expressão de micrornas e dos genes da interleucina 2 e fator

UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
LUANNA MUNHOZ ZABAGLIA
EXPRESSÃO DE MICRORNAS E DOS GENES DA
INTERLEUCINA 2 E FATOR DE NECROSE TUMORAL
E SUAS CORRELAÇÕES COM O H. PYLORI
BAURU
2017
LUANNA MUNHOZ ZABAGLIA
EXPRESSÃO DE MICRORNAS E DOS GENES DA
INTERLEUCINA 2 E FATOR DE NECROSE TUMORAL
E SUAS CORRELAÇÕES COM O H. PYLORI
Dissertação apresentada a Pró Reitoria
de Pesquisa e Pós-Graduação da
Universidade do Sagrado Coração, como
parte dos requisitos para obtenção do
título de mestre em Ciência e Tecnologia
Ambiental, área de concentração: Ciência
e Tecnologia Ambiental, sob Orientação
do Prof. Dr. Lucas Trevizani Rasmussen.
BAURU
2017
Zabaglia, Luanna Munhoz
Z12e
Expressão de micrornas e dos genes da interleucina 2 e fator
de necrose tumoral e suas correlações com o H. pylori / Luanna
Munhoz Zabaglia. -- 2016.
79f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Lucas Trevizani Rasmussen.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia Ambiental) Universidade do Sagrado Coração - Bauru - SP
1. Doenças gástricas. 2. Helicobacter pylori. 3. Interleucina 2.
4. MicroRnas. 5. TNF-alpha. I. Rasmussen, Lucas Trevizani. II.
Título.
LUANNA MUNHOZ ZABAGLIA
EXPRESSÃO DE MICRORNAS E DOS GENES DA
INTERLEUCINA 2 E FATOR DE NECROSE TUMORAL
E SUAS CORRELAÇÕES COM O H. PYLORI
Dissertação apresentada á Pró Reitoria
de Pesquisa e Pós-Graduação da
Universidade do Sagrado Coração, como
parte dos requisitos para obtenção do
título de mestre em Ciência e Tecnologia
Ambiental, área de concentração: Ciência
e Tecnologia Ambiental, sob Orientação
do Prof. Dr. Lucas Trevizani Rasmussen.
Banca examinadora:
_____________________________
Prof. Dr. Lucas Trevizani Rasmussen
Universidade do Sagrado Coração
_____________________________
Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão
Universidade do Sagrado Coração
________________________________
Prof.ª Dra. Isabela Bazzo
Faculdades Integradas de Ourinhos
Bauru, 7 de Março de 2017
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha família, meu
porto seguro, pelo exemplo de dignidade
e perseverança, pela confiança na minha
capacidade e pela sólida formação que
me proporcionou a continuidade dos
meus estudos até aqui. Á vocês, todo o
meu amor e agradecimento por tudo que
sou e por tudo que consegui conquistar.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus por me sustentar até aqui, por todas as
graças e bênçãos, por me dar fé, força e persistência para ultrapassar todos os
obstáculos encontrados, iluminando meu caminho em todos os momentos em que
precisava de luz, não permitindo que eu desistisse nesta longa caminhada de
realizações.
Agradeço aos meus pais, pelo profundo apoio me estimulando nos dias mais
difíceis. Obrigada por desejarem sempre o melhor pra mim, pelo esforço que fizeram
para que eu pudesse superar cada obstáculo em meu caminho, e chegar até aqui, e
principalmente, obrigada pelo amor imenso que vocês têm por mim. Sem vocês
nada disso seria possível, minha eterna gratidão.
Gratidão especial ao Professor Dr. Lucas Rasmussen, meu orientador e,
sobretudo amigo, pela pessoa e profissional que é. Obrigada por sua dedicação,
deixando de lado seus momentos de descanso para me ajudar e orientar, e
principalmente, por sempre ter acreditado e depositado sua confiança em mim ao
longo desses anos de trabalho, que se iniciaram ainda na graduação. Sem a sua
orientação, apoio e amizade, nada disso seria possível.
Um obrigado especial a todos meus amigos e familiares que sempre
estiveram do meu lado, me apoiando e torcendo por mim, independente da distância
entre nós.
Agradeço também a Universidade Sagrado Coração - USC e às instituições
colaboradoras: Faculdade de Medicina de Marilia – FAMEMA e Universidade
Federal de São Paulo – UNIFESP por tornar possível a realização do meu trabalho.
A elaboração deste trabalho tornou - se possível graças ao auxílio da
Fundação de Amparo à Pesquisa Científica do Estado de São Paulo-FAPESP (Nº
Processo 2015/11613-9 e 2015/11371-5) na forma de bolsa de estudo e auxílio
regular, respectivamente, na qual somos profundamente gratos.
RESUMO
Os miRNAs parecem exercer uma importante função no controle da
expressão de diversos genes, entre eles, IL-2 e TNF-α. Assim, 294 amostras de
biopsias gástricas de pacientes dispépticos foram submetidas à análise de
expressão, por PCR em Tempo Real, e dos polimorfismos, por PCR-RFLP,
rs2069762 (IL-2: +114T>G), rs2069762 (IL-2: -330T>G) e rs1800629 (TNF-α: -308
G>A), dos genes da IL-2 e TNF-α. Em paralelo, também foram avaliados os níveis
de expressão dos miRNAs 146a, 155, e 181c. Verificamos uma associação
estatisticamente significativa entre a presença do H. pylori e desenvolvimento de
gastrite e câncer gástrico (CA). Quanto aos polimorfismos da IL-2, o genótipo T/T do
+114 T>G, e o G/G do -330 T>G demonstraram ser um fator de risco para o CA. O
haplótipo +114T/-330G também foi associado ao CA. Aliado ao exposto, o genótipo
A/A do polimorfismo -308 G>A do gene TNF-α também foi associado ao risco do
desenvolvimento do CA. Quanto à expressão gênica, para IL-2, não houve diferença
estatisticamente
significante.
Por
outro
lado,
verificamos
um
aumento
estatisticamente significante da expressão do TNF-α no grupo gastrite em relação ao
controle, e uma diminuição estatisticamente significante no grupo CA também em
relação ao controle. Resultados similares foram encontrados considerando a
presenta do H. pylori. Houve também aumento estatisticamente significante da
expressão dos miRNA 146a e 155 no grupo gastrite em relação ao controle,
contrariamente houve uma diminuição estatisticamente significante da expressão do
miRNA 181c no grupo de câncer. Por fim nossos dados revelaram o envolvimento
dos miRNA 146a e 155 no controle dos genes IL-2 e TNF-α assim como o
envolvimento do miRNA 181c na etiologia do câncer gástrico.
Palavras-chave: Doenças gástricas. Helicobacter pylori. Interleucina 2.
MicroRNAs. TNF-α.
ABSTRACT
The miRNAs appear to play an important role in controlling the expression of
several genes, including IL-2 and TNF-α. Thus, 294 samples of gastric biopsies from
dyspeptic patients were submitted to expression analysis by PCR in Real Time and
polymorphisms by PCR-RFLP, rs2069762 (IL-2: + 114T> G), rs2069762 (IL- -330T>
G) and rs1800629 (TNF-α: -308G> A), of the IL-2 and TNF-α genes. In parallel, the
expression levels of miRNAs 146a, 155, and 181c were also evaluated. We found a
statistically significant association between the presence of H. pylori and the
development of gastritis and gastric cancer (CA). As for IL-2 polymorphisms, the
genotype T/T of the +114 T>G and the G/G of the -330 T>G showed to be a risk
factor for CA. The haplotype + 114T / -330G was also associated with CA. Allied to
the above, the A/A genotype of the -308 G>A polymorphism of the TNF-α gene was
also associated with the risk of CA development. As for gene expression, for IL-2,
there was no statistically significant difference. On the other hand, we observed a
statistically significant increase in the expression of TNF-α in the gastritis group in
relation to the control, and a statistically significant decrease in the CA group also in
relation to the control. Similar results were found considering the presence of H.
pylori. There was also a statistically significant increase in the expression of miRNA
146a and 155 in the gastritis group in relation to the control, in contrast there was a
statistically significant decrease in the expression of miRNA 181c in the cancer
group. Finally, our data revealed the involvement of miRNA 146a and 155 in the
control of IL-2 and TNF-α genes as well as the involvement of miRNA 181c in the
etiology of gastric cancer.
