INFLUÊNCIA DO CICLO CELULAR DA CÉLULA HOSPEDEIRA NA INTERAÇÃO COM TOXOPLASMA GONDII Campoy RM, Pacheco-Soares C Laboratório de Dinâmica de Compartimentos Celulares: Universidade do Vale do Paraíba- UNIVAP Av. Shishima Hifumi, 2911. CEP: 12.211-300. São José dos Campos – SP – Brasil Email: [email protected], [email protected] Resumo- O ciclo celular influencia o mecanismo celular e conseqüentemente a expressão de proteínas de superfície. O parasita intracelular Toxoplasma gondii, utiliza-se de proteínas da célula hospedeira associada as suas proteínas liberadas durante o processo de invasão. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência do ciclo celular da célula hospedeira na interação do T. gondii, durante as diferentes fases do ciclo celular da célula hospedeira. Inicialmente foi avaliado o comportamento de T. gondii na interação com células L929. A cultura de células foi preparada em placa de 24 poços e incubada com suspensão de parasitas por 24 horas. Após este período de incubação a cultura foi fixada com metanol e corada com Giemsa e analisada ao microscópio. A cultura de células L929 passou por um processo de sincronização do ciclo celular, ocorrendo para isto redução da concentração de soro fetal bovino (SFB)-1,0%. As células sincronizadas apresentaram redução na taxa de infecção, quando comparados ao grupo de células não sincronizadas. Pode-se concluir que o ciclo celular da célula hospedeira interfere no processo de interação com T. gondii, ocasionando redução do número de parasitas aderidos e interiorizados. Palavras-chave: Toxoplasma gondii, ciclo celular, interação célula-parasita Área do Conhecimento: Biologia celular Introdução O Toxoplasma gondii, parasita intracelular obrigatório, pertencente ao Filo Apicomplexa, tem sua distribuição geográfica mundial, com alta prevalência sorológica. A toxoplasmose, doença causada por este parasita, freqüentemente não causa doença clínica. Em caso de ocorrer doença clínica a forma mais grave ocorre em crianças recém-nascidas e pacientes com sistema imune comprometido. (NEVES, 2000). O mecanismo de invasão do parasito em células hospedeiras tem sido objeto de várias pesquisas, pois consiste em um mecanismo muito complexo e também porque estudos “in vitro” mostraram que até hoje todas as células nucleadas, podem ser infectadas pelo Toxoplasma gondii. (SOARES,1998) Quando o parasita invade a célula hospedeira, ele reside dentro de um vacúolo parasitoforo especializado (VP) resistente a acidificação endossomal e fusão lisossomal. Os parasitas neste VP exibem rápida replicação intracelular, redistribuição das organelas da célula hospedeira e citoesqueleto, modulando também a expressão gênica da célula hospedeira (COOPENS; JOINER, 2001). Através de informações obtidas por estudos, o ciclo celular da célula hospedeira parece influenciar no nível de infecção do Toxoplasma gondii (GRIMWOOD et al, 1996). A penetração do Toxoplasma gondii pode ser descrita por duas formas, por invasão, que ocorre através de deslizamento, ou fagocitose, sendo que uma importante diferença deve-se ao fato de a invasão ocorre também em células não fagocíticas, tais como fibroblastos, células endoteliais e epiteliais (SOARES, 1998) Este trabalho tem como objetivo analisar a influência do ciclo celular da célula hospedeira na interação do T. gondii, avaliando a relação do ciclo celular na interação célula-parasita durante as diferentes fases do ciclo celular da célula hospedeira . Metodologia Célula hospedeira: Para a execução do trabalho utilizamos a linhagem celular L929 para os modelos in vitro. Às células foram mantidas em meio MEM (Meio Essencial Minimo), com 5 % de Soro Fetal Bovino (SFB) e 1 % de antibiotico e antimicótico (todos da marca Gibco), e incubadas em atmosfera de 5 % de CO2 a 37 ° C (estufa de CO2 marca Forma Scientific), em garrafas de 2 cultura 25 cm (Corning) . Parasita:Toxoplasma gondii cepa RH, foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Sergio Henrique Seabra (Universidade Estadual da Zona OesteUEZO-RJ). A manutenção do T. gondii, foi feita na cultura celular L929, mantida em meio MEM, XVII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e XII Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba 1 suplementado com 5% de SFB e 1% antibiotico e antimicotico, e incubadas em atmosfera de 5% de CO2 a 37°C. Sincronização celular: para a sincronização da cultura de células L929, utilizou-se meio MEM suplementado com concentração de SFB, 1,0 %, todos contendo 1 % de antibiotico e antimicótico. As culturas foram cultivadas em placa de 24 poços (TPP) e incubadas em atmosfera de 5 % de CO2 a 37 ° C , por período de uma semanas, para após este periodo se iniciar interação célulaparasita. Interação célula-parasita: para interação do parasita com as células L929, foi realizada a contagem dos parasitas e da população