Newsletter

Volume 3
Número 36
29 de outubro de 2005
GBETH Newsletter
de Tumores Hereditários
de Estudos
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s
Uma
o Bra
publicação
semanal do Grup
GBETH Newsletter é uma
publicação semanal
distribuída aos sócios
do Grupo Brasileiro de
Estudos de
Tumores Hereditários.
Sede
R José Getúlio, 579 cjs 42/43 Aclimação São Paulo - SP
CEP 01503-001
E-mail
[email protected]
Editor
Erika Maria M Santos
Diretoria
Presidente
Benedito Mauro Rossi
Vice-Presidente
Gilles Landman
Diretor Científico
André Vettore
Secretário Geral
Fábio de Oliveira Ferreira
Primeira Secretária
Erika Maria M Santos
Tesoureiro
Wilson T Nakagawa
Conselho Científico
Beatriz de Camargo
José Claúdio C Rocha
Maria Aparecida Nagai
Maria Isabel W Achatz
Samuel Aguiar Jr
Conselho Fiscal
Titulares
André Lopes Carvalho
Gustavo Cardoso Guimarães
Stênio de Cássio Zequi
Suplentes
Fábio José Hadad
Mariana Morais C Tiossi
Milena J S F L Santos
IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES RELACIONADAS A
PREDISPOSIÇÃO HEREDITÁRIAS AO CÂNCER
André Vettore
Instituto Ludwig for Cancer Research
AS MUTAÇÕES
As mutações podem ser somáticas quando são alterações genéticas que ocorrem
em uma célula somática de um organismo multicelular. O organismo poderá ser
afetada (câncer), mas estas alterações não serão herdadas pelos descendentes.
As mutações germinativas são alterações genéticas presentes nos gametas,
portanto, todas as células do organismo vão possuir a alteração. A alteração poderá
ser herdada pelos descendentes
No câncer, a grande maioria das alterações genéticas nas células neoplásicas é
somática (tumores esporádicos), sendo assim, apenas cerca de 10% dos cânceres são
hereditários (mutações germinativas).
TIPOS
DE
MUTAÇÕES
Mutação Silenciosa (ou Sinônima): a substituição de um nucleotídeo resulta na
codificação do mesmo aminoácido.
Mutação Neutra: a substituição de um nucleotídeo resulta na codificação de um
outro aminoácido com propriedades químicas semelhantes (a função da proteína
“não se altera”).
Mutação Missense: a substituição de um nucleotídeo resulta na codificação de
um aminoácido com propriedades químicas diferentes.
Mutação Nonsense: a substituição de um nucleotídeo resulta na introdução de
um códon prematuro de Terminação da Tradução (TGA, TAA ou TAG), portanto a
proteína deverá ser menor.
IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES RELACIONADAS A PREDISPOSIÇÃO HEREDITÁRIAS AO CÂNCER
Mutação Frameshift: a inserção ou deleção de um
ou poucos nucleotídeos leva a uma alteração da fase
entanto, não se acumulam porque o sistema de
reparo de DNA as corrige.
de leitura, gerando: (a) uma seqüência incorreta de
São importantes, porque se não houvessem as
aminoácidos; (b) a introdução de um códon prematuro
mutações, as populações não poderiam se adaptar
de terminação da tradução (proteína será menor); (c)
às novas condições do ambiente.
ao não reconhecimento do códon original de
terminação da tradução (proteína será maior).
O PAPEL
DAS
MUTAÇÕES
NA
No entanto, embora algumas mutações possam
ser benéficas para a evolução de uma população, a
grande maioria é danosa para o indivíduo:
EVOLUÇÃO
As mutações são alterações ao acaso na seqüência
do DNA, muitas vezes são mudanças benéficas no
fenótipo, fazem parte do processo de seleção natural
e da evolução da população ao longo do tempo.
As mutações ocorrem em todas as células. No
- a mudança de um único aminoácido na
hemoglobina causa a Anemia Falciforme;
- a síndrome de Down é causada pela presença
de uma terceira cópia do cromossomo 21;
- o câncer surge quando as mutações permitem as
células proliferarem de um modo desordenado.
Quadro 1 – Principais síndromes de câncer hereditário
Síndrome
Tumores
Gene
Exons
mRNA
Localização
Polipose
Cólon
APC
15
10.386
5q21
Câncer colorretal
Colorretal,
hMSH2
17
3.145
2p16
hereditário sem
endométrio,
hMLH1
20
2.524
3p21
polipose
i.delgado,
BRCA1
24
5.711
17q21
BRCA2
32
10.987
13q12-13
TP53
11
2.629
17q13
RET
19
4.508
10q11.2
adenomatosa
familiar (FAP)
pelve renal
Síndrome
Mama e ovário
Mama-ovário
Li-Fraumeni
SPM, mama,
osteossarcoma,
cérebro, adrenal
Neoplasia end.
Carcinoma méd
Múltipla 2A
da tireóide,
adenoma da
paratireóide
ESTRATÉGIA
PARA
DETECÇÃO
DE
MUTAÇÕES
O seqüenciamento direto é o “gold standard”. É
realizada a extração de DNA a partir de linfócitos, e
cada Exon do gene de interesse é então amplificado.
