TERAPIA GÊNICA

5
TERAPIA GÊNICA
STEPHEN L. ECK E JAMES M. WILSON
Graças aos avanços na biologia molecular e celular foram descritas as proteínas
mediadoras de muitos processos patológicos, enquanto a tecnologia do ADN permite
um acesso rápido aos genes que controlam estes eventos. O tamanho, a complexidade
e a inacessibilidade celular destas proteínas tornam impossível a transferência ou a
modcação por meios farmacológicos. A terapia gênica supera estas barreiras pela
introdução seletiva de ADN recombinante nos tecidos de modo que as proteínas
biologicamente ativas podem ser sintetizadas dentro das células cuja função deve ser
alterada. Como tal, a transferência do ADN recombinante tornou-se fundamental em
todas as estratégias de terapia gênica. Inúmeros sistemas de transferência de
ADNforam desenvolvidos com base em vias do ciclo de vida dos vírus, encapsu
lamento de lipossomos, injeção direta efonnação de complexos com proteínas
carreadoras. Embora originalmente planejado como um tratamento para defeitos
monogênicos hereditários, constatou-se que a terapia gênica tem aplicações em
doenças adquiridas como câncer doenças cardiovasculares e moléstias infecciosas.
Este capítulo fornece uma introdução aos aspectos terapêuticos e atuais estratégias
exploradas para aplicar a terapia gênica a esta ampla gama de doenças.
ESCOPO DA TERAPIA GÊNICA
A transferência terapêutica de genes não é um conceito novo (Wolff e Lederberg,
1994). Mais de duas décadas antes de ocorrer a primeira transferência gênica em
laboratório, Edward Tatum especulava: “Nós podemos até mesmo ficar um tanto
otimistas quanto à possibilidade a longo prazo de terapia pelo isolamento ou
programação, síntese e introdução de novos genes em células defeituosas de
determinados órgãos” (Tatum, 1966). O tratamento de doenças humanas pela
transferência gênica foi visto como um meio para tratar doenças decorrentes de defeitos
monogênicos. As doenças hereditárias englobam uma ampla gama de distúrbios nos
quais um gene defeituoso leva à incapacidade de sintetizar uma determinada proteína
ou leva à síntese de uma proteína anormal. Em ambos os eventos, a ausência da
proteína nornial pode levar a inúmeras manifestações clínicas que dependem do papel
estrutural ou enzimático que a proteína normalmente tem na célula. Tais condições
variam desde distúrbios brandos, que não exigem tratamento (p.ex., daltonismo), a
doenças potencialmente fatais (p.ex., hemofilia, fibrose cística). Estas diversas doenças
são, em geral, inadequadamente tratadas pelos meios farmacológicos convencionais. A
terapia baseada na substituição da proteína ausente ou defeituosa (como o fator VIII
para hemofilia, transfusões para anemia falciforme e adenosina desaminase para a
síndrome da imunodeficiência combinada grave) está disponível apenas para algumas
destas doenças. Além disso, estas terapias são apenas parciahnente eficazes no alívio
das manifestações da
doença, e são acompanhadas por êomplicações significativas. P maioria das doenças
genéticas não é possível “fornecer” a prol ausente de modo terapêutico devido à
natureza complexa e frág proteína, e a necessidade de levar a proteína a um local
subce específico (p.ex., expressão na superfície da célula, localização 1 sômica etc.). O
transplante do principal órgão afetado tem sido em alguns casos (p.ex., transplante de
medula óssea para am falciforme ou transplante de fígado para hiperlipidemias), mas
conduta tem como limitações importantes a falta de disponibii de órgãos e as
conseqüências adversas da supressão imune neces:
para evitar a rejeição de um tecido alogênico.
Fornecer uma cópia normal do gene defeituoso aos tecidos a dos iria evitar o problema
do transporte de proteínas compli pois a proteína poderia ser sintetizada dentro das
células usan vias celulares normais. Embora o gene defeituoso exista em as células de
uma pessoa com um distúrbio hereditário, apena guns tecidos ou órgãos realmente
expressam o gene e, portanto afetados. Os defeitos nos genes que funcionam em todas
as las do corpo (chamados genes de manutenção) geralmente resu em anormalidades
tão graves que não pode ocorrer desenvolvim embrionário. O número limitado de
tecidos afetados pela maiori distúrbios hereditários simplifica muito as necessidades de
uma caz terapia gênica, pois uma cópia funcional do gene precisa ser apenas aos
tecidos que realmente o necessitam. A meta da tei gêmca, portanto, é corrigir
geneticamente o defeito em apenas i do corpo. Como este tipo de terapia não visa a
alteração da estri genética dos órgãos reprodutivos, não evita que o distúrbio gem seja
transmitido para a geração seguinte. E visto, entretanto, com poderoso instrumento
para aliviar ou reverter as conseqüências tabólicas na pessoa tratada. Orientar o gene
terapêutico para tecido especializado é uma área de grande interesse em toda
aplicações da terapia gênica. Além disso, se a transferência g puder ser orientada para
os órgãos mais afetados, então poder-:
evitar os efeitos colaterais da expressão gênica ectópica em cél que não são alvo.
Como com outros agentes farmacêuticos, a oi tação célula-específica tem a vantagem
de diminuir o volume efi de distribuição e a quantidade necessária do gene. Ainda não
há sistemas de orientação específicos para uma célula, nem para dr nem para o
material genético, mas pode ser razoavelmente es do que a explosão de interesse na
terapia gênica resulte em n métodos que serão aplicáveis ao transporte de ADN e de
fárm convencionais. Estão sendo desenvolvidos sistemas de transpori ADN usando
inúmeros agentes químicos, físicos e biológicos.
As primeiras experiências de transferência de genes humanos começ em 1989 com
estudos de marcação de linfócitos. Embora sem benei terapêuticos, estes estudos
iniciais mostraram que a transferência gênica 1 ser feita com segurança, e
esclareceram muitas das dificuldades técnic:
transferência de genes humanos (Rosenberg et aL, 1990). Os linfócitos prováveis alvos
para as tentativas iniciais de terapia gênica porque podiai
56
Seção 1 PRINCÍPIOS
facilmente isolados e manipulados ex vivo. Assim, a orientação para tecidos específicos
pode ser feita pela remoção física e manipulação das células receptoras, e não pela
alteração do sistema de transporte do gene, que até o momento tem se mostrado difícil.
Os linfócitos também eram alvos atraentes porque são o locus celular de vários
distúrbios hereditários e adquiridos (p.., imunodeficiência combinada grave, infecção
pelo HIV, doença enxerto versus hospedeiro e inúmeros processos malignos). Além de
serem prontamente isolados, pode-se esperar que os linfócitos vivam muito ao serem
retomados ao receptor e, portanto, existe potencialmente um efeito benéfico persistente
em distúrbios crônicos. Assim, a transferência de genes em lmfócitos fornece um
importante modelo para terapia gênica e continua a ser desenvolvido para muitos
distúrbios. Em setembro de 1990, começou a primeira prova com genes humanos com
potencial terapêutico. A transferência ex vivo do gene para adenosina desaminase
(ADA) para os linfócitos de uma criança com uma deficiência que é normalmente letal
foi feita pelos National Institutes of Ffealth (Anderson et ai., 1990). Os resultados desta
tentativa, que ainda não foram publicados com detalhes, foram encorajadores e
estimularam o desenvolvimento de muitas novas tentativas de terapia gênica.
A maioria das provas terapêuticas com genes em andamento é para distúrbios
adquiridos, como a AIDS, processos malignos e doença cardiovascular, e não para
doenças que surgem de defeitos monogênicos (Quadro 5.1). A aplicação da terapia
gênica em distúrbios adquiridos ocorreu mais rapidamente do que em defeitos
monogênicos, por vários motivos. Dentre as razões importantes está o fato de ter sido
difícil obter a expressão a longo prazo do gene (meses a anos), que é provavelmente
necessária para tratar doenças genéticas. A disponibilidade de um grande número de
pacientes candidatos com distúrbios adquiridos potencialmente fatais (sobretudo câncer
e AIDS) fornece um cenário clínico para o desenvolvimento de novas estratégias de
transferência de ADN que poderão ser aplicadas mais tarde aos distúrbios hereditários.
Em oposição às doenças hereditárias, nas quais um defeito genético já foi bem
caracterizado, na maioria das aplicações de terapia gênica em doenças adquiridas, a
base molecular da doença é menos bem compreendida. Em vez de corrigir um defeito
subjacente conhecido, o enfoque tem sido adicionar novas funções moleculares que
consigam alterar o curso da doença, ou bloquear uma função existente, e não corrigir
uma deficiência subjacente.
Considerações gerais da terapia gênica
Distúrbios hereditários. A inserção de um novo gene, que em última análise corrige
uma deficiência, exige que o novo produto gêmco esteja presente em quantidades
suficientes para se obter um efeito terapêutico. O nível de atividade da proteína
necessário para se obter a complementação do defeito varia muito entre as doenças
genéticas. Em geral, isto pode ser estimado por observações clínicas, comparando a
gravidade da doença com a magnitude da deficiência. Isto ocorre nas hemofilias, nas
quais a magnitude das complicações hemorrágicas é mais ou menos proporcional à
magnitude da deficiência. Essas estimativas não são possíveis em outros distúrbios
como a fibrose cística, na qual não se conhece a expressão do gene do regulador de
transporte (CFTR), nas vias aéreas e em outras células epiteliais necessária para atingir
benefício terapêutico. Aqui, a gravidade da doença está correlacionada com o tipo de
defeito genético, e não com o nível da expressão da proteína. Esses problemas tomamse mais complexos naquelas doenças nas quais a expressão gênica precisa ser muito
bem controlada. Um desses exemplos é o das talassemias, que são decorrentes de
defeitos na síntese das cadeias a ou
da hemoglobina. A produção excessiva de qualquer uma das subunidades por uma
transferência gênica terapêutica desregulada pode ser tão prejudicial quanto a própria
doença.
Doenças adquiridas. A mecânica da terapia gênica para os distúrbios adquiridos é
potencialmente mais flexível, em termos do ADN inserido, do que a da terapia gênica
para distúrbios hereditários. Nos distúrbios hereditários, um único gene defeituoso que
causa o distúrbio é tipicamente o objeto da intervenção. Nas doenças adquiridas,
entretanto, ou o gene que diretamente contribui para o
distúrbio, ou um gene que medeia um processo bioquímico nã cionado pode ser a base
para a intervenção. Esta diversida abordagens terapêuticas das doenças adquiridas é
ilustrada nas tégias de terapia gênica que têm sido propostas para o tratame
AIDS/SIDA e de vários cânceres. O tratamento da infecção po poderia basear-se na
interrupção dos processos virais que direta contribuem para a patogenia da AIDS/SIDA.
Isso poderia se do por vários meios, inclusive inserindo um gene que produ. ARNm antisentido, ARN catalítico (ribozimas), ou uma pr mutante negativa dominante.
Vacinação. A vacinação mediada por transferência gênic nou-se um campo em rápida
expansão e é aplicável ao tratame doenças tanto infecciosas quanto não-infecciosas.
Vacinação contra doenças não-infecciosas. A terapia gênica pare ças neoplásicas
inclui esforços para induzir urna resposta imune co células tumorais. A idéia de que as
células tumorais podem ser usad provocar uma resposta imune antitumoral baseia-se
em raras obser clínicas de regressão espontânea de tumor, no fato de que alguns turno
mais comuns em hospedeiros imunocomprornetidos e na descoberta genos associados
a tumores em muitos tipos diferentes de tumores. A tégias gerais propostas incluem a
transdução de células tumorais autólol linfócitos de infiltração tumoral) para secretar
uma citocina específica fator de necrose tumoral, interleucina-2, interleucina-4, gama
interfero induzindo a expressão na célula tumoral de um forte antígeno de o (p.ex.,
molécula MHC ou de histocompatibilidade principal alogên induzindo a expressão pela
célula tumoral de moléculas co-estimulach linfócitos (p.ex., B7-1). Vários destes
enfoques atingiram o estágio dc clínicas, mas os dados destes estudos de fase 1 são
limitados e insufli para indicar sua eficácia terapêutica (para artigos sobre este tópico, N
ai., 1994).
Vacinação conira doenças infecciosas. O uso da transferência para estimular
imunidade contra agentes infecciosos também está sem quisado. A inserção de
seqüências de ADN que codificam antígenos imj tes de agentes patogênicos (vacinas
subunitárias) permitiria a síntese cc a apresentação destes antígenos de um modo que
fisiologicamente simi apresentação durante as infecções, sem os riscos da exposição
real ao ganismo patogênico. Isto pode ter implicações significativas no desei mento de
uma vacina de HIV onde as implicações de segurança de uma com HIV vivo e
atenuado são preocupantes.
Obstáculos à terapia gênica
As aplicações terapêuticas da tecnologia de transferência aumentam a cada descoberta
de um novo processo celular. N mento, nossa capacidade de desenvolver terapias
clinicamente zes partindo de sólidos princípios científicos é limitada por• problemas que,
até certo ponto, dificultam todas as estratég terapia gênica. Em um futuro não muito
longínquo, a terapia será limitada a células somáticas (células não da linhagem ger
tiva). O modo como estas células em determinado tecido são do método de
transferência de ADN, tem sido uma área de ir interesse. Uma vez que o gene tenha
sido transferido com suce duração da expressão transgênica toma-se importante.
Finalme próprio vetor de ADN precisa ser estudado quanto a seu potenc causar efeitos
colaterais indesejados (Jolly, 1994).
‘fransporte de ADN e farmacocinética. O transporte de exógeno e seu processamento
por células-alvo exigem a intro de novos paradigmas farmacocinéticos além dos que
descrevi medicações convencionais em uso hoje em dia (Cap. 1). C transferência
gênica in vivo, temos que considerar o destino do do próprio vetor (volume de
distribuição, taxa de depuraçã tecidos etc.), bem como as conseqüências da expressão
gênic rada e a atividade da proteína. Um modelo multicompartimenta descrever estes
eventos de modo quantitativo foi desenvolvid dley e Ledley, 1994). Os processos que
devem ser conside incluem a distribuição do vetor de ADN após a administraç vivo; a
fração de captação do vetor pela população de células
o trânsito do material genético nas organelas celulares; a ta
Cap. 5 TERAPIA GÊNICA
degradação do ADN; o nível de ARNm produzido; a estabilidade do ARNm produzido; a
quantidade e a estabilidade da proteína; e a compartimentalização da proteína dentro
da célula, ou seu destino secretor, uma vez produzida. E concebível, embora ainda não
se saiba como, que cada um destes eventos possa ser incorporado ao planejamento do
sistema de transferência gênica de modo racional, a fim de ajustar a transferência
gênica às necessidades específicas da doença a ser tratada.
Duração da expressão do gene transferido. A duração de tempo na qual o gene
transferido irá funcionar é de suma importância. No tratamento de doenças hereditárias,
seria desejável ter uma expressão gênica estável durante muitos anos. No tratamento
dos processos malignos, por outro lado, é possível que a produção a longo prazo da
proteína terapêutica tenha conseqüências deletérias. A expressão gênica durável ainda
não foi conclusivamente demonstrada em seres humanos, por nenhuma das tentativas
atuais, mas isso está relacionado tanto ao curto prazo do acompanhamento quanto ao
projeto experimental. Os vetores que integram o ADN transferido nos cromossomos da
célula receptora têm o mais alto potencial de expressão a longo prazo. Os vetores
retrovirais e os vetores virais adeno-associados têm funções integrativas. A persistência
do ADN transgênico no ADN da célula receptora não garante, entretanto, a expressão
gêmca a longo prazo nesta célula. A produção do ARNm e proteína pretendidos pode
declinar devido à inativação do promotor transgênico, muito embora o ADN persista. Em
algumas circunstâncias, a perda da expressão transgênica pode ocorrer devido à perda
da célula transduzida pelos processos imunes do hospedeiro (Jolly, 1994, para uma
discussão detalhada deste aspecto).
Conseqüências adversas da expressão gênica heteróloga. Juntamente com os fatores
que limitam a transferência e a expressão gênica, há uma lista crescente de
conseqüências adversas que podem surgir como resultado de uma transferência gênica
bem-sucedida. Tal como acontece com qualquer droga nova, será impossível prever
estes eventos antes de maior experiência clínica. Entretanto alguns eventos específicos
podem ser antecipados independentemente do transgene empregado. Como, na
maioria das circunstâncias, a transferência gênica resultará na síntese de uma nova
proteína, a possibilidade de uma resposta imune precisa ser levada em conta. Uma
grave resposta imune pode inativar um produto secretado (como é visto em pacientes
com hemofilia que recebem fator Viii) ou levar a uma resposta “auto-imune” contra os
tecidos transduzidos. Em algumas circunstâncias, o próprio ADN vetor pode ser
imunogênico, como foi demonstrado para vetores de adenovfrus. Uma resposta imune
ao vetor pode impedir sua readministração ou limitar a duração de sua eficácia.
Podem surgir eventos patológicos da replicação do vetor viral. Esforços significativos
têm sido direcionados para a elaboração de vetores virais que são incapazes de se
replicar (incompetência de replicação) na célula-alvo. Isto tem sido obtido pela deleção
de genes específicos do genoma viral que são necessários para a replicação viral
(Miller et ai., 1993; ver também as legendas das Figs. 5.1 e 5.2). De modo a produzir o
vírus, ele precisa ser cultivado in vitro em uma célula especificamente projetada para
fornecer essas funções removidas do vírus. Por estes meios, foram produzidos
retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados, e herpesvfrus com replicação
deficiente. Este enfoque não elimina completamente o potencial replicativo em todas as
circunstâncias. O vírus pode superar a deleção da maquinaria de replicação pelo uso
de fatores não-identificados da célula hospedeira ou pela recombinação no paciente
com vírus selvagens. Felizmente, nas limitadas experiências atuais em pacientes, estes
eventos não foram relatados.
Aspectos éticos
Como em qualquer tecnologia nova, muita atenção tem sido direcionada para os
aspectos éticos da terapia gênica. Muitos destes
aspectos são comuns a todas as formas novas e caras de tratam médico, tais como
quem terá acesso à terapia e quem irá pagai ela. A percepção de que esta tecnologia
pode ser usada para enge ria genética da linhagem germinativa também tem suscitado
n discussão (Neel, 1993). E também preocupante a possibilidad que as técnicas de
transferência gênica sejam usadas para propó “frívolos”, como alterações cosméticas.
