Mecanismos epigenéticos da expressão gênica
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Controle epigenético da expressão gênica em plantas Alteração da expressão gênica sem alterações na sequência de DNA Caso clássico: Alterações epigenéticas que afetam propriedades de pigmentação Duas possibilidades: permanecem após a meiose x não permanecem após a meiose Mudancas epigenenéticas típicas das plantas: normalmente transmitidas na meiose Mecanismos da variação epigenética: Metilação do DNA Mudanças no posicionamento do nucleossoma Mudanças no empacotamento dos nucleossomas Modificações covalentes do nucleossoma Metilação: mecanismo mais connhecido DNA-metil transferase; preferência pelo motivo CpG ou Cp Metilação: mecanismos para garantir a heranca mitótica ou meiótica de padrões específicos de metilação. 1) : ATPase tipo SNF2 (Lsh) aflouxa os contatos entre o DNA e as histonas 2) Metiltransf. da histona (Suv39H1) metila Lys hist. (estrela): Configuração da cromatina permissível à metilação 3) “Targeting factor” reconhece a sequência a ser metilada, e traz consigo os fatores para a metilação: DNMT1: citosina-5-metil transferase HDAC: desacetilase da histona MeCP2: proteína de ligação ao DNA metilado 4) Sin3a +HDAC: desacetilação das histonas resultando em sua condensação Metilação e repressão transcricional Mecanismo epigenético 1: Imprinting Imprinting: a expressão de certos alelos difere dependendo da origem do gameta Exs: mamiferos, fungos e plantas Ex: pigmentação da semente de milho: alelos r (red): Bom nível de expressão quando transmitido pelo óvulo ::cor sólida da semente Baixo nível de expressão quando transmitido pelo pólem ::cor variegada: Diferenças fenotípicas: não depende da dosagem do gene R mas sim de mudanças epigenéticas que são macho-específicas Imprinting: sementes; mudanças epigenéticas relacionadas a dosagem gênica e ligadas ao sexo Grande desenvolvimento do endosperma periférico e chalazal, mas sem celularização Maternalização = redução da metilação 2x x 2x Reduzido endosperma periférico e chalazal Transgênicos e Mutantes hipometilados Fenocópia 4x x 2x Fenocópia 2x x 4x Fenocópia 2x x 6x Fatores epigenéticos controlando o desenvolvimento da semente paternal Mecanismo do imprinting (ratos) Dois genes reciprocamente sofrendo imprinting: 90 kb distância Igf2: fator cresc. fetal H19: RNA sem prot. DMD: differentially methylated domain -> silenciador: papel no “desliga expressão” H19 e IGF2 Estimuladores Endoderme Bloqueia o estimulador de Igf2 Específico para mesoderme ? Mesoderma Mecanismo epigenético 2: Paramutação Interação alélica: a expressão de um alelo em um heterozigoto é alterada na presenca de outro; herdável através da meiose Alelo B(booster): B-I: pigmentacao forte; B’: pigmentacao fraca B-I: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo B’ B’: transcrição 10-20 vezes menor Alelo Pl; forte pigmentação das anteras; Pl’: cor variegada PI e P’: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo P’ DNA metilado: proteínas ligam-se ao DNA metilado enzimas modificadoras das histonas fatores remodeladores da cromatina formação da heterocromatina Mecanismo da paramutação; Mecanismo 2 Mecanismo 1 Promotor 1 Promotor 2 RNA aberrante Interação dos cromossomas Transferência direta de elementos da cromatina Sinal difusivel: RNA Citosinas metiladas podem ser mantidas na replicação Mutantes com alterações no mecanismo epigenético da regulação gênica Milho: mop1: mediator of paramutation 1: bloqueia a paramutação do gene B e de outros pigmentos Arabidopsis: o caso dos genes PAI: sintese triptofano: 2 genes, em 2 cromos. ambos genes PAI tornam-se então metilados Introdução de novos genes PAI não metilados tornam-se metilados PAI: Phosphoribosilanathranilate