Trabalho

XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA E HISTOQUÍMICA DE EMBRIÕES
SOMÁTICOS OBTIDOS IN VITRO DO HÍBRIDO DE Phalaenopsis Classic
Spotted Pink. (ORQUIDACEAE)
Simone Sampaio e Silva1, Maiza de Azevedo Dantas2, Emilia Cristina Pereira de Arruda 3, Cláudia Ulisses4.
Introdução
O mercado floricultor brasileiro tem se destacado muito como uma atividade promissora para o agronegócio do país,
trazendo o suprimento do mercado interno como externo, e apresentando inúmeras conquistas neste ramo. Destacando-se a
comercialização de orquídeas e rosas que são as flores mais tradicionais e mais desejadas pelo consumidor final, e
consolidando-se como importante atividade econômica em várias regiões do país (REIS, 2011).
A família Orchidaceae evidencia-se na floricultura como um grupo muito apreciado e cultivado por sua beleza, exotismo,
diversidade de cores, tamanhos e formas, além de algumas espécies serem fornecedoras de aromas e outros componentes
utilizados na indústria (FARIA, 2012). Dentre os gêneros que mais se destacam de forma econômica mundial está o gênero
Phalaenopsis (HEW, 1994; LAWS, 1995), que apresenta plantas monopodiais, alternifólias, terminando sempre em um
meristema vegetativo, onde sua propagação vegetativa é lenta, pois a formação de brotos laterais não é comum, e a
utilização do ápice caulinar na propagação in vitro é extremamente prejudicial para a planta, promovendo a morte da
mesma. Por isso, torna-se necessário a indução da morfogênese in vitro que possibilita a utilização de regiões vegetativas
das plantas desse gênero, evitando a morte da planta matriz (MINAMIGUCHI e MACHADO NETO, 2007).
A embriogênese somática (ES) é um caso particular de morfogênese que se destaca por produzir um grande número de
embriões a partir de células haplóides ou somáticas que desenvolvem-se através de diferentes estádios embriogênicos,
dando origem a uma planta, sem que ocorra a fusão de gametas (WILLIAMS & MAHESWARAN, 1986). Os embriões
somáticos tanto de monocotiledôneas como de dicotiledôneas, apresentam muitas características morfológicas semelhantes
às do embrião zigótico, tendo uma estrutura bipolar e passando pelos estágios de desenvolvimento pró-embrionário e
embrionário de globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar (PEREIRA, 2007; ALMEIDA, 2008; JIMÉNEZ, 2001).
As estruturas internas do embrião somático globular e cordiforme são semelhantes aos equivalentes zigóticos; a
protoderme é evidente, bem como a polaridade, e no estádio cordiforme, simetria bilateral (SMITH, 1985). As principais
diferenças entre os embriões somáticos e zigóticos relacionam-se com o fato de os embriões somáticos se desenvolverem
livres de correlações físicas, fisiológicas e genéticas que ocorrem durante o desenvolvimento de um embrião zigótico
(ZIMMERMANN, 1993) e poderem apresentar desenvolvimento anormal. Uma particularidade dos embriões somáticos é a
presença de um sistema vascular fechado, sem conexão vascular com os tecidos do explante inicial. Esta característica
aliada a sua bipolaridade torna este modelo morfogenético distinto dos processos de micropropagação e de organogênese.
Desse modo, a embriogênese somática, como técnica para propagação clonal, tem sido tema de diferentes estudos, em
especial, com abordagens morfológicas e histológicas, para melhor entendimento da caracterização das estruturas iniciais e
do desenvolvimento embriogênico em plantas superiores (FLOR et al., 2008; QUIROZ-FIGUEROA et al., 2006). O
presente trabalho teve como objetivo, avaliar a morfologia interna e a histoquímica dos embriões somáticos obtidos da
indução in vitro de explantes foliares e protocormos do híbrido de Phalaenopsis Classic Spotted Pink.