Keywords: Gastric disease. Helicobacter pylori. Interleukin 2. microRNAs. TNF-α.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Gel de agarose à 2%, corado com brometo de etídio para a detecção do
H. pylori. Slots 1-8: Amostras H. pylori positivo; Slot 9: Amostras H. pylori negativo;
C-: Controle Negativo; C+: Controle Positivo. ...........................................................37
Figura 2- Gel de agarose à 2%, corado com brometo de etídio para a detecção do
gene cagA do H. pylori. Slots 1-5, 7 e 10: Amostras cagA negativa; Slots 6, 8 e 9:
Amostras cagA positivas; C-: Controle Negativo; C+: Controle Positivo. .................. 37
Figura 3- Gel de agarose à 2%, corado com brometo de etídio para visualização do
produto da PCR de 131pb referente ao gene IL-2 -330. Slot M: Marcador de peso
molecular 50pb; Slots 1-6: Amostras de biopsia gástrica; Slot C-: Controle Negativo.
.................................................................................................................................. 40
Figura 4- Gel de agarose à 2,5%, corado com brometo de etídio para caracterização
dos alelos do gene IL-2, utilizando a enzima BfaI. Slots 1, 4 e 6: Genótipo TG; Slots
2 e 7: Genótipo TT; Slot 3 Genótipo GG ; M Marcador de peso molecular 100pb. ... 40
Figura 5- Gel de agarose à 2%, corado com brometo de etídio para a visualização
do produto da PCR de 262 pb referente ao gene IL-2 +114. Slot M: Marcador de
peso molecular 100pb; Slots 1-4: Amostras de biópsia gástrica. C-: Controle
negativo. ....................................................................................................................42
Figura 6- Gel de agarose à 2,5% corado com brometo de etídio para a
caracterização dos alelos do gene IL-2 +114, utilizando a enzima Mwol. Slot M:
Marcador de peso molecular 50pb; Slot 1: Genótipo TT; Slot 2: Genótipo TG; Slot 3:
Genótipo GG. ............................................................................................................ 42
Figura 7- Gel de agarose à 2%, corado com brometo de etídio para visualização do
produto da PCR de 107pb referente ao gene TNF-α -308. Slot M – Marcador de peso
molecular 100pb; Slots 1-4: Amostras de biopsia gástrica; C-: Controle Negativo. ... 47
Figura 8- Gel de agarose à 3%, corado com brometo de etídio para caracterização
dos alelos do TNF-α, utilizando a enzima NcoI. Slots 1, 2 e 5: Genótipo GA; Slots 3,6
e 7: Genótipo GG; Slot 4 Genótipo AA; M Marcador de peso molecular 100pb. ....... 47
Figura 9- Esquema ilustrando as vias de atuação dos microRNAs 146a e 155 com
seus genes alvos....................................................................................................... 58
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1- Análise da expressão da IL-2 nos grupos de pacientes controle, gastrite e
câncer, independentemente da presença do H. pylori. E Análise da expressão da IL2 nos grupos de pacientes, considerando a presença da bactéria............................49
Gráfico 2- Análise da expressão do TNF-α, nos grupos de pacientes controle,
gastrite e câncer, independentemente da presença do H. pylori. E Análise da
expressão do TNF-α, nos grupos de pacientes, considerando a presença da
bactéria......................................................................................................................51
Gráfico 3- Análise da expressão do miRNA 146a, nos grupos de pacientes controle,
gastrite e câncer, independentemente da presença do H. pylori. E Análise da
expressão do miRNA 146a, nos grupos de pacientes, considerando a presença da
bactéria......................................................................................................................53
Gráfico 4- Análise da expressão do miRNA 155, nos grupos de pacientes controle,
gastrite e câncer, independentemente da presença do H. pylori. E Análise da
expressão do miRNA 155, nos grupos de pacientes, considerando a presença da
bactéria......................................................................................................................56
Gráfico 5- Análise da expressão do miRNA 181c, nos grupos de pacientes controle,
gastrite e câncer, independentemente da presença do H. pylori. E Análise da
expressão do miRNA 181c, nos grupos de pacientes, considerando a presença da
bactéria......................................................................................................................59
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Frequência da infecção por Helicobacter pylori nos grupos estudados. ... 38
Tabela 2- Frequência do marcador de patogenicidade cagA em amostras positivas
para infecção por Helicobacter pylori. ....................................................................... 38
Tabela 3- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo -330 (T>G) da IL-2, no
grupo Controle vs Câncer Gástrico. .......................................................................... 40
Tabela 4- Distribuição dos genótipos e alelos polimorfismo -330 (T>G) IL-2, no grupo
Gastrite vs Câncer Gástrico. .....................................................................................41
Tabela 5- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo -330 (T>G) da IL-2, no
grupo Controle vs Gastrite.........................................................................................41
Tabela 6- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo +114 (T>G) da IL-2,
no grupo Controle vs Câncer Gástrico. ..................................................................... 43
Tabela 7- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo +114 (T>G) da IL-2,
no grupo Gastrite vs Câncer Gástrico. ...................................................................... 43
Tabela 8- Distribuição dos genótipos e alelos da IL-2, polimorfismo +114 (T>G) no
grupo Controle vs Gastrite.........................................................................................44
Tabela 9- Análise do haplótipo IL-2 −330 T>G e +114 T>G nos grupos Controle vs
Câncer Gástrico ........................................................................................................ 45
Tabela 10- Análise do haplótipo IL-2 −330 T>G e +114 T>G nos grupos Gastrite vs
Câncer Gástrico. ....................................................................................................... 45
Tabela 11- Análise do haplótipo IL-2 −330 T>G e +114 T>G nos grupos Controle vs
Gastrite. .....................................................................................................................45
Tabela 12- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo -308 (G>A) do TNFα, no grupo Controle vs Câncer Gástrico. ................................................................. 47
Tabela 13- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo -308 (G>A) do TNFα, no grupo Gastrite vs Câncer Gástrico. .................................................................. 48
Tabela 14- Distribuição dos genótipos e alelos do TNF-α, polimorfismo -308 (T>G)
no grupo Controle vs Gastrite....................................................................................48
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A
♀
Adenina
Feminino
♂
CG
cag-A
cagPAI
CYLD
Masculino
Câncer Gástrico
Gene Associado a Citotoxina A (cytotoxin Associated Gene A)
Ilha de patogenicidade cag
Gene Cylindromatosis
dup-A
Gene Promotor de Úlcera Duodenal (duodenal ulcer promoting)
G
Guanina
GRO
Oncogêneses relacionados ao crescimento
H. pylori
Helicobacter pylori
IBP
Inibidor de bomba de prótons
Ig
Imunoglobulinas
IKK
I kappa B kinase
IL
Interleucina
INCA
Instituto Nacional de Câncer
IRA1
Receptor associado a quinase 1
KDa
Quilodalton
KRAS
Gene oncogênico
µM
Micromolar
miRNA/MIR MicroRNA
MyD88
Myeloid differentiation primary response gene
NF-κB
Nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells
NK
Natural Killer
NOTVH4
Gene oncogênico
oipA
Proteína inflamatória externa (outer inflammatory protein)
OMPs
Proteína de membrana externa
Pb
Pares de Base
PCR
Reação em Cadeia Polimerase
RNAm
RNA mensageiro
STAT
Signal transducer and activator of transcription 3
T
Timina
TLR
Receptor tipo Toll
TNF
Fator de Necrose Tumoral
TRAF6
Receptor do TNF associado ao fator 6
vac-A
Gene da Citotoxina Vacuolizante (vacuolating Cytotoxin A)
WASF2
WAS protein family, member 2
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO ..........................................................................................................................12
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .....................................................................................................16
2.1.
ASPECTOS GERAIS DO HELICOBACTER PYLORI E SUA EPIDEMIOLOGIA ........................................16
2.2.
DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO ...............................................................................................17
2.3.
MARCADORES DE PATOGENICIDADE .......................................................................................18
2.3.1.
