ardra 16s-23s

ENUMERAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO POR RESTRIÇÃO ENZIMÁTICA (ARDRA 16S-23S)
DE BACTÉRIAS ÁCIDO-LÁCTICAS ISOLADAS DE LEITE DE OVELHA
ENUMERATION AND IDENTIFICATION BY ENZIMATIC RESTRICTION (ARDRA 16S-23S)
OF LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM SHEEP MILK
Leonardo Borges Acurcio1, Naiara Milagres Augusto da Silva1, Dalila Lapinha Silva Oliveira1,
Lorrana Martins Salgado2, Alvaro Cantini Nunes4, Marcelo Resende de Souza3
1
Mestrando em Ciência Animal – Escola de Veterinária-UFMG
2
Médica Veterinária
3
Professor Adjunto – Escola de Veterinária-UFMG
4
Professor Adjunto – Instituto de Ciências Biológicas –UFMG
Palavras-chave: leite, Lactobacillus spp., ARDRA
Introdução
O estudo dos microrganismos ácido-lácticos presentes no leite e seus derivados tem sido de
extrema importância para a compreensão das diferenças entre os tipos de fermentação e
maturação que ocorrem nestes. As consequentes diferenças sensoriais entre os diversos
derivados lácteos produzidos nos locais com tradição na produção de queijos, iogurtes,
entre outros, podem ser explicadas, em grande parte, pela diversidade da microbiota
presente em cada um desses alimentos. Existem muitos estudos envolvendo a identificação
de microrganismos ácido-lácticos oriundos de leite e queijos brasileiros (RESENDE, 2010;
GUEDES NETO, 2004), de queijo e leite de ovelha italianos (CODA et al., 2006) de queijo e
leite de ovelha gregos (TZANETAKIS e LITOPOULOU-TZANETAKI, 1992), entre outros.
Objetivou-se nesse trabalho identificar a microbiota de leite de ovelhas Santa Inês, Lacaune,
East Friesian e suas mestiças criadas em Minas Gerais, considerando-se que não existem
estudos disponíveis sobre esse tema.
Material e Métodos
Microrganismos do leite de ovelhas das raças Santa Inês, Lacaune, East Friesian e suas
mestiças foram isolados em ágar seletivo para bactérias ácido-lácticas, como MRS (Difco,
EUA) e M17 (Difco, EUA). A contagem nas placas com as diluições de 10-3, 10-5 e 10-7 do
leite de cada ovelha foi feita após incubação por 48 horas, a 370C (MRS) e 320C (M17). As
colônias com morfologia típica de bactéria ácido-láctica (pequenas, brancas ou
esbranquiçadas e arredondadas) foram isoladas e cultivadas em caldo semelhantes ao ágar
no qual foram isoladas. As colônias que não eram Gram positiva e catalase negativa, foram
descartadas, por não se tratarem de bactérias ácido-lácticas). O DNA total das bactérias
selecionadas foi extraído de acordo com o protocolo proposto pelo kit Wizard SV Genomic
DNA Purification System (Promega, EUA). Então, foi feita a amplificação da região
intergênica ribossomal (16s-23s) por PCR. Os produtos de PCR foram então submetidos à
análise de restrição enzimática do DNA ribossomal amplificado (ARDRA), utilizando-se as
endonucleases de restrição SphI, NcoI, NheI SspI, SfuI, DraI, VspI, EcoRI e HincII, ArvII,
HindIII e EcoRV, que clivam o DNA em diversas porções: na região intergênica 16S-23S e
dentro do gene 16S e 23S de bactérias ácido-lácticas. Todas as etapas anteriormente
descritas estão de acordo com os procedimentos propostos por MOREIRA et al. (2005),
TANNOCK et al. (1999).
Resultados e Discussão
O leite de ovelha apresentou contagem média de bactérias ácido-lácticas de 7,78x105
UFC/mL, corroborando os resultados encontrados trabalhos de CODA et al. (2006) e
TZANETAKIS e LITOPOULOU-TZANETAKI (1992), que também não encontraram médias
populacionais maiores que 105UFC/mL, evidenciando a baixa concentração desses
microrganismos nesse leite.
A identificação pela ARDRA dos microrganismos isolados a partir do leite de ovelha foi
possível, ao nível de espécie, em 13 das 27 espécies de Lactobacillus, sendo elas L. ruminis
(n=5), L. casei (n=2), L. salivarius (n=2), L. fructivorans (n=1), L. johnsonii (n=1), L. mucosae
(n=1). As outras 14 espécies só puderam ser identificadas ao nível de gênero, sendo esse
Lactobacillus.
Conclusão
Leite de ovelhas Santa Inês, Lacaune, East Friesian e suas mestiças, criadas em Minas
Gerais, apresentou baixa concentração de bactérias ácido-láticas, com predominância do
gênero Lactobacillus e das espécies L. ruminis, L. casei e L. salivarius.
É necessário o uso de novas tecnologias para identificar todas as espécies de Lactobacillus
isoladas, sejam as que não foram identificadas pela ARDRA, ou seja, para confirmar
aquelas identificadas pela ARDRA.
Referências Bibliográficas
CODA, R., BRECHANY, E., DE ANGELIS, M., DE CANDIA, S., DI CAGNO, R., GOBBETTI,
M. Comparison of the Compositional, Microbiological, Biochemical, and Volatile Profile
Characteristics of Nine Italian Ewes’ Milk Cheeses. Journal of Dairy Science, v. 89, p.
4126–4143, 2006.
GUEDES NETO, L. G. Produção de queijo coalho em Pernambuco: isolamento e
identificação de Staphylococcus spp e bactérias ácido-láticas e de sua atividade
antagonista in vitro. 2004, 94 f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Escola de
Medicina Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2004.
MOREIRA, J.L.S.; MOTA, R.M.; HORTA, M.F. et al. Identification to the species level of
Lactobacillus isolated in probiotic prospecting studies of human, animal or food origin by
16S-23S rRNA restriction profiling. BMC Microbiology, v.5, n. 15, 2005.
RESENDE, M. F. S. Queijo Minas Artesanal da Serra da Canastra: Influência da
Altitude do Nível de Cadastramento das Queijarias nas Características FísicoQuímicas e Microbiológicas. 2010. 72 f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) –
Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte,
2010.
TANNOCK, G.W.; TISSALA-TIMISJARVI, A.; RODTONG, S.
et al. Identification of
Lactobacillus isolates from the gastro-intestinal tract, silage and yoghurt by the 16S-23S
rDNA gene intergenic spacer region sequence comparisons. Applied and Environmental
Microbiology, v. 65, n. 9, p. 4264-4267, 1999.
TZANETAKIS, N., LITOPOULOU-TZANETAKI, E. Changes in Numbers and Kinds of
Lactic Acid Bacteria in Feta and Teleme, Two Greek Cheeses from Ewes’ Milk . Journal
of Dairy Science, v. 75, p. 1389-1393, 1992.