O que vem a ser velocidade de uma reação enzimática?
4) Qual a explicação de Michaelis-Menten para o modo de ação de uma enzima?
5) Escreva graficamente a comparação entre as energias de ativação de uma reação
catalisada e de uma reação não catalisada.
6) A aldolase apresenta K-equilibrio 9 x 104. Porém na célula a reação se desloca no sentido
da degradação da frutose. Por quê?
7) Que vem a ser inibidor competitivo e não competitivo?
8) O que é uma enzima alostérica?
9) Qual o efeito da temperatura e do pH em uma reação enzimática?
10) O que é cofator enzimático?
11)
O que são coenzimas? Dê exemplos.
23
REAÇÃO DE HILL (FOTÓLISE DA ÁGUA)
1. OBJETIVO
Avaliar a habilidade metabólica do cloroplasto de promover a fotólise da água, o
primeiro passo na sequência de reações da fotossíntese.
2. FUNDAMENTOS DO MÉTODO
O processo fotossintético, que ocorre no interior do cloroplasto, compreende 2 etapas:
a) Fase luminosa: dependente de luz, ocorrendo a fotólise da água acoplada com as
produções de NADPH + H+ (fotorredução) e de ATP (fotofosforilação), conforme a equação
abaixo.
luz
NADP+ + ADP + Pi + H20
NADPH + H+ + ATP +½O2
cloroplastos
b) Fase escura: não depende de luz e corresponde à redução do CO2 ao nível de
carboidrato utilizando NADPH + H+ e ATP.
escuro
NADPH + H+ + ATP + CO2
NADP+ + ADP + Pi + C(H20)
cloroplastos
Hill, em 1937, tentando desvendar o processo fotossintético empregando cloroplastos
isolados de espinafre pretendia a redução do CO2 ao nível de carboidrato. Por dificuldades
técnicas, limitadas pela época, não conseguiu o seu intento, mas chegou a demonstrar a
habilidade de cloroplastos isolados de reduzir outros compostos em um processo acoplado à
fotólise da água com evolução de O2:
luz
2Fe+3 + H2O
2Fe+2 +H+ +1/2O2
cloroplastos
Assim a produção fotoquímica de oxigênio exige a presença de um aceptor de H + e/ou
elétrons, que necessariamente não precisa ser o CO2.
No presente experimento será utilizado como aceptor de elétrons (reagente de Hill) um
indicador de óxido-redução, o 2,6-diclorofenolindofenol, que na forma oxidada é azul (com 
max. ao redor de 540 nm) e na forma reduzida é incolor (Figura 1), o que permite o
acompanhamento da reação fotoquímica mediada por cloroplastos isolados de espinafre.
24
Figura 1. Redução do 2,6 diclorofenolindofenol na Reação de Hill.
3. MATERIAL
















Espectrofotômetro
Tubos de ensaio (4 por grupo)
Centrífuga de mesa para tubos de centrífuga (15 ml)
Almofariz com pistilo (1 para cada grupo)
Lâmpada de 100 W (2 por aula)
Micropipeta de 1mL
Tubos de centrífuga tipo Falcon
Algodão
Funil pequeno de plástico
Pipeta volumétrica (Pasteur)
Folha de alumínio
Banho maria (100oC)
Folhas de espinafre
Sacarose 0,35M
Tampão fosfato 0,05 M (pH = 6,5) contendo sacarose 0,35 M
2,6-diclorofenollindofenol (16 mg/100 ml)
 Ácido ascórbico (cristais)
4. PRÁTICA
A. Extração dos Cloroplastos
a) Picar 5 g de folhas de espinafre e homogeneizar em almofariz usando areia lavada
como abrasivo e 10 ml de sacarose 0,35 M (adicionados aos poucos) como extrator.
b) Filtrar o homogeneizado em algodão.
c) Centrifugar por 2 minutos a 200 x g, (1300 rpm) desprezar o precipitado e
centrifugar novamente o sobrenadante por 7 minutos a 1000 x g. (3000 rpm)
d) Ressuspender os cloroplastos lavados em 10 ml de tampão fosfato 0,05 M (pH= 6,5)
contendo sacarose 0,35 M.