Gene cagA .................................................................................................................18
2.4.
FATOR DE NECROSE TUMORAL E O HELICOBACTER PYLORI NAS DOENÇAS GÁSTRICAS .................19
2.5.
INTERLEUCINA 2 E O HELICOBACTER PYLORI NAS DOENÇAS GÁSTRICAS .....................................20
2.6 CÂNCER GÁSTRICO ....................................................................................................................21
2.7.
MICRORNAS NAS DOENÇAS GÁSTRICAS .................................................................................22
2.7.1.
MicroRNA 146a (miR 146a) .......................................................................................24
2.7.2.
MicroRNA 155 (miR-155) ...........................................................................................25
2.7.3.
Micro RNA 181 (miR 181) ..........................................................................................26
3.
OBJETIVOS..............................................................................................................................29
4.
MATERIAL E MÉTODOS ..........................................................................................................31
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
(G>A)
4.5.
4.6.
5.
OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS ..................................................................................................31
EXTRAÇÃO DE DNA, RNA E SÍNTESE DO CDNA .....................................................................31
DETECÇÃO DO HELICOBACTER PYLORI E DO GENE CAGA ..........................................................32
ANÁLISE DOS POLIMORFISMOS DO GENE DA IL-2, -330 (T>G) E , +114 (T>C) , E TNF-Α -308
33
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA POR PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL (Q-PCR)..................34
ANÁLISE ESTATÍSTICA ..........................................................................................................34
RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................................36
5.1.
DETECÇÃO DO HELICOBACTER PYLORI E DO GENE CAGA ..........................................................36
5.2 ANÁLISE DOS POLIMORFISMOS DO GENE DA IL-2 -330(T>G) E +114 (T>G) E ANÁLISE EM HAPLÓTIPO
38
5.2.1.
Polimorfismo IL-2 -330 (T>G) .....................................................................................38
5.2.2.
Polimorfismo IL-2 +114 (T>G) ....................................................................................41
5.2.3.
Análise em Haplótipo dos polimorfismos IL-2 -330(T>G) e +114 (T>G).......................44
5.2.4.
Polimorfismo TNF-α -308 (G>A) .................................................................................46
5.3 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES DA IL-2 E TNF- Α .................................................................49
5.3.1 Expressão Relativa da IL-2 ...............................................................................................49
5.3.2 Expressão Relativa do TNF- α ..........................................................................................50
5.4 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS MIRNAS 146A, 155 E 181C .............................................................52
5.4.1 Expressão Relativa do miRNA 146a .................................................................................52
5.4.2 Expressão Relativa do miRNA 155 ...................................................................................55
5.4.3 Expressão Relativa do miRNA 181c..................................................................................58
6.
CONCLUSÕES .........................................................................................................................62
REFERÊNCIAS ................................................................................................................................65
ANEXO A- COMITÊ DE ÉTICA ........................................................................................................75
ANEXO B- ARTIGO PUBLICADO DURANTE O MESTRADO..........................................................76
ANEXO C- ARTIGO PUBLICADO DURANTE O MESTRADO..........................................................77
ANEXO D- ARTIGO SUBMETIDO DURANTE O MESTRADO .........................................................78
ANEXO E- ARTIGO PUBLICADO ....................................................................................................79
INTRODUÇÃO
12
1. INTRODUÇÃO
O Helicobacter pylori (H. pylori) foi descrito por Warren e Marshall em 1983,
que afirmou o envolvimento dessa bactéria com o desenvolvimento de úlceras
gástricas e gastrites. Refere-se a uma bactéria gram-negativa que infecta e coloniza
as microvilosidades da mucosa gástrica, podendo levar a uma inflamação crônica,
que pode ser responsável por várias doenças gástricas, como: úlceras, gastrites e
até mesmo neoplasias gástricas. (1-3)
Esta bactéria é considerada o maior fator de risco associado ao câncer
gástrico, principalmente devido ao processo inflamatório que ocorre na mucosa
gástrica, aumentando o risco dessa neoplasia em mais de seis vezes em
comparação aos indivíduos não infectados. (4) Entretanto, nem todos os indivíduos
infectados pelo H. pylori desenvolvem manifestações clínicas associadas às
doenças gástricas, Sayehmiri et al., (2015) (5), afirmaram que o resultado da
infecção causada por H. pylori depende de fatores ambientais, fatores genéticos do
hospedeiro e da bactéria. (2, 6)
A literatura afirma que a infecção geralmente é adquirida na infância, mas os
sintomas das doenças gástricas, causados pelo H. pylori, aparecem com mais
frequência em adultos e que na ausência de tratamento adequado, pode persistir por
toda vida, sendo esse, o principal fator etiológico das gastrites e úlceras pépticas. (2,
3, 7, 8)
Segundo Escobar-Pardo et al., (2011), no Brasil, mais da metade das
crianças de 2 a 3 anos já estão infectadas pelo H. pylori, visto que essa
contaminação, na infância, é determinante na prevalência da bactéria na população
adulta. (9) A incidência de brasileiros infectados é maior que a média da população
mundial e os mecanismos de transmissão do H. pylori se caracterizam
principalmente pelas vias oral-oral e fecal-oral. (10)
A etiologia das doenças gástricas parece ser influenciada pelo ambiente,
características genéticas do hospedeiro e da bactéria, assim, a presença e/ou
ausência de determinados genes, sua expressão e suas associações estão
relacionados com um maior grau de patogenicidade da bactéria. A literatura destaca
quatro genes como sendo os principais marcadores de patogenicidade do H. pylori:
gene cagA (Cytotoxin Associated Gene A), o gene vacA (Vacuolating Cytotoxin A), o
13
oipA (outer inflammatory protein) e o mais recente gene dupA (Duodenal Ulcer
Promoting). (3, 8, 11, 12)
O principal fator fisiopatológico da infecção pelo H. pylori é caracterizado pela
intensa resposta inflamatória na mucosa gástrica. A quimiotaxia proporcionada pela
infecção bacteriana atrai neutrófilos e células mononucleares, que por sua vez
estimulam a síntese de várias citocinas pró-inflamatórias, que atuam mediando a
interação entre as células do sistema imune com outros sistemas, entre elas as
citocinas IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8 e o Fator de Necrose Tumoral (TNF) (13). Assim, o
aumento da produção de citocinas inflamatórias em resposta a infecção por H. pylori
resulta na intensa inflamação gástrica podendo causar danos à mucosa.
A citocina pró-inflamatória TNF-α contém em sua região promotora dois
polimorfismos de importância clínica, TNF -238 G>A (rs361525) e o TNF -308 G>A,
(rs1800629) que parecem ser relevantes, podendo estar associados com o
desenvolvimento de doenças gástricas. A bactéria H. pylori induz a produção de
TNF- α, um inibidor da secreção de ácido gástrico, tendo um papel importante no
processo infeccioso, e, por conseguinte, na gastrite induzida pela bactéria. (14, 15)
Kunstmann, Epplen (16) foram os primeiros a descreverem a associação entre o
polimorfismo TNF -308 (genótipo GG) e a susceptibilidade de doenças gástricas em
pacientes infectados pelo H. pylori.
A interleucina - 2 (IL-2) é uma citocina considerada pró- e anti-inflamatória
que tem como função regular o sistema imunológico induzindo a proliferação de
células T, a sobrevivência, e diferenciação, tendo papel importante na imunidade
antitumoral. (17, 18) O gene da IL-2 também contém dois importantes
polimorfismos, IL-2 -330 T>G (rs2069762) e o IL-2 +114 T>G (rs2069762), cuja
associação com doenças gástricas tem sido estudada. Em 2009, Queiroz et al
concluíram que no contexto da infecção o polimorfismo IL-2 -330 foi associado a um
aumento dos níveis de IL-2 em adultos e crianças infectados pela bactéria.
Aliado ao exposto anteriormente, fatores intrínsecos do hospedeiro também
podem contribuir no aparecimento das doenças gástricas e os microRNAs (miRNAs)
parecem desempenhar um papel importante na etiologia dessas doenças.
Os miRNAs são RNAs não codificantes capazes de regular a expressão
gênica através da degradação ou repressão da tradução de moléculas alvo de RNA
mensageiro
(RNAm).
