TÍTULO: ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIVIRULÊNCIA DO ÁCIDO

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TÍTULO: ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIVIRULÊNCIA DO ÁCIDO ENT - CAURENÓICO ISOLADO DA
COPAIFERA OBLONGIFOLIA FRENTE AS CEPAS MULTIRRESISTENTES
CATEGORIA: CONCLUÍDO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA
AUTOR(ES): ANA LUIZA CAETANO GOMES
ORIENTADOR(ES): CARLOS HENRIQUE GOMES MARTINS
COLABORADOR(ES): JAIRO KENUPP BASTOS, LUÍS FERNANDO LEANDRO, RODRIGO CASSIO
SOLA VENEZIANI, SERGIO RICARDO AMBROSIO, THAÍS DA SILVA MORAES
1. Resumo
As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas multirresistentes são um problema mundial de
saúde, a incidência destes isolados no Brasil e no mundo aumentam a cada ano tanto no âmbito
hospitalar como no comunitário. Staphylococcus aureus é um patógeno onipresente, associado
com inúmeras doenças humanas e de animais. A capacidade de patogenidade de S.aureus são
conseqüências de seus fatores de virulência. Virulência é a soma de características que dão aos
agentes infecciosos uma vantagem na batalha com seus hospedeiros, essa virulência
compreende duas características: sua infectividade isto é, a capacidade de iniciar uma infecção e
a gravidade da condição produzida. S. aureus produz diversas enzimas como catalase e
coagulase, dentre outras. Os vegetais representam as maiores fontes de substâncias ativas que
podem ser usadas na terapêutica, devido à grande diversidade estrutural de metabólitos
produzidos. Os óleos-resina das espécies de copaifera vêm sendo utilizado na medicina popular
como tratamento de várias doenças, como antimicrobiano, anticancerígeno, antitumoral, entre
outras, entretanto, todas estas atividades encontradas nos óleos-resina estão relacionadas aos
seus metabolitos secundários, constituídos de uma mistura de diterpenos e sesquiterpenos. Os
microrganismos com melhores chances são aqueles que apresentam as melhores estratégias de
sobrevivência ou fatores de virulência, estes fatores são componentes estruturais ou produtos das
bactérias que possibilitam ao microrganismo causar danos ao hospedeiro de alguma maneira, o
S. aureus produz diversas enzimas como catalase, coagulase dentre outras, como fator de
virulência. O objetivo desse estudo foi a avaliação da atividade antivirulência do ácido entcaurenóico isolado da Copaifera oblongifolia frente as cepas multirresistentes de S. aureus. Os
resultados revelaram que o ácido ent-caurenóico, não apresentou atividade sobre os fatores de
virulência nos testes catalase e coagulase. Portanto o diterpeno não impedeu a atividade
fenotípica de virulência das cepas pesquisadas.
2. Introdução
Diversos casos de infecções tem chamado atenção por um perfil de sensibilidade
reduzido para diferentes antimicrobianos, revelando frequentemente a dificuldade no
tratamento dos pacientes (Fridkin, 2001).
Neste sentido, os produtos naturais podem ser considerados uma estratégia importante
para este problema, eles representam uma rica e promissora fonte para a descoberta de
compostos biologicamente ativos (Newman, 2008; Newman e Cragg, 2012).
Os vegetais representam uma das maiores fontes de substâncias ativas que podem ser
usadas na terapêutica, devido à grande diversidade estrutural de metabólitos produzidos
(Balunas e Kinghorn, 2005; Cragg e Newman, 2013).
Atualmente vários estudos com espécies de copaifera estão relacionados aos seus
compostos bioativos, entre eles, a classe dos diterpenos, que se mostram promissores no
combate aos microrganismos causadores de doenças que afetam de modo geral os seres
humanos (Porto et al., 2009; Souza et al. 2011a; Fonseca et al., 2013).