Embora esses aspectos vavelmente sejam tópicos de debates contínuos, no momento,
lidam com eventos muito improváveis. Por exemplo, a transferê gênica para tecidos na
linhagem germinativa de modo a evitar fu gerações de crianças afetadas exigiria
tratamento “profilático” progenitores prospectivos. Como o risco de ter um filho afetad
grande maioria dos casos é de um em dois (doença autossôl dominante), ou de um em
quatro (doença autossômica recessiva) tratamento não será nem isento de risco nem
100% eficaz, é m vável que qualquer progenitor razoável se submeta a tal procedir to.
Mesmo se houver uma introdução bem-sucedida de um novo durante o processo de
fertilização in vitro, é improvável que o f tipo corrigido persista por mais de uma
geração. O novo gene que ser inserido no mesmo cromossomo (chance de 23 para 1 ci
isto), e em íntima proximidade ao gene defeituoso (chance de para 1 contra isto), de
modo que o novo gene ficaria bem próxim gene defeituoso. A alteração de
características normais é ainda forçada, pois temos apenas uma pequena compreensão
dos mi fatores que controlam o aspecto físico, personalidade, inteligên habilidade física,
bem como da compreensão genética dessas c terísticas.
TECNOLOGIA PARA TRANSFERÊNCIA IN VIVO DE GENES
O sistema ideal de transferência de ADN seria aquele que tasse uma grande variação
de tamanho do ADN inserido, fosse ponível em forma concentrada, fosse facilmente
produzido e pud ser dirigido para tipos específicos de células, não permitindo a r cação
do ADN, dando uma expressão a longo prazo do gene, e fosse tóxico nem
imunogêmco. Esse sistema de transferênci ADN ainda não existe, e nenhuma das
tecnologias para a transfe cia gênica in vivo é perfeita com relação a nenhum desses
pontos. 1995, três sistemas de transferência de genes (vetores retrovi vetores
adenovírus e lipossomos) têm sido usados em provas tera ticas gênicas em seres
humanos, com uma experiência clínica tot algumas centenas de pacientes no mundo.
Conseqüentemente, a cussão seguinte destacará estratégias conceituais e aspectos a
sc refinados, e não a experiência clínica.
Vetores virais
O ciclo de vida natural dos vírus de mamíferos os tornou ponto de partida lógico para o
desenvolvimento de veículos de tr ferência gêmca terapêutica, pois os vírus transferem
e expre material genético exógeno durante a infecção. Na análise mais ples, um vírus
consiste em material genético encapsulado em partícula que pode ser captada pela
célula-alvo, levando à expre dos genes codificados pelo vírus. Para que os vetores
virais st úteis, várias funções virais precisam ser alteradas. Uma exigê básica é tornar o
vírus não replicativo para evitar a dispersão mi trolada do transgene, e é preciso ter
algum elemento de seu pré genoma removido para permitir a inserção do transgene.
Além d modificações adicionais irão depender do vírus específico. Os vet virais têm sido
muito usados em pesquisas pré-clínicas e constit a base da maioria das provas
terapêuticas gêmcas em andamento em dia.
Retrovírus. Os vetores retrovirais têm sido os mais empreg até agora e oferecem o
potencial de expressão a longo prazo de transgene integrado estável. Eles não têm
proteínas irrelevant potencialmente imunogênicas, e não existe imunidade de hospec
58 Seção! PRINCÍPIOS
Quadro 5.1. Ensaios de terapia gênica aprovados pela comissão conselheira do ADN
recombinante dos Institutos Nacionais de Saúde.*
TÍTULO DO PROTOCOLO PESQUISADOR DAi
PRINCIPAL APRO
Terapia gênica de pacientes com câncer avançado usando linfócitos de infiltração
tumoral transduzidos com o gene S.A. Rosenberg 31/ codificante do fator de necrose
tumoral.
Imunização dos pacientes com câncer usando células cancerosas autólogas
modificadas por inserção do gene para S.A. Rosenberg 7/l
fator de necrose tumoral (TNF).
Imunização de pacientes com câncer usando células cancerosas autólogas modificadas
por inserção do gene para S.A. Rosenberg 7/li
interleucina-2 (IL-2).
Terapia gênica ex vivo de hipercolesterolemia familial. J.M. Wilson 8/li
Tratamento de deficiência imune combinada grave (SCID) devida a deficiência de
adenosina desaminase (ADA) com R.M. Blaese 1O/ linfócitos autólogos transduzidos
com gene ADA humano: um estudo experimental.
Imunoterapia de malignidade por transferência gênica in vivo em tumores. . G.J. Nabel
iOi
Transferência gênica para o tratamento de câncer. SM. Freeman lO/
Terapia gênica para o tratamento de glioblastoma recorrente multiforme por transdução
de tumor in vivo com o gene K.W. Culver 1/3) de timidina cinase/sistema ganciclovir —
herpes simples.
Estudo de fase 1, em pacientes com fibrose cística, da segurança, toxicidade, e eficácia
biológica de uma única R.G. Crystal l7/ administração de um adenovírus recombinante,
deficiente de replicação, portador do ADNc do gene regulador
normal humano de condutância transmembrana em fibrose cística no pulmão.
Estudo de fase 1 do gene da citocina de células de neuroblastoma autólogo
modificadas para tratamento de M.K. Brenner 1/6?
neuroblastoma refratário/recidiva.
Terapia gênica para o tratamento de tumores cerebrais usando transdução intratumoral
com gene de timidina cinase e E. Oldfield 1/6) ganciclovir intravenoso.
Imunização com células de melanoma alogênicas compatíveis em HLA-A2 que
secretam interleucina-2 em pacientes B. Gansbacher 2/6) com melanoma metastático.
Imunização com células de carcinoma renal alogênicas compatíveis em HLA-A2
secretoras de interleucina-2 em B. Gansbacher 2/6/
pacientes com hipernefroma avançado.
Protocolo clínico para modificação de oncogene e expressão de gene supressor
tumoral em células não pequenas de J.A. Roth 15/
câncer do pulmão (NSCLC).
Terapia gênica de câncer: um estudo piloto de vacinas antitumorais modificadas pelo
gene de IL-4. M.T. Lotze l5/
Terapia gênica de doenças de fibrose cística pulmonar usando adenovírus deletados de
El: experiência fase 1. J.M. Wilson 3/l
Terapia gênica de fibrose cística usando um vetor adenovírus: segurança e eficácia in
vivo no epitélio nasal. M.J. Welsh 4/l
Estudo de fase 1 de injeções de células tumorais autólogas não-replicantes usando
células preparadas com ou sem J. Simons 1/3/
transdução do gene do fator estimulante de colônia granulócito-macrófago em
pacientes com carcinoma
metastático de célula renal.
Administração de EBV marcado com gene de resistência a neomicina específico de
linfócitos t citotóxicos a H.E. Heslop 2/3/ recipientes de enxertos de medula óssea não
aparentados fenotipicamente similares ou aparentados não
compatíveis.
Um estudo de fase 1 de terapia gênica de fibrose cística usando um adenovírus
recombinante deficiente de replicação R.W. Wilmott 2/3/ como vetor para introduzir um
ADNc do regulador de condutância transmembrana de fibrose cística humana nas
vias aéreas.
Terapia gênica para fibrose cística usando o adenovírus deletado El: uma tentativa de
fase 1 na cavidade nasal. R.C.Boucher 2/3/
Uma tentativa de fase 1 de células tumorais autólogas transduzidas com gamainterferon humano em pacientes com H.F. Seigler 7/6/a melanoma maligno
disseminado.
Uso de retrovírus seguramente modificados para introduzir seqüências de resistência
quimioterápica em células A.B. Deisseroth 7/6/
hematopoiéticas normais para quimioproteção durante a terapia de câncer ovariano:
uma tentativa piloto.
Imunoterapia de câncer por transferência gênica direta em tumores. G.J. Nabel 7/6/
Terapia gênica para doença de Gaucher: transferência gênica ex vivo e transplante
autólogo de células CD34+. J.A. Barranger 7/6P
Transferência retroviral mediada por ADNc para glicocerebrosidase humana em célulastronco hematopoiéticas de S. Karlsson 7/6J
pacientes com doença de Gaucher.
Um estudo preliminar para avaliar a segurança de efeitos biológicos do vetor retroviral
murino codificando os genes J.E. Galpin 7/6/ HIV- 1 [HIV-IT(V)j em pessoas
assintomáticas infectadas por HIV- 1.
Uma intervenção genética molecular para AIDS/SIDA — efeitos de uma forma negativa
transdominante de rev. G.J. Nabel 7/M
Terapia gênica para o tratamento de astrocitomas malignos pediátricos recorrentes com
transdução tumoral in vivo do C. Raffel 8/6/ gene de timidina cinase-herpes simples.
* Os protocolos citados foram aprovados durante agosto de 1994. Os protocolos
detalhados destas experiências clínicas estão publicados na revista mensal Human
Gene Therapy.
(co
Cap. 5 TERAPIA GÊNICA
Quadro 5.1. Ensaios de terapia gênica aprovados pela comissão conselheira do ADN
recombinante dos Institutos Nacionais de Saúde.*
Transferência do gene MDR humano em pacientes com câncer avançado. C.
Hesdorffer 8/6/93
Terapia gênica para tumores cerebrais humanos usando transcrição de ADNc antisentido com base em epissomo de J. Ilan 8/6/93 fator 1 de crescimento similar a
insulina.
Imunização de pacientes de melanoma maligno com células de melanoma secretoras
de interleucina-2 expressando T.K. Das Gupta 10/9/9:
antígenos alogênicos de histocompatibilidade definidos.
Transferência retroviralmente mediada do gene humano de resistência multidroga
(MDR-l) em células primordiais J. O’Shaughnessy 9/9/93 hematopoiéticas durante
transplante autólogo após intensa quimioterapia para câncer de mama.
Terapia gênica para tumores cerebrais pediátricos recorrentes. L.E. Kun 9/9/93
Uma tentativa clínica de fase 1 para avaliar a segurança e os efeitos em humanos
infectados pelo HIV- 1 de linfócitos F. Wong-Staal l0/9/9 autólogos transduzidos com
ribozima que cliva ARN de HIV- 1.
Vacinas tumorais autólogas geneticamente modificadas produzindo interleucina-2 para
o tratamento de melanoma J.S. conomou 1W9/9
metastático.
Terapia gênica intratecal para o tratamento de carcinomatose leptomeningeal. E.H.
Oldfield 2/12/9:
Injeção em pacientes com carcinoma do cólon de células tumorais irradiadas autólogas
e fibroblastos geneticamente R.E. Sobol 2/12/9:
modificados para secretar interleucina-2.
Transferência mediada por retrovírus do ADNc para glicocerebrosidase humana para
células repovoadoras de sangue F. Schuening 2/12/9:
periférico de pacientes com doença de Gaucher.
Uma prova terapêutica de fase 1/11 para avaliar a segurança e atividade biológica de
HIV-IT (V) (HIV-l IIBenv/vetor R. Haubrich 3/12/9:
retroviral) em pessoas infectadas por HIV-1.
Uma tentativa de fase 1 de linhagens celulares alogênicas de melanoma letalmente
irradiadas transfectadas com 87 M. Sznol 3/12/9:
para induzir imunidade mediada por células Contra antígenos associados a tumor
apresentada por HLA-A1 em
pacientes com melanoma estágio IV.
Estudo de fase 1 de imunoterapia de carcinoma colorretal avançado por transferência
gênica direta em metástases j. Rubii 3/12/9:
hepáticas.
Imunoterapia adotiva de melanoma com células de linfonodo ativadas, in vivo, com
células tumorais autólogas A.E. Chang 3/12/9:
transduzidas com o gene IL-4.
Terapia gênica para fibrose cística usando transferência gênica catiônica mediada por
lipossomo: tentativa de fase 1 de E.J. Sorscher 3/12/9:
segurança e eficácia nas vias aéreas nasais.
Transferência gênica mediada por adenovírus de CFTR para o epitélio nasal e seio
maxilar de pacientes com fibrose M.J. Welsh 3/12/9:
cística.
Um estudo de fase 1 de imunização com interferon gama de células de neuroblastoma
transduzidas. 3. Rosenblatt 3/3/94
Um estudo piloto de fase 1111 da segurança da transferência adotiva de linfócitos T
citotóxicos singênicos modificados R. Walker 3/3/94 por gene em gêmeos idênticos
infectados por HIV.
Expressão de um gene de alfa-l antitripsina exogenamente administrado no trato
respiratório de pacientes humanos. K. Brigham 3/3/94
Estudo de fase 1 de imunoterapia para carcinoma metastático de célula renal por
transferência gênica direta em lesões N. Vogelzang 4/3/94 metastáticas.
Estudo de fase 1 de imunoterapia de melanoma maligno por transferência gêmca
direta. E. Hersh 4/3/94
Tentativa de fase 1 de uma imunização antitumoral aumentada com polinucleotídio de
antígeno carcinoembrionário D. Curiel 9/6/94
humano em pacientes com câncer colorretal metastático.
Prova terapêutica para avaliar a segurança, possibilidade e eficácia ao transferir um
gene de citocina potencialmente C.H. Evans 9/6/94
antiartrítico para articulações humanas com artrite reumatóide.
Uso de um retrovírus modificado com segurança para introduzir seqüências de
resistência quimioterápica em células A. Deisseroth 9/6/94 hematopoiéticas normais
para quimioproteção durante a terapia de câncer de mama: uma tentativa piloto.
Transferência gênica mediada por retrovírus do gene de grupo C de complementação
da anemia de Fancom para J.M. Lju 9/6/94
progenitoras hematopoiéticas de pacientes grupo C.
Protocolo clínico para modificação de expressão e indução de apoptose pelo gene
supressor tumoral em células não J.A. Roth l0/6/9
pequenas de câncer de pulmão (NSCLC) com um vetor adenoviral expressando p53
selvagem e cisplatina.
Infecção de pacientes de glioblastoma com células tumorais geneticamente modificadas
para secretar interleucina-2 R.E. Sobol l0/6/9
(lL-2): um estudo fase 1.
Terapia gênica de IL-2 usando injeção direta no tumor de fibroblastos autólogos
geneticamente modificados. M.T. Lotze l0/6/9
Estudo de fase 1111 de gene autólogo humano de GM-CSF transduzido de vacinas de
câncer de próstata em pacientes 1. Simons 3/8/94
com carcinoma metastático de próstata. ___________ __________________
________________________
* Os protocolos citados foram aprovados durante agosto de 1994. Os protocolos
detalhados destas expeiiências clínicas estão publicados na revista mensal Hw,wn
Gene Therapy.
TÍTULO DO PROTOCOLO PESQUISADOR DATA Li
PRINCIPAL
APROVA
60
Seção! PRINCÍPIO
preexistente ao vetor. Sua aplicação, entretanto, é limitada a células em divisão. A
produção em larga escala é tecnicamente possível, embora a purificação e a
concentração potencialmente sejam problemáticas devido à instabilidade do vírus.
Vários aspectos de segurança foram levantados, mas até agora não foram apoiados
pela experiência clínica.
Os retrovfrus foram inicialmente descritos para aplicação em transferência gênica em
1981 e primeiro usados em tentativas clínicas em 1989 (Rosenberg et ai., 1990). Os
retrovírus são compostos de um genoma de ARN que é acondicionado em um
envoltório derivado da membrana da célula hospedeira e de proteínas virais. Para que
os retrovírus efetuem a expressão gênica, eles primeiro têm que fazer uma transcrição
reversa de seu filamento de ARN para um ADN bicatenular, que é então integrado ao
ADN da célula hospedeira. Este processo é mediado pela transcriptase reversa e pela
integrase, proteínas contidas na partícula do retrovírus. O provírus integrado é capaz de
usar a maquinaria da célula hospedeira para fazer a transcrição de ARNm virais bem
como seu processamento subseqüente e tradução em proteínas virais. O vírus
completa seu ciclo de vida sintetizando novos filamentos de sentido positivo de ARN a
partir do provírus integrado. Um sinal de encapsulação () no ARN medeia a organização
do ARN genômico viral e de proteínas em partículas que brotam da superfície celular.
Desenvolvimento do vetor retroviral. A organização genômica dos retrovírus é
simples, e esta propriedade facilita sua manipulação em vetores para uso na terapia
gênica. O vírus da leucemia murina e seus congêneres são os vetores retrovirais mais
amplamente usados (Miller et ai., 1993). Os vetores retrovirais são construídos a partir
da forma proviral do vírus. Os genes gag, poi e env são removidos para abrir espaço
para o(s) gene(s) de interesse terapêutico e eliminar as funções replicativas do vírus
(ver Fig. 5.1 para uma compreensão da estratégia). Até 8 quilobases* de ADN
heterólogo podem ser incorporados ao vetor retroviral. Como todos os ARNm
viralmente codificados são eliminados dos retrovírus recombinantes, nenhuma proteína
viral é produzida por vetores retrovirais. Isto remove qualquer antígeno viralmente
codificado potencial que possa levar a uma resposta imune contra as células
transduzidas. Juntamente com o gene de interesse terapêutico, genes que codificam a
resistência a antibióticos com freqüência são incluídos no retrovírus recombinante como
um meio de selecionar as células que contêm o vírus em culturas ex vivo. O gene
bacteriano para aminoglicosídeo-3’-fosfotransfe- rase, que confere resistência à
canamicina, neomicina e geneticina, bem como o gene para higromicina B
fosfotransferase, que confere resistência à higromicina, são dois destes exemplos de
genes de resistência a antibióticos introduzidos em vetores retrovirais para a terapia
gêmea. A presença do gene de resistência a antibióticos facilita o isolamento do
retrovírus recombinante e a subseqüente determinação do título do vírus. As
seqüências que contêm as funções de promotor e acentuador também podem ser
incluídas com o trans- gene para facilitar sua expressão eficiente e, em algumas
circunstâncias, fornecer a expressão histoespecífica após a administração in vivo.
Alternativamente, as atividades promotora e acentuadora contidas na longa repetição
terminal do vírus podem ser usadas para este fim.