isomerase Estratégia de seleção de mutações que afetam as mudancas epigenéticas em PAI Reação catalizada pela enzima PAI [intermediário fluorescente] ………. Planta transgênica utilizado na seleção genética X 10 mutante isolado Triptofano 20 mutante isolado Única sequência PAI que pode ser expressa no cromossoma 1 foi mutada Met1 e CMT3: codificam para duas diferentes metil-transferases deDNA Nivel de metilação = reostato controle do nível de expressão gênica metilacoes redução na fluorescência metilação Mecanismo epigenético 3: Silenciamento Detecção: plantas trangênicas; Arabidopsis, Petunia e tabaco Repetição da presença de genes :::: silenciamento de outras sequências Estrutura ou organização do cromossoma como causa do silenciamento Petunia mutata : sem cor (sem o gene A1): Introdução gene A1 do milho: cópia simples: Flor torna-se pigmentada Adição da segunda cópia de A1: transcrição silenciada: herdável geneticamente Variegação: Silenciamento da segunda cópia Gene silenciado A1 pode induzir silenciamento epigenético de outro gene A1 novo, somente quando esse gene A1 expresso é inserido próximo do primeiro. Mecanismos: TGA (transcriptional gene silencing) pela metilação ddm1: afeta o reconhecimento da metilação met1: afeta a metilação mom1: TGS independente da metilação PTGA (post-transcriptional gene silencing) pela metilação: não afeta a transcrição Mecanismo epigenético 3: Silenciamento: Co-supressão Transgene pode induzir o silenciamento de um gene endógeno e homólogo Silenciamento não-herdável Experiência da sobre-expressão da chalcone sintase Co-supressão não herdável geneticamente: atividade endógena é restabelecida quando ocorre a segregação do transgene Silenciamento de viróides: enxerto de planta contaminada por um vírus em outra planta contaminada com outro vírus:. Silenciamento de outro vírus: Transmissão do sinal por toda a planta: Efeito a nível pós-transcripcional Eventos epigenéticos na poliploidização (70% angiosperma; 95% pteridófitas) Diferencas no número de cormossomas ou organização podem romper o pareamento e distribuição : duplicação dos cromossomas Inicio da formação de um poliplóide: “choque”: - silenciamento genes duplicados; - reduzir “infidelidade” cromossomal Híbrido F1 Duplicação gênica Duplicação gênica Autopoliploide Alopoliplóide Autopoliploidia; oportunidade para alterar a expressão gênica (silenciamento), e criar um tampão contra o efeito de mutações deletérias Vantagens dos alopoliplóides: manter a natureza híbrida indefinidamente Mudanças durante o estabelecimento da um autopoliplóide: eliminação de sequências de DNA, expansão heterocromatina, translocacao recíproca de segmentos de cromossomas: ajudam diferenciar os cromossomas homólogos dos homeologos Silenciamento nos alopoliplóides: metilação: uso do aza-dC Modelo explicativo do silenciamento em poliplóides Causas potencias da origem da variabilidade em poliplóides Seleção de mutações que afetam o controle das alterações epigenéticas ddm1: mutação no gene (SNW/SNF2) : fator de remodelação da cromatina; Mamíferos mudanças na estrutura da cromatina devem anteceder a metilação Sem fenótipo visível; autofecundação: Paradoxo? progenia anormal::desestabilização da programação epigenética reduzido nível de metilação :: nova metilação e silenciamento de genes que são normalmente expressos e não metilados (SUPERMAN): flores anormais Plantas antisenso para MET1; redução em 30% no nível de metilação Hipermetilação do gene SUPERMAN e do gene AG Hipermetilação do gene SUPERMAN Problema para a obtenção de plantas transgênicas: - súbito silenciamento do transgenes 1a defesa para superar este problema: selecionar planta transgênica com cópia unica Genes do florescimento precoce: genes silenciadores: mecanismos epigéneticos no controle do florescimento (repressores epigeneticos) Genes do florescimento precoce: genes de proteinas associadas a cromatina Repressores epigenéticos Mutantes tfl2, emf: 1) florescem precocemente, 2) florescem sob DC, flor terminal, 3) proteínas de reserva da semente são expressas antes 35S:TFL1 4 sépalas nova influorescência 35S:EMF1 + DL duas folhas caulinares flor terminal (2 silíquas) novo broto terminal 35S:EMF1 + DC flores e brotos originados na mesma regiao Importância da remodelagem da cromatina no controle da expressão gênica e dos processos de desenvolvimento Pouco compeendido como esses fatores de remodelagem da cromatina funcionam em plantas PGTS (post-transcriptional gene silencing):primeiramente descoberto em plantas Primeiro gene regulatório para PGTS foi descoberto em Neurospora Mediado por moléculas de RNA pequenas (<70 nucleotídeos) PGTS: um poderoso meio para manipular a expressao em sistemas animais::RNAi PGTS: mais conhecido em Drosophila e levedura (Saccharomyces) Plantas usam as mudancas epigenéticas para se adaptar a mudancas genômicas ou ambientais::flexibilidade Flexibilidade: reprogramação dos estágios de desenvolvimento Funções: 1) proteção contra efeitos deletérios da transposição de transposons 2) Resistência contra viroses (Produzem dsRNA) DICER Pode ser transmitido entre células e a longas distâncias PGTS (Silenciamento pós-transc. RNA curto de interferência (siRNA) Dupla fita Perfeitamente complementar ao RNA alvo Direciona a clivagem endonucleolítica RNA dupla fita perfeitamente ou quase perfeitamente pareado Não conservado entre as espécies Originado de um RNA percursor de maior tamanho Cromossomal ou citoplásmico Comprimento médio de 25 nucleotídeos Micro RNA (miRNA) Fita simples Parcialmente complementar ao RNA alvo Mecanismo de ação desconhecido RNA dupla fita pareado, mas com alças Frequentemente conservado entre as espécies e filos Originado de um RNA percursor de maior tamanho Cromossomal (IGR) Tamanho médio de 70 nucleotídeos RNA curto temporal (stRNA) Fita simples Parcialmente complementar ao RNA alvo Inibe a tradução do mRNA RNA dupla fita pareado, mas com alças Altamente conservado entre as espécies e filos Altamente conservado entre as espécies e filos Originado de um RNA percursor de maior tamanho Cromossomal (IGR) Tamanho médio de 70 nucleotídeos Mecanismos pelos quais os microRNAs promovem o silenciamento RNAse tipo III Complexo de endonucleases Locus de controle do cruzamento sexual em S. pombe (mat2P) Metilação da histona Recrutamento: criação de um sítio de nucleação da heterocromatina Difusão do processo de diferenciação da heterocromatina: Silenciamento do locus mat2P 61 alvos potenciais: 41 são fatores transcricionais Desen. floral Desen. floral Dicer Separação de orgãos Dif. Merist. Axilar e da folha Det. Da especificade de RISC: mutantes: arquit. mod Desen. floral Desen. floral Identidade floral Inoculação com o virus da planta transgênica 35SGFP TRV-00: vírus sem inserto TRV-P: contendo 359 nt 3’ da GFP TRV-35S: 347 nt do promotor da GFP Luz UV Nuclear Run of: taxa de transcrição PGS PTGS Luz UV TRV: tobacco rattle virus Efeito da proteína HC-Pro no silenciamento sistêmico HC-Pro: proteína viral que suprime o silenciamento SilGUS: locus de silenciamento de GUS Silenciamento sistêmico Supressão do silenciamento sistêmico RNAi: poderosa ferramenta atFAD2: Desaturase de A. thaliana AttP1/AttP2: clonagem por Recombinação utilizando o sistema Gateway Gene orientação Senso substitui ccdB Gene orientação anti-senso substitui ccdB Amplifico o gene adicionando o sítios attB1 e attB2 Recombinação in vitro utilizando o sistema Gateway Sistema ccdB: proteína letal: sistema para a seleção do vetor recombinante RNAi
