MORFOLOGIA E ESTRUTURA DA CÉLULA BACTERIANA Aula I
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MORFOLOGIA E ESTRUTURA DA CÉLULA BACTERIANA FORMA E ARRANJO • COCOS • BACILOS (cilíndricas) • ESPIRAL Cocos Bacilos Espirilos Diplobacilos Estreptobacilos Bacilos isolados espiroqueta Características Gerais das Bactérias • Morfologia • • • • • • Cocos: bactérias ovais ou esféricas - diplococos: 2 cocos - tétrade: 4 cocos - sarcina: 8 cocos (cúbico) - estreptococos: cocos em cadeia - estafilococos: cocos agrupados Características Gerais das Bactérias • Bacilos: bactérias cilíndricas ou em forma de bastão • - diplobacilos: 2 bacilos • - estreptobacilos: bacilos em cadeia • - cocobacilos Características Gerais das Bactérias • Espirilos e espiroquetas: bactérias helicoidais Campylobacter sp Leptospira sp Helicobacter sp ESTRUTURAS BACTERIANAS Estrutura da Célula Bacteriana e suas Funções 1. Estruturas externas à parede celular: - cápsula - flagelo - filamento axial - fímbria ou pilus 2. Parede celular 3. Estruturas internas à parede celular - membrana citoplasmática - região nuclear - estruturas citoplasmáticas Estruturas bacterianas e suas funções • CÁPSULA Composição: polissacarídeos ou polipeptídios → Substâncias poliméricas extracelulares substância gelatinosa Funções: • Difícil de ser observada ao microscópio; Visualizada com tinta nanquim; Não é indispensável para o crescimento bacteriano; porém importante para a sobrevivência no hospedeiro; • Adesão celular (biofilme): receptores específicos • aumento da capacidade invasiva: escapam da fagocitose • Ex: Streptococcus pneumoniae • Reservatório de água e nutrientes: proteção ao dessecamento • Limitam a capacidade de Fagocitose das células de defesa do organismo (Neutrófilos) Estruturas bacterianas e suas funções • FLAGELOS Confere movimento à célula; Formado pela proteína flagelina; Mais comum em bacilos que em cocos; Quimiotaxia Localização Polar (1 flagelo) Polar (vários flagelos) Peritríquio (muitos flagelos) Estruturas bacterianas e suas funções • FÍMBRIAS, PÊLOS ou “PILI” Menores, mais curtos e mais numerosos que os flagelos; Visto ao microscópio eletrônico; Aderência às células do hospedeiro e outras superfícies; Fímbria sexual – condutor de material genético durante a conjugação bacteriana Estruturas bacterianas e suas funções • CROMOSSOMO 1 único cromossomo Circular Duplo filamento Encontrado na região nucleóide; Não são necessárias histona para conformação do DNA Estruturas bacterianas e suas funções • PLASMÍDIOS DNA menores Circulares Extracromossomais Mais encontrados em GNão são essenciais, mas quando conferem vantagem antibióticos) presentes, seletiva (Ex: resistência aos Estruturas bacterianas e suas funções • RIBOSSOMOS Formado pelas subunidades 30S + 50S (70S) Diferente do ribossomo 80S dos eucariontes; Alvo importante para drogas antibacterianas; Estruturas bacterianas e suas funções • PAREDE CELULAR Gram + Funções : - dar forma à célula - proteção osmótica Gram - Estruturas bacterianas e suas funções • Membrana plasmática • MEMBRANA CELULAR • Formada por duas camadas de fosfolipídeos,com proteínas inseridas. • Diferencia-se da dos seres Eucariotas por não conter esteróis, sendo uma estrutura fluida, que permite a mobilidade de proteínas (permeases, enzimas respiratórias, enzimas hidrolíticas, etc.). Estruturas bacterianas e suas funções • Membrana plasmática • Funções : • • • • Permeabilidade seletiva Reações de obtenção de energia Produção de enzimas celulares Contém proteínas transportadoras; Mesossomo – Invaginação da membrana plasmática Onde ocorre a divisão da célula pela metade ligar e separar cromossomos das células filhas na divisão celular; • Membrana plasmática Estruturas bacterianas e suas funções • ESPOROS Algumas bactérias G+ (mas nunca as G-) formam esporos; Condições adversas- estado vegetativo - estado dormente; EX: Clostridium e Bacillus Resistência ao Calor e a compostos químicos Não são morto pela fervura 100ºC são mortos APENAS a 121ºC Estruturas bacterianas e suas funções Célula vegetativa esporo Estruturas bacterianas e suas funções Formação dos Esporos Esporulação Germinação Coloração de Gram • Hans Christian Gram (1884) • Fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias • Rotina da Bacteriologia • Permite dividir as bactérias em dois grupos: Gram positivas Gram negativas Coloração de Gram • A técnica de coloração de Gram consiste em expor as células bacterianas à seguinte sequência: • Corante primário – violeta de cristal: cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula. • Mordente – solução de iodo: aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a célula e forma com o corante um complexo insolúvel dentro da célula. • Agente descolorante – álcool, acetona ou ambos: solvente lipídico. • Contrastante – safranina ou fucsina básica: cora o citoplasma de vermelho. Coloração de Gram DIFERENÇAS ENTRE AS MEMBRANAS EXTERNAS Gram Negativas: contém uma membrana externa de lipídeos e peptídeos glicanos delgados perdem o corante púrpura quando tratadas com álcoolcetona. Coloração de Gram • BACTÉRIAS- renovação do protoplasma e execução de todas suas atividade PRECISAM DE: • FONTES DE ENERGIA • FONTE DE MATÉRIA-PRIMA Protoplasma: Parte viva da célula FONTE DE MATÉRIA-PRIMA • Para a renovação da matéria viva, os elementos quantitativamente mais importantes são: • Carbono Hidrogênio Oxigênio Nitrogênio Enxofre Fósforo FONTES DE CARBONO • AUTOTRÓFICAS – única fonte de Carbono é o CO2 ou HCO3 As bactérias autotróficas fabricam o seu próprio alimento por meio da fotossíntese ou da quimiossíntese. Na fotossíntese, a energia utilizada na produção do alimento vem da luz solar. Na quimiossíntese, a energia vem de algum composto químico a ser "queimado". Carboidratos (D-glicose) HETEROTRÓFICAS (maioria)exigem fontes orgânicas Aminoácidos de carbono Lipídeos Amido celulose • As bactérias heterotróficas, alimentam-se principalmente da matéria orgânica que conseguem decompondo organismos mortos. São chamadas de decompositores ou saprófitas ÍONS INORGÂNICOS ESSENCIAIS • MACRONUTRIENTES- necessitam em maior quantidade: P , S , K , Mg , Fe P – síntese de ácido nucléico e fosfolipídio; S – cisteína e metionina; vitaminas: tiamina, biotina, coenzima A; K – enzimas envolvidas na síntese de proteínas; Mg – estabilizador de ribossomos, membranas celulares e ácidos nucléicos; • MICRONUTRIENTESCu , Co , Zn , Mn , Na FATORES DE CRESCIMENTO • Compostos orgânicos indispensáveis a um determinado microrganismo, mas que ele não consegue sintetizar. Ex: vitaminas do complexo B aminoácidos nucleotídeos ÁGUA • Não constitui um nutriente, mas é absolutamente indispensável para o crescimento o Bactérias se nutrem pela passagem de substâncias em solução pela m. plasmática; o Regula a pressão osmótica; o A maioria das bactérias morre pela dessecação (quando não são esporos); OXIGÊNIO ATMOSFÉRICO • AERÓBICAS (exigem presença de O2 livre) • MICROAERÓFILAS (exigem O2 mas não toleram a pressão atmosférica) • ANAERÓBIA ESTRITA (não tolera O2 – morre) • ANAERÓBIA NÃO-ESTRITA (não utiliza O2, mas ele não é tóxico) • ANAERÓBIA FACULTATIVA (cresce tanto na presença quanto na ausência de O2 livre) OXIGÊNIO a) AERÓBIOS ESTRITOS b) ANAERÓBIOS ESTRITOS C) ANAERÓBIOS FACULTATIVOS d) MICROEAEÓFILOS e) ANAERÓBIOS AEROTOLERANTES Crescimento Bacteriano Temperatura de Crescimento dos Microrganismos Fatores Extrínsecos Classificação Quanto a Temperatura Crescimento Bacteriano Classificação Quanto ao Ph • Diferentes espécies de microrganismos têm diferentes tolerâncias de pH e estes pH específicos refletem a adaptação do organismo ao seu ambiente natural. No entanto, há determinadas espécies que estão adaptadas para crescer a vários valores da escala de pH • Acidófilos: desenvolvem-se em baixos valores de pH (1- 5,5) • Neutrófilos: desenvolvem-se em pH 5,5-8 • Alcalófilos:desenvolvem-se a valores elevados de pH (8,5-11,5) Reprodução das bactérias: divisão binária Assexuada Parede celular Duplicação do DNA Membrana plasmática Molécula de DNA Separação das células Crescimento Bacteriano Crescimento de uma cultura Bacteriana 1 única bactéria que sofre divisão binária o aumento da população na cultura é : 1 2 4 8 16 32... Crescimento Bacteriano Crescimento de uma cultura Bacteriana Esse aumento no numero de células bacterianas pode ser expresso por uma progressão geométrica: 1 2¹ 2² 2³ ... 2n N = ao numero de gerações Durante o crescimento ativo de uma cultura de bactérias (sem morte), as células crescem exponencialmente, aumentando por meio dessa progressão geométrica. Crescimento Bacteriano Tempo de Geração: É o intervalo de tempo requerido para que cada microrganismo se divida. • Cada especie tem seu tempo de geração • Ex: E.coli O tempo de geração em meio liquido pode ser apenas de 12,5 min • Ex Mycobacterium tuberculosis é de 13 a 15 horas • O tempo de geração são fortemente influenciados pela composição nutricional do meio de cultura e pelas condições físicas de incubação. Crescimento Bacteriano Curva de crescimento de Microrganismos Unicelulares em um Sistema Fechado Crescimento Bacteriano Curva de crescimento de Microrganismos Unicelulares em um Sistema Fechado Crescimento Bacteriano Curva de crescimento de