Linhagens de ce7ulas hospedeiras. Após a deleção dos genes que codificam
proteínas estruturais virais e das proteínas mediadoras da replicação viral, estes vírus
podem ser produzidos apenas em linhagens celulares especialmente preparadas, que
sejam capazes de fornecer estas proteínas (Fig. 5.1). A linhagem celular hospedeira é
idealmente construída inserindo-se estavelmente os genes virais deletados (gag, poi e
env) na célula, de tal maneira que estes genes residam em cromossomos diferentes
dentro da célula. Esta estratégia garante que a recombinação destes genes seja
altamente improvável. Na ausência de tal recombinação, é impossível produzir um ARN
genômico viral intacto que possa ser acondicionado em um vírus capaz de replicação. A
célula hospedeira é usada para construir uma linhagem produtora de retrovírus que
gere retrovírus sem replicação contendo o(s) gene(s) de interesse. Isto é feito inserindose o ADN proviral recombinante na linhagem celular hospedeira. O ADN recombinante
proviral está sob a forma de ADN de plasmídio contendo as seqüências de longas
repetições terminais que cercam uma pequena parte do gene gag que contém a
seqüência de encapsidação e os genes de interesse. Isto é transfectado para a célula
hospedeira usando-se uma das várias técnicas de transferência e captação de ADN
(eletroporação, precipitação de cálcio etc.). Várias versões desta organização básica
foram empregadas para diminuir a probabilidade de eventos recombinantes que
possam levar à produção de vírus capazes de replicação (Jolly, 1994). Modificações
adicionais foram empregadas para alterar a gama de células hospedeiras do vírus. Isto
é determinado em grande parte pelo gene do envoltório (env). O vírus da li murina de Moloney
é ecotrópico, o que significa que a infecção é n células de uma determinada espécie,
neste caso o camundongo. Um en que permita uma maior faixa de infecção está
disponível usando-se o da linhagem 4070A do vírus da leucemia murina. Este gene de
envolti uma especificidade anfotrófica e pode promover a infecção de célula nas,
munnas, e de outros mamíferos. Genes env com especificida ampliam a faixa de
hospedeiros a células que não de mamíferos també disponíveis. Os esforços para
projetar novos ligantes na proteína do en’ têm apresentado sucesso limitado, pois o
vírus produzido em geral é d título. Entretanto, a capacidade de direcionar
especificamente o vírus de reestruturação molecular é uma meta importante e, sem
dúvida, n mais atenção no futuro.
Administração clínica de retrovírus. A administração clínica dei rus tem sido feita
pela transdução ex vivo das células do paciente, pela direta do vírus em um tecido e
pela administração das células pr retrovirais.
Transferência gênica ex vivo. A abordagem e vivo é a mais emr em experiências
clínicas em seres humaos. Embora trabalhosa por e isolamento e a manutenção em
cultura de tecidos das células do pacien a vantagem de que a transferência gênica
pode ser prontamente quanti e uma população específica de células pode ser atingida.
Além disso, ui proporção de partículas virais para células-alvo pode ser obtida, aume
assim a eficiência da transdução. Este enfoque foi usado para mc linfócitos (Anderson
et ai., 1990; Rosenberg et ai., 1990; Culver et ai.. e células hematopoiéticas (Nienhuis
etal., 1991), no tratamento da defi de adenosina desaminase (Anderson et ai., 1990), no
tratamento da hit demia (Grossman et ai., 1994) (ver Fig. 5.4, adiante) e para expressar
a moduladores imunes em células tumorais (Lotze et ai., 1992; I.otze, Lotze et ai.,
1994). E lógico que nem todas as potenciais aplicaçi doenças são passíveis de
transferência ex vivo de genes, pois a remoç cultura de células do paciente podem não
ser tecnicamente possíveis. E circunstâncias, a introdução direta do vírus in vivo é
necessária.
Transferência gênica in vivo. Os retrovírus estão sendo testados agentes potenciais
para tratar tumores cerebrais que, em muitas circu cias, são relativamente inacessíveis.
Aqui, a capacidade inerente de um vírus em transduzir apenas células em divisão
(células tumorais) e poii células que não se dividem (parênquima cerebral normal) seria
particula te vantajosa. Embora a injeção estereotática direta do retrovírus recomb no
tecido-alvo seja possível, a eficiência da transferência gênica geralni muito baixa.
Vários fatores contribuem para a ineficiência da transferência
retroviral in vivo. As preparações de retrovírus são relativamente diluíd comparação a
outros vetores, tipicamente com 106 a l0 unidades form de placas por mililitro. Além
disso, o vírus consegue transduzir apenas e em divisão, e no tecido-alvo apenas uma
pequena fração de células pod se dividindo no intervalo de tempo entre a injeção do
vírus e a depuras vírus. Assim, mesmo com um grande excesso de vírus, apenas uma
fraç células é efetivamente transduzida. Para superar estas dificuldades, Oldi
colaboradores (1993) propuseram a administração de uma linhagem e produtora de
retrovfrus diretamente nos tumores cerebrais do paciente u injeção estereotática. Sua
hipótese foi que a célula produtora murina sol veria no tumor cerebral por alguns dias, e
durante este tempo secr retrovfrus capazes de transduzir o tumor cerebral adjacente.
Estudos est progresso em um número limitado de pacientes usando o gene da tin
cinase do vírus herpes. Este gene torna as células susceptíveis a desti pelo antibiótico
sistemicamente administrado ganciclovir, que é metabol a um metabólico citotóxico pela
timidina cinase. Alguns problemas impi tes precisam ser solucionados antes que este
enfoque ganhe ampla aceil A capacidade do vírus em difundir-se da célula produtora
para as c tumorais não-vizinhas ainda não foi bem quantificada. Se a área das ci
tumorais transduzidas for pequena, as células tumorais que ficam em co microscópicos
do tumor infiltrando o cérebro normal podem ficar sem mento. Também não sabemos
se uma resposta imune à linhagem ci produtora xenogênica impede o tratamento
subseqüente do tumor resi Isto será muito importante considerando que, na época da
secreção do todas as células tumorais podem não estar se dividindo ativamente e, poIl
algumas células podem ser poupadas. Tratamentos em série, como na qui terapia
convencional, poderiam ser necessários para obter-se a erradi completa do tumor. Os
resultados das experiências clínicas estão sendo dos e estudos subseqüentes podem
responder a essas dúvidas.
Segurança das estrat€gws de vetor retroviraL O uso de vetores rei rais levantou
vários aspectos importantes de segurança. Uma preocupai que como o vírus se integra
aos cromossomos das células-alvo (uma caí
* N.T.: Cada 1.000 pares de bases do ADN formam 1 quilobase.
Fig. 5.1 Transferência gênica mediada por retrovírus.
A. Estratégia geral de produção retroviral. A replicação de vetores retrovirais deficitários
é produzida a partir de uma célula auxiliar preparada para fornecer as funções virais
(ADN) que foram removidas do vírus. As seqüências gag (G), pol (P) e env (E) de ADN
são clonadas em plasmídios de ADN que são então transfectados na célula auxiliar
para produzir a célula hospedeira. Estas células hospedeiras são capazes de produzir
as proteínas gag, p01 e do envoltório necessárias à replicação retroviral. Um plasmídio
contendo ADN proviral recombinante, mas sem os genes gag, pol e em’, é transfectado
para a linhagem
ADN do retrovirus integrando-se ao genoma de célula em divisão
de células hospedeiras para criar a célula produtora que contém toda a na naria
molecular necessária para reproduzir o retxovfrus recombinante q secretado no meio de
cultura de tecidos. Apenas a seqüência proviral re binante é acondicionada no
retrovírus. Como o retrovírus recombinante contém os genes gag, p01 e env, as células
que este retrovfrus recombir com replicação defeituosa infecta não conseguem produzir
virions adicio B. Expressão do gene de interesse na célula-alvo após a transferência
de) mediada por retrovírus.
rística atrativa para a expressão a longo prazo) e como a integração ocorre de modo
quase aleatório, a integração pode ser mutagênica. Por exemplo, podem ocorrer
mutações indesejáveis se a inserção do ADN retroviral alterar o funcionamento de um
gene regulador do crescimento celular. Embora os retrovfrus com capacidade de
replicação tenham um potencial tumorigênico, isto não tem sido observado com vetores
deficientes de replicação que estão em uso como agentes de transferência gênica.
Adicionalmente, isto não tem sido observado em pacientes que tenham recebido terapia
gênica retroviral. Entretanto, o número de pacientes estudados até hoje é muito
pequeno e seu acompanhamento muito curto para a atual experiência clínica ser
extrapolada com relação a segurança a longo prazo.
Demonstrar que os agentes retrovirais não se replicam é de importância capital. Vírus
com capacidade de replicação podem surgir de vários modos. Como já foi notado, a
recombinação dos elementos genéticos retrovirais inseridos na célula hospedeira é
extremamente improvável. A recombinação
com outros genomas retrovirais é, entretanto, teoricamente possível. Exi seqüências
retrovirais endógenas em linhagens celulares de camundongo das para criar linhagens
de células hospedeiras. O uso de linhagens celul derivadas de cães ou seres humanos
sem essas seqüências já foi prop (Jolly, 1994). A recombinação com seqüências
retrovirais na célula-ai teoricamente possível. Os retrovírus murinos selvagens, dos
quais derivai vetores genéticos, não infectam as células humanas. Portanto, é improv
que um vírus selvagem possa infectar a mesma célula-alvo e levar à recup ração do
vetor retroviral defeituoso. Entretanto, realmente existem retro endógenos em todos os
tecidos humanos (HERV-K) que têm um baixo de homologia com os vetores retrovirais.
E muito improvável que este tip recombinação ocorra com freqüência suficiente para
levar a resultados ad sos clinicamente significativos. Na análise final, a segurança deste
e de OL vetores precisa ser determinada por experiência clínica direta e sua segun
avaliada em relação aos benefícios terapêuticos.
A
Cap. 5 TERAPIA GÊNICA
Célula auxiliar
Célula hospedeira
Célula produtora
Vetor plasmídio que codifica os genes gag,
pole env
Vetor plasmídio que codifica o gene de
interesse
()
o
B
Vetor retroviral que codifica o
genede
interesse •.. ..
()
Ligação à superfície da célula
/
Expressão de gene heterólogo
Membrana citoplasmática
62
Adenovírus. São conhecidos mais de 40 sorotipos de adenovírus humanos, e muitos
adenovfrus animais já foram caracterizados em graus variados. O espectro clínico de
infecções adenovirais humanas está bem descrito (Horwitz, 1990). As infecções que
envolvem as vias respiratórias são comuns e tipicamente autolimitadas em hospedeiros
normais. Infecções gastnntestinais, hepáticas e do SNC ocorrem esporadicamente. A
maioria dos adultos, senão todos, tem uma exposição prévia ao adenovírus e são
soropositivos para anticorpos antiadenovfrus quando testados por métodos sensíveis.
Nos Estados Unidos, os recrutas militares são especificamente vacinados com uma
vacina adenoviral polivalente para evitar surtos de infecções respiratórias (Rubin e
Rorke, 1994). Em oposição aos retrovírus, estes vírus maiores, sem envoltório,
possuem um genoma com ADN bicatenular, e se replicam independentemente da
divisão da célula
hospedeira.
Os vetores adenovirais possuem várias características atraentes que estimularam seu
desenvolvimento para uso clínico. Eles são capazes de transduzir um amplo espectro
de tecidos humanos, incluindo o epitélio respiratório, o endotélio vascular, os músculos
cardíaco e esqueléticos, os tecidos nervosos central e periférico, os hepatócitos, o
pâncreas exócrino e muitos tipos de tumor. Níveis excepcionalmente altos de
transferência gênica e expressão de transgenes podem ser obtidos em células que
estão ou não se dividindo. Várias vias de administração podem ser usadas incluindo
intravenosa, intrabiliar, intraperitoneal, intravesicular, intracraniana e iniratecal, bem
como a injeção direta no parênquima do órgão-alvo. Até agora não foi possível
modificar o adenovfrus para obter um vírus histo-especffico. As múltiplas vias de
administração podem superar esta deficiência dando flexibilidade ao direcionamento
com base nas limitações anatômi cas.
As provas terapêuticas que usam adenovírus foram limitadas até
agora a protocolos em desenvolvimento para fibrose cística, nos quais o adenovírus
recombinante é introduzido por aerossol nas vias respiratórias. Estudos empregando a
administração direta de vetores adenovirais no fígado para tratar deficiências
hereditárias e vários tipos de tumores provavelmente começarão em futuro próximo (ver
Ohno et ai., 1994, e Kozarsky eta!., 1994, para dois exemplos de estratégias de terapia
gênica adenoviral).
A estrutura genômica dos adenovírus é mais complexa do que a dos retrovírus. O
genoma adenoviral codifica aproximadamente 15 proteínas. A infecção ocorre quando a
proteína da fibra, que se estende a partir do capsídio icosaédrico, liga-se a um receptor
de superfície celular. Subseqüentemente, as seqüências peptídicas na base penton do
capsídio ligam-se aos domínios receptores de integrina (a ou tx3135) na superfïcie
celular. Isto leva à internalização do vírus via endossomo, onde a partícula viral começa
a se desmontar. O vírus escapa do endossomo antes de sua fusão com os
compartimentos lisossômicos, e assim evita a digestão. O ADN viral consegue entrar no
núcleo da célula-alvo e começar a transcrição do ARNm viral sem a concomitante
divisão celular. Embora a integração ao ADN viral no ADN genômico da célula
hospedeira possa ocorrer em altos níveis de infecção nas células em divisão, isto é
relativamente raro e não contribui significativamente para a utilidade destes vírus como
vetores. A expressão gênica viral e a replicação ocorrem de modo ordenado, e são
desencadeadas em grande parte pelos genes EIA e E1B na parte 5’ do genoma
adenoviral. Os genes EIA e EIB fornecem funções de transativação para a transcrição
de vários genes virais a jusante (Horwitz, 1990).
Como os genes El estão envolvidos intimamente na replicação do adenovírus, sua
remoção torna o vírus incapaz de replicação, ou pelo menos, muito deficiente com
relação à replicação. Devido à complexidade do vírus, tem sido mais difícil remover
todos os genes adenovirais como é feito com vetores retrovirais. A expressão das
proteínas adenovirais, com os vetores adenovirais atualmente empregados, leva tanto a
uma resposta imune celular quanto humoral aos vetores adenovirais recombinantes.
Em alguns casos, isto limita a utilidade deste vetor em termos de resposta do
hospedeiro às células transdu7idas por adenovírus e com relação a readministração do
vetor.
Desenvolvimento dos vetores adenovirais para terapia gênica. Embora vários
sorotipos adenovirais sejam conhecidos, os sorotipos 2 e 5 têm sido os mais usados
para a construção de vetores. Os vetores adenovirais podem ser construídos usando-se
um dos vários enfoques gerais. Um diagrama esquemá Seçã
1 PR!NCÍPI(
tico destacando os elementos básicos de um vetor adenoviral par gênica é mostrado na
Fig. 5.2. Bett e colaboradores (1994) desenvolv vetor adenoviral do tipo 5 baseado em
plasmídios bacterianos co genoma do adenovírus com deleções dos genes adenovirais
El e E3.? de El compromete a capacidade de replicação do vírus. Além disso parte da
região E3, que não é essencial para o funcionamento do deletada de modo a acomodar
o ADN inserido no genoma do adeno’ genes de interesse podem ser clonados nas
regiões de deleção, e o p vetor pode então ser cultivado em cultura bacteriana. O ADN
de p purificado subseqüentemente é transfectado para a linhagem 293 d renais de
embrião humano. A linhagem celular 293 foi criada para e as proteínas El e pode,
portanto, transcomplementar o genoma vir vírus pode ser isolado do meio com células
293 e purificado por dos diluição limitada (Graham e Prevek, 1991). Um enfoque
alternativo é um plasmídio contendo o gene de interesse, flanqueado por seqüêl ADN
do adenovírus. A transfecção deste plasmídio em células 293 jun com o ADN genômico
adenoviral com deleções selecionadas (p.., à formação de partículas adenovirais com o
transgene substituindo El por recombinação homóloga. E esta estratégia que é dada
em det Fig. 5.2. Tanto a clonagem direta quanto a recombinação homóloga po usadas
para produzir adenovfrus deletadn de El, sem replicação.
Grandes quantidades do sistema adenoviral criado podem ser pro através do
crescimento do vírus recombinante em culturas de células vírus é isolado através da
lise das células 293 infectadas e da purific lisado não refinado por centrifugação por
densidade de cloreto de cé procedimento que não só separa o vírus de outras
substâncias denv cultura de tecidos, mas também concentra o vírus em títulos bem
altos partículas/mI). O vfrus purificado é acentuadamente estável em m tampões
aquosos, e pode ser congelado por um prolongado período di sem perda de atividade.
Duração da expressão do transgene. Atualmente, os vetores ader são limitados por sua
duração de expressão do trangene relativament Vários fatores contribuem para isso,
incluindo a depuração das célula duzidas por células T citotóxicas e outras células
inflamatórias (Yaní 1994) e perda dilucional de ADN epissômico durante a divisão da
célul O primeiro provavelmente será resolvido pela organização de vetores virais que
são menos imunogênicos. Os vetores com mutações sens temperatura na região E2
são claramente menos imunogênicos e oô uma expressão gêmea significativamente
mais longa (Engelhardt et ai., Suprimindo o gene E4 de vetores adenovirais também
podemos dim resposta imune às células transduzidas (Armentano eta!., 1994). As ge
subseqüentes dos vetores adenovirais com modificações adicionais do ma adenoviral
ou o uso de adenovírus não-humanos pode promover o vetores adenovirais. A natureza
epissômica do genoma dos adenovírus a duração da expressão gênica nos tecidos com
ativa divisão celular, tais medula óssea e epitélios de superfície. Como cada ciclo de
divisão da alvo após a transferência do gene não é acompanhada pela replicaç
transgene, as células-filhas terão progressivamente menos e, por fim, nei cópia do
transgene. A integração do vetor adenoviral ocorre, mas não ei freqüência
suficientemente alta para ser útil.
Segurança das estratégias de vetor adenoviral. A segurança dos v adenovirais
provavelmente surgirá das atuais tentativas clínicas. Os prin efeitos colaterais são da
resposta imune do hospedeiro às proteínas ad rais, uma limitação que pode ser
eliminada pelas futuras gerações de v Existe alguma preocupação, entretanto, de que a
replicação do vetor ocorrer a despeito da remoção de genes reguladores importantes.
Coi infecções adenovirais do tipo selvagem são comuns, existe a possibilids que os
vírus do tipo selvagem possam se recombinar com vetores defic de replicação para
produzir vírus recombinantes capazes de replicação bora não observada nas atuais
tentativas clínicas de fibrose cística, isto p nece em expectativa. Adicionalmente, há
uma soma crescente de evidé de que alguns tipos celulares podem conter proteínas
com funções homé a Ela e, portanto, capazes de fornecer um ambiente pennissivo para
repli viral recombinante. Com os atuais vetores adenovirais, n.o é muito pro que isso
evolua para uma infecção grave, devido à imunidade preexister hospedeiro à infecção
adenoviral. Entretanto, no futuro, os vetores adeno serão capazes de escapar deste
mecanismo de proteção, e a replicação recombinante pode se tornar uma grande
preocupação.
