Apresentação do PowerPoint

Fatores de transcrição Foxo e indução de
células T reguladoras
Djalma
Jonilson
Jaqueline
Origem de células T reguladoras no timo e na periferia
Workman et al. Cell Mol Life Sci (2010) 66, 2603-2622
Vias de sinalização que convergem para a indução de Foxp3
Existe uma rede transcricional que determina a
expressão de foxp3 e outros genes relacionados
às células T reguladoras?
Identificação molecular, estrutura e padrão de
expressão do gene fkh (fox)
 As proteínas expressas pelo gene fkh estão localizadas no núcleo
e portanto podem agir como um reguladores transcricionais
Subfamílias das protíenas Fox
 15 Subfamílias classificadas de acordo com sua homologia
6
Kaestner, K. H., et al. Genes Dev. 2000 14: 142-146
Modificações pós-traducionais nos fatores de
trancrição Foxo
NES: Sequência de exportação nuclear
NLS: sinal de localização nuclear
Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288
Funções dos fatores de transcrição FoxO
nas células e organismos
Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288
Regulação dos fatores de transcrição FoxO
Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288
Regulação dos fatores de transcrição FoxO
Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33
Interação entre FoxO e outros fatores de transcrição
 Indução de genes pró-apoptóticos
 Inibição de genes relacionados ao ciclo celular
 Indução da expressão de genes supressores
de tumor
ER: Receptor nuclear de estrógeno
Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288
Remodelamento da cromatina por proteínas FoxO
Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288
Regulação de genes envolvidos na migração e homeostase
de células T por Foxo1
Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33
Papel de proteínas FoxO na ativação e
diferenciação de células T
(Naive)
(Ativadas)
Ouyang, W., et al. Immunity (2009) 30, 358-371
Outra funções de proteínas FoxO em células T
Peng, S. L. Oncogene (2008) 27, 2337-2344
Modelo provável de diferenciação de nTregs no timo
Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33
Controle molecular da diferenciação de células
T reguladoras induzida por TGF-β
Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33
OBJETIVO
Avaliar as funções de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T, principalmente no que se
refere ao desenvolvimento de funcionalidade de Tregs.
Qual o efeito da deleção de Foxo1 e/ou Foxo3 em linfócitos T?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)
Foxo1-/-Foxo3+/Foxo1+/-Foxo3-/Foxo1-/-Foxo3-/8 semanas
Expressão
Foxo
Score
clínico
Histologia
ELISA
A deleção de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T de camundongos resultou em caquexia, esplenomegalia,
linfadenopatia, grande infiltrado de células mononucleares em órgãos vitais, aumento do título de
autoanticorpos e falecimento precoce dos animais, demonstrando um papel cooperativo de Foxo1 e
Foxo3 na proteção contra uma desordem inflamatória fatal.
Quais são as causas da imunopatologia observada em
camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)
Foxo1-/-Foxo3+/Foxo1+/-Foxo3-/Foxo1-/-Foxo3-/-
CD4
6 a 8 semanas
FACS
CD8
A desordem inflamatória observada em camundongos de 6 a 8 semanas está associada com
a expansão específica da população de células CD4.
Qual é o fenótipo e função das células CD4 em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)
Foxo1-/-Foxo3+/Foxo1+/-Foxo3-/Foxo1-/-Foxo3-/-
6 a 8 semans
Isolamento
CD4 (FACS)
PMA+iono
(4h)
FACS
FACS
Foxo1 e Foxo3 desempenham função crítica na inibição da ativação e
diferenciação de linfócitos T, mais especificamente a diferenciação em células CD4 efetoras
do tipo Th1 e Th17.