Microrganismos Unicelulares em um Sistema Fechado Crescimento Bacteriano Curva de crescimento de Microrganismos Unicelulares em um Sistema Fechado Crescimento Bacteriano Curva de crescimento de Microrganismos Unicelulares em um Sistema Fechado Caracterização dos Microrganismos Caracterização dos Microrganismos • Uma população microbiana no ambiente natural possui diversas espécies não somente de bactérias , mas também de leveduras, bolores, algas, protozoários. E também vírus. Protozoário Algas Fungos Virus Bactérias Caracterização dos Microrganismos • Como fazer para identificar quantos e quais são os tipos de microrganismo que estão presentes em um ambiente particular? • Qual é a importância dessa identificação? Caracterização dos Microrganismos Importância da Caracterização dos microrganismos: • Verificar a portabilidade da Água – Ausência de E.coli • Isolar bactérias que causam doenças para dar um diagnostico médico preciso • Definir as populações de bactérias existentes nos ambientes aquático, terrestre ou no ar. Caracterização dos Microrganismos Técnica de Cultura Pura • Para determinar as características de um microrganismo, ele deve estar em Cultura Pura. • Cultura Pura: Todas as células presentes deverão ser idênticas morfologicamente e geneticamente. Isso quer dizer que essas células partiram de uma mesma célula parental. “Uma cultura que tem apenas um tipo de microrganismo é conhecida por cultura pura, uma cultura que tem mais do que um tipo de microrganismo é uma cultura mista” Caracterização dos Microrganismos Isolamento e Cultivo de Culturas Puras Em laboratório os microorganismos são cultivados em material nutriente chamado Meio de Cultura. Caracterização dos Microrganismos CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS MEIOS DE CULTURA • Para a cultura de microrganismos é necessário existirem meios de cultura apropriados que simulem ou até melhorem as condições naturais do ambiente em que se desenvolvem. • Um meio de cultura é um substrato nutritivo capaz de permitir a nutrição e o crescimento dos microrganismos (bactérias, fungos, algas, parasitas) fora do seu ambiente biológico natural, ou seja, é uma preparação de nutrientes utilizada para o crescimento de microrganismos em laboratório. • A sobrevivência e o crescimento dos microrganismos depende de um adequado suprimento de nutrientes e de um ambiente físico favorável. No entanto, há uma grande diversidade de necessidades nutricionais e ambientais entre os microrganismos e por isso é que só compreendendo as suas necessidades que se consegue ter sucesso na cultura de microrganismos no laboratório. Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura • Os meios de cultura devem conter os nutrientes em quantidades e proporções corretas para a manutenção e multiplicação dos microrganismos. A maior parte dos microrganismos utiliza substâncias de baixo peso molecular que são, freqüentemente, derivadas da degradação enzimática de nutrientes complexos. Por isso, os nutrientes indispensáveis ao organismo em causa devem estar sob forma assimilável. • As necessidades nutricionais dos microrganismos são satisfeitas no laboratório através da variedade de meios de cultura existentes. Os microrganismos têm necessidades nutricionais variáveis de acordo com a espécie, no entanto, há determinadas substâncias cuja necessidade é comum a todos. Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura • Constituintes essenciais ou básicos: » » » » » » » » » » » Água Fonte de energia Fonte de carbono Fonte de hidrogénio e de oxigénio Fonte de azoto Fonte de enxofre e de fósforo Elementos metálicos Factores de Crescimento Substâncias Inibidoras: Indicadores de pH Substâncias solidificantes (inertes) Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura Água • A água é um componente importante e sempre presente em altas quantidades. Todas as células requerem água no meio para que os nutrientes de baixo peso molecular possam atravessar a membrana celular. • A água utilizada nos meios de cultura deve ser destilada, pois a água de consumo contém minerais que podem reagir com os constituintes do meio formando precipitados, além de substâncias antisépticas (ex. cloro) que podem interferir com o crescimento microbiano. Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura Fonte de energia • As atividades metabólicas das células só podem ocorrer se houver energia disponível na célula. RELEMBRANDO.... • Os microrganismos podem ser divididos em duas categorias de acordo com a sua fonte de energia: • - Fototróficos: usam a energia radiante como única fonte de energia, através da fotossíntese. • - Quimiotróficos: dependem da oxidação de compostos químicos como fonte de energia. Alguns microrganismos usam moléculas orgânicas (como a glicose), enquanto outros usam compostos inorgânicos (como o H2S e o NaNO2). Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura Fonte de carbono • O carbono é um elemento essencial necessário ao crescimento microbiano. RELEMBRANDO... Entre os microrganismos há duas categorias de acordo com as suas necessidades nutricionais: • - autotróficos: usam carbono inorgânico na forma de dióxido de carbono como única ou principal fonte de carbono. Estes microrganismos podem ser cultivados num meio de cultura só com compostos inorgânicos, pois não necessitam de compostos orgânicos e podem ser inibidos por eles. • - heterotróficos: usam compostos orgânicos como principal fonte de carbono. Estes microrganismos não podem ser cultivados num meio só com compostos inorgânicos, pois eles necessitam de nutrientes orgânicos, principalmente glicose. Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura Fonte de hidrogénio e de oxigénio • As necessidades de hidrogénio e de oxigénio são, geralmente, satisfeitas ao mesmo tempo que as de carbono, uma vez que esses elementos fazem parte de muitos compostos, usados como fonte de carbono e de energia. Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura Fonte de azoto • O azoto é também um elemento essencial para a síntese de muitas macromoléculas celulares particularmente proteínas e ácidos nucleicos. • Alguns microrganismos utilizam o azoto atmosférico (N2), outros contam com compostos inorgânicos como a amónia e os sais de nitrato, enquanto outros necessitam de compostos orgânicos que contêm azoto como os aminoácidos. • Uma das principais fontes de azoto de origem comercial são as peptonas. Estas são obtidas a partir da hidrólise ácida, alcalina ou enzimática de matérias proteicas de origem animal ou vegetal e incluem aminoácidos, peptídeos e polipeptídeos. • As peptonas são hidrossolúveis e não coaguláveis pelo calor o que permite que os meios de cultura sejam esterilizados no autoclave. Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura Fonte de enxofre e de fósforo • O enxofre faz parte de alguns aminoácidos e por isso é um componente das proteínas. As suas fontes incluem compostos orgânicos como os aminoácidos sulfurados, compostos inorgânicos como os sulfatos, e ainda o enxofre elementar. • O fósforo é necessário para a formação dos ácidos nucleicos e para a síntese dos compostos orgânicos de alta energia - adenosina trifosfato (ATP). O fósforo é fornecido na forma de sais de fosfato para ser usado por todas as células microbianas. Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura Elementos metálicos • A maior parte das células necessita de alguns iões metálicos como cálcio, potássio, magnésio, ferro, manganésio, zinco, cobre, molibdénio, níquel, cobalto e sódio para as suas várias actividades celulares. Estes iões são necessários em quantidades ínfimas (micronutrientes), sendo usados como cofactores e activadores de enzimas. Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura Factores de Crescimento: • São substâncias essenciais para o metabolismo bacteriano, pois são componentes celulares ou precursores desses componentes que não podem ser sintetizados pelos microrganismos (aminoácidos, purinas, pirimidinas e vitaminas). Os microrganismos que não conseguem sintetizar esses componentes dentro da célula necessitam de uma fonte externa. • As vitaminas são substâncias orgânicas que contribuem para o crescimento celular e são essenciais, em pequenas concentrações, para as atividades celulares. São também fontes de coenzimas que são necessárias para a formação de sistemas enzimáticos ativos. • São factores de crescimento o sangue (factores x e v e soro), aminoácidos, extrato de leveduras, líquido ascítico, etc. A ação de algumas destas substâncias reside na sua capacidade de adsorver substâncias tóxicas do meio exterior. Caracterização dos Microrganismos Composição dos meios de cultura Substâncias Inibidoras Incluem corantes, antibacterianos, sais biliares, NaCl, alteração do pH, etc. Indicadores de pH • Indicam se o microrganismo é ou não capaz de utilizar o substrato alterando o pH e originando mudanças de cor do meio de cultura. Substâncias solidificantes (inertes) • São aquelas que conferem consistência ao meio. Utilizam-se o Agar ou gelose, a gelatina e o gel de sílica. Caracterização dos Microrganismos Condições de incubação dos meios de cultura • Para que haja crescimento microbiano é necessário que um meio de cultura forneça