Vírus adeno-associado. O vírus adeno-associado (AAV) pt ter muitas das
características desejáveis dos retrovfrus e adeno’ sem alguns de seus aspectos
negativos potenciais, para ser apli na terapia gênica (Kotin, 1994). Este parvovfrus não
autônomo ADN unifilamentar é capaz de se integrar eficientemente ao ger
Cap. 5 TERAPIA GÊNICA
Unidade de transcrição ativada por CVM 0,0 um.
Nhe 1 Promotor
Adição
de O a 1
B
Adenovírus recombinante (—36 kb)
• replicação defeituosa nas células sem a região El do adenovírus
• totalmente capaz de infectar células-alvo
Fig. 5.2 Transferência gênica mediada por adenovfrus.
A. Construção do adenovfrus recombinante para preparação das células. Estratégia
para preparação de adenovírus recombinante por recombinação homóloga. O
adenovfrus recombinante que codifica um gene de interesse pode ser produzido
clonando o gene de interesse (retângulo cinza escuro) em um plasmídio. Este
transgene é flanqueado por uma seqüência promotora fp.ex., promotor CMV) e por
regiões do genoma do adenovírus (retângulo cinza claro). O exemplo aqui é baseado
no adenovírus 5. O ADN do adenovírus 5 é dividido em 100 unidades de mapa (360
pares de base por unidade de mapa; um.). As deleções são feitas no ADN do
adenovírus para remover as regiões El (1 a 9,2 u.m.) e E3 (78,4 a 84,3 u.m.), para
eliminar a possibilidade de replicação autônoma e criar espaço para a inserção do
transgene. A recombinação homóloga ocorre entre o ADN do plasmídio e o ADN
genômico do adenovírus para produzir o vírus recombinante. Como a seqüência
transgênica substitui os genes El do adenovírus, este é incapaz de se replicar em
células que não as produzidas para expressar os produtos do gene El, tais como as
células 293 de rim de embrião humano mostradas aqui.
Após a linearização do plasmídio pela digestão com uma endonucle (p. ex, Nhe 1 neste
exemplo), o plasmídio expressando o transgene é cotn fectado com o ADN genômico
do adenovírus do qual foi removida a pont (p.ex., digestão com endonuclease Cla 1 em
Ad a 2,5 um.), também para e’ a replicação autônoma do adenovírus, até que ocorra a
recombinação honu ga, que neste exemplo ocorre dentro das células 293.
B. infecção de células-alvo mediada por adenovfrus. Expressão do g de interesse na
célula-alvo após a colocação do ADN mediada por aden rus. Um adenovírus
recombinante liga-se a receptores específicos na sup cie da célula-alvo e entra na
célula por endocitose. As proteínas virais pro vem o escape do adenovírus do
endossomo antes que ele se funda os lisossomos e seja destruído por eles, O ADN do
adenovírus se lib das proteínas virais e vai para o núcleo onde começa a sintetizar um ri
ARNm. O ADN codificado por adenovírus, incluindo o transgene, ni integrado ao
genoma da célula hospedeira. (Modificado de Greber etal.. l com permissão.)
A
Adção Promotor deoal CMV
u.m.
Nhe 1
Digestão enzimática para linearizar o ADN (Nhe 1 usada aqui)
enéd’eøe U
Plasmídio codificante
9.0 um.
16 um.
Gene de intemase flanqueado por
Digestão enzimática de ADN de adenovírus (da I usada aqui)
um.
Cia 1
r2.5
ADN de adenovírus
9,0 um. 16 um. 100 um.
Cotranstecção in células 293
Células 293 alteradas para ejpressar proteínas El
Recombinação homóloga intracelular do ADN introduzido e
expressão de El pelas células 293
1.1
9 um.
16 um.
100 u.m.
Complexo do poro de envoltório nuclear
64
Seção 1 PRINCIPIO
de células que não se dividem, de uma ampla faixa de hospedeiros. A integração do
vírus tipo selvagem é especffica para o cromossomo 19 (1 9q 13.3-qter), ou pelo menos
mostra integração preferencial por este ponto. Embora de natureza ubíqua, não se tem
demonstrado o AAV associado a nenhuma doença humana conhecida e ele não evoca
uma resposta imune em um hospedeiro humano infectado, O AAV é um vírus não
envolvido que é capaz e estável a uma variedade de manipulações químicas e fisicas; e
portanto pode ser purificado, concentrado e estocado por períodos prolongados.
No momento, o uso de AAV como um vetor para a terapia gênica é limitado por
dificuldades em produzir o vírus em grandes quantidades e, o mais importante, por uma
falta de compreensão da biologia do vírus recombinante. Ainda não foi determinado se
estes vetores têm ou não a habilidade de infectar e se integrar a células que não se
dividem, uma característica importante do vírus selvagem que promoveu seu uso. Há
pouca experiência nos seres humanos com esses novos vetores, O Recombinant DNA
Advisory Convnittee dos National Institutes of Health aprovou a primeira prova
terapêutica de AAV em pacientes com fibrose cística. Esta tentativa pode fornecer
informações sobre a duração da expressão gênica após uma transferência gênica
mediada por AAV em células epiteliais diferenciadas de vias aéreas.
O AAV tem duas fases distintas em seu ciclo de vida. Na ausência de um vírus auxiliar
(adenovírus), o vírus tipo selvagem irá infectar a célula hospedeira, se integrar ao
genoma da célula hospedeira, e permanecer latente por um longo período de tempo.
Na presença do adenovírus, a fase lítica do vírus é induzida, a qual é dependente da
expressão dos genes adenovirais iniciais, e leva a uma ativa replicação do vírus.
Estruturalmente, o genoma do AAV é composto de duas matrizes de leitura abertas
(chamadas rep e cap) flanqueadas por seqüências invertidas tenninais repetidas (ITRs).
A região rep codifica quatro proteínas que medeiam a replicação de AAV, a transcrição
do ADN viral, e as funções de endonuclease usadas na integração do genoma
hospedeiro. Os genes rep são as únicas seqüências AAV necessárias para a replicação
viral. A seqüência cap codifica proteínas estruturais que formam o capsídio viral. As
ITRs contêm as origens virais de replicação, fornecem os sinais de encapsidação e
participam na integração do ADN viral. A função de muitas dessas proteínas e a
biologia geral do vírus têm sido amplamente estudadas nos vírus selvagens (Kotin,
1994). Os vfrus recombinantes deficitários de replicação, que têm sido desenvolvidos
para a terapia gênica, não têm seqüências rep e cap. Os vírus recombinantes não são
tão bem estudados, e não se sabe se esses vírus mantêm todas as características do
vírus tipo selvagem (integração sítio-específica em uma célula que não está se
dividindo).
A produção de AAV em grandes quantidades é consideravelmente mais dificil que a
produção de retrovírus ou adenovírus. Os AAV deficientes de replicação podem ser
produzidos cotransfectando os elementos separados necessários para a replicação de
AAV em uma linhagem celular permissiva (tipicamente as células 293). Em um método
comumente usado, o ADN plasmídio contendo rep e cap, sob o controle de promotores
AAV mas sem ITRs, é transfectado em células 293. O ADN contendo o gene a ser
“embalado” (promotor, acentuador, transgene e sinal de poliadenilação) flanqueado por
lTRs é cotransfectado ao mesmo tempo. A infecção com adenovírus fomece funções
auxiliares que induzem a síntese de proteínas rep, que por sua vez transativam a
síntese das proteínas do capsídio. O transgene flanqueado por ITRs é então embalado
em partículas virais que podem ser isoladas e purificadas por centrifugação de
densidade em cloreto de césio. Este enfoque requer que o plasmídio que expressa ITR
(ITR’ aqui, o plasmídio codificante do transgene) tenha pouca homologia de seqüência
com plasmídios ITR (cap e rep) para reduzir a possibilidade de eventos de
recombinação que possam levar à produção do vírus selvagem. Sistemas
aperfeiçoados para preparação
- de AAV recombinante estão sendo desenvolvidos, incluindo o uso de linhagens
celulares produtoras que forneçam as funções rep e cap. Tal enfoque não só
simplificaria o esquema de transfecção, mas também forneceria as proteínas rep e cap
em quantidades maiores, levando a maior produção de vírus recombinantes.
Vetores vacínia (vírus pox). A extensa experiência clínica com vacinas vacínia e sua
facilidade de manipulação levaram a esforços para desenvolver vetores de terapia
gênica a partir dos vírus pox (Moss e Flexner, 1987; Moss, 1990). Vacínia são grandes
vírus com ADN envolvidos que se replicam no citoplasma de células infectadas.
Como o adenovírus, eles podem infectar células tanto de tecidos diferentes que não se
dividem tanto quanto as que se e e fornecem expressão gênica de curto prazo de um
genoma vi integrado. O vírus recombinante pode ser produzido inserin transgene em
um plasmídio derivado de vacínia e transfect este ADN para células infectadas por
vacínia. A recombinação ioga leva à produção do vírus recombinante que pode ser pur
por piaqueamento. E facilmente obtida uma grande produção que pode ser estocada
por longos períodos de tempo. O vírus’ pode acomodar inserções muito maiores de
ADN do que os r rus, adenovírus ou vetores AAV. Além disso, como o vírus sei não
existe mais na natureza, a recombinação para produzir linhagens de vírus é improvável.
O aspecto negativo do us vetor é que ele provoca uma resposta imune no hospedeiro
às 200 proteínas viralmente codificadas. Isso provavelmente torr biemática a
administração repetida. A replicação do vetor tan uma preocüpação, pois pode resultar
em morbidade significat hospedeiros imunodeficientes. lssopode ser superado com
gerações de vírus vacínia construídos. No momento, este siste vetor não foi adotado
para tentativas clínicas de terapia gênica na, embora possa ser útil como vetor de
vacina.
Vetores de vírus herpes simples 1. O vírus herpes simple kb), um vírus com ADN
bicatenular, replica-se no núcleo de c infectadas. Ele tem uma ampla faixa de
hospedeiros, e pode iii células que se dividem e que não se dividem, bem como persis
um estado não integrado. Grandes seqüências de ADN exóget dem ser inseridas no
genoma viral por recombinação homólog vírus recombinante defectivo de replicação
pode ser purifica placas em células Iranscomplementares (IEj. Estas vantagen as
estratégias de terapia gênica são prejudicadas pela dificulda tornar as preparações
virais totalmente livres de vírus com cap de replicativa e a provocação de uma potente
resposta imune teínas codificadas pelo vírus que são diretamente tóxicas para a la. A
despeito dessas aparentes dificuldades, as vantagens tais sua habilidade em acomodar
grandes inserções de ADN (20 a 3 a disponibilidade de estoques com altos títulos, e
seu neurotrop estimularam o interesse em desenvolver úteis vetores de vírus h
(Kennedy e Steiner, 1993).
A supressão do gene da timidina cinase torna o vírus herpes deficiei replicação em
células com níveis baixos de timidina cinase endógena (e que não se dividem,
terminalmente diferenciadas). Por outro lado, as e que sofrem ativa divisão celular
(p.ex., células tumorais) possuem sufi atividade de timidina cinase para permitir que o
vírus herpes sem timidi cinase se replique. Este tipo de vetor pode ser útil para o
tratamento de tur intracranianos, pois as células tumorais, mas não os neurônios,
seletivar sofrerão transferência gênica. Como ocorre a replicação do vetor, a dis nação
sistêmica pode ocorrer potencialmente com este vetor viral. Isto é i menos provável nos
hospedeiros imunocompetentes porque a resposta ii celular do hospedeiro
provavelmente controlará a dispersão do vírus. O u vetores de vírus herpes em
hospedeiros imunocomprometidos, o que incluir alguns pacientes com câncer, é
potencialmente problemático (‘ Nagy et ai.. 1994).
Outros vetores virais. A necessidade de transferência gê histoespecífica levou à
consideração de inúmeros outros vírus cluindo o HIV, o pequeno vírus de camundongo,
o vírus da hep B, e o vírus influenza, como possíveis vetores para a transferê gêmca.
Esses e outros vírus podem encontrar aplicações baseadas aspectos de seu ciclo de
vida que resultem em expressão gê histoespecífica ou outras características únicas que
os destine doenças específicas (Jolly, 1994).
Comparação das propriedades dos vetores virais para ter gênica. Boviatsis e
colaboradores (1994) recentemente compara a utilidade dos retrovfrus recombinantes,
adenovírus e vetore vírus herpes em um modelo de tumor de cérebro humano usan
codificação para -ga1actosidase bactenana como um indicado transferência gênica.
Embora seus experimentos não estabele definitivamente que vetor é mais eficiente para
a transferência gêr
Cap. 5 TERAPIA GÊNICA
foram notadas características diferenciais úteis de cada vetor. Após a administração
intralesional, os vetores de retrovírus e herpes vírus efetuaram seletivamente a
transferência gênica para células tumorais de neurônios e outras células cerebrais
endógenas. Por outro lado, o vetor adenoviral transduziu células tumorais cerebrais
bem como do parênquima cerebral normal vizinho. No caso do vetor retroviral, a
seletividade pela célula tumoral resulta das necessidades do vírus para divisão celular
como um pré-requisito para a integração e expressão do transgene. No caso do vetor
do vírus de herpes, a seletividade ocorre como um resultado da expressão diferencial
da tiniidina cinase endógena em células tumorais (muito alta) versus células
nãoneoplásicas (muito baixa). O adenovfrus mostrou pouca seletividade celular, e
qualquer preferência pela expressão celular tumoral provavelmente foi resultado do
local da injeção (dentro do tumor). Outra notável observação foi o grau de inflamação e
necrose que ocorreu após a transferência do gene. O vetor retroviral não induziu
significativa resposta inflamatória, e a induzida pelo vetor adenoviral foi mínima.
Entretanto foram notados proeminentes infiltrados inflamatórios nos tecidos cerebrais
após a transferência gêmca mediada por vírus. Embora este estudo sugira um papel útil
para o vetor do vírus herpes no tratamento de tumores, a aplicação clínica de tal vetor
provavelmente será difícil. Medidas adicionais para o controle de replicação deste vetor
derivado de um patógeno humano terão que ser instituídas, e as conseqüências de
uma potencial resposta inflamatória grave precisam ser abordadas. Além disso, como
destacaram Boviatsis e colaboradores (1994), a latência deste tipo de vetor não é
conhecida, portanto é possível que a reativação por recombinação com o vírus
selvagem (timidina cinase positivo) ocorra.
Estratégias de transferência de ADN não-viral
Devido às limitações potenciais dos vetores virais, os pesquisa- dores examinaram o
uso de agentes não-virais para mediar a captação celular de ADN exógeno. Esses
sistemas de transferência de ADN, que incluem ADN de plasmídio não-associado,
complexos ADN-lipossomo, complexos ADN-proteína e partículas de ouro revestidas
com ADN, são construídas a partir de componentes conhecidos. Portanto, sua
composição, ao contrário de virions complexos, é bem definida. Além do mais, sua
formulação é tecnicamente mais fácil do que a dos vírus e, em muitos casos, esses
sistemas de endereçamento de ADN podem ser produzidos sem a necessidade de
cultura de células.
ADN de plasmídio não-associado purificado. Surpreendentemente, o ADN purificado
(ou ARNm) pode ser diretamente injetado em tecidos e resulta em expressão de
transgene. Isto tem sido mais bem ilustrado no tecido muscular, onde a injeção direta
de ADN não-associado é mais efetiva. Wolff et ai. (1990) demonstraram que o ADN de
plasmídio purificado ou ARNm que codificam um gene relator podiam mediar a
expressão transgênica após injeção direta no músculo quadríceps de um camundongo.
A injeção de ADN resulta em uma expressão gênica mais prolongada (um substancial
produto gênico foi visto após 60 dias) do que a injeção de ARNm (a expressão declinou
após 18 horas). O ADN provavelmente persiste como ADN de plasmídio não-integrado
ao contrário da forma integrada. Uma comparação direta dos vetores adenovirais e
retrovirais com o ADN de plasmfdio integrado em transferência gênica em músculo
murino revelou que todos os três sistemas eram mais eficientes em transferir gene no
músculo em regeneração (induzida por cardiotoxina) do que em células normais
maduras de camundongo. No músculo em regeneração, tais sistemas de transferência
de ADN foram igualmente eficientes, conforme avaliado pelo número de fibras
musculares expressando o gene relator. Surpreendentemente, em fibras maduras, a
transferência gênica por injeção direta do ADN plasmídio foi superior a de ambos os
vetores virais (Davis et ai., 1993). Além disso, nenhuma resposta inflamatória foi vista
após a injeção direta de ADN, enquanto uma branda inflamação foi vista com ambos os
vetores virais. Até o momento, a injeção direta do ADN do plasmídio tem se
demonstrado bastante efetiva apenas na musculatura esquelética e cardíaca. Sua
eficácia pode depender de características únicas da fibra muscular.
Partículas de ouro revestidas de ADN. O ADN de plasmídio pode ser afixado a
partículas de ouro (com aproximadamente 1 mícron de diâmetro) e então “disparado”
em células superficiais. O ADN é coprecipitado na partícula
de ouro e disparado usando-se uma faisca elétrica ou gás pressurizado c força motriz.
Esta chamada “pistola de gene” pode ser usada para aceler partículas revestidas com
ADN em células superficiais da pele (epiderme em tumores de pele (melanomas). A
expressão gênica dura apenas alguns o que pode ser mais uma função das células
alvejadas (p.ex., células da que descamam) do que o método de transferência. Em
modelos animai vacinas de pistola de ADN são muito eficicntes (Fynan et ai., 1993
endereçamento com pistola de genes é idealmente adequado à imuniz mediada por
genes, onde apenas uma breve expressão do antígeno é neces para se obter uma
resposta imune.
Devido à limitação de profundidade de penetração do ADN, esta téc é restrita a células
superficiais que podem ser diretamente alcançadas. A disso, como as camadas
epidérmicas da pele são ricas em células de apre tação de antígenos, elas são o alvo
preferido para a vacinação. A simplicid a segurança e a facilidade técnica de
preparação deste sistema de transferê de ADN tomam sua aplicação em larga escala
mais factível d5 que os siste virais de transferência de ADN.