Na literatura podemos encontrar alguns trabalhos relacionados à atividade antimicrobiana
dos diterpenos isolados de espécies de copaifera (Tincusi et al., 2002; Souza et al., 2011b;
Abrão et al.,2015), como também outras atividades como anti-inflamátoria (Paiva et al.,
2002), relaxante muscular (Cunha et al., 2003),), antitumoral (Ohsaki et al., 1994), dentre
outras atividades. Frente aos aspectos analisados, verifica-se a importância de investigar os
diterpenos isolados de espécies de copaiferas como alternativas terapêuticas no combate à
bactérias multirresistentes.
Virulência é a soma de características que dão aos agentes infecciosos uma vantagem
na batalha com seus hospedeiros, essa virulência compreende duas características: sua
infectividade isto é, a capacidade de iniciar uma infecção e a gravidade da condição
produzida. (Koneman et al., 2008). Staphylococcus aureus produz diversas enzimas como
catalase e coagulase, dentre outras.
S. aureus é um importante patógeno devido à sua virulência, resistência aos
antimicrobianos e associação a várias doenças, incluindo enfermidades sistêmicas
potencialmente fatais, infecções cutâneas, infecções oportunistas e intoxicação alimentar
(Xavier et al, 2007). Sua patogenicidade está diretamente ligada à capacidade que estas
bactérias possuem de produzir determinados fatores que irão promover e facilitar a adesão,
penetração e sobrevivência da bactéria no organismo hospedeiro (Liu, 2009). Entre este
fatores estão as enzimas catalase e coagulase, dentre outras (Nostro et al. 2001a).
3. Objetivo
Estudo da atividade antivirulência do ácido ent-caurenóico isolado da Copaifera
oblongifolia frente as cepas multirresistentes.
4. Metodologia
O ácido ent-caurenóico avaliado neste estudo foi fornecido pelo Prof. Dr. Sérgio
Ricardo Ambrósio, pesquisador e coordenador do Curso de Pós-Graduação em Ciências da
Universidade de Franca e vice-coordenador do projeto temático intitulado “Validação
química e farmacológica de extratos e princípios ativos de espécies de copaifera” (processo
nº 2011/13630-7). O diterpeno ácido ent-caurenóico utilizado e a respectiva espécie de
Copaifera, foi isolado da C.oblongifolia.
As bactérias multirresistentes utilizadas no estudo são provenientes da “American
Type Culture Collection” (ATCC), S. aureus (ATCC 9393), S. aureus (ATCC 43300),
S.aureus (BAA 44), S.aureus (ATCC 25923) e S.pneumoniae (ATCC). Os clones
epidêmicos de S. aureus (USA 400, USA 800 e USA 100) utilizados, foram gentilmente
cedidos pela Profª Drª Agnes Marie Sá Figueiredo da Universidade Federal do Rio de
Janeiro. Todas as bactérias estão mantidas na coleção de cultura do LaPeMA/UNIFRAN,
sob criopreservação à – 80oC.
5. Desenvolvimento
Em tubos contendo o ácido ent-caurenóico na concentração sub-CIM, juntamente com
os inóculos de cada bactéria testada na concentração final de 5 x 10 5 UFC/ mL (CLSI,
2012), foram avaliados a atividade antivirulência (catalase e coagulase). Os tubos foram
incubados à 37°C por 24 horas em estufa bacteriológica.Este procedimento foi realizado
para os dois ensaios (catalase e coagulase).
Para ensaio da catalase, após 24 horas de incubação dos tubos (S. aureus + ácido
ent-caurenóico), com o auxílio de uma alça bacteriológica, foram retiradas alíquotas de 50
µL do cultivo. Estas alíquotas foram colocadas em lâminas limpas contendo 50 µL de
peróxido de hidrogênio a 3%. O controle de qualidade foi realizado utilizando as cepas S.
aureus (ATCC 25923) catalase positivo e S. pneumoniae (ATCC 6305) catalase negativo.