nutrientes, mas também é preciso que forneça um ambiente físico adequado a cada microrganismo. • A temperatura, o pH e a atmosfera gasosa são três dos mais importantes fatores físicos que influenciam o crescimento e sobrevivência dos microrganismos. Caracterização dos Microrganismos Composição Química do Meio de Cultura • Quimicamente definidos ou sintéticos • São constituídos por quantidades conhecidas de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas quimicamente puras e bem definidas, ou seja, a sua composição química é conhecida. • Estes meios são, geralmente, usados na cultura de microrganismos autotróficos, como as algas, ou de microrganismos heterotróficos pouco exigentes. • Podem ser usados para determinar as necessidades nutricionais precisas de um microrganismo. Adicionando ou retirando um constituinte a este tipo de meios permite verificar se esse constituinte é essencial ou não para o crescimento de um determinado microrganismo. Caracterização dos Microrganismos Composição Química do Meio de Cultura Quimicamente complexos ou artificiais • Resultam da adição de substâncias naturais de composição química mal definida a um meio sintético, ou seja, a composição química exata não se conhece. • São usados para simular e até melhorar o ambiente natural dos microrganismos a ser estudados. São usados por rotina na cultura de microrganismos • São compostos por um número limitado de substâncias complexas, extrato de plantas ou animais, cujas composições químicas exatas não são conhecidas: extratos de carne, peptonas (proteínas parcialmente degradadas por enzimas como os hidrolisados de caseína do leite e os hidrolisados de proteínas de soja), extrato de leveduras, sangue, soro, leite, extrato de solo, etc. Todos estes produtos adicionados ao meio de cultura estimulam a crescimento da maior parte dos microrganismos heterotróficos. • Caracterização dos Microrganismos Estado Físico do Meio de Cultura • Líquidos ou caldos • São aqueles que não têm agente solidificante. Não permitem distinguir os diferentes tipos de microrganismos pelo aspecto morfológico porque não há formação de colônias organizadas. • São usados para o estudo da morfologia bacteriana, para aumentar o número de microrganismos e para várias provas bioquímicas (ex. provas fermentativas). Caracterização dos Microrganismos Estado Físico do Meio de Cultura • • Sólidos Obtêm-se a partir dos meios de cultura líquidos após adição de uma substância solidificante em determinada quantidade. • Os meios sólidos têm a vantagem de apresentar uma superfície endurecida onde os microrganismos podem crescer, formando colónias. Cada colónia é um aglomerado de células visível macroscopicamente que teve origem a partir da multiplicação de uma só célula e que representa o crescimento de uma só estirpe de microrganismos. • Estes meios permitem observar a morfologia das colónias, isolar culturas puras, conservar e armazenar estirpes bacterianas e observar reacções bioquímicas específicas. • Um meio completamente sólido requer uma concentração de agar entre 1,5 e 2%, enquanto para se obter um meio semi-sólido são necessárias concentrações entre 0,2 e 0,5%. Caracterização dos Microrganismos Estado Físico do Meio de Cultura • Semi-sólidos • Obtêm-se também a partir de meios de cultura líquidos após adição de um agente solidificante em menor proporção que nos meios sólidos. • Estes meios de cultura são usados no estudo da mobilidade activa dos microrganismos. Podem também ser usados em estudos fermentativos e na promoção de crescimento anaeróbio. Caracterização dos Microrganismos Objetivos Funcionais dos Meio de Cultura • Simples ou básicos • São os meios que apenas possuem os nutrientes básicos ou essenciais, por isso só crescem microrganismos pouco exigentes que tenham grande capacidade de síntese. • Como são meios pobres em nutrientes são insuficientes para suportar o crescimento de microrganismos mais exigentes. – Exemplos: » Água Peptonada: contém água, peptonas e cloreto de sódio. Caracterização dos Microrganismos Objetivos Funcionais dos Meio de Cultura • Ricos ou enriquecidos • • • A partir dos meios básicos, por adição de outros nutrientes, produzem-se todo o tipo de meios complexos e ricos. Estes meios são usados para a cultura de microrganismos exigentes que têm necessidades nutricionais altamente elaboradas e específicas. Estes microrganismos não crescem ou crescem com dificuldade em meios básicos e por isso requerem a adição de fatores de crescimento (são substâncias essenciais para o seu metabolismo, mas que eles não são capazes de sintetizar). Nestes meios pode haver também