Slides de testes tumorais de câncer de ovário

Teste do tumor para identificar
mutações somáticas
© AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE.
Data de preparo: Fevereiro de 2015; Data de validade : Fevereiro 2016. 660,329.011.
Conteúdo
Teste do tumor: Uma introdução
Mutações BRCA somáticas no câncer de ovário
Teste de mutação BRCA no tumor na prática
Teste do tumor: O futuro
Resumo
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Teste do Tumor: Uma introdução
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Teste do Tumor: Uma introdução
Introdução ao teste do tumor para identificar
mutações somáticas no câncer de ovário
Mutações em diversos genes vêm sendo relacionadas com câncer de ovário
Mutações podem ser herdadas (germinativas) ou podem ocorrer de novo no tecido
ovariano (somáticas)
A compreensão de como a base molecular do câncer de ovário, mutações germinativas e
somáticas, pode auxiliar nas decisões de tratamento
Romero I, Bast RC. Endocrinology 2012;153:1593–602.
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Teste do Tumor: Uma introdução
Mutações Germinativas
Uma mutação germinativa pode ser
passada adiante para a próxima geração1
Em oncologia, mutações germinativas
contribuem para a probabilidade de
desenvolvimento de determinados tipos de
câncer e desempenham um papel
significante na resposta à quimioterapia2
Mutação germinativa
presente em todas as
células
Mutação no
óvulo ou
espermatozoide
Todas as células afetadas
nos filhos
1. National Cancer Institute. http://w ww.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/cancergenomics.
2. Filipski KK, et al. Front Genet 2014;5:73.
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Teste do Tumor: Uma introdução
Mutações Somáticas
Uma mutação somática não pode ser herdada, e não
ocorre em células reprodutivas1,2
– Apesar de um indivíduo com uma mutação
germinativa também poder desenvolver uma
mutação somática
– Mutações somáticas fornecem indicações sobre
a biologia subjacente do câncer
– Descobertas sobre mutações somáticas elucidam
as alterações genéticas primárias impulsionando a
tumorogênese e fornecem novos alvos moleculares
para medicamentos
Análise de DNA do tumor está crescentemente sendo
utilizada, permitindo tratamento com direcionamento
molecular2
– Novos medicamentos estão sendo desenvolvidos
para alvos moleculares definidos, por exemplo,
crizotinibe em câncer de pulmão de não pequena
célula positivo para quinase de linfoma anaplásico
1. National Cancer Institute. http://w ww.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/cancergenomics.
2. Filipski KK, et al. Front Genet 2014;5:73.
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Não
herdadas
Mutação somática
(ex. mama)
Mutações BRCA somáticas
no câncer de ovário
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Mutações BRCA somáticas no câncer de ovário
Introdução ao BRCA
Proteína
Proteína
BRCA1 e BRCA2 são genes supressores de tumor1,2
BRCA1
BRCA2
– Proteínas BRCA funcionais regulam o crescimento celular e
previnem a divisão celular anormal que poderia levar ao
desenvolvimento do tumor
– Proteínas BRCA são expressas em muitos tecidos diferentes e atingem o nível mais
alto de expressão durante a fase S, indicativo do seu papel no reparo DSB do DNA
Tumourigênese em portadoras de mutação BRCA1 / 2 germinativa (herdada) segue uma
hipótese de dois acertos3
– Primeiro ‘acerto’ sendo devido a uma mutação herdada de um alelo BRCA
– Segundo ‘acerto’ devido à inativação do segundo alelo tipo selvagem
Tipos principais de mutações
– Mutação em ponto: Pares de base de DNA ‘substituídos’ alteram a estrutura /função
da proteína ou expressão gênica4
– Mutações de desvio de estrutura ou inserção / deleção que alteram a estrutura de leitura4
– Grandes rearranjos: Seções de DNA que são transferidas para uma nova posição no
genoma, completamente deletadas ou novas seções são inseridas, todas as quais
podem alterar a expressão e afetar a função das proteínas resultantes5
– Todos estes tipos de mutações são encontrados em BRCA1 / 26
DSB, ruptura de dupla fita.