(2)
Alguns
autores
demonstraram que
os
miRNAs
14
desempenham um papel importante na proliferação celular, apoptose, diferenciação
e regulação transcricional, sendo associado a várias patologias, tais como a
inflamação e o câncer, através de alterações na sua expressão gênica (2, 19, 20)
Adicionalmente, estudos sugerem que o H. pylori possa atuar como um
agente desregulador dos miRNAs, contribuindo para a etiologia do câncer gástrico
mediado pela bactéria. (21, 22)
15
REVISÃO DE LITERATURA
16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.
Aspectos Gerais do Helicobacter pylori e sua epidemiologia
Em 1983, Warren e Marshall (1) identificaram o H. pylori isolando-o da
mucosa de estômagos humanos, e foram os primeiros a cultivá-lo in vitro,
verificaram o envolvimento desta bactéria com o desenvolvimento de doenças
gástricas. (23). A bactéria, denominada inicialmente Campylobacter pylori, é um
bastonete microaerofílico, Gram-negativo que mede de 2,5 a 5 µm de comprimento e
0,5 a 1 µm de largura, com formato helicoidal possuindo de 6 a 8 flagelos arranjados
em forma unipolar ou bipolar, permitindo penetrar com maior eficiência na camada
de muco, que protege o epitélio gástrico. (24, 25)
O H. pylori infecta a mucosa do estômago e através da produção de adesinas
conseguem aderir ás células epiteliais gástricas, segregando quimiocinas para iniciar
a imunidade inata e ativar as células de defesa do sistema imunológico, levando a
uma inflamação responsável por várias doenças gastroduodenais, como: gastrite,
úlcera péptica e neoplasias gástricas. (3)
Essa bactéria coloniza preferencialmente o estômago humano sendo um dos
poucos microrganismos capaz de colonizar esse ambiente ácido, isso, devido a sua
capacidade de secretar a enzima urease, que converte ureia em amônia e
bicarbonato, neutralizando o micro ambiente e permitindo sua colonização. (12)
Aproximadamente 50% da população mundial é infectada pelo H. pylori, mas
sua prevalência é diferente em países desenvolvidos e emergentes. (12) Na
população adulta do Brasil, a infecção por H. pylori pode variar de 60% a 90%, já no
caso de países desenvolvidos a prevalência da infecção varia de 17% a 59%. (2628) Em paralelo, a infecção deste microrganismo é distribuída igualmente entre
homens e mulheres, porém, a sua incidência tende a ser maior em indivíduos
adultos em comparação às crianças, embora a aquisição da bactéria, na maioria das
vezes, ocorra mais comumente na infância. (29, 30)
Diversos estudos sugerem que a contaminação/transmissão está associada à
renda, idade, etnia, condições de moradia e higiene, já que os mecanismos de
transmissão se caracterizam pelas vias, fecal-oral e oral-oral. (31)
A grande maioria dos indivíduos infectados pelo H. pylori desenvolvem
gastrite, mas permanecem assintomático ao longo da vida, e apenas uma minoria
desses indivíduos desenvolvem doença gástrica devido à associação de vários
17
fatores, entre eles, os marcadores de virulência do H. pylori, tais como genes cagA,
vacA e dupA, oipA, fatores genéticos e ambientais. (32, 33)
Em 1994, a bactéria foi classificada como carcinógeno do tipo I para
câncer de estômago pelo International Agency for Researchon Cancer (órgão
subordinado à Organização Mundial da Saúde) sendo a neoplasia gástrica o quarto
tipo de câncer mais comum e a segunda causa mais comum de morte por câncer.
(33)
2.2.
Diagnóstico e tratamento
O diagnóstico da infecção por H. pylori pode ser realizado utilizando dois tipos
principais de exames: os exames não invasivos e os invasivos. (34)
Com relação aos não invasivos, estão: o teste respiratório da ureia e a
detecção de IgG e IgA, na sorologia. (34) Há também testes rápidos de consultório
que utilizam as mesmas imunoglobinas, por ELISA ou hemoaglutinação. A grande
vantagem é que pode ser realizado com quantidades pequenas de sangue,
permitindo seu uso em consultórios médicos. (35)
Por outro lado, os exames invasivos incluem: a endoscopia digestiva alta,
com coleta de biopsias gástricas, nas quais podem ser realizados: os testes rápidos
da urease, a detecção histológica e/ou imunohistoquímica da bactéria, bem como a
cultura microbiana e a detecção por biologia molecular. (35, 36)
Como todos os métodos possuem sensibilidade e especificidade altas e
semelhantes, a escolha dependerá da disponibilidade e acessibilidade do teste,
devendo-se considerar também o objetivo da sua realização, seja para diagnóstico,
epidemiologia ou seguimento. (35)
O tratamento ideal para o H. pylori ainda não foi definido para todos os
pacientes. Além disso, as taxas de resistência aos antibióticos variam conforme a
região, e os dados de resistência local devem ser usados para orientar o tratamento,
quando disponível. A conduta terapêutica sugere a terapia tripla, a sequencial e a
terapia quádrupla, conforme resumido nas diretrizes publicadas pela American
College of Gastroenterology and Conference Maastricht. (37)
A terapia tripla é a mais utilizada. É administrado um regime contendo um
inibidor de bomba de prótons (IBP) (iansoprazol, omeprazol, pantoprazol,
18
rabeprazol, esomeprazol), e os antibióticos amoxicilina e claritromicina por 10-14
dias. (33, 37)
2.3.
Marcadores de patogenicidade
O motivo pelo qual apenas à minoria de pacientes infectados pelo H. pylori
desenvolvem manifestações clínicas associadas às doenças gástricas permanece
desconhecido. No entanto, o resultado da infecção depende não só de fatores
ambientais, mas também de fatores genéticos do hospedeiro e da bactéria. Dentre
os marcadores de virulência mais conhecidos estão, o cagA (cytotoxin-associated
gene A), vacA (vacuolating cytotoxin A), dupA (duodenal promoter ulcer) e oipA
(outer inflammatory protein).
2.3.1. Gene cagA
O gene cagA, desde 1995 quando foi inicialmente relacionado ao aumento do
risco de carcinoma gástrico, tem sido profundamente estudado, principalmente em
relação aos seus efeitos patogênicos. (38)
Está diretamente relacionado às doenças gástricas, sendo o mais patogênico
fator de virulência expresso pelo H. pylori. Presente em 50-70% das cepas de H.
pylori, o gene cagA está localizado em um segmento do DNA denominado de ilha de
patogenicidade cag (cagPAI), codifica uma proteína imunodominante de alto peso
molecular, 120-140 KDa, que é translocada para células epiteliais gástricas pelo
sistema de secreção IV e no interior dessas células, essa proteína estimula as vias
de sinalização celular, que por sua vez, causam o alongamento da célula e ativação
de proto-oncogenes (39).
Existem dois tipos clínicos de H. pylori: as cepas de gene cagA-positivo, que
são mais virulentas e induzem níveis elevados de expressão das Interleucina 1β, 8 e
do Fator de Necrose Tumoral e as cepas de gene cagA-negativo, clinicamente mais
brandas. (40) Estudos revelam que pacientes infectados por cepas cagA+
apresentam probabilidade muito maior de desenvolver gastrites, úlceras gástricas e
câncer gástrico, do que aqueles infectados por cepas cagA-. (8, 41)
19
2.4.
