M OD ULAÇ ÃO D A FUNÇ ÃO NE UR ONAL POR PR OTEÍNAS QUINASE S E FOSFATASE S Claudio Marcos Teixeira de Queiroz Pós-graduando do Departamento de Fisiologia Escola Paulista de Medicina – Universidade Federal de São Paulo RESUMO A morfologia de uma célula é determinada não somente pelos tipos protéicos por ela expressos, mas também pela concentração, forma e localização dessas proteínas. A fisiologia de uma célula, por sua vez, pode ser compreendida ao se observar o funcionamento dessas proteínas, sua ativação e inativação, sua síntese, movimentação e biotransformação. Neste trabalho procuraremos destacar a atividade das proteínas quinase, que catalisam reações de fosforilação e das proteínas fosfatases, que catalisam reações de desfosforilação. A fosforilação, adição de um radical fosfato (PO32-) a uma proteína, resulta na alteração de sua conformação espacial (estrutura terciária). Logo, a adição desta carga eletronegativa promove a modificação da função da proteína, podendo, portanto, ativá-la ou desativá-la. Tais reações podem ser reguladas por sistemas de segundos mensageiros ou por ligantes extracelulares (no caso de fatores tróficos e hormônios), além de poderem ser potencializadas depois de determinados padrões de estimulação (por exemplo, um estímulo prolongado e intermitente ou mesmo uma associação de múltiplos estímulos <IMAGEM 13>). Assim, acredita-se que os processos de fosforilação/ desfosforilação possibilitam o aparecimento de uma “memória” molecular dentro da célula e que esta por sua vez, participaria ativamente dos processos de plasticidade neuronal. O PROCESSO DE FOSFORILAÇÃO Os principais determinantes da morfologia e do funcionamento de uma célula são as proteínas por ela expressa. Dentre essas proteínas estão as proteínas quinase e as proteínas fosfatases. Aproximadamente 4% de todos os genes codificam proteínas deste tipo (enzimas capazes de adicionar/retirar um radical fosfato de um substrato), sendo que 20% de todas as proteínas sintetizadas em uma célula servem como substrato para essas enzimas <IMAGEM 2>. A fosforilação pode rapidamente modificar a função de proteínas e enzimas, sem necessariamente modificar os níveis de suas expressões. Desta forma, as células apresentam normalmente um “potencial bioquímico”, ou seja, um estado de Trabalho apresentado para conclusão do curso de Neuroquímica do Programa de Pós-graduação em Neurologia Experimental da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). As informações contidas nesse trabalho podem ser utilizadas livremente desde que citada a fonte. E-mail: [email protected] 2 equilíbrio dinâmico entre três entidades: as proteínas quinase e fosfatase (ativadas ou desativadas) e os substratos protéicos (fosforilados ou desfosforilados) <IMAGEM 1>. Com esse sistema de controle, múltiplos sinais provenientes de diferentes sinapses podem ser integrados, variando o estado de fosforilação das proteínas desde o mínimo possível até praticamente o máximo de fosforilação. Este é um processo bidirecional que pode sofrer ainda uma potenciação ou inibição em relação ao steady-state bioquímico da célula. Tais modificações são sugeridas como um dos possíveis alicerces dos processos de plasticidade celular observados no sistema nervoso central. FOSFORILAÇÃO E O FLUXO DE INFORMAÇÃO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL A atividade das proteínas quinase pode ser regulada tanto pelo sistema de segundos mensageiros como também por estímulos extracelulares (fatores tróficos, por exemplo) <IMAGEM 4>. Em geral, as quinases reguladas por segundos mensageiros adicionam o radical fosfato em resíduos de serina (Ser) e/ou treonina (Thr) enquanto que as quinases ligadas a receptores atuam através da fosforilação de resíduos de tirosina (Tyr) <IMAGEM 3>. Dentre todas as diferentes células que constituem um organismo, as do sistema nervoso apresentam a maior capacidade e concentração de proteínas capazes de catalisar reações de fosforilação. Como base nesta informação podemos especular que tais processos podem estar diretamente relacionados com o fluxo de informação no sistema nervoso central, implicados na comunicação entre os diferentes tipos celulares deste tecido. O estado de fosforilação celular depende do grau de ativação (ou inativação) das proteínas quinase e fosfatase, da afinidade dessas enzimas por seus respectivos substratos, além da concentração e disponibilidade da quinase, fosfatase e proteína alvo; conceitos esses da farmacologia básica. Assim, a fosforilação e a desfosforilação das proteínas