Como é a diferenciação de Tregs em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?
timo
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)
Foxo1-/-Foxo3+/Foxo1+/-Foxo3-/Foxo1-/-Foxo3-/-
3 semanas
FACS (timo e baço)
baço
Em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3 é possível observar menor
frequência e número total de células T reguladoras nobaço
timo e no baço.
timo
Como é a sobrevivência e proliferação das Tregs na ausência de Foxo1 e Foxo3?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)
Foxo1-/-Foxo3+/Foxo1+/-Foxo3-/Foxo1-/-Foxo3-/-
Cultura com FITC-VAD-FMK
FACS
3 semanas
Tregs
FACS
Camundongos com 6 semanas
As Tregs deficientes de Foxo1 e Foxo3 apresentam sobrevivência semelhante às
Tregs WT e maior proliferação.
Como é a funcionalidade das Tregs in vitro e in vivo na ausência de Foxo1 e Foxo3?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)
Foxo1-/-Foxo3+/Foxo1+/-Foxo3-/Foxo1-/-Foxo3-/-
CD4 naive – CFSE
Anti – CD3
Esplenócitos irradiados (72h)
3 semanas
Tregs
FACS
FACS
Tregs WT
Tregs Foxo1-/-Foxo3-/(1x105)
CD4 T naive
(4x105 )
6 semanas
Rag1 -/-
Mudança de peso
Desenvolvimento de colite
Foxo1 e Foxo3 são necessários para a função supressiva de células Treg.
Quais são os genes regulados por Foxo1 e Foxo3?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)
Foxo1-/-Foxo3-/Tregs baço
(FACS)
Extração e
amplificação
RNA
Hibridização
Affymetrix
603 sondas analisadas
(genes assinatura Treg)
189 sondas com
diferença de expressão
(1.5)
3 semanas
• 33 genes positivamente correlacionados com a
expressão de Foxp3 downregulados no DKO
• 3 genes negativamente correlacionados com a
expressão de Foxp3 upregulados no DKO
• Sem mudanças na expressão de Foxp3, CTLA4 e
CD25
Devido à expressão semelhante de Foxp3 em Tregs WT e DKO, Foxo1 e Foxo3
• Maior expressão de genes correlacionados à proliferação celular
podem controlar a expressão de
umaexpressão
série de
genes
assinatura
de Treg
• Maior
de genes
codificantes
para receptores
de citocinas do padrão
Th1 e Th17 (IL-12, IL-18, IL-1 e IL-17)
independentemente
da expressão de Foxp3.
• Maior expressão de genes de fatores de transcrição (STAT1, Rorc, Rora e Ahr)
Os defeitos de Tregs deficientes para Foxo1 e Foxo3 são responsáveis pela
imunopatologia observada em camundongos?
WT Tregs (CD45.1)
(3x105)
V
8 semanas
FACS (Treg e CD4)
Foxo1-/-Foxo3-/- (CD45.2)
3-4 dias
CD4
Os defeitos funcionais de Treg contribuem para o fenótipo inflamatório em
camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3, sendo que estes também têm função na
supressão da expressão de citocinas inflamatórias nas Tregs.
Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 no controle de doenças autoimunes sistêmicas
causadas por deficiência de Tregs?
BM WT
BM Foxo1-/-Foxo3-/(2x106)
BM scurfy
(2x106 )
Sobrevivência
FACS
Rag1 -/6ª 8 semanas
Foxo1 e Foxo3 são essenciais para a geração de um compartimento efetivo de
Tregs para evitar a ativação de linfócitos T scurfy.
Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs no timo?
BM WT (2x106 )
CD45.1
BM Foxo1-/-Foxo3-/(2x106) CD45.2
FACS Tregs timo
Rag1 -/6ª 8 semanas
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)
Foxo1-/-Foxo3-/-
3 semanas
Isolamento CD4 timo
Cultura IL-2, anti-CD3 e
anti-CD28 por 18 ou 54h
(TGF-β)
Expressão Foxp3 (FACS)
Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR)
Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs do timo.
Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs na periferia?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)
Foxo1-/-Foxo3-/-
3 semanas
Isolamento CD4
periferia(naive)
Cultura IL-2, anti-CD3
e anti-CD28 por 54h
com ou sem TGF-β
Expressão Foxp3 (FACS)
Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR)
Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs induzidas por
TGF-β.
Foxo1 e Foxo3 se ligam no gene de Foxp3 para controlar a transcrição?
WT
rVISTA tool
3 semanas
Isolamento CD4 e
Tregs (Foxp3+)
Preparação cromatina
Incubação com Ab antifoxo1 e anti-foxo3
Anti-Foxo1
Anti-Foxo3
Precipitação com beads de
proteína A agarose
PCR do precipitado
Foxo1 e Foxo3 interagem com o gene de Foxp3 e, possivelmente, podem controlar a sua
transcrição.
Objetivo: Avaliar o papel dos fatores de
transcrição Foxo na diferenciação de linfócitos.
Caracterização do modelo experimental: como estão os
linfócitos T na ausência de foxo1?
Animais com 3, 8 ou15
semanas
foxo1f/ f- Wt
Cd4Cre foxo1f/f - KO
LN,
baço
Citometria de fluxo CD44, CD69
Linfocitos CD4+ TCRb+
Caracterização do modelo experimental: como estão os
linfócitos T na ausência de foxo1?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- Wt
Cd4Cre foxo1f/f - KO
LN,
baço
Linfocitos CD4+ TCRb+
Incorporação de BrdU
Linfocitos CD4+ TCRb+
PMA+Ionomicina
Elisa
Caracterização do modelo experimental: como estão os
linfócitos T na ausência de foxo1?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- Wt
Cd4Cre foxo1f/f - KO
HE- infiltrado celular
Paralisia de membros posteriores
Foxo1 é essencial na prevenção a ativação sistêmica e patológica
de linfócitos T.
Caracterização do modelo experimental: como estão os
linfócitos B na ausência de foxo1?
Animais com 3,8 ou 15
semanas
foxo1f/ f- Wt
Cd4Cre foxo1f/f - KO
LN,
baço
Linfócitos B B220+
Citometria de fluxo GL-7 e FAS
Caracterização do modelo experimental: como estão os
linfócitos B na ausência de foxo1?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- Wt
Cd4Cre foxo1f/f - KO
Soro
Quantificação de Igs e
anticorpo anti DNA dupla fita.
Caracterização do modelo experimental: como estão os
linfócitos B na ausência de foxo1?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- Wt
Cd4Cre foxo1f/f - KO
LN
Baço
Linfócitos T CD4+ CD44hi
Citometria de fluxo CXCR5, PD-1, CD62L
Cxcr5-Tfh
Caracterização do modelo experimental: como estão os
linfócitos B na ausência de foxo1?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- Wt
Cd4Cre foxo1f/f - KO
LN
Linfócitos T CD4+ CD44hi do LN
RT-qPCR Prdm1, Bcl6 e Il21.
A ausência de Foxo1 é capaz de induzir uma autoimunidade
dependente de Linfócitos B (aumento de células no centro
germinativo, anticorpos circulantes, Tfh, expressão de il21 e Bcl6)
A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da
alteração homeostática devido a manutenção das células T?
Fatores Foxo regulam 7Ilra
Animais com 8 semanas
foxo1f/ fCd4Cre foxo1f/f –
foxo1f/ f- Il7ra tg
Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg
Linfócitos T CD4+
Citometria de fluxo CD44, CD69.
A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da
alteração homeostática devido a manutenção das células T?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f
Cd4Cre foxo1f/f
foxo1f/ f- Il7ra tg
Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg
Linfócitos T CD4+
Citometria de fluxo CD44, CD69.
A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da
alteração homeostática devido a manutenção das células T?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ fCd4Cre foxo1f/f –
foxo1f/ f- Il7ra tg
Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg
LN,
baço
Linfócitos B B220+
Citometria de fluxo GL-7 e FAS
A expressão de IL-7Ra não é capaz de prevenir a ativação de
linfócitos T na ausência de de foxo1 (não é conseqüência de
alteração homeostática).