Os resultados da atividade do diterpeno sobre a enzima catalase foram avaliados mediante
a formação ou não de bolhas de gás ou efervescência, resultantes da dissociação do
peróxido de hidrogênio em água e oxigênio (Koneman et al., 2008, Becker e Von Eiff, 2011).
Para o ensaio da coagulase, após o período de incubação dos tubos, a produção da
coagulase livre foi verificada pela adição de 0,5 mL da cultura (S. aureus + ácido entcaurenóico) em tubos de vidro estéreis contendo 0,5 mL de plasma de coelho com EDTA
incubados a 37ºC em banho-maria durante 24 horas. As leituras foram realizadas a cada
hora, durante 4-5 horas iniciais, para verificação da formação do coágulo. Não sendo
possível a visualização do coágulo neste período de tempo, as amostras foram deixadas em
banho-maria até completar 24 horas. Os resultados foram avaliados com presença ou
ausência de coágulo. O controle de qualidade foi realizado utilizando as cepas S. aureus
(ATCC 25923) coagulase positivo e S. epidermidis (ATCC 12228) coagulase negativo
(Koneman et al., 2008, Becker e Von Eiff, 2011).
6. Resultados
Utilizando uma concentração Sub-CIM (6,25 μg/mL) frente a estas bactérias, o ácido entcaurenóico não foi capaz de inibir os fatores de virulência catalase e coagulase produzidos
pelas cepas do S. aureus, quando comparamos com os controles (cepas padrão). Estes
resultados estão apresentados na tabela 1.
Tabela 1. Resultados da antivirulência do diterpeno (ácido ent-caurenóico) frente às cepas
multirresistentes de S. aureus
Coagulase Catalase
Bactérias
C
T
C
T
S. aureus (ATCC 43300)
+
+
+
+
S. aureus (ATCC 9393)
+
+
+
+
S. aureus USA 400
+
+
+
+
S. aureus USA 800
+
+
+
+
S. aureus USA 100
+
+
+
+
S. aureus BAA 44
+
+
+
+
*S. aureus (ATCC 25923)
+
+
*S. pneumoniae (ATCC 6305)
•
‒
*S. epidermidis (ATCC 12228)
‒
•
* Cepas controle; Controle (C - Inóculo sem adição do ácido ent-caurenóico - 6.25 μg/mL); Teste (TInóculo com adição do ácido ent-caurenóico - 6.25 μg/mL); + Resultados positivos; ‒ Resultados
negativos, • Não realizado.
Estudos têm demonstrado que em concentrações sub-inibitórias, extratos e compostos
isolados de plantas embora não causam a morte de bactérias, são capazes de inibir e
reduzir a produção de alguns fatores essenciais tais como, catalase e coagulase, para
bactérias patogênicas (Qiu et al 2011; Raja et al, 2011; Chaieb et al, 2011; Schito et al,
2011; Qiu et al, 2010; Xiang et al, 2010).
Nostro et al. (2001a) avaliaram a atividade do extrato Helichrysum italicum sobre o
crescimento do S. aureus e a influência das sub-CIMs em alguns enzimas consideradas
como fatores de virulência. Os resultados indicaram que o extrato possui um efeito inibidor
sobre cepas de S. aureus reduzindo tanto o seu crescimento como algumas enzimas, entre
elas, a coagulase, DNAse e lipase. Segundo os autores o extrato de H. italicum poderia ser
um novo agente antimicrobiano, menos tóxico para pele e tecidos humanos, merecedor de
estudos posteriores. Nossos estudos não foram capazes de corroborar com estes autores.
7. Considerações finais
Os resultados revelaram que o ácido ent-caurenóico, não apresentou atividade sobre os
fatores de virulência de catalase e coagulase. Portanto, o diterpeno não impedeu a atividade de
virulência das cepas pesquisadas.
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