apresentam alguns princípios em comum entre si, independente do sistema que a ativa. Primeiramente as proteínas quinase apresentam uma atividade bastante promíscua, ou seja, são multifuncionais, podendo ser ativadas por diferentes classes de estímulo e agindo em diferentes tipos de substratos. Deste conceito deriva a segunda característica comum desta classe de substâncias, a relevância do posicionamento espacial (discutido abaixo). Para que as proteínas quinase (ou fosfatase) possam ser ativadas, elas devem estar próximas das regiões produtoras de segundos mensageiros (no caso das Ser/Thr quinases) ou muito próximas a membrana (no caso das Tyr quinase). Em terceiro lugar, o sistema de fosforilação permite uma grande amplificação do sinal, uma vez que uma única molécula pode fosforilar muitos substratos. Além disso, alguns sistemas de quinase podem fosforilar as “enzimas irmãs” (processo denominado de autofosforilação) que se encontram no estado desfosforilado. Em quarto lugar, os sistemas de quinases podem interagir entre si, com uma via favorecendo ou até mesmo ativando uma outra cascata de fosforilação. Em último lugar, os sistemas de quinase funcionam como quinases 3 cognitivas, ou seja, uma quinase capaz de memória molecular. Esta memória molecular potencia a atividade da quinase, sendo que uma menor concentração de segundo mensageiro já é suficiente para produzir o mesmo grau de ativação da quinase que na situação de equilíbrio. LOCALIZAÇÃO ESPACIAL REGULA A AÇÃO DAS PROTEÍNAS QUINASE E FOSFATASE As proteínas quinase e fosfatase estão freqüentemente posicionadas espacialmente perto de seus respectivos substratos ou são translocadas para seus substratos após a ativação com o intuito de aumentar a velocidade e a especificidade em resposta à estimulação proveniente dos neurotransmissores. O uso de proteínas-âncoras, que sustentam o posicionamento das proteínas quinase e fosfatase, acarreta o aparecimento de algumas características: [1] aumento da freqüência de fosforilação/ desfosforilação quando as quinases/ fosfatases estão próximas ao substrato, aumentando conseqüentemente a especificidade da quinase/ fosfatase; [2] aumento da razão sinal/ ruído para substratos localizados a uma certa distância das proteínas quinase/ fosfatase; e [3] uma fosforilação basal significante para substratos localizados muito próximos às proteínas-âncoras. PROTEÍNAS QUINASE DEPENDENTES DE AMPc Os neurotransmissores que estimulam a formação de AMPC <IMAGEM 5> exercem seus efeitos intracelulares principalmente através da ativação das proteínas quinase dependentes de AMPC (PKA). As PKA são proteínas tetraméricas, sendo que duas subunidades funcionam como regiões reguladoras da atividade das outras duas subunidades, as catalíticas <IMAGEM 6>. Assim, a ligação de quatro moléculas de AMPC, duas moléculas para cada subunidade reguladora, diminuem a afinidade existente entre as subunidades reguladora e catalítica, levando a dissociação entre ambas e conseqüentemente a ativação das subunidades catalíticas. Nesta configuração, as subunidades catalíticas podem fosforilar proteínas (nos resíduos de Ser e Thr) tais como a CREB (proteína reguladora da expressão gênica), a tirosina hidroxilase (enzima envolvida com a síntese de catecolaminas), a MAP-2 (proteína associada a microtúbulo do tipo 2, envolvida com a definição da morfologia celular), entre outras <IMAGEM 11 e 12>. CÁLCIO-CALMODULINA QUINASES Muitos dos efeitos intracelulares do Ca2+ são mediados pela calmodulina, sendo que os efeitos do complexo Ca2+-calmodulina (CaM) são obtidos através da fosforilação/ desfosforilação de proteínas. Diferentemente do sistema de fosforilação despendente de AMPC, o sistema de fosforilação CaM pode ser tanto específico como multifuncional. A miosina de cadeia leve quinase (MLCK) só é capaz de fosforilar (em resíduos de Ser e Thr) as cadeias leves de miosina, sendo 4 portanto extremamente específica. Já as CaM quinase I, II e IV possuem a capacidade de fosforilar um amplo espectro de substratos, dentre eles a sinapsina I, canais de cálcio, a Ca2+-ATPase, fatores de transcrição e receptores glutamatérgicos, apresentando portanto características de quinases multifuncionais. Essas quinases são ativadas com o aumento da concentração intracelular de Ca2+, proveniente tanto de canais de cálcio localizados na membrana plasmática quanto de canais sensíveis ao inositol trifosfato (IP3) presentes na membrana do retículo endoplasmático liso <IMAGEM 8>. As CaM quinases são encontradas em todos os tecidos, porém os neurônios