25
B. Ensaio
Preparar 4 tubos de colorímetro conforme o quadro que se segue:
SUSPENSÃO
CLOROPLASTO
(mL)
1,5
(+ ác.ascórbico)
TAMPÃO
FOSFATO
(mL)
2,6-DCF
(mL)
OBSERVAÇÕES
3
0,5
ajustar o “zero”do
aparelho
1,5
3
0,5
ler imediatamente
3
1,5
3
0,5
ler imediatamente e
cobrir com folha de
Alumínio
4
1,5
(ferver 3’)
3
0,5
TUBOS
1
2
Os tubos 2, 3 e 4 são expostos à luz de lâmpada (100 W) durante 1 minuto (o tubo no 3
protegido da luz) e faz-se a leitura de absorbância (Abs.) repetindo a operação 3 vezes.
5. QUESTIONÁRIO – FOTOSSÍNTESE
1)
Em relação à Aula Prática, anotar as leituras obtidas e fazer um gráfico:
TUBOS
1
SUSPENSÃO
CLOROPLASTO
(mL)
1,5
(+ ácido ascórbico)
2
ABS.
(λ=540 nm)
1ª LEITURA
ABS.
(λ=540 nm)
2ª LEITURA
ABS.
(λ=540 nm)
3ª LEITURA
1,5
3
1,5
4
1,5
(ferver 3’)
Discutir os resultados:
a) Qual a função do ácido ascórbico?
b) Qual a função do 2,6 DCF?
c) Descreva o observado nos tubos 2, 3 e 4 durante as leituras.
d) Em quais tubos ocorrem fotossíntese? Por quê?
e) Em quais tubos não ocorre a fotossíntese? Por quê?
ABS.
λ=540 nm
LEITURAS
26
2) Quais os eventos que dependem e quais os que não dependem da luz quanto à formação
de glicose por uma planta fotossintetizadora?
3) Por que os comprimentos de onda na faixa de 450 e 650 nm são mais eficientes para a
realização de fotossíntese pelas plantas superiores?
4) Quais as funções dos carotenóides no processo fotossintético conduzido pelas plantas?
5) Como se explicam a essencialidade do Cl, Mn e Mg para o processo fotossintético?
6) Como são estruturados os sistemas de pigmentos para a captação da energia radiante
para a condução da fotossíntese?
7) Qual a função da água no processo fotossíntético?
8) O que fica demonstrado quando se observa a redução do 2,6-diclorofenolindofenol por
cloroplastos iluminados (reação de Hill)?
9) Como os herbicidas que bloqueiam o transporte de elétrons no processo fotossintético
matam a planta?
10) Como que os herbicidas que bloqueiam o transporte de elétrons na fase luminosa da
fotossíntese (2,4-DNP e DCMU) matam a planta?
11) O que vem a ser “foto-redução do NADP+” e “fotofosforilação do ADP”?
12) Qual o primeiro composto formado pela assimilação do CO2 mediante a via C3 de
fixação? Idem para a via C4. Quais as enzimas envolvidas nesta etapa e suas afinidades
para com o CO2?
13) Que adaptações ocorreram nas crassuláceas que lhes permitem a melhor sobrevivência
em ambientes quentes e áridos?
14) O que vem a ser “fotorrespiração”? Qual o seu substrato e porque é pouco intensa nas
plantas C4? Qual a importância da luz e do O2 neste processo?
15) Cite quatro diferenças entre plantas C3 e C4 (exceto foto-respiração).
16) Porque as plantas C4 fazem fotossíntese com boa eficiência mesmo em temperaturas
mais elevadas?
17) Porque a fotossíntese nas plantas C4 não atinge a saturação mesmo com grande
intensidade luminosa?
18) O que vem a ser “ponto de compensação” e por que é menor para as plantas C4?
27
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AVRON, M. "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated chloroplasts", in D.R.