Fator de necrose tumoral e o Helicobacter pylori nas doenças
gástricas
O Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) é uma proteína com peso molecular
de 17 kD e composta por 157 aminoácidos, é sintetizado principalmente por
macrófagos e monócitos, onde o principal estímulo para a sua produção são os
lipopolissacarídeos que compõem a membrana das bactérias Gram-negativas. (42)
O TNF-α foi descoberto em (1975) por Carswell et al., sendo considerado uma
das
principais
citocinas
relacionadas
aos
processos
inflamatórios
e
ao
desenvolvimento do câncer. (43, 44) A bactéria H. pylori induz a produção de TNF-α,
que por sua vez, é um potente inibidor da secreção de ácido gástrico
desempenhando papel importante no processo de infecção da bactéria, e por
consequência na gastrite induzida pela infecção do H. pylori. (45)
A principal função do TNF-α é promover a resposta imune, por meio do
recrutamento de neutrófilos e monócitos para o local da infecção. Além disso, Beales
and Calam (15) e
Crabtree, Shallcross (14) destacaram que o TNF-α inibi a
secreção de ácido gástrico podendo afetar a infecção pelo H. pylori; estes autores
ainda sugeriram que a secreção de ácido gástrico é um dos mais importantes fatores
no desenvolvimento de doenças gastroduodenais associadas à infecção por H.
pylori. (45, 46)
A região promotora do gene do TNF-α contém dois polimorfismos (TNF -238
G>A; TNF -308 G>A) que parecem ser relevantes na susceptibilidade da doença e
afetar a atividade transcricional dos genes. Desta forma, influencia o processo
inflamatório na resposta a doenças infecciosas, podendo estar associados ao
desenvolvimento de úlceras duodenais, úlceras gástricas e carcinomas. (46)
Santos, Ladeira (47), observaram não encontrar associação entre o
polimorfismo TNF-α -308 e o risco de câncer gástrico. Por outro lado, Suganuma,
Watanabe (48), sugeriram que o TNF-α induziu a expressão da proteína Tip-α que é
carcinogênica, representando um risco para o desenvolvimento de neoplasia
gástrica.
Mais recentemente, Xu et al., (2016) (46) verificaram associação do
polimorfismo TNF-α -308 com o risco de câncer gástrico, afirmando também
associação da doença com a infecção pela bactéria H. pylori na população chinesa.
20
Em concordância, outro estudo observou que os polimorfismos de único
nucleotídeo em genes de citocinas pró e anti-inflamatórias, como o TNF-α,
modificam a intensidade da resposta inflamatória podendo contribuir para variações
na susceptibilidade do câncer gástrico. (49)
2.5.
A
Interleucina 2 e o Helicobacter pylori nas doenças gástricas
IL-2
é
uma
citocina
secretada
principalmente
pelas
células
imunorreguladoras T helper (Th), em menor quantidade por células B e monócitos.
Esta citocina atua como importante mediadora na regulação do sistema imunológico,
ativando a resposta imune e desempenhando um papel importante na imunidade
antitumoral. (17, 50) Também favorece a proliferação de células NK, linfócitos,
monócitos e macrófagos, ademais, cooperam para o desenvolvimento das células T
reguladoras; regulam a apoptose e expansão das células T ativadas e ativam
linfócitos B que passam a sintetizar imunoglobulinas. (13, 51, 52)
A IL-2 é uma glicoproteína de 14 a 17KDa, que em humanos é codificada por
um único gene, localizado no cromossomo 4. A ação da IL-2 sobre as células é
mediada pela ligação a receptor específicos, expressos na superfície das células T
ativadas, em menor número em T não-ativadas e células B ativadas. (53)
Na infecção pela H. pylori, células mononucleares e neutrófilos são ativados
pela bactéria e seus produtos, deste modo, estas células migram até a mucosa
gástrica infectada para estimular a síntese de citocinas anti-inflamatórias e próinflamatórias, como a interleucina 2. Essa alta produção de citocinas desencadeiam
em uma inflamação na mucosa gástrica, através de ligações a receptores
específicos em células alvo. (12, 13)
O gene IL-2 é caracterizado por polimorfismos de único nucleotídeo (SNP),
tais como o -330 T>G e o +114 T>G. O polimorfismo -330 T>G da região promotora
da IL-2 está ligado a alguns carcinomas, doenças inflamatórias e à atrofia gástrica
pela H. pylori. (52, 54). O polimorfismo +114 T>G que está no primeiro exon dessa
região ainda está sendo estudado e correlacionado com diversas doenças, entre
elas o câncer. Pesquisas mostraram que o haplótipo -330G/+114T apresentou um
alto risco no linfoma Non- Hodgkin. (18)
21
Estudos verificaram que os indivíduos com alelo G para o polimorfismo IL-2 330 foram associados com a redução da produção de IL-2, regulando negativamente
a imunidade antitumoral e desempenhando papel na etiologia do câncer. (55-57)
Barbosa et al., (2009) descreveram que polimorfismos na região promotora
do gene, tais como a IL-2-330, têm sido associados com um aumento na
hipocloridria da mucosa gástrica e a síntese de interleucinas que pode ser
considerada um fator de risco para o câncer. Em estudo, Zhao et al., (2015) (52)
observaram que o polimorfismo IL-2-330 T>G p estava associado a um aumento do
risco de câncer gástrico em pacientes asiáticos. Em controvérsia, Wang et al., (2015)
(50) sugeriram que o polimorfismo -330 T>G não está associada ao risco de câncer.
Mais recentemente, Zhang et al.,(2016) (54) sugeriram que não existe uma
associação entre o polimorfismo -114 T>G e o risco de câncer, apenas o -330 T> G
apresenta associação.
A diversidade de resultados encontrados na literatura pode estar relacionada
principalmente a diversidade populacional estudada, e ferramentas utilizadas no
diagnóstico do H. pylori e genotipagem do TNF e IL-2. No Brasil essa associação
permanece incerta, porém é relevante seu entendimento, podendo nos auxiliar no
esclarecimento da patogênese da doença gástrica.
2.6 Câncer Gástrico
O câncer gástrico (CG) se apresenta, predominantemente, na forma de três
tipos histológicos: adenocarcinoma (responsável por 95% dos tumores, sendo um
tipo de câncer que se desenvolve nas células da mucosa gástrica e no tecido
epitelial glandular), linfoma, diagnosticado em cerca de 3% dos casos, e
leiomiossarcoma, (iniciado em tecidos que dão origem aos músculos e aos ossos).
A carcinogênese gástrica é um processo complexo e multifatorial. (58)
Atualmente se apresenta como o quarto tipo de câncer mais comum, e a segunda
causa mais comum de morte por câncer. No Brasil, esses tumores aparecem em
terceiro lugar na incidência entre homens e em quinto, entre as mulheres (58).
Segundo o INCA (Instituto Nacional de Câncer) (58), doenças pré-existentes
podem ter associações com este tipo de câncer, como por exemplo, anemias, lesões
pré-cancerosas (gastrite atrófica e metaplasia intestinal), e principalmente, devido a
infecções pelo Helicobacter pylori, por ser a segunda causa mais frequente de
22
infecções no Brasil, perdendo apenas para a bactéria da cárie. Estima-se que essa
bactéria habite o estômago de cerca de 70% da população brasileira, porém
somente indivíduos predispostos geneticamente são afetados. O tratamento por
meio de antimicrobianos contra a bactéria é eficaz em 95% dos casos. O H. pylori
causa gastrite crônica, e sem tratamento adequado evolui para gastrite atrófica e
atrofia gástrica. Uma lesão pré-cancerosa, no entanto, leva aproximadamente 20
anos para evoluir e se tornar um câncer (58).
A taxa de proliferação de células epiteliais gástricas de pacientes infectados
pelo H. pylori é significativamente mais alta do que a de indivíduos não-infectados. A
infecção crônica pela bactéria induz aumento dos índices de apoptose, que podem
acelerar a progressão para gastrite atrófica, e consequente aumento do risco para
desenvolvimento de câncer gástrico. Trabalhos anteriores destacam que este risco é
ocasionado devido ao aumento de expressão de interleucinas e cicloxigenases que
atuam na inibição da apoptose das células infectadas pelo H. pylori, e esta redução
da morte celular, acompanhada por hiperproliferação, leva ao acúmulo de mutações,
favorecendo a gênese do câncer. (59)
2.7.