celular, observando-se a proporção de 10:1 parasita por célula. Após 48 horas de incubação as células foram fixadas com metanol e coradas com Giemsa. As imagens do experimento foram feitas em microscopia óptica, Microscópio Leica DMLI, com sistema de captura de imagem DFC310 FX, usando lente de 400x . Para a contagem foram consideradas as células com parasitas aderidos a membrana celular e interiolizados, sendo contadas em média 100 células por campo. Figura 2 - Células L929 tratadas com privação de SFB nas concentrações de A-1,0%, B- 0,75%, C- 0,5%. Observa-se na concentração de 0,5% maior número de células. A concentração utilizada na sincronização de células L929 foi de 1,0% para interação de T.gondii, os resultados obtidos foram comparados com as células L929 cultivadas em meio MEM contendo 5% de SFB, não sincronizadas. A contagem de parasitas interiorizados e aderidos foi realizada, sendo obtida uma redução de 52% no processo de invasão pelo parasita, como mostra a figura 3. Resultados Os resultados obtidos após coloração de Giemsa demonstram que células não sincronizadas apresentaram 56% dos parasitas interiorizados e 24% aderidos a superfície celular (Figura 1). Figura 3 – Avaliação do número de parasitas aderidos e interiorizados nas células sincronizadas a 1% de SFB e não sincronizadas com 5% SFB. Discussão Figura 1 - Células L929 não sincronizadas infectadas com T. gondii. A) célula infectada com 2 parasitas (seta) e uma célula com o parasita aderido (estrela), B) Célula altamente infectada, contendo grande numero de T. gondii após 24 horas de interação (seta). O meio de cultura com concentração de soro fetal bovino de maior eficácia foi o de 1,0%, devido ao alto grau de sincronização e o número populacional de células (Figura 2). O estudo da interação de T.gondii com célula hospedeira tem sido em modelo animal (BLADER, SAEIJ, 2009). Em decorrência das novas diretrizes do COBEA, o estimulo para uso de modelos in vitro tem aumentado. Assim estudos demonstrando os tipos de linhagens celulares propicias a interação célula-parasita são de extrema importância. Em nosso estudo verificamos que a linhagem celular L929 é um bom modelo para a manutenção do parasita, apresentando uma boa taxa de infecção. Associado a isto, verificamos também que esta linhagem é bem adaptada a redução da concentração de SFB. XVII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e XII Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba 2 Estas características nos levaram a utilizar esta linhagem para avaliação do ciclo celular da célula hospedeira na interação com o parasita T. gondii. Os estudos relacionados ao processo de interação célula x T.gondii, dão ênfase na influencia do parasita no genoma da célula hospedeira (COOPENS; JOINER, 2001). Entretanto alguns esclarecimentos são necessários no processo de interação célula x parasita, entre eles a importância do ciclo da célula hospedeira na interação com o parasita. Nossos resultados corroboram com os achados de Tosetto, 2005, que verificou a interação célula x parasita, no ciclo de mitose da célula hospedeira. A cultura de células hospedeiras sincronizadas apresentam redução na taxa de infecção, quando comparados ao grupo de células não sincronizadas, cultivadas com 5% de SFB. - TOSETTO A.C.Z.; Influência do ciclo celular das células hospedeiras cho e vero na interação com toxoplasma gondii.Tese (graduação) Univesidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, 2005. Conclusão Os resultados sugerem que o ciclo celular da célula hospedeira interfere no processo de interação de T. gondii, levando a uma redução do número de parasitas aderidos e interiorizados. Tal evento pode ocorrer devido alterações nas proteinas de superficie. Referências - BLADER, I.J.; SAEIJ, J.P. Communication between Toxoplasma gondii and its host: impact on parasite growth, development, immune evasion, and virulence. APMIS, Volume.117, issues 5-6, Page 458–476, May/June 2009. - COPPENS I.: JOINER K.A. (2001) parasitehost cell interactions in toxoplasmosis: new avenues for intervention? Expert Rev Mol Med 2001: 1–20. - GRIMWOOD. J; MINEO. J, R; KASPER .L.H. Attachment of Toxoplasma gondii to Host Cell Is Host Cell Cycle Dependent. Infection and Immunity. Vol. 64, n° 10, p. 4099-4104, Oct 1996. NEVES, D.P. Parasitologia Humana, 10ª edição. São Paulo: Editora Atheneu, 2000. - SOARES, C.P. Estudos da participação da supefície da célula hospedeira na formação do vacúolo parasitóforo na interação com Toxoplasma gondii. 100p. Tese (Doutorado) Universidade Estadual Norte Fluminence ,Campos dos Goytacazes-RJ, Rio de Janeiro, 1998 XVII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e XII Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba 3 XVII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e XII Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba 4