Lipossomos. Os lipossomos têm sido muito usados como t tecnologia para
administração de drogas experimentais no inte das células. A idéia é que envolvendo
moléculas hidrofflicas moléculas hidrofóbicas, os agentes de outro modo impermeávei
membranas celulares podem ser levados para dentro da célula. vantagens potenciais
desse sistema de transferência incluem drc destinadas a uma localização intracelular e
a redução da toxicida
O desafio básico da terapia gênica in vivo é levar um transgl uma grande molécula
hidrofilica, através da membrana plasmát para dentro do núcleo onde tenha acesso à
maquinaria de transcri da célula. A tecnologia de endereçamento com lipossomo parece
1 adequada a esta tarefa, embora não tenha sido comprovada como eficiente quanto se
esperava.
Os lipossomos são esferas unilamelares ou multilamelares são produzidas usando
vários lipídios. Sua estrutura pode ser inflt ciada pela escolha da composição de lipídio
e processo de prodm As proteínas e outras moléculas não-lipídicas podem ser incorp
das às membranas lipídicas. Por conveniência, os lipossomos classificados como
aniônicos ou catiônicos, com base em sua c elétrica negativa ou positiva,
respectivamente.
Lipossomos aniônicos. A primeira transferência in vivo usando lipo mos foi relatada por
Nicolau e colaboradores (1983), que encapsularam transgene de ADN codificando
insulina em lipossomos aniônicos e injeta o complexo em ratos. Os ratos transfectados
tinham níveis circulante insulina aumentados e concentrações de glicose diminuídas no
sangue.
A despeito deste sucesso inicial, existem significativas desvantagen uso de lipossomos
aniônicos para endereçamento de ADN. Estas estruti quando dadas por via
intravenosamente, têm como alvos primários as cél reticuloendoteliais do fígado,
tomando-as de pouco uso para outras célt alvo. Como a substância a ser entregue tem
que estar encapsulada dentro lipossomos, o processo de produção é complexo. Além
disso, a maioria preparações de ADN necessárias para a terapia gênica são grandes
em cor ração com o lipossomo, de modo que a eficiência de encapsulação é iv baixa,
provavelmente proibitiva para aplicações práticas.
Várias proteínas podem ser inseridas na camada externa dos liposso para alterar seu
comportamento in vivo, incluindo o endereçamento seletiv célula. Este enfoque pode
capacitar os lipossomos dados intravenosamel sair do sistema reticuloendotelial. Os
ligantes de proteína ou anticorp moléculas de superfície celular incorporados à
superfície do lipossomo 1 bém podem marcar os lipossomos para receptores de
superfície de cél específicas em populações de células desejadas (Wu e Wu, 1987). Em
promissoras, estas estratégias ainda não foram aplicadas com sucesso à ter gênica.
Lipossomos catiônicos. Felgner e colaboradores (1987) sintetizarar possomos
catiônicos e demonstraram que eles ligariam ávida e eficientem ácidos nucléicos (que
são aniônicos) por interações eletrostáticas pela sim incubação de lipossomos com
ácidos nucléicos em temperaturas ambiei por breves períodos. O ADN ou ARN
complexado a lipossomos catiôn entram prontamente nas células em cultura sem danos
celulares perceptí Um diagrama ilustrando o suposto mecanismo para a transfecção
catiô lipossomo-plasmídio é dado na Fig. 5.3.
In vivo, os lipossomos catiônicos têm propriedades bem diferentes da lipossomos
aniônicos. A injeção intravenosa de complexos catiônico
66
Seção 1 PRINCÍPIOS
demonstrada como efetuando a expressão transgênica na maioria dos órgãos, caso o
complexo lipossomo-ADN seja injetado no suprimento aferente de sangue ao órgão.
Além do mais, os complexos ADN-lipossomo podem ser administrados por injeção nas
vias aéreas ou aerossol para o epitélio pulmonar como alvo. Em animais experimentais,
nem as injeções intravenosas nem o aerossol de complexos catiônicos lipossomo-
plasmídio parecem ser tóxicos (Bngham et ai., 1989).
Os lipossomos catiônicos foram usados para transferir ADN construídos em vários
modelos experimentais in vivo. Nabel e colaboradores (1994) introduziram um gene
exógeno de histocompatibilidade por injeção direta de complexos plasmídio-lipossomo
em tumores e demonstraram atenuação de crescimento de tumor em modelos murinos.
Hyde e colaboradores (1993) mostraram que a transferência gênica mediada por
lipossomos catiônicos podia corrigir a condutância de cloreto estimulada por AMP
cíclico CFTR-dependente em células normais de camundongos transgênicos
homozigotos para uma mutação nula em CFTR. Coelhos que receberam
intravenosamente o gene codificante para a enzima proximal na síntese prostanóide
(prostaglandina sintase) como um complexo lipossômico plasmídio-catiônico
produziram grandes quantidades de prostanóides derivados de endotélio em seus
pulmões. Isso protege os pulmões de animais transfectados dos efeitos de endotoxemia
(Conary eta!., 1994).
O Quadro 5.1 inclui as metas terapêuticas nos primeiros estágios de aplicação humana
usando o endereçamento de ADN mediado por lipossomos para terapia gênica, como a
introdução de um gene exógeno de histocompatibilidade em tumores, de gene de a1antitripsina humana na mucosa nasal de pacientes deficientes desta enzima e para
subsegmentos dos pulmões por broncoscopia de fibra óptica, e transferência do gene
CFTR para a mucosa nasal de pacientes com fibrose cística.
No momento, a transfecção mediada por lipossomos oferece um meio não-tóxico, nãoimunogênico de transferir ADN a vários tecidos. A utilidade atual dessa estratégia é
limitada a níveis geralmente baixos de transferência gênica que podem ser obtidos com
vetores virais, embora as novas formulações de lipossomo ofereçam maior eficiência de
transferência gênica e melhores propriedades físicas, como por exemplo, maiores
concentrações de complexo sem agregação. As aplicações de lipossomos na terapia
gênica provavelmente irão expandir-se à medida que melhores reagentes se
desenvolverem, particularmente os que facilitam a marcação de células específicas.
Fig. 5.3 Transferência de ADN mediada por lipossomo catiônico.
• Representação diagramática de como os complexos lipossomo-plasmídio catiônicos
são tidos como efetuando a transferência gênica pera uma célula. Pouco se sabe sobre
a estrutura real do complexo plasmídio-lipossomo. Similarmente, o processo que afeta a
entrada na célula e o transporte para o núcleo ainda está para ser esclarecido. O ADN
circular de plasmídio não se incorpora prontamente ao genoma hospedeiro e não se
replica nas células de mamíferos. Portanto, a expressão do transgene é aparentemente
de natureza epissômica.
Conjugados ADN-proteína. Vários grupos desenvolveram mas específicos de células
para transferência de ADN que receptores únicos de superfície celular na célula-alvo
(Mici Curiel, 1994). Anexando o ligante reconhecido por tal recep ADN transgênico, o
complexo ligante-ADN fica seletivament do e internalizado na célula-alvo (Wu e Wu,
1987). Esses v moleculares conjugados são atrativos porque potencialmente cem
transfecção gênica citoespecífica sem os problemas dos v virais, como replicação,
proteínas virais imunogênicas ou poti recombinação. Os sistemas de modelos iniciais
enfocam o dest vimento de meios efetivos de anexar o ADN ao ligante usando cátions,
complexos antígeno-anticorpo, e ligadores biotina-esti vidina. O poli-L-lisina (PLL), um
policátion, tem sido amplar usado pois pode ser acoplado com facilidade a uma
variedade gantes de proteínas por métodos químicos de ligação cruzada. ( do o ligantePLL é misturado ao ADN do plasmídio, formt complexos macromoleculares nos quais o
ADN é eletrostatican ligado às mbléculas de PLL-ligante. Tais estruturas toroidais 100
nm de diâmetro) apresentani 1igantes a receptores de supe celular que são
eficientemente endocitados. O receptor de trans na (Zenke et ai., 1990), o receptor
asialo-orosomucóide (Wu e 1987), e os carboidratos de superfície celular (Batra e! ai., 1
foram usados para demonstrar o potencial de transferência gi mediada por ligante. O
receptor asialo-orosomucóide é de intei particular porque é encontrado quase
exclusivamente em hepat& portanto pode ser útil em mediar a transferência gênica para
o
Os complexos ligante-ADN iniciais eram ineficientes pt transferência de ADN porque a
maior parte do complexo endoci era remetido para o compartimento lisossômico, e o
ADN era e degradado. Embora vários agentes (p.ex., cloroquina) tenham usados para
bloquear a degradação lisossômica, a eficiência de ti fecção ainda é lenta comparada a
outros métodos de endereçam de ADN. Um enfoque mais efetivo é usar as funções de
esi endossômico do adenovírus. Como já foi descrito, as proteína capsídio do
adenovírus promovem o escape do complexo de AD endossomo antes da fusão com o
lisossomo. Embora os vírus ir bolicamente inativados teoricamente possam ser
empregados escapar da transferência lisossômica, as concentrações de adeno
necessárias para garantir a localização do vírus e do complexo AI proteína no mesmo
endossomo são tão altas que induzem efc citopáticos mediados por adenovfrus.
Conseqüentemente, os pes sadores construíram complexos fisicamente ligados entre o
aden rus e o ADN-Iigante, garantindo assim seu endereçamento simi. neo para cada
endossomo e diminuindo a quantidade de adenov necessária para escapar dos
lisossomos e da degradação (Fishi Wilson, 1994).
Dois enfoques gerais foram usados para construir complexos ADN-li1 te. A poli-L-lisina
pode ser covalentemente ligada a partículas purifica de adenovírus usando
carbodiimida hidrosolúvel. Isto é então misturac toróides asialo-orosomucóide-receptorpoli-L-lisina-ADN para fonnar a pamentos de partículas adenovirais icosaédricas e
toróides. O tamanho de] agrupamentos varia desde pequenos agrupamentos (<200 nm)
com toró] únicos acoplados a duas partículas virais até grandes agrupamentos (2( 300
nm) contendo mais de uma dúzia de partículas virais e toróides. A o posição dos
agrupamentos é governada pela quantidade de poli-L-lisina lig às partículas virais.
Esses complexos atingem maiores níveis de transferêi gênica específica de hepat&itos
em baixas concentrações do vírus do qu misturas de toróides não-ligados e adenovírus
(Cristiano et a!., 1993).
Essa tecnologia pode amda ser melhorada colocando-se oADN e o ligs sobre a
superfície do adenovírus para criar um adenovírus revestido, em de estruturas lado a
lado (vírus-toróide-vírus) descritas acima (Fisher e ‘1 son, 1994). Isso cria partículas
virais isoladas que mantêm sua capacid endossômica, são revestidas com ADN e
estendem o receptor asialo-orosor cóide da superfície da partícula. As menores
partículas (<100 nm) ali mantêm algum reconhecimento de receptor de adenovírus e
captação, sim aos agrupamentos maiores acima, mas seu tamanho menor pode torná
mais capazes de atravessar o endotélio hepático fenestrado. O uso de! genes relatores,
um transportado no ADN do plasmídio e o outro no gene do adenovfrus, permitiu a
avaliação simultânea da infectividade viral
Cap. 5 TERAPIA GÊNICA
eficiência da transferência do gene plasmidial. Diminuindo a quantidade de adenovírus
necessária, a citotoxidade induzida por vírus pode ser essencial- mente eliminada. A
presença de duas vias de receptor para a entrada de ADN (receptor de ligante e
receptor de adenovírus) claramente diminui a especificidade deste sistema de entrada
de ADN. A via de receptor de adenovírus pode ser efetivamente eliminada usando um
anticorpo contra a fibra de proteína do adenovírus como meio para ligação do ADN
(Michael e Curiel, 1994), um enfoque que oblitera a habilidade do vírus em se ligar aos
receptores de adenovírus mas não sua capacidade de mediar o escape do lisossomo.
Outros refinamentos, como o uso de proteínas endossomicamente purificadas no lugar
das partículas intactas de adenovírus, devem aumentar a utilidade deste tipo de
sistema de endereçamento de ADN (Seth, 1994).
DOENÇAS-ALVO PARA TERAPIA GÊNICA
Terapia gênica dirigida a órgão
Fígado. A terapia gênica dirigida para o fígado emergiu como um modelo importante
para o tratamento de distúrbios hereditários e adquiridos, O fígado pode ser afetado por
inúmeras doenças metabólicas, infecciosas e neoplásicas para as quais podem ser
propostas intervenções moleculares específicas. Por exemplo, os métodos de
transferência gênica podem ser usados para introduzir o interferon alfa para o
tratamento de hepatite B, terapia citotóxica para carcinomas hepáticos, ou para fornecer
um gene ausente a fim de corrigir um defeito metabólico herdado. As aplicações
potenciais são possíveis pela existência de múltiplos métodos para endereçamento de
transferência gênica para o fígado. Os conjugados moleculares, vetores adenovirais,
lipossomos, e vetores retrovirais todos têm sido usados para transferência gênica em
hepatócitos. Para a transferência gênica in vivo, o fígado é acessível por várias vias,
incluindo a injeção direta e intravenosa bem como a administração intrabiliar de vetores.
As estratégias ex vivo podem ser implementadas por ressecção cirúrgica parcial do
fígado, isolamento dos hepatócitos, e trausdução in vitro dos hepatócitos. As células
geneticamente modificadas podem ser reimplantadas no fígado.
HipercolesterolemiafamiliaL Os pacientes com hipercolesterolemia familial têm uma
deficiência herdada do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e, como
conseqüência, desenvolvem níveis plasmáticos extremamente altos de colesterol e
arteriosclerose em idade muito jovem (Cap. 36). O defeito genético se manifesta como
uma capacidade diminuída do fígado em remover partículas de LDL do sangue, e os
níveis de lipídio do soro fornecem um marcador conveniente da doença. Embora as
intervenções farmacológicas tenham tido sucesso limitado, a correção da disfunção
hepática por transplante ortotópico de fígado leva à normalização dos níveis
sanguíneos de lipídio e diminuição da progressão da doença arterial. Esta observação
clínica sugere que se o fígado puder ser geneticamente modificado para expressar o
receptor de LDL, os mesmos benefícios podem ser obtidos. Os coelhos com
hiperlipidemia hereditána de Watanabe serviram como um modelo animal ideal para
demonstrar que este enfoque poderia levar a reduções persistentes de LDL do soro
(Fig. 5.4) (Chowdhury et ai., 1991). Vários pacientes foram tratados em uma tentativa
clínica usando um enfoque ex vivo de endereçamento de ADN e um retrovírus para
introduzir o gene de receptor de LDL nos hepatócitos isolados dos pacientes após uma
hepatectomia parcial (Grossman eta!, 1994). Este estudo demonstrou a possibilidade,
segurança e eficácia potencial da terapia gênica hepática ex vivo.
O sucesso geral da transferência de ADN em hepat&itos será determinado por vários
fatores que atualmente são desconhecidos. Em particular, muito pouco se sabe sobre a
renovação normal dos hepat&itos e como isto está relacionado à persistência de células
geneticamente modificadas. Uma resposta imune ao produto gênico terapêutico, um
problema potencial para todas as terapias gênicas de estados de deficiência, ainda não
foi observada até agora. O potencial do produto gênico terapêutico para servir como um
novo antígeno pode variar entre tipos diferentes de deficiências, e depende da natureza
do produto protéico e se a deficiência surge da ausência total da proteína ou da
expressão de uma proteína disfuncional (mutada). A tentativa clínica citada acima
(Grossman et ai., 1994) deu o primeiro exemplo de uma correção metabólica mantida
de um defeito genético. O enfoque da transferência gênica ex vivo provavelmente será
substituído pelas estratégias de transferência gênica in vivo no futuro, uma vez que os
problemas de eficácia do vetor, persistência e imunogenicidade sejam superados.
Pulmão. As duas doenças pulmonares hereditárias mais comun são o enfisema familial
e a fibrose cística. As estratégias de terapi gênica têm sido direcionadas para a
melhoria de ambas as doenças.
Enfisema familial. O enfisema familial é uma conseqüência d um defeito no gene que
codifica a principal antiprotease endógena, cxi-antitripsina. Esta deficiência torna os
pulmões vulneráveis ao danos pelas proteases dos neutrófilos liberadas nos locais da
inflama ção. A proteína a1-antitripsina é disponível clinicamente e é dada pacientes
com a doença. O gene humano foi clonado e introduzid efetivamente nos pulmões de
animais experimentais (Canonico et ai. 1994). Os estudos iniciais em seres humanos
com deficiência d a1-antitripsina foram aprovados pelo NIH (Quadro 5.1).
Fibrose cística. A fibrose cística é o distúrbio hereditário mal comum na população
caucasiana, e como a maior parte de sua mor bidade e mortalidade se baseia em
manifestações pulmonares, é un modelo ideal para terapia gênica de doença pulmonar
herdada. A estratégias de transferência gênica ex vivo não são uma opção viáve no
pulmão. A remoção e reimplante das células de vias aéreas não tecnicamente possível
para terapia. Como as células-alvo nas via aéreas se renovam muito lentamente,’a
transferência gêmca retrovi ral, que requer divisão celular, é muito ineficiente. Em
contrapartida os vetores adenovirais são muito adequados para esta aplicação, poi os
adenovfrus têm um tropismo conhecido pelo epitélio respiratórie Uma desvantagem do
uso de adenovírus é a natureza passageira d expressão gênica e a incerteza de se uma
resposta inflamatória indu zida por adenovírus permitirá a readministração do vetor.
Além d mais, os neutrófilos das vias aéreas e as secreções podem diminuir eficiência
da transfecção. Entretanto foi feito um grande esforço par se desenvolver vetores
adenovirais adequados para a transdução d epitélio de vias aéreas in vivo.
Foram conduzidos estudos em seres humanos nos quais o adenovín codificando o
regulador de transporte na fibrose cística (CFFR) foi admini trado no epitélio nasal de
pacientes com fibrose cística (Zabner et ai., 1993 Com doses relativamente baixas do
vírus a normalização da condutância cloreto foi observada. A principal desvantagem
atual do adenovfrus coir vetor tem sido a resposta do hospedeiro às proteínas de
codificação viral. F observada uma resposta inflamatória a células transduzidas por
adenovírus e vários modelos animais e em pacientes, porque o vetor contém a maior
par do genoma viral selvagem. Embora a replicação do vfrus tenha sido tomai
incompetente por supressão de um grupo de genes virais, ele ainda dirige células
viralmente transduzidas para sintetizar proteínas virais imunogênic
Remoção
de lobo hepático
Estabelecer
culturas de hepatócitos
Fig. 5.4 Um modelo animal para a transferência gênica ex vivo receptor de iipoproteína
de baixa densidade (LDL).