1. Gudmundsdottir K, et al. Oncogene 2006;25:5864–74; 2. Venkitaraman AR. J Cell Sci 2001;114:3591–8; 3. Esteller M, et al. Hum Mol Genet 2001;10:3001–7;
4. Clancy S. Nature Education 2008;1:187; 5. Edw ards PA. J Pathol 2010;220:244–54; 6. Larsson N, et al. EMQN Guidelines 2007; MRC-Holland b.v.
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Mutações BRCA somáticas no câncer de ovário
Mutações somáticas são responsáveis por uma porção
significante de aberrações gerais em BRCA1 / 2
Em uma análise de 28 cânceres de ovário com
mutações BRCA1 / 2, ~40% foram
consideradas como sendo mutações
somáticas
Uma mutação BRCA foi determinada como
sendo somática se nenhuma mutação BRCA1
/ 2 pudesse ser encontrada no DNA
germinativo
Ambas as mutações, germinativas e
somáticas, podem ser encontradas no tumor
Teste de tumor
Tumor BRCA1 /
2 inclui mutações
germinativas e
somáticas
(n=17)
N=28
Hennessy BT, et al. J Clin Oncol 2010;28:3570–6.
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Somente
BRCA1
somática
(n=9)
Somente
BRCA2
somática
(n=2)
Mutações BRCA somáticas no câncer de ovário
Mutações BRCA1 / 2 somáticas e germinativas
conferem impacto positivo similar na sobrevida geral e
resposta à platina
Presença de mutações BRCA1 e BRCA2 no tecido de câncer de ovário foram associadas com
PFS significantemente melhorada após quimioterapia a base de platina em comparação com
câncer tipo selvagem para BRCA1 / BRCA2 em uma análise univariada (p=0,032; HR=0,65; IC
95%: 0,44–0,98)
A comparação de pacientes que foram positivos para uma mutação BRCA somática versus
germinativa não demonstrou diferença na PFS (p=0,69)
Perda de função BRCA devido a aberrações somáticas frequentes em câncer de ovário
provavelmente desregula recombinação homóloga e assim aumenta a sensibilidade a
medicamentos de platina
– Consistente com estudos prévios de mutações BRCA1 / 2 germinativas
PFS, sobrevida livre de progressão.
Hennessy BT, et al. J Clin Oncol 2010;28:3570–6.
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Teste de mutação BRCA
do tumor na prática
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Teste de mutação BRCA no tumor na prática
Teste de mutação somática e germinativa: Amostragem
Se uma paciente for referida para teste de tumor e uma mutação (ou mutações) for
identificada, uma amostra de sangue precisa ser avaliada para determinar se a paciente
apresenta uma mutação germinativa herdada
Tumor
(germinativa e somática)
Germinativa
FFPE
Amostra de sangue
Congelamento rápido
Swab (amostra) da boca
FFPE, embebido em parafina e fixado em formalina.
Comunicação pessoal da Dr Emma How e, Genomic Diagnostics Laboratory, St Mary’s Hospital, Manchester, UK.
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Teste de mutação BRCA no tumor na prática
Desafios para o teste de tumor
Teste de tumor de rotina atualmente enfrenta desafios no preparo da amostra e padronização
das metodologias de teste:
– A rigor, a sensibilidade deve ser limite de detecção de mutação 1
• Amostras do tumor têm células normais presentes
– Amostras FFPE tendem à degradação 2
• Se usar um método a base de PCR, amplicons curtos (<160) devem ser
usados, pois pouca amplificação ocorrerá se o DNA for degradado 1
– Quantidade limitada de DNA extraído de amostra FFPE2
PCR, reação em cadeia de polimerase.