MicroRNAs nas doenças gástricas
O miRNA foi caracterizado pela primeira vez em 1993 por Lee et al., (1993)
(60), ao caracterizarem a regulação do desenvolvimento larval de C. Elegans por um
pequeno transcrito não codificador de proteína, o gene lin-14. Entretanto seu papel
distinto na regulação da transcrição não foi reconhecido até o início de 2000. (20, 22,
61)
Os
miRNAs
são
RNAs
não codificantes
que compreendem 18-24
nucleotídeos de extensão, capazes de regular a expressão gênica através da
degradação ou repressão da tradução de moléculas alvo de RNAm.(61) Seus alvos
são os RNAs mensageiros com os quais interagem para silenciar a tradução de
proteínas envolvidas em uma gama de processos celulares que vão da
embriogênese a apoptose. São expressos de uma forma específica no tecido,
desempenhando
um
papel
importante
na
proliferação
celular,
apoptose,
diferenciação e regulação transcricional, sendo associado a várias patologias, tais
como a inflamação e o câncer. (19, 20, 61)
23
Calin et al., 2004 (4), demonstraram que a distribuição de miRNA no genoma
humano não é aleatória, mas sim, uma fração significativa dos quais estão
localizados em regiões cromossômicas conhecidas como sítios frágeis e em regiões
genômicas associados com câncer.
A localização dos genes miRNA em sítios
frágeis do genoma e as marcantes variações na expressão destas moléculas em
diversas neoplasias, provêm evidência circunstancial para a participação dos
miRNAs na etiopatogênese tumoral.
Estudos demonstraram uma associação entre alterações na expressão de
miRNAs e o desenvolvimento de câncer, onde podem atuar como miRNAs
oncogênicos ou como miRNAs supressores de tumor. (19, 22, 62) Sugerem também
que o H. pylori possa atuar como um agente desregulador dos miRNAs, contribuindo
para a etiologia do câncer mediado pela bactéria. (21) Dessa forma, a função dos
miRNAs pode depender do microambiente específico de determinado tipo celular, o
qual pode prover diferentes repertórios de genes alvo. (22)
A infecção por H. pylori induz alterações nas células epiteliais gástricas e no
sistema imune, estimulando a síntese de moléculas pró e/ou anti-inflamatórias que
são destinadas a perpetuar ou controlar a infecção. (3, 62)
Entre as moléculas induzidas em resposta a infecção, o miRNA têm potencial
para desempenhar um grande impacto sobre o resultado da interação bactériashospedeiro, podendo interagir com moléculas de mRNA, bloqueando a tradução de
proteínas ou induzindo a sua degradação. (62)
A identificação de miRNAs associados à promoção da resposta inflamatória
iniciada pela infecção por H. pylori, aumenta a progressão maligna do epitélio
gástrico aumentando a invasividade e capacidade migratória das células
cancerígenas. No entanto, ao mesmo tempo, vários miRNA têm sido associados à
eventos que são totalmente opostos, levando a uma inflamação reduzida, inibição de
neoplasia maligna e aumento da apoptose de células transformadas. (62)
Matsushima et al. (2011) (63), conduziram um estudo para caracterizar
expressão de miRNA em mucosa gástrica de pacientes infectados pelo H. pylori,
sugerindo que
a infecção pela bactéria realmente afeta a expressão global de
miRNA na mucosa gástrica, e este efeito é, em parte, ligado ao hospedeiro iniciando
uma resposta inflamátoria induzida por H. pylori. (21)
24
2.7.1. MicroRNA 146a (miR 146a)
A família gênica de miR-146 compreende duas isoformas, localizadas em
diferentes loci gênicos: miR-146a na região 5q34, e miR-146b na região 10q24.32.
Foi verificado que a isoforma miR-146b está predominantemente expressa em
carcinoma papilífero da tireóide, enquanto a isoforma miR-146a aparentemente
associa-se ao carcinoma anaplásico da tireóide. (30, 64)
Kupcinskas et al., (2014) (65), mostraram que o miR-146 parece modular a
resposta inflamatória, induzida por H. pylori através da
segmentação da IL-1
associada a quinase 1 (IRAK1) e o receptor TNF associado ao fator 6 (TRAF6).
Song et al., (2013) (66), demostraram resultados que sugerem que o
polimorfismo miR-146a (rs2910164) pode contribuir para a evolução de H. pylori
associado à lesões gástricas de alto risco na população chinesa, podendo evoluir
para um câncer gástrico. Estes mesmos autores ainda demostraram que variantes
genéticas de miRNA podem desempenhar um papel importante na patogênese
gástrica, em indivíduos infectados com H. pylori.
Rusca et al., 2011 (67), sugeriram existir cada vez mais provas
demonstrando que o miR-146a está envolvido na resposta adaptativa, bem como
na resposta imune inata, e que esse miRNA pode ser muito importante para regular
a progressão de um tumor.
Segundo Belair et al., (2009) (68), na infecção por H. pylori, a resposta imune
inata nas células epiteliais gástricas é caracterizada pela ativação da via do NF-κB
em resposta a bactéria. Esta ativação conduz à secreção de IL-8, e outras
moléculas tais como TLR2, TLR4 E TLR5, que parecem desempenhar um papel
menos efetivo no reconhecimento do H. pylori. No entanto, o miR-146 não é
expresso em células epiteliais gástricas durante a infecção pela bactéria,
levantando a questão de que os miRNAs possam estar envolvidos na regulação do
feedback do NF-kB nessas células.
Yao et al., 2013 (69), em estudo para investigar o papel do miR-146a em
células de câncer gástrico e de seus genes alvo, demonstraram um papel oncosupressor do miR-146a em células gástricas através da redução da expressão da
proteína WASF2, que atua como gene alvo do miR. A expressão do miR-146a foi
inversamente correlacionada com a expressão da proteína WASF2 em células de
câncer gástrico.
25
2.7.2. MicroRNA 155 (miR-155)
Entre os oncomiRs conhecidos, o miR-155 destaca-se por ser regulado em
tumores sólidos e hematológicos, sendo um alvo importante para o diagnóstico,
prognóstico e terapia. A desregulação do miR-155 tem sido associada à várias
formas de câncer, incluindo o linfoma, o câncer de mama e de pâncreas, doenças
inflamatórias e cardiovasculares. (61, 70)
Xiao et al., (2009) (70), sugeriram que o miR-155 desempenha um papel
central na regulação da resposta imune a uma vasta gama de estímulos, relatando
que a infecção por H.pylori pode estimular a expressão anormal desse miR-155 em
células epiteliais gástricas. (61) Além disso, a super expressão do miR-155 pode
modular negativamente a liberação de citocinas pro-inflamatórias como IL-8 e
oncogêneses relacionados ao crescimento (GRO- α). (70)
Em concordância, em pesquisa para avaliar o papel do miR-155 no controle
da infecção por H.pylori no trato gastrointestinal, e no desenvolvimento de gastrite
crônica induzida e gastrites associadas a patologia pré neoplásica, Oertli et al.,
(2011) (71), mostraram que o miR-155 é regulado positivamente na mucosa gástrica
de ratos infectados.
Em estudo para investigar a patogênese molecular do tecido linfóide
associado à mucosa gástrica (MALT), analisaram o perfil de expressão do miR-155,
revelando uma super expressão do miR-155 em lesões de linfoma MALT, indicando
que essa super expressão desempenhou papel crítico na patogênese do linfoma
gástrico. Sugeriram ainda, que o miR-155 pode ser usado como alvos terapêuticos e
novos biomarcadores para esse tipo de linfoma gástrico, já a inibição desse miR
pode ser uma nova abordagem para a prevenção e tratamento desse linfoma. (72)
Em estudo recente, Wan et al., (2016) (61), afirmaram que durante a infecção
por H. pylori, o miR-155 exibe elevado nível de expressão em vários tipos de células,
incluindo as células T humanas, macrófagos, células epiteliais, bem como a mucosa
gástrica de seres humanos infectados. Similarmente, o miR-155 apresenta níveis
elevados de expressão em gastrite induzida por H.pylori, úlceras gastroduodenais, e
linfoma MALT, sugerindo que a infecção pode ser relevante para o aumento da
expressão do miR-155. (72, 73) Por outro lado, a expressão do miR-155 é reduzida
em células e tecidos com câncer gástrico, o que revela que esse miR pode
26
desempenhar diferentes funções nessas doenças, e o processo de carcinogênese é
complexo e pode ocorrer através do silenciamento ou perda do miR-155. (61)
2.7.3. Micro RNA 181 (miR 181)
O miR181 foi descrito inicialmente na diferenciação de linhagens celulares
hematopoéticas, porém, diversos estudos tem mostrado o envolvimento dessa
família de miRNAs nas doenças neoplásicas. O miR181 compreende uma família de
quatro miRNAs: miR181a, miR181b, miR181c e miR181d sendo a função de cada
um deles distinta em cada doença. (74)
Guo et al., (2012) (74), elaboraram um painel de expressão dos miR181a,
miR181b, miR181c e miR181d em linhagem celular de câncer gástrico e tecido
normal e verificaram um aumento de expressão de todos estes miRNAs na linhagem
tumoral, porém, o miR181b apresentou um aumento exacerbado de expressão.