• O coelho com hiperlipidemia hereditária de Watanabe é um modelo ani ideal da
deficiência herdada de receptor de LDL. Na falta de receptor de L normalmente
expressa em hepatócitos, estes animais rapidamente desen vem aterosclerose. A
possibilidade da transferência gênica retroviral ex vi demonstrada por este modelo. E
feita uma hepatectomia parcial, remove até um terço do fígado. A porção removida do
fígado é perfundida ex vivo enzimas para dispersar os hepatócitos, que são então
colocados em cultur tecidos e expostos ao retrovírus recombinante que expressa o
receptor de L Os hepatócitos contendo o ADN viral estavelmente integrado são injet
pela veia porta de volta ao fígado onde passam a residir. Este procedim tem sido feito
em pacientes humanos com o mesmo distúrbio.
6
atõcitos ,-‘ repovoam o fígado
Transplante para,—
veia porta .-‘
_ Coleta de ________________________
células Infectar com ______________ retrovírus recombinanle
codificando receptor de LDL
68
Seção 1 PRINCÍPIOS (
As novas versões do vetor recombinante adenoviral podem superar esta limitação
atenuando a expressão das proteínas adenovirais. Engelhardt e colaboradores (1994)
mostraram que a alteração do genoma adenoviral em adição a supressões de El e E3
podem diminuir a resposta inflamatória após a transferência gênica. Um mutante E2
termo-sensível (ts 125) que cresce preferencial- mente a 32°C é introduzido no genoma
viral, de modo que quando o vírus é usado para infectar células a 39°C, a proteína
mutante E2 é menos efetiva em transativar os genes adenovirais seguintes que
supostamente são responsáveis por induzir a resposta inflamatória do hospedeiro. Na
prática, o vírus pode ser propagado em células permissivas (células 293) a 32°C, in
vitro, e então usado para transduzir células in vivo a 37°C. Após a transdução in vivo, o
vfrus perde a capacidade de replicação (El ausente) e toma-se menos eficiente na
síütese de proteínas adenovirais na temperatura corpórea elevada. Isto resulta em
menos inflamação e uma expressão transgênica prolongada. Está sendo desenvolvida
uma melhora no desenvolvimento de vetores adenovirais, incluindo mutações que irão
remover toda ou parte da região E4.
No momento, o número de pacientes tratados em todas as tentativas de terapia gênica
de fibrose cística é muito pequeno para se tirar conclusões significativas quanto à
eficácia. Entretanto os princípios de introdução do material genético nas vias aéreas
estão hoje bem estabelecidos. As gerações futuras de sistemas de transferência de
ADN, incluindo os sistemas adeno-associados e de lipossomos já discutidos,
provavelmente oferecerão benefícios significativos não só para fibrose cística mas
também para uma variedade de distúrbios pulmonares.
Circulação. O sistema vascular sanguíneo tem sido o alvo de vários experimentos de
transferência gênica que demonstraram o potencial terapêutico da introdução de genes
neste tecido. Tanto as células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos quanto as
células de músculos lisos abaixo do endotélio chamaram muita atenção devido ao seu
papel na aterosclerose e à perspectiva de que possam ser usadas para introdução de
produtos transgênicos na corrente sanguínea. As alterações genéticas destas células
podem ser usadas para alterar ou evitar o processo de aterosclerose, ou para introduzir
local- mente agentes vasodilatadores ou, alternativamente, para introdução local de
anticoagulantes.
Estratégias ex vivo. Os experimentas iniciais enfocaram métodos de transferência
gênica ex vivo. Wilson et ai. (1989) mostraram que as células endoteliais caninas
podiam ser geneticamente modificadas in vitro por transferência gênica retroviral e
então transplantadas para o cão como um implante vascular de Dacron, com as células
endoteliais modificadas demonstrando a expressão transgênica por mais de 5
semanas. Em outro estudo, células endoteliais cultivadas de um miniporco Yucatan
foram transduzidas in vitro com retrovfrus defeituoso de replicação antes da
reincubação na artéria por meio de um cateter especial de balão duplo. Ocluindo o fluxo
sanguíneo para um segmento desnudo da artéria, o cateter criou um espaço
temporariamente protegido onde as células endoteliais podiam se religar à parede do
vaso (Nabel et ai., 1989).
Estratégias in vivo. A introdução de genes in vivo evidencia a necessidade de células
singênicas, e serão necessárias para aplicações terapêuticas, tais como o tratamento
de aterosclerose. A transferência gênica in vivo foi obtida usando o enfoque de cateter
de balão duplo com instilação do sistema de introdução de ADN no espaço protegido do
vaso temporariamente ocluído. Os retrovírus, lipossomos e vetores retrovirais têm sido
usados para marcar um local específico dentro de um vaso grande usando este
enfoque.
Aterosclerose. Vários genes têm sido expressos por transferência gênica in vivo com a
finalidade de desenvolver aplicações clínicas úteis bem como para desenvolver
modelos de mecanismos patogênicos. A proliferação de células vasculares e a
deposição de proteínas da matriz extracelular estão associadas ao estreitamento
aterosclerótico das artérias. Os fatores que potencialmente contribuem para este
processo podem ser estudados pela hiperexpressão de seus genes em segmentos
arteriais. Por exemplo, quando o fator ácido de crescimento de fibroblastos (FGF- 1) é
ectopicamente expresso em artérias porcinas, a parede do vaso fica espessada
(hiperplasia da íntima) como resultado da proliferação celular dos músculos lisos (Nabel
et aL, l993c). Além disso, formam-se novos vasos sanguíneos dentro da parede arterial
como resultado de migração e crescimento de células endoteliais. Por outro lado, o
TGF-J31 é expresso ectopicamente no vaso, resultando em síntese de matriz
extracelular e espessamento da íntima (Nabel et ai., 1 993a). O fator de crescimento B
derivado de plaquetas também foi demonstrado como indutor de hiperpiasia da íntima
após a transferência gênica in vivo (Nabel et ai., 1 993b). Essas mudanças
experimentalmente induzidas na parede do vaso
mimetizam mudanças encontradas nas lesões ateroscleróticas. A transfe gênica
fornece, portanto, um instrumento útil para se estudarem os efei agentes que podem
ser parte de um complexo processo de doença.
Vasculite auto-imune. Na tentativa de um modelo de outra doenç rial, a vasculite autoimune, foi introduzido um gene exógeno de histoc tibilidade em paredes de vasos por
transferência gênica mediada por li1 mo, resultando em uma resposta imune focal no
local da transferência i que histologicamente se assemelha à arterite de Takayasu
(Nabel et ai., Tais experimentos demonstram que modelos de doenças humanas pode
desenvolvidos introduzindo alterações moleculares específicas nos vaso guíneos.
Esses modelos de doença arterial podem ser úteis na avaliaç agentes que podem
bloquear estes processos e alterar a progressão da dc
Prevenção de reestenose. Além de compreender o processo pelo q desenvolvem as
doenças vasculares, as técnicas de transferência gênica 1 desenvolvidas para tratar
essas doenças. Por exemplo, as artérias coroi ateroscleróticas em geral podem ser
tratadas por angioplastia com bal segmento estreitado do vaso aterosclerótico é
mecanicamente dilatadc inserção e inflagem de um cateter em balão. Embora ele
forneça benefí longo prazo para os pacientes, este procedimento tem uma alta taxa de
mento do vaso (reestenose) semanas após a dilatação. A reestenose ocorr parte, como
resultado da hiperpiasia de músculo liso. A introdução d vetor adenoviral codificando a
timidina cinase seguida da administração mica de ganciclovir bloqueou a hiperplasia
arterial em um modelo mia reestenose (Ohno et ai., 1994).
Terapia gênica para o câncer
As terapias gênicas para o câncer têm empregado várias est gias que se baseiam em
alvos moleculares únicos encontrado células cancerosas. Oncogenes ativados ou
genes supressores tt rais mutados são características comuns de malignidades humt
Por exemplo, as mutações no oncogene Kirsten-ras, que ocoi comumente em
adenocarcinomas do pulmão, estão associada consumo de tabaco e podem contribuir
para a progressão tumora mutações em genes supressores tumorais também ocorrem
freq temente em cânceres humanos, O gene p53 de retinoblastoma, codifica a proteína
nuclear p53 que regula o crescimento celular gene de câncer mais freqüentemente
alterado. Os defeitos no fur namento de seu produto gênico contribuem para uma
prolifen celular desregulada.
As doenças moleculares que regulam o crescimento celular, bora fundamentais para o
progresso do tumor, são em geral difi de marcar como alvo para os atuais métodos de
transferência gê por vários motivos. Determinados oncogenes, tais como o Kirs ras,
estão comumente mas não uniformemente presentes em todc tumores, mesmo de um
determinado tipo histológico. E o mais portante, a interrupção de uma função de um
oncogene específio a restauração do funcionamento dos genes supressores tumorai
riam que ser feitas em cada célula maligna, pois as células não tI das se dividiram
prontamente. Como a maioria dos cânceres ex sua morbidade e mortalidade por
dispersão metastática, defronta nos não apenas com o fato de marcar cada célula
cancerosa, c também marcar células cancerosas em vários locais anatômicos sos,
fígado, pulmões, cérebro etc.). Mais ainda, muitas lesões depósitos metastáticos
microscópicos, indetectáveis pelos métc atuais de diagnóstico com imagens. Isto
dificulta a avaliação da cácia de um novo método de transferência gênica porque, no ci
do acompanhamento necessário, pode não ficar claro se o fracl terapêutico resultou de
uma ineficiente transferência gênica ou de dentre muitos outros eventos que podem
contribuir para a inefic da terapia do câncer.
Muitos tumores adquirem uma série de defeitos genéticos à dida que progridem. Além
disso, alguns tumores surgem como c seqüência de mutações que resultam em um
ganho de função, perda de função, e portanto requerem a ablação da nova atividi Por
exemplo, a leucemia mielóide crônica ocorre como resultadc expressão de um novo
produto gênico quimérico.
Como as atuais técnicas de transferência gênica são incapazet obter um nível
satisfatoriamente alto de eficiência de transferênci vivo, têm sido procuradas
estratégias alternativas que não necessil
Cap. 5 TERAPIA GÊNICA
ria dos tumores humanos. Ao contrário, existe uma crescente evidên cia que sugere
que as células tumorais expressam determinantes úni cos que são capazes de ser
reconhecidos pelo sistema imune.
Expressões ectópicas de citocina. Inúmeras citocinas comprova damente diminuem o
crescimento tumoral quando ectopicamente ex pressas em células tumorais ou em seu
microambiente (Teppe e Mule, 1994). As células tumorais produzidas para secretar
certa citocinas foram observadas sendo menos capazes de formar tumore quando
implantadas em hospedeiros singênicos, embora seu cresci mento in vitro não seja
afetado, sugerindo que os fatores do hospe deiro são induzidos em resposta às
citocinas diminuindo a tumorige nicidade. Alguns agentes imunoestimulatórios não
alteram a tax de crescimento inicial do tumor, mas levam à imunidade contra
crescimento do tumor se o animal é depois confrontado com célu las tumorais do tipo
selvagem. E óbvio que as células tumorais gene ticamente modificadas provocam
inúmeras respostas imunes do hos pedeiro dependendo do agente imunomodulador
empregado. Pe exemplo, a secreção de interleucina-4 (IL:4) por uma célula tumor
provoca potente resposta inflamatória local sem nenhum efeito sobr células tumorais
distantes ou células tumorais administradas em épc cas posteriores. Por outro lado, o
fator estimulante de colônias d granulócitos-macrófagos (FEC-GM) tem pouco efeito
sobre a tumc rigenicidade, mas evoca uma potente imunidade antitumoral (Drano et ai.,
1993). Em muitos casos, os efeitos imunes múltiplos são in ciados por tumores que
expressam agentes imunomoduladores. Iss é visto em tumores que secretam
interleucina-2, onde o tumor torni se infiltrado por linfócitos T, macrófagos ativados,
células destruid ras naturais (NK), neutrófilos e eosinófilos. Além do mais, uma citr ema
pode ter efeitos diferentes em tipos diferentes de tumores. 1k exemplo, a interleucina-6
pode ter efeitos antiproliferativos direto; recrutar células citotóxicas naturais, ou servir
como um fator d crescimento autócrino, dependendo do tipo de tumor investigad Em
muitas circunstâncias, é difícil distinguir os efeitos que são mdi zidos pela citocina dos
efeitos mediados secundariamente por oi tras células efetoras imunes. Isto levou a um
enfoque empírico d terapia gênica do câncer baseada em citocina. As citocinas interlei
cina-l, -2, -4, -6, -7 e -12, o fator-a de necrose tumoral (FNT-cx interferon gama, FEC-G,
FEC-GM e moléculas co-estimuladoras c linfócitos têm sido demonstradas como
induzindo a destruição imur das células tumorais em sistemas modelo. Destas, a
interleucinainterleucina-4, FNT-ct, gama-interferon e FEC-GM entraram pai experiências
clínicas usando células tumorais geneticamente modif cadas para secretar a citocina
(Tepper e Mule, 1994; ver também Cap. 52).
Estimulação imune. Foram desenvolvidos outros enfoques de
tinados a aumentar a resposta imune às células cancerosas. Um de
Quadro 5.2 Combinações enzima-pró-droga para
terapia gênica de câncer
6
de 100% de eficiência de transferência gênica. Dois enfoques gerais evoluiram e
podem ser efetivos quando apenas uma minoria das células tumorais são transduzidas:
(1) “suicídio” das células-alvo, obtido pela orientação da síntese de um metabólito tóxico
que consegue infiltrar-se no microambiente tumoral, e (2) a produção de uma resposta
imune das células tumorais pela expressão de citocina ectópica ou outros meios para o
reconhecimento ou ativação imune.
Suicídio das células-alvo. A conversão de uma pró-droga em um metabólito tóxico pela
engenharia genética da célula tumoral é um modo atrativo de criar uma diferença
“artificial” entre os tecidos normais e neoplásicos. Isto pode ser obtido pela expressão
de um gene que confere um fenótipo dominante, negativamente selecionável, à célula
cancerosa, tal como a morte celular ditada pela expressão de uma enzima
metabolizante de droga. Várias enzimas conseguem desempenhar tal função, e
tipicamente destruir as células pela ativação de uma pró-droga relativamente não tóxica
em uma forma cito- tóxica (Quadro 5.2). A maior seletividade em destruir células
malignas será obtida se o gene transferido não for normalmente encontrado em seres
humanos (p.ex., HSV-timidina cinase), em vez da hiperexpressão de um gene
endógeno (p.ex., desoxicitidina cinase).
A inserção do gene de HSV-timidina cinase (HSV-TK) em células malignas em conjunto
com a administração sistêmica de ganciclovir tomou-se o protótipo de sistema de
terapia gêmea que usa o enfoque enzima-pró-droga. Muitos pesquisadores mostraram
que a expressão do gene HSV-TK confere um fenótipo negativo selecionável às células
cancerosas tanto in vitro quanto in vivo.
Moolten (1986) mostrou a sensibilidade adquirida ao ganciclovir em uma linhagem
celular de sarcoma murino transduzida com um vetor retroviral que produz HSV-TK. As
células tumorais transduzidas do sarcoma eram 200 a 1 .000 vezes mais sensíveis a
ganciclovir do que as células tumorais controle. Este achado foi reproduzido em vários
sistemas de modelo de câncer de roedores e humanos, incluindo o câncer de pulmão,
mesotelioma, carcinoma hepatocelular, leucemia, melanoma e modelos de tumores do
SNC. A eficácia deste enfoque varia significativamente e pode ser devida a uma
variedade de fatores incluindo o funcionamento do promotor, células-alvo estudadas e
eficiência de transdução.
A atividade tumoricida do sistema HSV-TKlganciclovir é devida a vários fatores. Nas
células em divisão, o ganciclovir fosforilado inibe a síntese de ADN. Este efeito não é
confinado a células que são diretamente transduzidas com HSV-TK, pois as células
vizinhas também são afetadas. Este fenômeno, que provavelmente ocorre como
resultado de vários mecanismos, foi chamado de “efeito circunstante” e tem sido
observado em vários tipos de tumores, incluindo tumores do SNC (Freeman et ai.,
1993). A transferência de ganciclovir fosforilado entre células (“cooperação metabólica”)
via junções comunicantes foi proposto como um possível mecanismo. A fagocitose por
células vizinhas de vesículas apoptóticas contendo fosfato e ganciclovir (de células
transduzidas “moribundas”) também foi proposta. Os processos imunomediados podem
contribuir para a morte significativa de células não-transduzidas. Em um relato,
imunidade antitumoral foi observada após a morte mediada por TK de tumores
cerebrais experimentais. Se a imunidade do tumor é dependente de TK, ou uma mera
manifestação da imunogenicidade inerente da célula tumoral, ainda não foi estabelecido
neste modelo (roedor) (Barba et ai., 1994).
Mais recentemente, os vetores adenovirais têm sido usados para transferência gênica
de HSV-TK. Chen ei ai. (l994a) demonstrou a regressão de gliomas experimentais após
a transferência gênica mediada por adenovírus in vivo e tratamento com ganciclovir. Os
depósitos tumorais não foram totalmente eliminados com este tratamento. As células
tumorais próximas ao local da injeção eram mais prontamente transduzidas do que as
distantes, ajulgar pelos experimentos de transferência de gene marcador paralelo. Além
disso, essas células mais distantes escaparam da toxicidade do ganciclovir devido a um
efeito diminuído atribuído a poucas junções intercelulares na linhagem de células
tumorais de cérebro de roedor empregada. Esta limitação potencialmentè pode ser
superada na clínica por um planejamento de tratamento estereotático mais preciso
(ajudado por RMN e PET) e por múltiplas injeções no tumor.
Outras abordagens enfocaram a introdução de genes que estimulam a resposta imune
ao tumor. Embora alguns questionem que o crescimento tumoral ocorre como resultado
da estimulação imune, existem poucas evidências diretas que apóiem esta hipótese na
maio* A nucleosídio fosforilase é codificada pelo gene DeoD de E. coli. a seqüência codifica
usada nesta estratégia de terapia.
Símbolos: HSV, vírus herpes simples; VSV, vírus de estomatite vesicular; Ara-C, citos
arabinosídio ou citarabina; Ara-M, 6-metoxipurina arabinosídio; MeP-dR, 6-metilpuri 2’desoxirribosídio.