capacidade de adsorção de substâncias tóxicas. Estes meios permitem o crescimento generalizado de todos os microrganismos da amostra. Assim, utilizam-se quando se quer quantificar os microrganismos de uma amostra ou se pretende fazer crescer todos os microrganismos que existam num produto que em princípio deveria estar estéril (ex. sangue), já que qualquer crescimento é sinal de patogenicidade. Um meio rico contém uma grande variedade de substâncias orgânicas como: extratos de carne, extrato de levedura, sangue, soro, líquido ascítico, infusão de coração e cérebro, etc. Caracterização dos Microrganismos Objetivos Funcionais dos Meio de Cultura • Ricos ou enriquecidos • • Exemplos: Agar Sangue: é composto por 5 a 10% de sangue desfibrinado, animal ou humano, o que vai enriquecer o meio em nutrientes. O sangue só é adicionado ao meio liquefeito quando a temperatura se encontra entre 45-48º C, para que os glóbulos vermelhos fiquem intactos. • Agar Chocolate: é também composto por sangue, mas este é adicionado ao meio quando a sua temperatura é de 80º C. É utilizado para o crescimento de microrganismos exigentes como os do género Neisseria. • Brain-Heart infusion: é um meio muito rico que contém infusão de cérebro e coração de vitela. É utilizado para microrganismos exigentes como os do género Streptococcus e Neisseria. Caracterização dos Microrganismos Agar Sangue Agar Chocolate Agar Brain-Heart infusion Caracterização dos Microrganismos Objetivos Funcionais dos Meio de Cultura • Seletivos (sólidos) ou de enriquecimento (líquidos) • Além dos nutrientes necessários para o crescimento de todos os microrganismos, estes meios específicos contêm um ou mais compostos químicos que são essenciais devido à sua especificidade funcional. • Estes meios são usados para isolar grupos específicos de microrganismos, pois selecionam um determinado microrganismo de um produto polimicrobiano (expectoração, fezes, saliva, etc.). • No entanto, é preciso ter em conta que não há meios de cultura 100% seletivo, podendo crescer eventualmente outros microrganismos. Caracterização dos Microrganismos Objetivos Funcionais dos Meio de Cultura • Seletivos (sólidos) ou de enriquecimento (líquidos) • • • • São meios que permitem o crescimento de um tipo de microrganismos em detrimento de outro ou de outros, pois são formulados para suprimir o crescimento dos microrganismos que não interessam ao fim em vista, permitindo o crescimento dos microrganismos que se desejam isolar. Assim, o favorecimento de um tipo de microrganismo pode dever-se a uma ação inibidora sobre os restantes (condiciona o crescimento de uns) ou à ação estimuladora do microrganismo pretendido (mais raro) ou ambas, ou seja, inibe o crescimento de um tipo de microrganismos enquanto aumenta o crescimento de outro. Os meios líquidos com inibidores do crescimento microbiano não permitem uma seleção tão precisa como nos meios sólidos, há é um enriquecimento do conteúdo microbiano do meio. Estes caldos estimulam o crescimento de um microrganismo específico, que se torna assim a espécie dominante porque se sobrepõe aos seus competidores. Permitem aumentar a concentração de microrganismos que estão em minoria no ambiente. Os agentes de seleção podem ser produtos químicos, corantes (eosina, verde de malaquita, azul de metileno, violeta cristal, verde brilhante, etc.), antimicrobianos, sais minerais (tetrationato de sódio, nitrato de potássio, telurito de potássio, cloreto de sódio, etc.), sais biliares, asparagina (promove o crescimento), etc. Caracterização dos Microrganismos Objetivos Funcionais dos Meio de Cultura • Seletivos (sólidos) ou de enriquecimento (líquidos) • Exemplos: • Agar Sabouraud: favorece o crescimento dos fungos, pois tem um pH baixo (5,6) e uma alta concentração de glicose, além disso o crescimento bacteriano está inibido devido à presença de um antibacteriano no meio. • Caldo Verde Brilhante: condiciona o crescimento de cocos Gram positivo e favorece o crescimento de bacilos Gram negativo, principalmente da família Enterobacteriaceae devido à presença de sais biliares e do corante verde brilhante. • Caldo de Tetrationato e Caldo de Selenito: o tetrationato e o selenito de sódio são substâncias inibidoras de bactérias intestinais e de muitos cocos Gram positivo. Estes meios são utilizados no isolamento de Salmonella e de Shigella a partir de produtos (água, alimentos, fezes, urina, etc.) onde a concentração destes patogénicos é baixa em relação ao resto da população normal. Caracterização dos Microrganismos Agar Sabouraud Caracterização dos Microrganismos Objetivos Funcionais dos Meio