1. Comunicação pessoal de Dr Emma How e Genomic Diagnostics Laboratory, St Mary’s Hospital, Manchester, UK.
2. Bourgon R, et al. Clin Cancer Res 2014;20:2080–91.
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Teste de mutação BRCA no tumor na prática
Análise de rotina de FFPE de tumores de mama e
ovário é viável com NGS
Amostras FFPE de ovário (n=68) e mama (n=30) (seções de 40micron)
Método NGS usado que foi sensível o suficiente para detectar níveis baixos de mutações, multiplicadas
para reduzir a quantidade de DNA necessário e apresenta um desenho de amplicon curto
Variantes BRCA1 / 2 significantes foram identificadas
– Confirmado pela repetição de NGS e validado por sequenciamento de Sanger
87/98 das amostras (89%) (não incluindo replicatas) tiveram uma cobertura de >90% com uma
profundidade mínima de 100x
– Profundidade média da cobertura foi >5000x para amostras com o uso recomendado de DNA
Maioria das amostras fornece uma profundidade média de cobertura de >1000x para as regiões
cobertas por este ensaio
– Importante para análise tumoral, assim variantes de nível baixo podem ser identificadas com
confiança
Mutações BRCA foram detectadas se presentes em >10% da amostra de DNA
– Possibilitou a detecção de mutações de nível baixo comumente encontradas no material tumoral
NGS, sequenciamento de próxima geração.
Ellison G, et al. Curr Oncol 2014;21:e378.
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Teste de mutação BRCA no tumor na prática
Métodos de teste de mutação BRCA no tumor
Poucos laboratórios de serviço BRCA oferecem teste clínico de rotina para triagem de BRCA
tumoral 1–3
Métodos de teste de BRCA germinativo podem precisar ser desenvolvidos novamente para
funcionar em DNA de baixa qualidade de tecido tumoral FFPE4
DNA de amostras tumorais podem ser de qualidade inadequada e baixo rendimento4
NGS é uma tecnologia adequada para análise de material tumoral4
Kits BRCA comercialmente disponíveis desenvolvidos para uso em amostras tumorais
Método
Detalhes
BRCA Mastr Dx para material
congelado de tumor (CE-KIT)1
Fornecedor: Multiplicom
Método NGS apenas para tecido congelado
Fornecedor: QIAGEN
Método NGS para uso em material FFPE
GeneRead DNAseq Targeted Exon
Enrichment Breast Panel (RUO)2
O Human Breast Cancer GeneRead DNAseq Targeted Panel é uma
coleção de ensaios com primer PCR multiplicado para enriquecimento
direcionado das regiões de codificação (exônica) dos 44 genes mais
comumente mutados nas amostras de câncer de mama humano
Ion AmpliSeq™ BRCA1 and
BRCA2 Panel (RUO-IVD)3
Fornecedor: Life Technologies
Método NGS
1. www.multiplicom.com/products; 2. www.qiagen.com; 3. www.lifetechnologies.com; 4. Bourgon R, et al. Clin Cancer Res 2014;20:2080–91.
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Teste de mutação BRCA no tumor na prática
BRCA Mastr™ Dx
Abordagem de amplificação múltipla que fornece cobertura éxon completa de todas as
sequências codificadoras de BRCA1 e BRCA2
Usa amostras de tecido fresco congelado
Compatível com a maioria das plataformas NGS
Testes de validação de BRCAMASTR™ Dx e MID Dx para kits Illumina MiSeq no FFT indicou
alta sensibilidade (≥99,3%), especificidade (≥99,988%) e exatidão (≥99,988%)
http://www.multiplicom.com/products/brca-mastr-dx.
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Teste de mutação BRCA no tumor na prática
GeneRead
O GeneRead DNAseq painéis direcionados possibilita enriquecimento das regiões
codificadoras e junções de éxon/íntron frequentemente mutadas em uma determinada doença
Usando uma abordagem de enriquecimento direcionado PCR múltiplo de alta dimensão,
DNAseq painéis direcionados aumenta a eficiência dos esforços de sequenciamento ao focar
nos genes mais relevantes para uma doença específica
Estes painéis fornecem enriquecimento para possibilitar sequenciamento ultra-profundo e
detecção de mutações de baixa frequência nas amostras FFPE
Adequado para uso em DNA extraído de material FFPE
http://www.sabiosciences.com/manuals/1082872_PP_GeneReadPanelsV2_0514_WW_V5.pdf.
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Teste de mutação BRCA no tumor na prática
Ion AmpliSeq™
Baseada em PCR ultra-alto múltiplo, a tecnologia Ion AmpliSeq™ direciona a conjuntos de
genes de amostras FFPE
– Necessita apenas de pequenas quantidades de input DNA (10 ng)
Ion AmpliSeq™ os painéis de comunidade BRCA1 e BRCA2 são usados para construir
bibliotecas para teste BRCA1 / 2
– Desenvolvido em colaboração com especialistas em ciência molecular no câncer de mama
– Verificado usando amostras que foram previamente triadas usando tecnologia ortogonal
Construir
biblioteca
Preparar
modelo
Correr
sequência
Analisar dados
https://www.lifetechnologies.com/uk/en/home/about-us/news-gallery/press-releases/2013/life-techologies-lauches-two-io-ampliseq.html.