A ausencia de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central
periférica ou dominante?
Transferência Medula óssea
foxo1f/ f CD45.1
Cd4Cre foxo1f/f CD45.1/2
E na proporção 1:4 WT:KO
Tcra-/CD45.2
após 8 semanas
Linfócitos T CD4+
Citometria de fluxo CD44, CD69., Foxp3
A ausência de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central
periférica ou dominante?
Transferência Medula óssea
foxp3foxo1f/ f+ foxp3Cd4Cre foxo1f/f+ foxp3+
Tcra-/CD45.2
após 6 semanas
Linfócitos T CD4+
Citometria de fluxo CD44, CD69, Foxp3
Foxo1 controla a tolerância dominante de células T (Tregs).
Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das
nTreg?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- Wt
Cd4Cre foxo1f/f - KO
Timo
Citometria de fluxo Foxp3, CTLA-4 CD25 e CD62L.
Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das
nTreg?
Animais com 8 semanas
LN,
baço
foxo1f/ f- Wt
Cd4Cre foxo1f/f - KO
periferia
Foxp3+
Citometria de fluxo Foxp3, CD44, CD103
CD62L CD127
Linfócitos CD4+ TCRb+
Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das
nTreg?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- Wt
Cd4Cre foxo1f/f - KO
Naive
LN
Linfócitos CD4+ TCRb+
Citometria de fluxo CTLA-4
Estimuladas
3 dias aCd3 aCD28 e TGFb
Foxo1 controla a homeostase e o desenvolvimento de célula nTreg
(diminuição de CTLA-4, CD-25 e CD62L).
Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das
iTreg?
foxo1f/ f- Wt
ER4Cre foxo1f/f – KO
Tamoxifeno
Linfócitos naives CD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas
Citometria :
Proliferação CFSE
Expressão de Foxp3 após 3 dias de tratamento com TGFb
ou não
Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das
iTreg?
foxo1f/ f- Wt
ER4Cre foxo1f/f – KO
Tamoxifeno
Linfócitos naivesCD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas
Citometria :
Expressão de Foxp3, CTLA-4, CD25 , IFN-g após 3 dias de
tratamento com TGFb ou não
Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das
iTreg?
Linfócitos naives CD4+ CD69- CD25- foram isoladas dos animais LN
foxo1f/ f- Wt
ER4Cre foxo1f/f – KO
Tamoxifeno
Co- cultura células CD45.1 WT Naives também de LN
Citometria :
Expressão de Foxp3,GITR g após 3 dias de estímulo com TGFb, aCD3
e aCD28
Foxo1 controla a responsividade de célula iTreg na TGF-b (diminuição
de CTLA-4 CD-25 e CD62L).
Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Animais com 8 semanas
CD4CreCd4Cre foxo1f/f
foxo3kca/kca
HE- infiltrado celular
Imunofluorescencia a dsDNA
Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Animais com 8 semanas
foxo1f/f foxo3f/f
Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f
Citometria de fluxo CD44, CD69
Linfócitos CD4+ TCRb+
Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Animais com 8 semanas
foxo1f/f foxo3f/f
Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f
LN,
baço
Linfócitos B B220+
Citometria de fluxo GL-7 e FAS
Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Animais com 8 semanas
foxo1f/f foxo3f/f
Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f
foxo1f/f foxo3f/f
Cd4Cre foxo1f/f foxo3f/f
Timo
Linfócitos T CD4+
citometria de fluxo CD25, FOxp3 eTCRb
Treg periférica
LN
Foxo3 e Foxo1 possuem papeis sobrepostos no desenvolvimento e função de
linfócitos t reguladores derivados do timo apesar de não serem necessários para
expressão e manutenção de Foxp3.