Estes autores demonstraram que a infecção pelo H. pylori induz altos níveis de
expressão do miR181b, que retorna aos níveis basais após a erradicação da
bactéria, além de demonstrarem o envolvimento do miR181b na proliferação,
invasão e migração de células neoplásicas.
Hashimoto et al., (2010) (75), realizaram uma análise de 328 miRNA por
microarray e após validação revelaram uma redução de expressão do miR181c em
amostras de câncer gástrico sugerindo que este microRNA seja um supressor de
tumor e tenha um papel importante na regulação de genes envolvidos na
carcinogênese.
Cui et al. (2013a) (88) estudaram a relação entre a expressão do miR181c e
o câncer gástrico, através de 103 amostras de tecidos com a doença. Observaram
que o nível de expressão de miR181c foi significativamente relacionado ao câncer
gástrico, e portanto, o miR181c poderia desempenhar um papel no seu
desenvolvimento e progressão. Para testar o miR181c como marcador molecular
para o diagnóstico de câncer gástrico, Cui et al. (2013b) (89), em um outro estudo,
analisaram a expressão do miR181c m tecido e plasma de 30 pacientes com câncer
gástrico, 30 com úlcera gástrica e 30 com gastrite crônica. Encontraram níveis de
expressão significativamente maior nas amostras de tecido e plasma com câncer
gástrico, destacando o miR181c como possível novo marcador sorológico para o
diagnóstico de câncer gástrico.
27
Em outro estudo, Cui et al. (2013b) (89), para testar o miR181c como
marcador molecular para o diagnóstico de câncer gástrico, analisaram a expressão
do miR181c em tecidos e no plasma de pacientes com câncer gástrico.
Ishiguro et al. (2014) (19), em um estudo de revisão, relataram altos e baixos
níveis de expressão dos miR181b, miR181c em amostras de câncer gástrico. A
divergência de resultados é ampla e os mecanismos de atuação dos miR181b,
miR181c, os genes por eles silenciados, assim como o envolvimento do H. pylori e
seus marcadores de patogenicidade na etiologia e desenvolvimento das gastrites e
câncer gástrico permanecem incertos.
28
OBJETIVOS
29
3. OBJETIVOS

Avaliar os níveis de expressão do mRNA dos genes IL-2 e TNF-α em
amostras de gastrite crônica e câncer gástrico;

Avaliar os níveis de expressão dos miRNAs 146a, 155, e 181c nas
mesmas amostras de gastrite crônica e câncer gástrico;

Diagnosticar o H. pylori e o marcador de patogenicidade, gene cagA;

Avaliar as frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos dos
gene da IL-2 +114T>G (rs2069762) e -330T>G (rs2069762) e do gene do TNF-α 308 G>A (rs1800629)

Avaliar a ocorrência de correlação entre a expressão dos miRNAs e a
dos genes IL-2 e TNF-α;

Associar a expressão dos miRNAs e dos genes IL-2 e TNF-α com a
presença do H. pylori.
30
MATERIAL E MÉTODOS
31
4.
MATERIAL E MÉTODOS
4.1.
Obtenção das Amostras
Foram avaliadas um total de 294 amostras de biópsias gástricas de indivíduos
com sintomas pépticos (dor e desconforto abdominal), submetidos à endoscopia
digestiva alta e que não receberam drogas quimioterápicas, antiparasitários ou
antibióticos nos últimos trinta dias. Os indivíduos eram de ambos os gêneros e com
idade superior a 18 anos (172♀/ 122♂, média de idade 53,99 ±14,55), sendo 181
provenientes de pacientes com gastrite crônica (102♀/ 79♂, média de idade 53,30 ±
14,47), 62 indivíduos com a mucosa gástrica normal (pacientes controle) (47♀/15♂,
média de idade 53,71 ± 14,58), da cidade de Bauru e Marília, atendidos no Serviço
de Gastroenterologia do Hospital Estadual de Bauru e da Faculdade de Medicina de
Marília, e 51 pacientes diagnosticados com câncer gástrico e submetidos à cirurgia
(22♀/29♂, média de idade 59,33 ±14,07), atendidos no Serviço de Gastroenterologia
da UNIFESP em São Paulo. Para a análise de expressão gênica, das 294 amostras
utilizadas foram selecionadas 179, sendo 60 controle, 99 provenientes de pacientes
com gastrite e 20 de pacientes com câncer gástrico. Vale mencionar que o presente
projeto foi aceito pelo comitê de ética: 1.215.180 (Anexo A).
A esofagogastroduodenoscopia foi realizada por fibroendoscópio (GIF-XP20,
GIF-XQ20) ou vídeo-endoscópio (GIF-100) ambos da marca Olympus, que permite
definir o diagnóstico endoscópico e retirar fragmentos do antro gástrico para
posterior análise. Foram obtidos fragmentos para exame histológico e molecular. A
caracterização histopatológica foi realizada de acordo com o Sistema Sydney para
classificação de gastrites.
4.2.
Extração de DNA, RNA e Síntese do cDNA
A extração do DNA à partir das biópsias gástricas foi realizada conforme
protocolo estabelecido pelo Kit QiAmp® DNA Mini Kit da QIAGEM (Cat Nº 51304),
na Universidade do Sagrado Coração.
Para extração dos RNAs, o tecido gástrico coletado foi armazenado em uma
solução para estabilização de RNA, RNAlater®TissueCollection (Ambion, EUA),
segundo instruções do fabricante e estocado a -20ºC até o momento de sua
utilização. Dois fragmentos do tecido (no máximo 100mg) foi pulverizado no
equipamento Precellys em solução de lise e o RNA total e miRNA foram extraídos
32
utilizando o Kit miRNeasy® Mini Kit (QIAGEM - Cat Nº 217004), segundo instruções
do fabricante, realizado no Instituto Lauro de Souza Lima. Todas as amostras foram
tratadas com RNase-FreeDNAse set (QIAGEN, Alemanha) como determinado pelo
fabricante.
A concentração de RNA de cada amostra e a razão de absorbância (A260/A280)
foram medidas pelo equipamento NanoDrop 2000 (spectrophotometer ND – 2000 –
NANODROP, EUA) na Universidade do Sagrado Coração, e somente amostras com
valor de razão entre 1,85 e 2,2 foram utilizadas.
A síntese do DNA complementar (cDNA) a partir do RNA total e miRNA foi
realizada utilizando os kits: High-CapacitycDNA Reverse Transcription Kits e
TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit, (Applied Biosystems™, EUA),
segundo protocolo estabelecido pelo fabricante.
4.3.
Detecção do Helicobacter pylori e do gene cagA
A detecção do H. pylori e do gene cagA foi realizada através da técnica de
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), desenvolvida na Universidade do Sagrado
Coração. Para o diagnóstico do H. pylori foram utilizados um par de
oligonucleotídeos Hpx1/Hpx2, os quais amplificaram um fragmento de 150pb
referente a um fragmento da fração 16S do RNA bacteriano (Tabela 1) (76).
Para a detecção do marcador de patogenicidade cagA foram utilizados os
oligonucleotídeos cagA1/ cagA2, os quais amplificaram um fragmento de 232pb
(Tabela 1) (77, 78).
33
Quadro 1- Descrição dos oligonucleotídeos e das condições de amplificação que foram utilizados no
presente trabalho.
Condições de
Primers
Sequência ( 5’- 3’ )
Amplicon
Gene
Bibliografia
Amplificação
a
Hpx1
Hpx2
40 ciclos de: 1 min a
94ºC, 1 min a 59ºC e 1
GAGGAATACTCATTGCGAAGGCGA
min a 72ºC.