apresentam uma grande quantidade dessas quinases, representando aproximadamente 2% de todas as proteínas presentes no hipocampo (para a CaM quinase do tipo II). A CaM quinase do tipo II é a principal quinase estudada neste grupo <IMAGEM 7>. Ela é uma enzima multimérica, consistindo de 10 a 12 subunidades derivadas de quatro genes homólogos (α, β, γ, δ) que codificam diferentes isoformas da quinase (variando de 54 kDa a 65 kDa por subunidade). Ao contrário da PKA, as CaM quinases apresentam em um único polipeptídeo os subdomínios reguladores e catalíticos. A regulação destas quinases por processos de autofosforilação representa um importante aspecto destes tipos de agentes fosforiladores e será abordado neste trabalho mais adiante, quando será discutida a propriedade cognitiva dos sistemas de quinases e fosfatases. PROTEÍNAS QUINASE ASSOCIADAS AO SISTEMA DE SINALIZAÇÃO DO INOSITOL FOSFATO As proteínas quinase C, ou PKC, são proteínas quinase relacionadas ao sistema de sinalização intracelular do inositol fosfato. As PKC são Ser/Thr quinases, com múltiplas funções, dentre elas, exocitose e endocitose de vesículas sinápticas, plasticidade neuronal, expressão gênica e regulação do crescimento e ciclo celular. Esta família de proteínas quinase é ativada por dois tipos de sinalizadores intracelulares: o diacilglicerol (DAG), produzido pela ação da fosfolipase C sobre lipídios de membrana (no caso, o fosfatidilinositol 4,5-difosfato) e o Ca2+, produzido pela ação do IP3 (o outro produto da ação da fosfolipase C) sobre canais de Ca2+ localizados no retículo endoplasmático liso <IMAGEM 8>. Ao contrário da PKA, as PKC são enzimas monoméricas, ou seja, um único polipeptídio contém os domínios reguladores e catalíticos. Assim como visto para outras quinases, a ligação dos segundos mensageiros ao domínio regulador promove o deslocamento do domínio autoinibidor, levando a ativação reversível do domínio catalítico. PROTEÍNAS TIROSINA QUINASE Proteínas quinase que fosforilam resíduos de Tyr em proteínas-chave participam em numerosos processos celulares, estando normalmente associadas com a regulação do crescimento e da diferenciação celular <IMAGEM 9>. 5 Normalmente a transdução de sinal pela via das proteínas tirosina quinase (PTK) envolve múltiplas fosforilações, de diferentes tipos de aminoácidos (Tyr, Ser e Thr). Existem duas classes de PTK. A primeira família inclui aquelas proteínas que são ativadas pela ligação de substâncias localizadas no meio extracelular à receptores específicos localizados na membrana plasmática (fazem parte desta classe os fatores de crescimento e as neurotrofinas). A segunda família compreende as quinases solúveis, localizadas no citoplasma e ativadas indiretamente por ligantes extracelulares. Assim, a ativação das PTK se diferencia enormemente das Ser/Thr quinases pois as primeiras não dependem da produção de um segundo mensageiro. Assim, as PTK são independentes da produção de segundos mensageiros, sendo ativadas imediatamente após a ligação do estímulo extracelular com o receptor da PTK. PROTEÍNAS FOSFATASES As proteínas fosfatases envolvidas na sinalização neuronal são classificadas em dois tipos: as fosfoserinas-fosfotreoninas fosfatases (PSPs) e as fosfotirosinas fosfatases (PTPs). Essas proteínas são enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster do aminoácido fosforilado, formando assim, um fosfato inorgânico e uma proteína desfosforilada. As fosfatases controlam todos os processos celulares das proteínas quinase, incluindo a neurotransmissão, a excitabilidade neuronal, a expressão gênica, a síntese protéica, a plasticidade neuronal e o crescimento celular. As PSPs são as principais fosfatases encontradas nas células. Elas são normalmente multifuncionais e podem ser classificadas em seis grupos: 1, 4, 5, 2A, 2B e 2C. Essa classificação está de acordo com os substratos por elas atacados, seus inibidores e no recrutamento por outras substâncias <IMAGEM 10>. Dentre todas essas fosfatases, somente a fosfatase-2B (ou calcineurina) responde diretamente à um segundo mensageiro (aumento da concentração intracelular de Ca2+). Todas as outras são ativadas quando fosforiladas pelas próprias proteínas quinase. MEMÓRIA MOLECULAR E QUINASES COGNITIVAS A habilidade dos três maiores sistemas de quinase (PKA, CaM quinase II e PKC) cerebrais em iniciar e manter alterações sinápticas que suportem funções cognitivas, como o aprendizado e a memória, requer a modificação persistente dessas proteínas. Assim, essas quinases são consideradas quinases cognitivas porque [1] são capazes de sustentar seus estados de ativação mesmo após o desaparecimento da sinalização de segundos mensageiros e [2] seus substratos modulam a plasticidade sináptica. 