56º Congresso Brasileiro de Genética Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010 Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2 108 Análise epigenética integrada: expressão gênica, metilação do DNA e imunoprecipitação da cromatina na caracterização de genes supressores tumorais em 3p21.3 Prando, EC1; Aguiar, G1; Cavalli, LR2; Rainho, CA1 Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UNESP - Botucatu, SP Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University Medical Center - Washington DC [email protected] 1 2 Palavras-chave: câncer de mama, regulação epigenética, genes supressores tumorais, RASSF1, PCR em tempo real, ChIP. Alterações epigenéticas, incluindo as alterações da metilação do DNA e as modificações das histonas, são eventos frequentes em células tumorais e estão associadas às mudanças da estrutura da cromatina e dos níveis de expressão gênica. A perda da expressão do gene supressor tumoral RASSF1, localizado em 3p21.3, constitui um dos principais exemplos de genes inativados tanto por mecanismos genéticos quanto epigenéticos em vários tipos de cânceres humanos. Este gene codifica uma proteína com domínio de associação a RAS com função na regulação da fase G1/S do ciclo celular, transdução de sinal, trocas e transporte de íons, apoptose e morte celular. A hipermetilação da ilha CpG presente na sua região promotora foi detectada em até 90% dos carcinomas mamários. Com a finalidade de investigar a provável regulação epigenética de um agrupamento gênico contendo outros prováveis supressores tumorais mapeados upstream ao gene RASSF1 (SEMAB3, HYAL3, HYAL1, HYAL2 e TUSC2) e downstream (ZMYND10A, TUSC4, TMEM115 e CACNA2D2) foram analisados seus níveis de expressão em 10 linhagens celulares derivadas de carcinomas mamários (MDA-MB-134 IV, MDA-MB-453, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF7, BT-549, BT-483, Hs 578T e SK-BR-3), uma linhagem celular não-tumorigênica (MCF-10A) e 2 linhagens celulares derivadas de tecido mamário normal (184A1 e 184B5). Os níveis de expressão destes dez genes foram quantificados utilizando a técnica de qRT-PCR (quantitative real time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), nas 13 linhagens celulares tratadas ou não com as drogas 5-aza-2’-desoxicitidina, um agente desmetilante, e tricostatina A (TSA), um inibidor das desacetilases de histonas. Os genes GAPDH e PPIA foram utilizados como controles endógenos e a quantificação relativa foi obtida pelo método ∆∆Ct. Os dados de expressão foram comparados com a análise do padrão de metilação do gene RASSF1 em cinco linhagens celulares (MDA-MB-134 IV, MDA-MB-453, MDA-MB-231, MCF7 e SK-BR-3) não submetidas à ação das drogas e a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) com os anticorpos para se detectar a acetilação e a metilação da lisina 9 da histona H3 (H3K9ac e H3K9me3) da região promotora do gene RASSF1, na linhagem MDA-MB-231. Após o tratamento com Aza seguido ou não do tratamento com TSA observou-se um aumento da expressão do gene RASSF1 positivamente correlacionada com a re-expressão dos genes TUSC2, TUSC4, TMEM115 e ZMYND10 (correlação não-paramétrica de Spearman, p<0,05). Adicionalmente, a linhagem MDA-MB-231 foi a que mostrou os maiores níveis de metilação do DNA e de metilação H3K9 e baixos níveis de acetilação deste aminoácido. Em conjunto, esses dados preliminares sugerem a inativação epigenética dos genes localizados próximos ao gene RASSF1 em carcinomas mamários. Apoio Financeiro: FAPESP e Capes