Nos genes maiores, como o BRCA1, por exemplo
é necessário o sequenciamento de 35 fragmentos em
ambas as direções (direto e reverso), ou seja, são 70
reações de seqüenciamento.
Após a detecção da mutação, é realizada a
Então para genes grandes, há outras estratégias
confirmação em uma nova amostra de DNA do
para o teste genético. Ocorre a extração de DNA a
paciente. Com a confirmação da mutação no
partir de linfócitos e é realizada uma pré-seleção,
paciente afetado é realizada a busca da mutação nos
para seqüenciamento apenas dos exons com suspeita
familiares por Seqüenciamento Direto (diagnóstico
de alteração.
pré-sintomático).
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IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES RELACIONADAS A PREDISPOSIÇÃO HEREDITÁRIAS AO CÂNCER
TÉCNICAS
DE
separação dos heteroduplexes e homoduplexes sob
PRÉ-SELEÇÃO
DGGE (DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS)
Se um indivíduo possui alelos com seqüências
condições parciais de desnaturação.
PTT (PROTEIN TRUNCATION TEST)
diferentes para um determinado lócus, ambos
Detecta mutações que levam a terminação
são amplificados em uma reação de PCR. Para
precoce do processo de tradução do mRNA e,
a formação de heteroduplexes de DNA, esta
conseqüentemente, a formação de uma proteína
reação é submetida a uma reação de aquecimento,
truncada. Ou seja, este método detecta especificamente
seguida de renaturação pela diminuição gradual
as Mutações Nonsense ou Fremeshift que criam um
da temperatura. Durante este último processo,
códon de terminação.
as fitas irão parear aleatoriamente, levando a
Neste médodo, ocorre a extração de RNA a partir
formação de homoduplexes e heteroduplexes, que
de linfócitos. É realizada a síntese de cDNA. Os
são submetidos a um fracionamento eletroforético
fragmentos de interesse são amplificados (BRCA1
em géis de poliacrilamida com um gradiente
– exon 11). É realizada transcrição e tradução in vitro
crescente de desnaturação. Nos alelos diferentes são
(Met, Leu ou Cys [35S]), e os polipeptídeos formados
observadas alterações no padrão de migração quando
são separados por tamanho em SDS-PAGE. Os
comparados com uma seqüência normal.
fragmentos com alteração são examinados por
HA (HETERODUPLEX ANALYSIS)
seqüenciamento (identificação da mutação)
Duplex de DNA formada por fontes diferentes,
Por exemplo, para a detecção de mutação na
referidas como heteroduplex, no qual os DNA são
síndrome mama ovário são utilizadas as seguintes
diferentes.
estratégias:
FAMA (FLUORESCENT ASSISTED MISMATCH ANALYSIS)
SSCP (SINGLE-STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM)
Baseia-se no fato de que, após a desnaturação do
- Extração de DNA a partir de linfócitos
- Amplificar os 21 exons (exceto exon 11)
- Pré-seleção por DHPLC
DNA, as fitas simples geradas formam estruturas
- Exon 11 - dividir em 4 fragmentos – Pré-seleção
tridimensionais
por PTT
devido
à
complementariedade
entre as bases de uma mesma fita. Fitas simples
- Seqüenciamento apenas dos exons com suspeita
com
de alteração
seqüências
tridimensionais
diferentes
diferentes
formam
com
estruturas
mobilidades
eletroforéticas diferentes em géis de poliacrilamida.
DHPLC (DENATURING HIGH PERFORMACE LIQUID CHROMATOGRAPHY)
DHPLC é uma cromatografia líquida baseada no
método de pareamento de íons em fase reversa sob
condições desnaturantes. Seu princípio é: formação
de heteroduplexes através da hibridação após o
aquecimento e esfriamento dos produtos de PCR;
- Confirmar em uma nova amostra de DNA do
paciente
-
Busca
da
mutação
Seqüenciamento
Direto
nos
familiares
(diagnóstico
por
pré-
sintomático)
No Quadro 2, estão apresentadas as técnicas de
pré-seleção das principais síndromes hereditárias de
câncer.
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IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES RELACIONADAS A PREDISPOSIÇÃO HEREDITÁRIAS AO CÂNCER
Quadro 2 – Técnicas pré-seleção para os genes relacionados às principais síndromes de câncer hereditário
Síndrome
Gene
Exons
Método
Polipose adenomatosa familiar
APC
15
PTT + SD
Câncer colorretal hereditário
hMSH2
17
DHPLC + SD
sem polipose (HNPCC)
hMLH1
20
DHPLC + SD
Síndrome mama/ovário
BRCA1
24
DHPLC + PTT + SD
BRCA2
32
DHPLC + PTT + SD
Li-Fraumeni
TP53
11
DHPLC + SD
Neoplasia endócrina
RET
6
SD
VHL
3
SD
Múltipla tipo 2A (MEN2A)
Von Hippel-Lindau
Além das questões técnicas mencionadas nesta
newsletter, há uma série de questões éticas que devem
ser consideradas em relação ao teste genético:
- Confidencialidade;
- Todos indivíduos devem ter acesso a informação
genética e suas aplicações;
- Descriminação genética;
- Direito de recusa ao teste genético;
- Informe consciente;
- Patentes e Licenças.
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