6 Determinados padrões de estimulação das fibras musgosas que inervam os neurônios da região de CA3 no hipocampo (estrutura cerebral envolvida com processos de memória e aprendizado) podem levar ao aparecimento de uma potenciação de longa duração. Tal processo é dependente das PKA. Assim, a estimulação elétrica dessas fibras promove um aumento dos níveis intracelulares de AMPC, dentre outros segundos mensageiros (como o Ca2+, por exemplo), que atuando sobre os domínios reguladores da PKA causam a dissociação desta subunidade da subunidade catalítica. Caso esse estímulo persista por muito tempo ou seja facilitado por outra via de neurotransmissão, as subunidades reguladoras podem sofrer a ação de proteases <IMAGEM 6>. Essas proteases irão diminuir a razão entre as subunidades reguladoras/ catalíticas, permitindo que subunidades catalíticas fiquem livres por um longo período (pois não existem subunidades reguladoras suficientes para inativar as subunidades catalíticas). Assim, a atividade da PKA permanece presente mesmo após a cessação do estímulo (i.e., aumento dos níveis de AMPC). A ativação prolongada da PKA possibilita que as subunidades catalíticas possam migrar para a região intranuclear e assim, induzir a expressão gênica. Dentre os genes induzidos pela PKA encontram-se aqueles responsáveis por sintetizar novas proteases que irão facilitar a degradação das subunidades reguladoras. Podemos observar, portanto, a modificação do estado de “equilíbrio bioquímico” de uma célula por eventos anteriores, caracterizando assim a memória molecular de uma via de fosforilação. A CaM quinase tipo II é a quinase mais estudada dentre aquelas dependentes de Ca2+ e que apresentam memória molecular, porque esta enzima possui a capacidade de se autofosforilar e as proteínas por ela fosforiladas participam da plasticidade neuronal (i.e., sinapsina I) <IMAGEM 11>. Assim, estímulos de baixa freqüência levam a ativação submáximas da quinase a cada estímulo, enquanto que estímulos de alta freqüência resultam em um maior recrutamento das subunidades da quinase, tornando-a mais ativa e autônoma em relação ao seu sistema de segundo mensageiro (CaM). Em estímulos de alta freqüência, o intervalo entre as ondas de Ca2+ é muito pequeno para permitir a desfosforilação ou a dissociação entre a calmodulina e as subunidades da quinase. Deste modo, aquelas subunidades fosforiladas (e, portanto ativas, capazes de realizar uma reação de fosforilação) podem fosforilar as subunidades vizinhas <IMAGEM 7>. Assim, esta quinase pode ser catalogada como uma quinase cognitiva porque apresenta processos de memória molecular (autofosforilação) e seus substratos alvos são proteínas envolvidas na plasticidade sináptica (sinapsina I). As PKC também podem ser convertidas em um formato que é independente, ou autônoma, de seus segundos mensageiros e por isso podem ser descritas como quinases cognitivas. Os mecanismos pelos quais essa família de quinase é considerada uma quinase cognitiva estão pouco elucidados, porém experimentos demonstram a participação desta classe de substâncias em 7 processos como a potenciação de longa duração, sendo sugeridos a participação dos receptores NMDA e AMPA, ambos substratos desta classe de quinase. POR QUE DOIS CONJUNTOS DE AMINOÁCIDOS FORAM SELECIONADOS COMO ALVOS PARA FOSFORILAÇÃO? Existem três tipos de aminoácidos que podem sofrer a adição de um radical fosfato, sendo as quinases responsáveis por essa reação divididas em duas classes, as PSPs (Ser/Thr quinases) e as PTPs (Tyr quinases). Conforme visto anteriormente, as PSPs são quinases envolvidas com processos plásticos de célula e são ativadas por diferentes sistemas de segundos mensageiros. Já as PTPs são quinases envolvidas com processos de crescimento e diferenciação celular. Assim, as conseqüências da perda de especificidade de uma reação de fosforilação por uma PSPs pode afetar a atividade metabólica de uma célula ou mesmo a função sináptica de um neurônio, mas seguramente não irá iniciar processos irreversíveis e globais como o crescimento e a diferenciação celular. A conseqüência de estímulos impróprios entre os dois sistemas de quinase pode ser observado no aparecimento de tumores, onde provavelmente estímulos “corriqueiros” são responsáveis por induzir a expressão de oncogenes. 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