de Cultura Seletivos (sólidos) ou de enriquecimento (líquidos) Diferenciais • Estes meios permitem separar grupos de microrganismos através da sua aparência no meio (características morfológicas ou bioquímicas). • Têm incorporado substâncias químicas (indicadores) que, após a inoculação e a incubação, assinalam alterações características na aparência do crescimento microbiano (colônias) e/ou no meio que rodeia as colônias (geralmente por mudança de cor do meio onde existe a colônia) o que permite a sua diferenciação e identificação. Dão informação acerca do comportamento e do metabolismo dos microrganismos, permitindo a visualização de atividades metabólicas. • Um meio com um hidrato de carbono e um indicador de pH permite detectar se o açúcar foi ou não metabolizado, pois este quando fermentado origina como produtos terminais ácidos orgânicos que fazem diminuir o pH e por isso mudam a cor do meio assinalando as características fermentativas do microrganismo em estudo. Caracterização dos Microrganismos • • Exemplos: Meio de Simmons: o citrato é neste meio a única fonte de carbono, assim se houver crescimento microbiano significa que o citrato está a ser metabolizado. Isto origina uma variação de pH (aumento de pH) que é detectada pelo azul de bromotimol que passa de verde a azul. • Agar Sangue: este meio com glóbulos vermelhos intactos fornece informação acerca da capacidade hemolítica dos microrganismos. Distingue as bactérias não hemolíticas (gama-hemólise) das bactérias alfahemolíticas (hemólise parcial) e das bactérias beta-hemolíticas (hemólise total). • Agar Cled (Cystine Lactose Electrolyte Deficient Media): é um meio diferencial, pois como contém lactose e um indicador de pH (azul de bromotimol) permite detectar se o açúcar foi ou não metabolizado. É usado para cocos Gram positivo e para bacilos Gram negativo, e permite travar o crescimento em toalha dos Proteus. Caracterização dos Microrganismos Objetivos Funcionais dos Meio de Cultura Seletivos (sólidos) ou de enriquecimento (líquidos) • • • Simultaneamente seletivos e diferenciais Exemplos: Agar SS: a presença de sais biliares e do corante verde brilhante tornam-no um meio seletivo, pois inibem muitas bactérias Gram positivo. É bom para o isolamento de Salmonella e Shigella. É um meio diferencial devido à presença de lactose e de um indicador de pH (vermelho neutro) que permite distinguir os microrganismos fermentadores da lactose (colônias rosa) dos não fermentadores (colônias da cor do meio). • Agar EMB (Eosine Methylene Blue) ou Meio de Levine: é um meio seletivo, pois é parcialmente inibidor para microrganismos Gram positivo devido ao azul de metileno, e por conseguinte o crescimento dos Gram negativo é mais abundante. É um meio diferencial, pois a presença de lactose e do corante eosina permite diferenciar as bactérias fermentadoras das não fermentadoras da lactose. Os microrganismos fermentadores da lactose levam à baixa de pH, de modo que as colônias aparecem com aspecto verde metalizado. Os que não fermentam a lactose produzem colônias incolores, mas devido à sua transparência aparecem com a cor do meio, ou seja, púrpura. Este meio permite identificar os Gram negativo patogênicos através da caracterização visual, porque eles raramente fermentam a lactose. • • Caracterização dos Microrganismos Objetivos Funcionais dos Meio de Cultura Seletivos (sólidos) ou de enriquecimento (líquidos) • • • • • Simultaneamente selectivos e diferenciais Exemplos: Agar MacConkey: é um meio seletivo, pois contém sais biliares e o corante violeta de cristal para inibir o crescimento de bactérias Gram positivo permitindo que as Gram negativo cresçam. Por outro lado, é um meio diferencial, pois como contém lactose e um indicador de pH (vermelho neutro) permite distinguir entre as bactérias Gram negativo que fermentam (ex. E.coli) e as que não fermentam (ex. Salmonella e Shigella) esse hidrato de carbono. As colônias das bactérias fermentadoras de lactose aparecem rosadas enquanto as outras ficam incolores e até transparentes. Agar Manitol Sal: é um meio seletivo pois, como tem uma grande concentração salina (7,5% NaCl) inibe a maior parte dos microrganismos permitindo o crescimento das bactérias da família Micrococcaceae (cocos Gram positivo). É um meio diferencial, pois tem presente o álcool manitol e um indicador de pH (vermelho de fenol) que passa de vermelho a amarelo se o microrganismo fermentar o manitol. Caracterização dos Microrganismos Meios de transporte • São meios estáveis que não permitem que os microrganismos se desenvolvam, mas mantendo a viabilidade de todos os microrganismos