Material e métodos
As estruturas formadas durante o processo de indução in vitro no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da
UFRPE foram fixadas em FAA 50 (JOHANSEN,1940) por 72 horas e preservadas em álcool etílico 70% (JENSEN, 1962).
Posteriormente, o material foi desidratado em série alcoólica (95% e 100%), sendo então emblocado em parafina e
seccionado em micrótomo rotativo (MRP09 LUPETEC), em séries transversais e longitudinais, cujos cortes variaram entre
5 a 10 µm de espessura. Os cortes obtidos foram submetidos à dupla coloração composta por azul de Astra e safranina (1:1,
v/v) e montados em lâminas permanentes com bálsamo do Canadá (BUKATSCH, 1972). A análise e o registro dos
caracteres histológicos mais relevantes foram realizados em microscópio de luz (Coleman) com registros fotográficos. Para
a verificação histoquímica, as lâminas com os cortes foram submetidas aos testes histoquímicos com Lugol para amido,
Sudam III para lipídio, Cloreto férrico para fenóis em geral e depois fotografados em microscópio de luz.
1
Simone Sampaio e Silva é Graduanda do Bacharelado em Ciências Biológicas, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua D. Manoel de
Medeiros s/n Dois Irmãos Recife – PE – Brasil, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
2
Maiza de Azevedo Dantas é Mestranda no Programa de Pós-graduação em Botânica, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua D. Manoel de
Medeiros s/n Dois Irmãos Recife – PE – Brasil, CEP 52171-900.
3
Emilia Cristina Pereira de Arruda é Professora Adjunta do Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco. Av. Prof. Moraes
Rego,1235- Cidade Universitária, Recife-PE, CEP 50670-901.
4
Claudia Ulisses é Professora Adjunta do Departamento de Botânica, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua D. Manoel de Medeiros s/n
Dois Irmãos Recife – PE – Brasil, CEP 52171-900.
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
Resultados e Discussão
As análises histológicas permitiram evidenciar a formação de estruturas embriogênicas surgindo diretamente da
superfície do explante, ou seja, da epiderme e tecido subepidérmico do explante foliar (Fig. 1A e 1B), conforme foi também
observado por Chen e Chang (2006) que trabalhando com outra espécie, a Phalaenopsis amabilis, conseguiram resultados
semelhantes. Pode-se verificar uma intensa divisão das células, com divisões anticlinais e periclinais, apresentando
citoplasma denso, caracterizando células meristemáticas para a formação da protoderme do embrião (Fig. 1E e 1F) e na
região mais central a formação de tecido fundamental (parênquima).
Na estrutura formada com 60 dias de cultivo (Fig. 1C) observa-se acima de um embrião somático formado inicialmente
(embrião primário), uma outra estrutura embriogênica (embrião secundário) que apresenta uma ligação entre o embrião
primário e o embrião secundário, semelhante a um suspensor, o qual geralmente se observa em embriões zigóticos. A
epiderme do embrião é bem parecida com a do explante e as estruturas formadas são bem superficiais sem conexões com o
sistema vascular.
No corte contendo a regeneração em planta via embriogênese somática secundária já se pode observar uma organização
melhor das células para formar os tecidos, como por exemplo o domo apical, porém tudo ainda muito meristemático.
Verifica-se o surgimento dos primórdios foliares representados por estruturas alongadas próximas ao meristema apical da
planta (Fig. 1D). Há vários feixes dispersos (Fig. 1G) e a presença de ilhotas de procâmbio (Fig. 1H) que dará origem ao
sistema vascular da planta, ou seja, como será distribuído os vasos: xilema e floema. Segundo Raven (2007) todos estes
meristemas primários: protoderme, meristema fundamental e procâmbio são formados durante a embriogênese e estendemse para outras regiões do embrião, à medida que a embriogênese continua.
