Silenciamento de RNA como ferramenta para exploração da função

55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Silenciamento de RNA como ferramenta para
exploração da função de genes no dermatófito
Trichophyton rubrum
Silveira, HCS1; Segato, F2; Prade, RA2; Cazzaniga, RA1; Rossi, A3; Martinez-Rossi, NM1
Departamento de Genética, FMRP-USP
Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University OK
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Departamento de Bioquímica e Imunologia, FMRP-USP
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Palavras-chave: Trichophyton rubrum, dermatófito e silenciamento de RNA
Trichophyton rubrum é um dermatófito que acomete seres humanos, é cosmopolita e o mais prevalente entre
as micoses. Os dermatófitos são fungos que consomem substratos queratinizados do hospedeiro para sua
sobrevivência. Para isto, liberam uma ampla variedade de proteases importantes na patogenicidade. O
conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos nos processos de adaptação deste patógeno é fundamental
para o entendimento de sua instalação no hospedeiro e manutenção da infecção. Uma das frentes promissoras no
descobrimento da função gênica são as metodologias baseadas na inativação do RNAm por silenciamento (RNAi).
A fim de silenciar genes em T. rubrum, construímos um plasmídeo com repetições invertidas do promotor do
gene TrpC de Aspergillus nidulans que flanqueiam um gene de interesse. Neste caso utilizamos o gene pyrG que
codifica a orotidine 5’-phosphate decarboxylase, uma enzima essencial para a biossíntese de uracil, subseqüente
formação de uridina. Mutantes para este gene são cultivados em excesso de uracil e uridina. Dessa forma, o
RNA dupla fita é transcrito, desencadeando o mecanismo de RNAi para silenciar o gene alvo. Para a construção
do plasmídeo, primeiramente por PCR de fusão, fusionou-se os fragmentos de TrpC e do gene da orotidine
5’-phosphate decarboxylase, obtendo-se um produto amplificado de 1.500 pb. Este fragmento foi clonado através
do sitio de clivagem de Hind III no vetor pCSN43, que contém o gene de resistência a higromicina, originando
o plasmídeo pTrpC/hyg. Essa construção é uma poderosa ferramenta genética porque o mecanismo celular de
RNA de interferência pode ser facilmente induzido e vários genes de interesse poderão ser clonados e silenciados.
Além disso, o descobrimento de funções celulares e vias metabólicas em T. rubrum podem elucidar as respostas
moleculares envolvidas na interação patógeno-hospedeiro e fornecer novas abordagens para o desenvolvimento
de novos antifúngicos.
Suporte financeiro: FAPESP, CNPq, CAPES e FAEPA