da amostra sem alterarem as suas concentrações. • São usados para armazenamento temporário de amostras para serem transportadas para o laboratório, nas mesmas condições em que se encontravam no momento da colheita. Meios de manutenção • Permitem manter as culturas durante algum tempo, pois os microrganismos vão crescendo, mas lentamente. Caracterização dos Microrganismos CULTURA DE MICRORGANISMOS • Conhecer procedimentos para a cultura de microrganismos. • Compreender a importância das técnicas assépticas na cultura de microrganismos. • Conhecer princípios e procedimentos das diversas técnicas de semeadura em placa. • Executar semeaduras em diferentes meios de cultura em placa para isolamento de colônias a partir de produtos polimicrobianos. Caracterização dos Microrganismos • Semear :é a designação microbiológica para a introdução, de um inoculo de origem biológica ou cultural num meio de cultura adequado. • Os instrumentos usados para a execução da semeadura (inoculação)são: - alças simples ou calibradas. - fio reto - pipeta Pasteur - Alça de Drigalsky - zaragatoa - outros Caracterização dos Microrganismos • • • • • Os meios de cultura sólidos podem ser distribuídos de forma variada de acordo com o que se pretende: em balões tipo Erlermeyer ou outros, tubos em rampa, em cilindro e em placas de Petri. Os meios de cultura líquidos (caldos) são habitualmente distribuídos em balões ou tubos. A passagem de bactérias de um meio de cultura para outro é chamada repicagem. Técnicas de semeadura (Inoculação • Meios sólidos: - Em picada - Em estria - Esgotamento. - Em toalha - “Shake.” • • Meios líquidos: - Dispersão. Caracterização dos Microrganismos CONTAGEM EM SUPERFÍCIE CONTAGEM EM POUR PLATE Caracterização dos Microrganismos Contagem em superfície • Plaqueamento de um volume de cultivo diluído (não exceder 0,1ml); • Alça de Drigalski (alça de vidro); • Incubação e contagem das colônias; • Superfície de meio de cultura seca; Caracterização dos Microrganismos Contagem em pour plate • Adiciona volume conhecido da cultura (0,1- 1ml) em placa de Petri estéril; • Adição meio com ágar fundido; • Mistura- movimentos suaves da placa sobre a superfície da mesa; • Organismo deve suportar a temperatura de 45oC do ágar fundido; Caracterização dos Microrganismos Observação do crescimento bacteriano • Em meios sólidos: • • O crescimento traduz-se pelo aparecimento de colônias, isto é, aglomerados de células resultantes da multiplicação bacteriana a partir de um único ancestral. Nessas colônias devem ser averiguadas as seguintes características, principalmente quando observadas em placas de Petri: - tamanho – ponta de alfinete, pequeno, médio e grande. - cor/pigmentação – diversificadas. - forma - circular, irregular, rizóide e em toalha. - textura – lisa, rugosa e mucóide. - brilho – opacas e brilhantes. - elevação - sem relevo (achatadas), com ligeiro relevo, relevo marcado, convexo e mamilonadas. - margens – inteiras, lobadas, onduladas, serradas e filamentosas. Caracterização dos Microrganismos Observação do crescimento bacteriano Em meios líquidos O crescimento nos caldos pode ser apreciado por: - turvação - fina, uniforme, floculenta. - sedimento. - película ou anel (crescimento à superfície) Caracterização dos Microrganismos • O crescimento das populações mede-se estimando as mudanças: 1) No número de células; 2) Na quantidade de algum composto das mesmas (ex: proteína); 3) Peso total seco das células; Existem vários métodos de contar o número de células ou de determinar a massa celular, adequados para diferentes organismos e diferentes situações. Caracterização dos Microrganismos Contagem de células viáveis • Célula viável: “aquela que é capaz de dividir-se e dar origem a uma descendência”. • Célula viável- Multiplicar repetidas vezes e originar uma colônia visível a olho nu. • Determinação de células viáveis- contagem do número de células da amostra que é capaz de formar colônias sobre um meio sólido adequado. • Contagem em placa- método indireto o Contagem em superfície o Contagem em pour plate Caracterização dos Microrganismos Outros métodos de contagem Contagem direta- “câmaras de contagem” O número de bactérias é determinado em um volume fixo de cultura, usando câmaras com áreas delimitadas. Ex: Câmara de Newbauer Caracterização dos Microrganismos Outros métodos de contagem Contagem direta- “câmaras de contagem” •Método rápido para conhecer número de células; oDesvantagens: o Não distingue células vivas das mortas; o Células pequenas difíceis de visualizar no microscópio; o Método não adequado para baixas suspensões celulares (< 106);