Nas estruturas provenientes de protocormos pode-se observar formação do meristema apical caulinar (Fig. 2A), presença
de grãos de amido nos embriões formados (Fig. 2B), início da formação do vaso condutor (xilema) (Fig. 2C) e presença de
ráfides (Fig. 2D).
Nos testes histoquímicos, o Sudam III reagiu apenas na cutícula do embrião (Fig. 2A e 2B), a nível de revestimento, nada
de lipídeo dentro do corte, apenas reação com a cutina (lipídeo que fica na cutícula); o Lugol reagiu na área do tecido
fundamental ou parênquima em volta do sistema vascular (Fig. 2C) e da bainha amilífera; e com o Cloreto férrico não se
observou muita reação, apenas próximo do meristema apical da planta que estava se regenerando (Fig. 2D), provavelmente
devido a alguma injúria sofrida pela mesma durante o processo de indução da embriogênese.
Esses resultados permitiram evidenciar o caráter embrionário dessas estruturas morfogênicas obtidas in vitro durante o
processo de indução, além de auxiliar na identificação de compostos orgânicos como lipídios, amido, compostos fenólicos,
entre outros, presentes no desenvolvimento dos tecidos e órgãos da planta.
Agradecimentos
Agradecimento ao CNPQ pelo fornecimento da bolsa de pesquisa para a obtenção de mais conhecimentos na área
científica.
Referências
ALMEIDA, J.; SILVAROLLA, M.; FAZUOLI, L.; STANCATO, G. Somatic embryogenesis in genotypes of Coffea arabica L.. Coffee
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Disponível em: http://www.biota.org.br/publi/banco/index?show+12921167 .Acesso em 01. nov. 2012.
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MINAMIGUCHI, J.; MACHADO NETO, N.B. Embriogênese somática direta em folhas de Phalaenopsis: Orquidaceae. Colloquium
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PEREIRA, A. R. et al . Direct somatic embryogenesis in Coffea arabica L. cv. Acaiá Cerrado: kinetin and giberelic acid effects. Ciênc.
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QUIROZ-FIGUEROA, F.R.; ROJAS-HERRERA, R.; GALAZ-AVALOS, R.M.; LOYOLA-VARGAS, V.M. Embryo production
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RAVEN, P. H., EVERT, R. F.; EICHHORN, S. E. BIOLOGIA VEGETAL. 7A ED. ED. GUANABARA KOOGAN. RIO DE JANEIRO.
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WILLIAMS, E.S.; MAHESWARAN, B. Somatic embryogenesis: factors influencing coordinated behavior of cells as embryogenesis.
Annals of Botany. v.57, p.443-462, 1986.
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
Figura 1. A e B- Formação de embriões somáticos diretos (setas) do explante foliar; C- Explante foliar com embriões somáticos primários
(EP). Estrutura semelhante a um “suspensor” (círculo) ligando um embrião primário (EP) a um embrião secundário (ES) e D- Embrião
regenerando em planta, presença do domo apical (seta preta) e primórdio foliar (seta vermelha). E e F- Células em constante divisão celular
(seta preta), característica de células meristemáticas para a formação da protoderme do embrião, e presença de ráfides (seta roxa). GVários feixes dispersos na estrutura que está regenerando em planta; H- Presença de ilhotas de procâmbio.
Figura 2. Estruturas formadas da indução embriogênica de protocormos. A- Formação do meristema caulinar apical. B- Formação do vaso
condutor (xilema). C- Presença de grãos de amido. D- Presença de ráfides. Fig. 2A, (10x); Fig. 2B, (40x); Fig. 2C, (40x); Fig. 2D,(40x).
Figura 3. A e B- Reação do Sudam III na cutícula do embrião com 60 dias de cultivo. C- Reação do lugol na área do parênquima em volta
do sistema vascular que estava se formando do embrião regenerando em planta. D- Reação do cloreto férrico próximo ao meristema apical da
planta em regeneração. Fig. 3A,(10x) ; Fig. 3B, (40x); Fig. 3C, (10x); Fig. 3D, (10x).