GENE
PRÓ-DROGA
HSV timidina cinase
(HSV-TK)
Ganciclovir
Aciclovir
VSV timiclina cinase
Ara-M
Desoxicitidina cinase
Ara-C
Fludarabina
2-Clorodesoxiadenosina
Difluorodesoxicitidina
Citosina desaminase
5-Fluorocitidina
Nucleosídio fosforilase* MeP-dR
70
Seção 1 PR1NCÍP1O
ses enfoques é expressar moléculas altamente imunogênicas na superfície das células
cancerosas, tais como a expressão de antígenos alotípicos de MHC. Alternativamente,
em vez de expressar um antígeno de “rejeição” exógeno, as células tumorais podem ser
modificadas de modo que antígenos endógenos fracamente imunogênicos associados
a tumor sejam mais bem reconhecidos. Já se sabe há muito tempo que vias adicionais
“co-estimulantes” distintas do receptor de células T são necessárias para obter a
ativação de células T (Cap. 52). As moléculas B7-l e B7-2 estimulam uma dessas vias.
As moléculas B7, cuja expressão normalmente é limitada a células apresentadoras de
antígenos e outras células efetoras imunes especializadas, encaixam receptores
específicos (CD-28 e CTLA-4) na superfície de células T em conjunto com a ligação de
antígenos aos receptores de células T. Subseqüentemente, a ativação de células T, a
proliferação celular e a produção de citocina ocorrem, e podem levar à elaboração de
imunidade antitumoral. A ausência de um sinal co-estimulador no momento do encaixe
no receptor de células T não é um evento neutro. Ao contrário, isso resulta no
desenvolvimento de anergia específica ao tumor, e não uma mera falta de ativação de
célula T (Cap. 52). Portanto, a simples presença de antígenos nas células tumorais
seria esperada produzindo um estado de imunotolerância e não um estado de resposta
imune se os eventos co-estimulatórios não ocorressem. Com efeito, isto é o que é visto
na maioria das situações clínicas onde os tumores humanos crescem aparentemente
sem impedimento dos mecanismos imunes do hospedeiro. Quando algumas células
tumorais são abastecidas de moléculas co-estimuladoras, ocorre uma efetiva ativação
de célula T. Isso foi demonstrado pela expressão ectópica de B7 em células tumorais,
que são então usadas para estimular uma resposta imune à linhagem celular tumoral
original.
Vários pesquisadores empregaram este enfoque experimental para demonstrar que os
tumores dotados de capacidade de co-estimulação de B7 são capazes de ativar o
sistema imune do hospedeiro a reconhecer e erradicar células tumorais. Chen et ai.
(l994b) co-expressaram B7 e o antígeno de rejeição E7 do papilomavírus humano
(HPV) em células Kl735 de melanoma murino. Quando injetadas em camundongos
singênicos, estas células (E7+B7+) induziram uma resposta imune dependente de B7,
que resultou em regressão tumoral. Por Outro lado, células tumorais E7+B7- não
induziram uma resposta antitumoral. Além disso, uma vez marcados por células
E7+B7+, os camundongos foram capazes de rejeitar células tumorais E7+B7subseqüentemente injetadas. Entretanto esses camundongos não foram capazes de
rejeitar tumores originais, que eram E7-. Este estudo também revelou que a rejeição
imune necessitava a presença de células CD8+, mas não células
T CD4+.
Um estudo similar por Li e! ai. (1994) sugeriu a contribuição tanto de células CD8+
quanto CD4+ na imunidade tumoral. Uma linhagem celular Kl735 expressando tanto
moléculas de MHC classe 1 quanto II foi transfectada para expressar tanto o antígeno
B7- 1 quanto p97. O antígeno p97 é conhecido como muito imunogênico e estimulante
da produção de clones específicos CD4+ para este antígeno. A expressão de B7,
quando co-expressa com p97, apoiou a expansão tanto de linfócitos T citotóxicos CD8+
quanto de linfócitos CD4+. Além disso, embora as células T CD8+ sejam as células
efetoras mais importantes, ambos os tipos de células são necessários para eliminar
nódulos tumorais estabelecidos. A experiência clínica demonstra claramente que a
mera presença de antígenos associados a tumores não induzem uma resposta imune.
A implicação destes estudos é que a ineficácia dos antígenos tumorais pode ser
superada expressando B7 nas células tumorais. Neste e em outros experimentos, a
presença de moléculas de MHC classe II na superfície do tumor, além das moléculas
classe 1, contribui para a resposta imune geral, e em particular o componente CD4+ da
resposta. Como a maioria dos tumores não expressa moléculas da classe II, uma
efetiva resposta de célula T CD4+ pode necessitar de intervenção adicional além da
expressão de B7. Conseqüentemente, é importante a estimulação de citocinas que
possam fornecer este efeito.
Os experimentos anteriores foram feitos com o que hoje é conhecido como B7- 1.
Experimentos adicionais mostraram que outras moléculas (B7-2, e talvez outras) são
capazes de se ligar aos mesmos receptores de células T que B7-l (CD-28 e CTLA-4) e
ativar vias co-estimulantes de célula T. O papel diferencial destes ligantes similares está
apenas começando a ser explorado. O curso temporal e o nível relativo de sua
expressão são claramente diferentes, bem como sua capacidade em ser
diferencialmente regulada pelo mesmo
estímulo. Um nível similar de complexidade está emergindo para os res B7 CTLA-4 e
CD-28. Embora o papel diferencial destas molécula relação com o funcionamento
normal do sistema imune esteja come ser compreendido, não se sabe qual dos B7
fornece a via mais efetiv imunidade antitumoral (ver Cap. 52 para uma revisão dos
mecanismo res de acentuação e supressão imune).
A ativação de células T, embora criticamente dependente de TCI co-estimulatórias,
também pode ser apoiada por funções adicionais mente dadas por células
apresentadoras de antígeno. A interleucina- 12 é secretada por células apresentadoras
de antígeno e funciona ligan receptores específicos nas células T e células citotóxicas
naturais.
induz a produção de interferon gama e acentua a produção de uma resi linfócito T
citotóxico. No modelo de tumor murino, a IL-12, quando da no microambiente de um
nódulo tumoral em desenvolvimento, ret desenvolvimento de nódulos tumorais
detectáveis (Ohno e! ai., l994). neste modelo não levou à imunidade antitumoral
protetora, ou seja, c volvimento do tumor foi retardado, mas não totalmente evitado.
Intei notar que a linhagem de células BL-6 de melanoma derivada de Bl6 imunogênica,
mas foi capaz de provocar ativação de células T quando por esta citocina exógena.
Outros pesquisadores relataram que linha células tumorais B16 não foram tornadaS
capazes de induzir resposta quando transduzidas para expressar B7-l. O fato de que IL12 pode resposta imune a um tumor quando B7- 1 não pode, sugere que estas mc
imunomoduladoras podem fornecer funções diferentes. Recentemei demonstrado que
B7-1 e IL-l2 podem agir sinergisticamente para proliferação de célula T e produção de
citocina (interferon gama e 1 (Cap. 52).
Nem todos os obstáculos a vacinas tumorais geneticamente pro foram totalmente
identificados. A tolerância imune de células tumora surgir por muitos mecanismos,
incluindo a secreção em célula tum agentes imunossupressores (p.ex., TGF-3), e outros
meios para su tolerância terão que ser criados. Entretanto a expressão ectópica de ge
células cancerosas é um instrumento muito flexível e poderoso que pri mente irá
melhorar o atual enfoque terapêutico de agentes antineop sistematicamente
administrados (Cap. 51).
Transferência gênica para células primordiais bematopoiéticas
A transferência de genes para células primordiais da medt sea foi proposta para uma
variedade de distúrbios hereditá adquiridos. Eles incluem defeitos hereditários em
células pn das pela medula óssea (p.ex., anemia falciforme, talassemias, d
granulomatosa crônica e vários distúrbios de linfócitos), bem doenças adquiridas nas
quais as células derivadas da medula secundariamente envolvidas (p. ex., síndrome da
imunodefic adquirida [AIDS], e mielossupressão induzida por quimioterap potencial de
repovoamento a longo prazo das células primordi medula óssea também a toma um
agente potencialmente útil 1 produção e a transferência de proteínas normalmente
produzid células não-hematopoiéticas (p.ex., proteínas de coagulação). senvolvimento
de transplantes de medula óssea deu uma subst precedência a este enfoque. O
crescente número de doença podem ser tratadas efetivamente por transplante de
medula demonstra a eficácia terapêutica de fornecer uma medula “corril Por exemplo,
uma grave talassemia (um defeito herdado na síntese de hemoglobina) pode ser curada
pelo transplante de m óssea de um doador normal. A terapia gênica equivalente seria
gir a própria medula óssea do paciente em vez de substituir poi medula óssea
“exógena”. Como a medula óssea pode ser facili removida e reimplantada, ela fornece
uma situação ideal pa estratégias de terapia gênica ex vivo. A meta final é ser cap
transferir genes para células primordiais hematopoiéticas e pe] que estas células
reconstituam a medula óssea com a expressão tiva do gene transferido em uma
linhagem celular hematopo específica.
Distúrbios de imunodeficiência. A terapia gênica oferece mentos potenciais para
uma variedade de doenças de imunodefi eia. Como notado antes, o primeiro distúrbio a
ser tratado pela te gêmea foi uma forma de grave imunodeficiência combinada (S
causada pela deficiência da enzima adenosina desaminase (A
7.
Cap. 5 TERAPIA GÊNICA
Nas crianças com este distúrbio, a ausência de ADA leva ao acúmulo de
desoxiadenosina trifosfato, que é tóxico para os linfócitos. Os pacientes desenvolvem
recorrentes infecções ameaçadoras de vida devido a respostas imunes defeituosas
mediadas por células e humorais. A terapia padrão atual inclui transplante de medula
óssea de um irmão compatível quanto a HLA. Embora menos eficaz, a reposição
intravenosa de ADA é usada em pacientes que não têm um doador adequado de
medula. Embora a primeira tentativa clínica de terapia gênica para deficiência de ADA
tenha resultado em melhora clínica, ela não forneceu cura permanente. Os primeiros
pacientes foram tratados com repetidas transferências gênicas para linfócitos de
sangue periférico que tinham sido isolados por aferese. Um enfoque preferível seria
inserir o gene ADA em células-tronco hematopoiéticas pluripotentes que podiam
reconstituir o sistema imune com um repertório completo de células imunes. Tais
enfoques estão em desenvolvimento. Foi demonstrado recentemente que a correção a
longo prazo da deficiência de ADA pode ser obtida (embora em níveis menores) em um
modelo de macaco rhesus (Van Beusechem et ai., 1992; Bodine et ai., 1993).
A deficiência de adesão leucocitária (LAD) é outro distúrbio hereditário que resulta do
funcionamento defeituoso dos leucócitos. Os pacientes com este distúrbio não têm
glicoproteínas de superfície celular que medeiam as interações célula-célula
necessárias ao funcionamento imune. Krauss ei ai. (1991) desenvolveram uma
estratégia de terapia gênica mediada por retrovírus para o tratamento desses distúrbios.
Doenças de armazenamento lisossômico. As doenças de armazenamento
lisossômico resultam do acúmulo lisossômico de material celular que não pode ser
degradado, ou de material degradado que não pode ser posteriormente processado.
São conhecidos mais de 50 desses distúrbios em seres humanos e animais. Nesses
distúrbios, a ausência de uma enzima lisossômica em particular envolvida na cisão de
glicolipídios e esfingolipídios leva a um aumento do número e do tamanho dos
lisossomos, e secundariamente a uma perturbação do funcionamento celular. A doença
de Gaucher, herdada de modo recessivo, é típica das doenças de armazenamento em
muitos aspectos. A glicosilceramida, um lipídio, acumula-se nos macrófagos de pessoas
afetadas devido à deficiência de glicocerebrosidase. Isto resulta no aumento do fígado
e baço, lesões ósseas destrutivas e disfunção variável do sistema nervoso central.
Vários defeitos genéticos são conhecidos, e há uma variação significativa do aspecto
fenotípico da doença em um determinado genótipo (Neufeld et ai., 1991).
A observação de que fibroblastos cultivados de uma pessoa afetada podiam ser
“transcorrigidos” por cocultura com células normais que secretam a enzima levou ao
desenvolvimento da terapia de reposição. Embora a administração intravenosa da
enzima deficiente não seja altamente eficaz nos pacientes, a terapia de reposição
demonstrou que as células deficientes da enzima são capazes de captar a enzima
produzida exogenamente. Por outro lado, o transplante em um paciente afetado com
células normais de medula óssea pode oferecer uma melhora clínica em alguns casos
de doenças de armazenamento lisossômico. As células hematopoiéticas transplantadas
são capazes de levar a enzima normal para os tecidos afetados. As células capazes de
produzir a enzima normal podem transferir a enzima secretada para uma célula
receptora por uma via de endocitose mediada por receptor, ou via transferência
mediada por contato direto. Esta capacidade de transferência célula a célula de
enzimas lisossômicas via endocitose, mediada por receptor, foi demonstrada em vários
modelos animais, incluindo um modelo murino de deficiência de 3-glicu- ronidase (BouGharios ei ai., 1993) e um modelo felino de ct-manosidose (Walkley et ai., 1994).
Embora o transplante de medula óssea possa ser terapeuticamente útil em algumas
circunstâncias, sua utilidade é diminuída pela disponibilidade de doadores adequados
de medula e os riscos imunossupressores associados a transplantes alogênicos de
medula óssea. Os métodos de transferência gênica que podem superar esses
problemas estão sendo desenvolvidos. Modificando a medula do paciente para
expressar a enzima desejada, os próprios leucócitos do paciente podem produzir a
enzima normal. Em uma estratégia de tratamento proposta, a medula óssea do
paciente seria colhida e o gene “correto” inserido em uma cultura in vitro. A reinfusão de
células da medula óssea manipuladas levaria a uma reposição a longo prazo da enzima
sem a necessidade de agentes imunossupressores. Vários pesquisadores fizeram transferência gênica mediada por retrovírus em células d medula óssea
de animais e seres humanos, e demonstraram que a produção longo prazo da enzima
desejada é obtenível.
Genes de fármaco-resistência no tratamento do câncer. O
mecanismos pelos quais as células cancerosas são capazes de sobre viver aos efeitos
citotóxicos da quimioterapia são bem descritos par vários agentes quimioterápicos.
Estes mecanismos incluem a expre são dos genes que são capazes de inativar ou
eliminar a droga tóxic (Cap. 51). Embora estes genes atualmente sirvam para limitar a
ef5 cácia de muitos esquemas quimioterápicos, é possível que sejar modificados para
ter o efeito oposto, isto é, para proteger os tecide normais dos efeitos tóxicos da
quimioterapia. Um gene em particulr recebeu muita atenção quanto a isto, o gene de
multifámaco-resistêr eia (MDR- 1) que codifica a proteína transportadora multidroga (tan
bém conhecida como glicoproteína-P). Esta proteína transmembran é capaz de
bombear uma grande variedade de agentes quimioteráp cos (p.ex., dexorrubicina,
alcalóidesda yinca, epipodofilotoxinas taxol) e outras drogas para fora das células,
protegendo-as dos efeitc tóxicos dos agentes (Gottesman et ai., 1994). Muitos cânceres
apre sentam uma sensibilidade dependente de dose para quimioterapi onde doses
maiores de quimioterapia levam a uma maior regressã tumoral e melhor sobrevida
(Cap. 51). Isto é mais bem ilustrad pelos cânceres de testículo, que são altamente
curáveis quando agre sivamente tratados. Infelizmente, a toxicidade para tecidos
normai especialmente medula óssea, limita o uso de doses maiores de qu mioterapia
em muitos cânceres. Para superar isto, o transplante e medula óssea autóloga foi
empregado para salvar a medula óssea d efeitos tóxicos da quimioterapia de alta dose.
Em alguns câncer (p.ex., câncer de mama e testicular), a recidiva após a terapia padri
pode ser tratada colhendo a medula óssea normal não envolvida anU da quimioterapia
de alta dose. A medula autóloga estocada é enti reinfundida para resgatar o paciente da
ablação de medula induzic pela terapia. Esta quimioterapia de alta dosagem com
transplante medula óssea autóloga é hoje a terapia padrão para a recidiva câncer
testicular. Ainda neste conceito, uma estratégia baseada e:
terapia gênica foi proposta na qual o gene MDR- 1 seria usado pa tornar a medula
óssea resistente aos efeitos tóxicos da quimioterap (Gottesman ei ai., 1994).
Embora a transferência gênica para células primordiais da medu óssea leve à
expressão transgênica em apenas uma pequena porcei tagem de células
hematopoiéticas, podem ser usados ciclos sucess vos de quimioterapia para enriquecer
as células de medula transdu2 das. Este enfoque pode ser aplicado a cânceres que
demonstram un grande resposta à dose de quimioterapia e onde a mielossupressão a
toxicidade limitante de dose.
Terapia gênica para doenças infecciosas
A falha dos antibióticos convencionais em tratar muitos tipos graves agentes
patogênicos de modo eficaz, mais notadamente vírus da imunodeficiência humana, e a
disponibilidade de alvos m leculares únicos nestes patógenos encorajaram a
exploração das ter pias gênicas para doenças infecciosas.
AIDS. Nabel et ai. (1994) e Malim et ai. (1992) usaram un proteína mutante negativa
dominante para o desenvolvimento de un estratégia de transferência gênica para o
tratamento de AIDS. A pr teína rev, produzida pelo vírus da imunodeficiência humana, é
un proteína reguladora necessária para a replicação viral. Ela se liga um ARN viral
específico (elemento de resposta rev, RRE) e promo a síntese de novas proteínas
virais. Os estudos em modelos expe mentais mostraram que introduzindo um gene rev
mutante, a céli. infectada por HIV produz uma proteína rev alterada. Esta proteír
chamada Rev MiO, é capaz de ligar-se à mesma organização que a r normal, mas não
é funcional em promover a síntese de novas proteín virais. Conseqüentemente, Rev
MIO inibe competitivamente a ativic de da proteína rev normal e finalmente atenua a
replicação do HIV.
72
Seção 1 PRINCÍPI(
Imunização. Por um enfoque inteiramente diferente, a transferência gênica pode ser
empregada para desencadear a síntese de um anticorpo com uma especificidade
predeterminada. Isto eliminaria a necessidade de depender de uma resposta imune
variável ou imprevisível a uma vacina (particularmente nos pacientes
imunocomprometidos) e poderia ser usada para dirigir a síntese do anticorpo para um
local específico. Chen et ai. (1994b) recentemente descreveram um anticorpo de cadeia
única com especificidade para a proteína gpl2O HIV que pode ser introduzida por
transferência gênica. Eles mostraram que os linfócitos T CD4+ humanos podem ser
transduzidos para expressar este anticorpo intracelularmente, e que a formação de um
sincício citopático e a produção de HIV- 1 foram inibidas, embora não eliminadas.