Sanadi (ed.), Current Topics of Bioenergetics, 12, Academic Press, New York, 1967,
p.1.
JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Van Nostrand, New
York, 1958, 970p.
LITWACK, G. Experimental Biochemistry - A Laboratory Manual. John Wiley & Sons,
Inc., New York, 1960, 313p.
MARTELLI, H.L.; PANEK, A.D. Bioquímica Experimental. Ao Livro Técnico, Rio de
Janeiro, 1968, 112p.
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger Princípios de Bioquímica. 3a. Ed., Sarvier, São
Paulo, 2002, 975p.
VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica.
Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1972, 522p.
VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica.
Koogan, Rio de Janeiro, 1973, 552p.
WHARTON, D.C.; MC CARTY, R.E. Experiments and Methods in Biochemistry.
McMillan Publishing Co, Inc., New York, 1972, 350p.
28
Tabela de Conversão
00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
2.000
1.699
1.523
1.398
1.301
1.222
1.155
1.097
1.048
1.000
959
921
886
854
824
796
770
745
721
699
678
658
638
620
602
585
569
553
538
523
509
495
481
469
456
444
432
420
409
398
387
377
367
357
347
337
328
319
310
01
3.000
1.959
1.678
1.509
1.387
1.292
1.215
1.149
1.092
1.041
0.996
955
917
883
851
821
793
767
745
719
697
676
656
636
618
600
583
567
551
536
521
507
493
480
467
455
442
431
419
408
397
386
376
366
356
346
336
327
318
309
02
2699
1.921
1.658
1.495
1.377
1.284
1.208
1.143
1.086
1.036
0.991
951
914
879
848
818
790
764
742
717
695
674
654
635
616
599
582
565
550
535
520
506
492
479
468
453
441
429
418
407
396
385
375
365
355
345
335
328
317
308
~
2.523
1.886
1.638
1.481
1.387
1.276
1.201
1.137
1.081
1.032
0.987
947
910
876
845
815
788
762
738
714
693
672
652
633
614
597
580
564
548
533
519
504
491
478
465
452
440
428
417
406
395
384
374
364
354
344
334
326
316
307
04
2.398
1.854
1.620
1.469
1.357
1.268
1.194
1.131
1.076
1.027
0.983
943
907
873
842
812
785
759
735
712
690
670
650
631
613
595
578
562
547
532
517
503
489
476
463
451
439
427
416
405
394
383
373
363
353
343
333
325
315
306
05
2.301
1.824
1.602
1.458
1.347
1.260
1.187
1.125
1.071
1.022
0.979
939
903
870
839
810
783
757
733
710
688
688
648
629
611
503
577
561
545
530
516
502
488
475
462
450
438
426
415
403
393
382
372
362
352
342
333
324
314
305
06
2.222
1.796
1.585
1.444
1.337
1.252
1.180
1.119
1.066
1.018
0.975
938
900
866
836
807
780
764
730
708
686
666
646
627
609
592
575
559
544
529
514
500
487
474
461
449
437
425
413
402
391
381
371
361
351
341
332
323
313
305
T em A x 1.000
07
2.155
1.770
1.569
1.432
1.328
1.244
1.174
1.114
1.060
1.013
0.971
932
896
863
833
804
777
752
728
706
684
664
644
625
607
590
573
558
542
527
513
499
485
472
460
447
435
424
412
401
390
380
370
360
350
340
331
322
312
304
08
2.097
1.745
1.553
1.420
1.319
1.237
1.167
1.108
1.056
1.009
0.967
928
893
860
830
801
775
750
726
703
682
662
642
623
606
588
572
556
541
528
511
498
484
471
458
446
334
423
411
400
389
379
369
359
349
339
330
321
312
303
09
2.046
1.721
1.538
1.409
1.310
1.229
1.161
1.102
1.051
1.004
0.963
924
889
857
827
799
772
747
724
701
680
660
640
622
604
587
570
554
539
524
510
495
483
470
457
445
433
421
410
399
388
378
368
358
348
338
329
320
311
302
Cont.
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
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