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Anotar
resultados
Teste de mutação BRCA no tumor na prática
Fornecedores do serviço de teste BRCA: Mutações
somáticas
Foundation Medicine oferece um serviço de teste BRCA que é realizado no tecido tumoral
(FFPE ou biópsia com agulha)
FoundationOne
– Usa NGS
– Pode identificar alterações no número de cópias, inserções, deleções e rearranjos
– Resultados de perfis são reportados para o médico e pareados com terapias
direcionadas e/ou estudos clínicos
Foundation Medicine www.foundationone.com/.
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Teste de mutação BRCA no tumor na prática
Futuro dos fornecedores do serviço de teste BRCA:
Mutações somáticas
Myriad estabeleceu um laboratório Tumor BRACAnalysis CDx™ na Europa1
Estudo recente avaliou 131 pacientes previamente não tratados com câncer de ovário em alto
grau2
– O teste Tumor BRACAnalysis CDx identificou 28,3% das mulheres com mutações BRCA1
/ 2 germinativas ou somáticas2
– Em contraste, teste germinativo no sangue identificou apenas as 19,6% das pacientes
com mutações BRCA1 / 2 germinativas2
– Mutações somáticas identificadas pelo teste Tumor BRACAnalysis CDx representa um
aumento de 44% na detecção de mutações BRCA causadoras de câncer em relação ao
teste germinativo2 Médicos prescritores receberam os resultados do teste Tumor BRACAnalysis CDx em
aproximadamente 2 semanas2
1. http://investor.myriad.com/releasedetail.cfm?releaseid=878044 Acessado em 13 Nov 2014.
2. http://investor.myriad.com/releasedetail.cfm?releaseid=873406. Acessado em 13 Nov 2014.
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Teste do tumor: O futuro
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Teste do tumor: O futuro
O futuro do teste de tumor para mutações somáticas
em câncer de ovário
O objetivo final futuro do teste de tumor em câncer de ovário é a disponibilidade do teste para
mutações BRCA1 / 2 somáticas usando tecido FFPE1
– Direcionado por tecnologia NGS
– Métodos a base de kit
– Pode ser inicialmente realizado, pois tem o potencial para detectar mutações germinativas
e somáticas
Outros objetivos incluem:
– Testar pacientes com câncer de ovário seroso de alto grau com deficiência de
recombinação homóloga, incluindo identificação de outras vias de sinalização molecular
como RB, RAS/Raf, Notch e FOXM12
– Desenvolver ensaio para hipermetilação BRCA1 somática, que também inativa
um alelo de BRCA11
– Painel de triagem NGS para incluir outros genes envolvidos no reparo por recombinação
homóloga do dano do DNA, por exemplo, RAD511
Armazenamento de tecido fresco/congelado na biópsia inicial facilitaria o teste somático e
superaria os problemas encontrados com tecido FFPE 1
1. Comunicação pessoal de Dr Emma How e, Genomic Diagnostics Laboratory, St Mary’s Hospital, Manchester, UK.
2. Pothuri B. Ann Oncol 2013;24(Suppl. 8):viii22–viii27.
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Resumo
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Resumo
Resumo
Mutações somáticas que ocorrem de novo nas células no tecido de ovário estão cada vez
mais sendo reconhecidas e relacionadas com câncer de ovário
O teste futuro de rotina de tumor de amostras de tumor de ovário melhoraria os desfechos do
paciente através de terapia adequadamente direcionada
© AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE.
AstraZeneca reconhece, com agradecimentos, as
opiniões de especialistas e diretrizes recebidas de:
Dr Andrew Wallace, Dr Emma Howard e
membros associados do Genomic Diagnostic
Laboratory, Manchester Centre for Genomic
Medicine, Manchester Reino Unido durante o
desenvolvimento desta plataforma educacional
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