PERSPECTIVAS
A terapia gênica humana, embora ainda nos primeiros estágios de desenvolvimento,
oferece a possibilidade de grandes avanços na pre vençã
e tratamento de muitas doenças. A terapia gênica tra; radigma inteiramente novo para o
tratamento de distúrbios 1 na ausência ou no defeito de genes, sejam eles herdados ou
dos. Além disso, esta tecnologia provavelmente também evoll o tratamento de doenças
“não-genéticas”, onde a síntese hist fica de uma proteína pode ser usada para benefício
terapê identificação de novos genes relacionados a doenças especff pliará o escopo
das aplicações. Atualmente, entretanto, a a clínica da terapia gênica é mais limitada
pela disponibilidade metodologia adequada de transferência gênica do que pela id ção
de alvos adequados para alteração genética. Entretanto ur ro crescente de
pesquisadores estão se dedicando a estes as melhores reagentes provavelmente irão
emergir. Além dis melhor compreensão dos processos fisiopatológicos irá pe
estabelecimento de intervenções fisiologicamente apropriada ra-se que o aumento de
colaboração entre os médicos, biólo1 leculares e biólogos celulares resulte no
desenvolvimento de gens altamente integradas para’ esta nova forma de terapia.
BIBLIOGRAFIA
Anderson, W. F., Blaese, R.M., and Culver, K. The ADA human gene therapy protocol.
Hum. Gene The,, 1990, 1:33 1-341.
Armentano, D., Sookdeo, C., White, G., Giuggio, V., Souza, D., Couture, L., Cardona,
L., Vincent, K., Wadsworth, S., and Smith, A. Second generation adenovirus vectors for
cystic fibrosis gene therapy. J. Celi Biochem Suppl., 1994, 18A:222.
Barba, D., Hardin, J., Sadelain, M., and Gage, EH. Development of antitumor immunity
following thymidine kinase-mediated killing of experimental brain tumors. Proc. Nati.
Acad. Sci. USA., 1994, 91 :4348-4352.
Batra, R.K., Wang-Johanning, E, Wagner, E., Garver, RI., and Curiel, D.T. Receptormediated gene delivery employing Iectin-binding specificity. Gene Therapy, 1994, 1:255260.
Bett, AJ., Haddara, W., Prevec, L., and Graham, F.L. An efficient and flexible system for
construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3.
Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 1994, 91:8802-8806.
Bodine, D.M., Moritz, T., Donahue, R.E., Luskey, B.D., Kessler, S.W., Martin, D.1.K.,
Orkin, S.H., Nienhuis, A.W., and Williams, D.A. Long-term in vivo expression of a murine
adenosine deaminase gene in Rhesus monkey hematopoietic celis of multiple lineages
after retroviral mediated gene transfer into CD34 bone marrow celis. Biood,
1993,82:1975-1980.
Bou-Gharios, G., Adams, O., Pace, P., Warden, P., and Olsen, 1. Correction of a
lysosomal deficiency by contact-mediated enzyme transfer after bone marrow
transpiantation. Transpiantation, 1993, 56:991-996.
Boviatsis, E.J., Chase, M., Wei, M.X., Tamiya, T., Hurford, R.K., Jr., Kowall, N.W.,
Tepper, RI., Breakefield, X.O., and Chiocca, E.A. Gene transfer into experimental brain
tumors mediated by adenovirus, herpes simplex virus, and retrovirus vectors. Hum.
Gene Ther., 1994,5:183-191.
Brigham, K., Meyrick, B., Christman, B., Magnuson, M., King, G., and Berry, L., In vivo
transfection of murine lungs with a functioning prokaryotic gene using a liposome
vehicle. Am. J. Med. Sci., 1989, 298:278-281.
Canonico, A.E., Conary, J.T., Meyrick, B.O., and Brigham, K.L. Aerosol and intravenous
transfection of human es 1 -antitrypsin gene to lungs of rabbits. Am. J. Resp. Celi. Moi.
Biol., 1994, 10:24-29.
Chen, S.-H., Shine, H.D., Goodman, J.C., Grossman, R.G., and Woo, S.L. Gene
therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirusmediated
gene transfer in vivo. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1994a, 91 :3054- 3057.
Chen, S.-Y., Bagley, J., and Marasco, W.A. Intracellular antibodies as a new class of
therapeutic molecules for gene therapy. Hum. Gene Ther., 1994b, 5:595-601.
Chowdhury. J.R., Grossman, M., Gupta, S., Chowdhury, N.R., Baker, J.R., Jr., and
Wilson, J.M. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy
in LDLR-deficient rabbits. Science. 1991, 254:1802-1805.
Conary, J.T., Parker, R.E., Christman, B.W., Faulks, R.D., King. G.A., Meyrick, B.O.,
and Brigham, K.L. Protection of rabbit lungs from endotoxin injury by in vivo
hyperexpression of the prostglandin G/H synthase gene. J. Clin. Invest., 1994, 93:18341840.
Cristiano, R.J., Smith, L.C., Kay, M.A., Brinkley, B.R., and Woo, S.L.C. Hepatic gene
therapy: efficient gene delivery and expression in primary hepatocytes utilizing a
conjugated adenovirus-DNA complex. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1993,90:1154811552.
Culver, K.W., Anderson, W.E, and Blaese, R.M. Lymphocyte gene thera Gene Ther.,
1991,2:107-109.
Davis, H.L., Demeneix, B.A., Quantin, B., Coulombe, J., and Whalen, R mid DNA is
superior to viral vectors for direct gene transfer into adu skeletal muscle. Hum. Gene
Ther, 1993,4:733-740.
Dranoff, G., Jaffee, E., Lazenby, A., Golumbek, P., Levitsky, H., Brose, son, V.,
Hamada, H., Pardoll, D., and Mulligan, R.C. Vaccination witl ted tumor celis engineered
to secrete murine granu1ocyte-macrophag stimulating factor stimulates potent, specific,
and long-lasting ar immunity. Proc. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 1993, 90:3539-3543.
Engelhardt, J.E, Litzky, L., and Wilson, J.M. Prolonged transgene expn cotton rat lung
with recombinant adenovirus defective in E2a. Hum Therapy, 1994,5:1217-1229.
Feigner, P., Gadek, T., Hoim, M., Roman, R., Chan, H.W., Wenz, M., North
Ringold, G.M., and Danielsen, M. Lipofection: a highly efficient, lipis
ted DNA transfection procedure. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1987,1
74 17.
Fisher, K.J., and Wilson, J.M. Biochemical and functional analysis of an rus-based
ligand complex for gene transfer. Biochem. J., 1994, 299:4
Freeman, S.M., Abboud, C.N., Whartenby, K.A., Packman, C.H., Koepl Moolten, F.L.,
and Abraham, G.N. The “bystander effect”: tumor re when a fraction of the tumor mass
is genetically modified. Cancer Re, 53:5274-5283.
Fynan,E.E,Webster,R.G., Fuller,D.H.,Haynes,J.R., Santoro,J.C., andR H.L. DNA
vaccines: protective immunizations by parenteral, muco gene-gun inoculations. Proc.
Nati. Acad. Sei. USA., 1993, 90:11478
Gottesman, MM., Germann, U.A., Aksentijevich, 1., Sugimoto, Y., Ca CO., and Pastan,
1. Gene transfer of drug resistance genes: implical cancer therapy. Ann. N.Y Acad. Sei.,
1994, 716: 126-138.
Graham, F.L., and Prevek, L. Manipulation of adenoviral vectors. In, Me Molecular
Biology: Gene Transfer and Expression Protocois. The 1 Press, Inc., Clifton, NJ, 1991,
pp. 109-128.
Greber, U.F., Willetts, M., Webster, P., and Helenius, A. Stepwise dismar adenovirus 2
during entry into celis. Celi. 1993, 75:477-486.
Grossman, M., Raper, SE., Kozarsky, K., Stein, E.A., Engelhardt, J.E, Mu Lupien, P.J.,
and Wilson, J.M. Successful ex vivo gene therapy directet in a patient with familial
hypercholesterolaemia. Nat. Genet., 1994,6:3
Horwitz, M.S. Adenoviruses. In Viroiogy, 2nd cd. Raven Press, New Yorl pp. 1723-1740.
Hyde, S.C., Gil!, D.R., Higgins, C.E, and Trezise, A.E.O. Correction of transport defect in
cystic fibrosis transgenic mice by gene therapy.
1993, 362:250-255.
Jo!ly, D. Viral vector systems for gene therapy. Cancer Gene Therapy
1:51-64.
Kennedy, P.G.E., and Steiner, 1. The use of herpes simplex virus vectors f therapy in
neurological diseases. Q. J. Med., 1993, 86:697-702.
Kotin, R.M. Prospects for the use of adeno-associated virus as a vector for gene
therapy. Hum. Gene Ther., 1994,5:793-801.
Kozarsky, K.E, McKinley, D.R., Austin, L.L., Raper, S.E., Stratford-Perri L.D., and
Wilson, J.M. Iii vivo correction of low density lipoprotein r
Cap. 5 TERAPIA GÊNICA
deficiency in the Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit with recombinant
adenoviruses. J. Biol. Chem., 1994, 269:13695-13702.
Krauss, J.C., Bond, L.M., Todd, R.EI., and Wilson, J.M. Expression of retroviral
transduced human CD 18 in murine celis: an in vitro model of gene therapy for leukocyte
adhesion deficiency. Hum. Gene Ther., 1991,2:221-228.
Ledley, T.S., and Ledley, F.D. Multicompartment, numerical model of celiular events in
the pharmacokinetics of gene therapies. Hum. Gene Ther, 1994,
5:679-691.
Li, Y., McGowan, P., Helistrom, 1., Helistrom, K.E., and Chen, L. Co-stimulation of
tumor-reactive CD4+ and CD8÷ T Iymphocytes by B7, a natural ligand for CD28, can be
used to treat established mouse melanoma. J. Immunol., 1994, 153:421-428.
Lotze, M.T. Transpiantation and adoptive ceilular therapy of cancer: the role of T-cell
growth-factors. Celi Transplant., 1993, 2:33-47.
Lotze, M.T., and Rubin, J.T. Gene therapy of cancer: a pilot study of IL-4-gene- modified
fibroblasts admixed with autologous tumor to elicit an immune response. Hum. Gene
Ther., 1994,5:41-55.
Lotze, M.T., and Rubin, J.T. The treatment of patients with melanoma using interleukin2, interleukin-4 and tumor infiltrating lymphocytes. Hum. Gene Ther., 1992,3:167-177.
Malim, M.H., Freimuth, W.W., Liu, J., Boyle, T.J., Lyerly, H.K., Culien, B.R., and Nabel,
G.J. Stable expression of transdominant Rev protein in human T cells inhibits human
immunodeficiency virus replication. J. Exp. Med., 1992, 176:1197-1201.
Michael, SI., and Curiel, D.T. Strategies to achieve targeted gene delivery via the
receptor-mediated endocytosis pathway. Gene Therapy, 1994, 1:223-232.
MilIer, A.D., MilIer, D.G., Garcia, J.V., and Lynch, C.M. Use of retroviral vectors for gene
transfer and expression. Methods Enzymol., 1993,217:581-599.
Moolten, EL. Tumor chemosensitivity conferred by inserted herpes thymidine kinase
genes: paradigm for a prospective cancer control strategy. Cancer Res.,
1986, 46:5276-5281.
Moss, B. Poxviridae and their replication. lo, Virology. Raven Press, New York, 1990,
pp. 2079-2111.
Moss, B., and Flexner, C. Vaccinia virus expression vectors. Annu. Rev. Immunol.,
1987, 5:305-324.
Nabel, E.G., Plautz, G., Boyce, EM., Stanley, J.C., and Nabel, GJ. Recombinant gene
expression in vivo within endothelial cells of the arterial wall. Science,
1989, 244:1342-1344.
Nabel, E.G., Plautz, G., and Nabel, G.J. Transduction of a foreign histocompatibility
gene into the arterial wall induces vasculitis. Proc. Nati. Acad. Sei., U.S.A.,
1992,89:5157-5161.
Nabel, E.G., Plautz, G.E., and Nabel, G.J. Recombinant growth factor gene expression
in vascular cells in vivo. Ann. N. Y Acad. Sci., 1994a, 714:247-252.
Nabel, E.G., Shum, L., Pompili, V.J., Yang, Z.Y., San, H., Shu, H.B., Liptay, S., Gold, L.,
Gordon, D., Derynck, R., and Nabel, G.J. Direct transfer of transforming growth factor
beta 1 gene unto arteries stimulates fibrocellular hyperplasia. Proc. Nau. Acad. Sei.
U.S.A., 1993a, 90:107759-107763.
Nabel, E.G., Yang, Z., Liptay, S., San, H., Gordon, D., Haudenschild, C.C., and Nabel,
G.J. Recombinant platelet-derived growth factor B gene expression in porcine arteries
induces intimal hyperplasia in vivo. J. Clin. Invest., 1993b, 91:1822-1829.
Nabel, E.G., Yang, Z.Y., Plautz, G., Forough, R., Zhan, X., Haudenschild, CC., Maciag.
T., and Nabel, G.J. Recombinant fibroblast growth factor-1 promotes intimal hyperplasia
and angiogenesis in arteries in vivo. Nature, 1993c, 362:844-846.
Nabel, G.J., Fox, B.A., Felgner, P., Shu, 5., and Cho, K. Immunotherapy for cancer by
direct gene transfer into tumors. Hum. Gene Ther., 1994b, 5:57-77.
Nabel, G.J., Fox, B.A., Post, L., Thompson, C.B., and Woffendin, C. A molecular genetic
intervention for AIDS — effects of a transdominant negative form of Rev. Hum. Gene
Ther., 1994, 5:79-92.
Neel, J.V. Germ-line gene therapy: another view. Hum. Gene Ther., 1993, 4:127-128.
1
Neufeld, E.F. Lysosomal storage diseases.Annu. Rev. Biochem., 1991,60:257-28
Nicolau, C., Le Pape, A., Soriano, P., Fargette, E, and Juhel, M-F. In vivo expre
sion of rat insulin after intravenous administration of the liposome-entrapp gene for rat
insulin 1. Proc. Nau. Acad. Sei. USA., 1983, 80:1068-1072.
Nienhuis, A.W., McDonagh, K.T., and Bodine, D.M. Gene transfer into hemat poietic
stem cells. Cancer, 1991, 67:2700-2704.
Ohno, T., Gordon, D., San, H., Pompili, V.J., Imperiale, M.J., Nabel, G.J., ar Nabel, E.G.
Gene therapy for vascular smooth muscle cell proliferation aft arterial injury. Science,
1994, 265:781-784.
Oldfield, EH., Ram, Z., Culver, K.W., Blaese, R.M., DeVroom, H.L., and Ande son, W.E
Gene therapy for the treatment of brain tumors using intra-tumor transduction with lhe
thymidine kinase gene and intravenous ganciclov Hum. Gene Ther., 1993,4:39-69.
Rosenberg, S.A., Aebersold, P., Cornetta, K., Kasid, A., Morgan, R.A., Moen, F Karson,
E.M., Lotze, M.T., Yang, J.C., Topalian, S.L., Merino, M.J., Culve K., Miller, AD., Blaese,
R.M., and Anderson, W.E Gene transfer into human immunotherapy of patients with
advanced melanoma, using tumor-infiltratir lymphocytes modified by retroviral gene
transduction. N. Engi. J. Med., 199 323:570-578.
Rubin, B.A., and Rorke, L.B. Adenovirus vaccines. In, Vaccines, 2nd ed. W.l Saunders,
Philadelphia, 1994, pp. 474-502.
Seth, P. Adenovirus-dependent release of choline from plasma membrane vesicl at an
acidic pH is mediated by the penton base protein. .1. Virol., 199
68:1204-1206.
Tatum, E.L. Molecular biology, nucleic acids and the future of medicine. Perspe Biol.
Med., 1966, 10: 19-32.
Tepper, R.I., and Mule, J.J. Experimental and clinical studies of cytokine gene-mi dified
tumor edis. Hum. Gene The,, 1994,5:153-164.
Valyi-Nagy, T., Gesser, R.M., Raengsakulrach, B., Deshmane, S.L., Randazz B.P.,
Dillner, A.J., and Fraser, N.W. A thymidine kinase-negative HSV- 1 stra establishes a
persistent infection in SCID mice that features uncontrolle peripheral replication but only
marginal nervous system involvement. Viro1 gy, 1994, 199:484-490.
Le van Beusechem, V.W., Kukler, A., Heidt, P.J., and Valerio, D. Long-ten expression of
human adenosine deaminase in rhesus monkeys transplante with retrovirus-infected
bone-marrow cells. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 1992, 89:7640-7644.
Walkley, S.U., Thrall, M.A., Dobrenis, K., Huang, M., March, P.A., Siegel, DA and
Wurzelmann, 5. Bone marrow transplantation corrects lhe enzyme defe in neurons of lhe
central nervous system in a lysosomal storage disease. Pro Nau. Acad. Sei. USA.,
1994, 91:2970-2974.
Wilson, J.M., Birinyi, L.K., Salomon, R.N., Libby, P., Callow, AD., and Mulliga R.C.
Implantation of vascular grafts lined with genetically modified endoth lial cells. Science,
1989,244:1344-1346.
Wolff. J.A.. and Lederberg. J. An early history of gene transfer and therapy. Hue Gene
Ther., 1994, 5:469-480.
Wolff, IA., Malone, R.W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A., as Feigner, P.L.
Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science, 199 247:1465-1468.
Wu, G.Y., and Wu, C.H. Receptor-mediated iii vitro gene transformation by soluble DNA
carrier system. J. Biol. Chem., 1987, 262:4429-4432.
Yang, Y, Nunes, F.A., Berencsi, K., Furth, E.E., Gbncziil, E., and Wilson, Jis Cellular
immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for ger therapy. Proc. Nati.
Acad. Sei. U.S.A., 1994, 91:4407-4411.
Zabner, J., Couture, LA., Gregory, R.J., Graham, S.M., Smith, A.E., and Welsl
MI. Adenovirus-mediated gene transfer transiently corrects the chloride tran
Port defect in nasal epithelia of patients with cystic fibrosis. CeIl, 199
75:207-216.
Zenke, M., Steinlein, P., Wagner, E., Cotten, M., Beug, H., and Bimstiel, M.I Receptormediated endocytosis of transferrin-polycation conjugates: an effe tive way tu introduce
DNA into hematopoietic cells. Proc. Nati. Acad. Se
U.S.A., 1990, 87:3655-3659.
a