150pb
40 ciclos de: 1 min a
94ºC, 1 min a 53ºC e 1
min a 72ºC.
232pb
CTGGAGARACTAAGYCCTCC
Cag1
ATGACTAACGAAACTATTGATC
Cag2
CAGGATTTTTGATCGCTTTATT
16SrRNA
CagA
Scholte et al.,
1997
Rasmussen et
al., 2010
Fonte: Elaborado pela autora.
4.4.
Análise dos Polimorfismos do Gene da IL-2, -330 (T>G) e , +114
(T>C) , e TNF-α -308 (G>A)
Para o polimorfismo -330 (T>G) (rs2069762) foi realizada a técnica de PCR,
que amplificou um fragmento de 131pb (Figura 3), seguido do tratamento enzimático
utilizando a enzima de restrição BfaI, seguindo o protocolo descrito por Sayad and
Movafagh (17) (Figura 4).
Para determinação do polimorfismo +114 (T>G) (rs2069763) (a partir do sítio
de início da transcrição) foi realizada a técnica de PCR, que amplificou um
fragmento de 262pb (Figura 5), seguido do tratamento enzimático (RFLP –
Restriction Fragment Lenght Polimorphism) utilizando a enzima de restrição MwoI,
de acordo com o descrito por Song, Han (79) (Figura 6).
Para determinação do polimorfismo em –308 (G>A) (rs1800629) do TNF- α
foi realizada a técnica da PCR, que amplificou um fragmento de 107pb (Figura 7),
seguida do tratamento enzimático de acordo com as condições descritas por Wilson,
di Giovine (80), que consistiu no tratamento do produto de PCR com a enzima de
restrição Ncol (Figura 8).
Após o tratamento, todos os produtos foram fracionados em um gel de
agarose a 2,5%, e 3%, corado com brometo de etídeo, visualizado em um
transluminador ultravioleta, fotografado e analisado quanto à distribuição dos alelos,
por meio do sistema de captura de imagens Alpha Imager 2200). A descrição dos
“primers” assim como as condições de amplificação estão descritas na Tabela 2.
34
Quadro 2- Descrição dos oligonucleotídeos e das condições de amplificação que foram utilizados no
presente trabalho.
Primers
Sequência ( 5’- 3’ )
+114 IL2F
ATGTACAGGATGCAACTCCT
+114 IL2R
TGGTGAGTTTGGGATTCTTG
-330 IL2F
ATTCACATGTTCAGTGTAGTTCT
-330 IL2R
GTGATAGCTCTAATTCATGC
-308TNF1
AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT
-308TNF2
TCCTCCCTGCTCCGATTCCG
Condições de
Amplificação
Fragmento
Gene
Bibliografia
35 ciclos de: 30seg a
94ºC, 45 seg a 63ºC e 30
seg a 72ºC
262pb
IL2
Song et al., 2012
(18)
35 ciclos de: 45 seg a
94ºC, 45 seg a 52ºC e 30
seg a 72ºC
131pb
IL2
Sayad &
Movafagh 2014
(17)
35 ciclos de: 45 seg a
94ºC, 45 seg a 61ºC e 45
seg a 72ºC
107pb
TNF-α
Wilson et al.,
1992
(94)
Fonte: Elaborado pela autora.
4.5.
Análise da Expressão gênica por PCR quantitativo em tempo real
(q-PCR)
Após ajuste das concentrações de RNA e síntese do cDNA, a reação de PCR
quantitativa (qPCR) foi realizada no equipamento ABI Prism 7500 Fast Sequence
Detection System, utilizando ensaio de expressão gênica TaqMan e sondas
específicas. A quantificação relativa da expressão foi calculada usando o método 2ΔΔCt
de acordo com Livak and Schmittgen (81).
Para a etapa seguinte, a análise da expressão do RNAm, foram utilizados os
ensaios TNF-α (TNF – Hs01113624_g1) IL-2 (Hs00174114_m1) e para os miRNAs
hsa-miR-146a-5p (000468), hsa-miR-155-5p (002623) e o hsa-miR-181c-5p. Os
RNU6B (Hs001093) e RNU48 (Hs001006) (Applied Biosystems) foram utilizados
como controle de normalização para os miRNAs e os genes constitutivos GUSB
(Hs00187320_m1), UBC (Hs00221499_m1), e TBP (Hs00187332_m1) para
normalização dos RNAm estudados. É importante destacar que os genes
constitutivos foram testados e validados em projetos anteriores.
4.6.
Análise Estatística
As frequências alélicas e os genótipos foram calculados por contagem de
alelos e o equilíbrio de Hardy-Weinberg testado por meio de Teste do χ2. A Análise
da expressão dos genes entre os grupos foi realizada por testes χ2 e/ou Exato de
Fisher e/ou pelo teste de Kruskal-Wallis e/ANOVA. As análises estatísticas foram
realizadas utilizando-se o pacote estatístico SPSS, versão 18.0.
35
RESULTADOS e DISCUSSÃO
36
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1.
Detecção do Helicobacter pylori e do gene cagA
O H. pylori foi detectado em 135/294 (45,9%) (Figura 1) amostras de biópsias
gástricas, e entre as amostras positivas, a presença do marcador de patogenicidade
gene cagA, foi detectado em 60/135 (44,5%) (Figura 2). A frequência da bactéria em
cada grupo estudado, bem como a frequência do marcador de patogenicidade cagA
estão descritos nas Tabelas 2 e 3.
Em concordância com estudos feitos desde o descobrimento do H. pylori,
nossa análise estatística preliminar revelou uma associação estatisticamente
significativa entre a presença da bactéria H. pylori e o desenvolvimento de gastrite
(OR: 4,70; 95%CI: 2,25 - 9.83; p<0.001) e câncer gástrico (OR: 16,9; 95%CI: 6,62 –
43,11; p<0.001). (1, 23)
Quanto ao marcador de virulência cagA, não houve associação com o
desenvolvimento de gastrite e câncer gástrico, valor de p não significativo. Vale
destacar que no artigo científico intitulado: “Prevalence of Helicobacter pylori vacA,
cagA, dupA and oipA genotypes in patients with gastric disease” (Anexo B) publicado
recentemente, analisamos quatro marcadores de virulência do H. pylori em 516
amostras e não verificamos uma associação entre o cagA e o desenvolvimento de
doenças gástricas, apenas associação do cagA combinado com outros fatores de
virulência. O número amostral do artigo, superior ao aqui proposto justifica-se pelo
foco do trabalho. Vale destacar que o artigo é produto do presente trabalho
associado a resultados anteriores.
37
Fonte: Elaborado pela autora.
Figura 1- Gel de agarose à 2%, corado com brometo de etídio para a detecção do H. pylori. Slots 1-8:
Amostras H. pylori positivo; Slot 9: Amostras H. pylori negativo; C-: Controle Negativo; C+: Controle
Positivo.
.Fonte: Elaborado pela autora.
Figura 2- Gel de agarose à 2%, corado com brometo de etídio para a detecção do gene cagA do H.
pylori. Slots 1-5, 7 e 10: Amostras cagA negativa; Slots 6, 8 e 9: Amostras cagA positivas; C-:
Controle Negativo; C+: Controle Positivo.
38
Tabela 1- Frequência da infecção por Helicobacter pylori nos grupos estudados.
Normal
Gastrite
Câncer
H. pylori +
10 (15,4%)
86 (47,5%)
39 (76,5%)*
H. pylori -
52 (80%)
95 (52,5%)
12 (23,5%)
TOTAL
62 (100%)
181 (100%)
51 (100%)
* diferença estatisticamente significante
Fonte: Elaborado pela autora.
Tabela 2- Frequência do marcador de patogenicidade cagA em amostras positivas para infecção por
Helicobacter pylori.
Normal
Gastrite
Câncer
cagA +
4 (40%)
38 (44,2%)
18 (46,2%)
cagA -
6 (60%)
48 (55,8%)
21 (53,8%)
TOTAL
10(100%)
86 (100%)
39 (100%)
Fonte: Elaborado pela autora.
5.2 Análise dos Polimorfismos do Gene da IL-2 -330(T>G) e +114 (T>G) e
Análise em haplótipo
Todos os resultados apresentados neste tópico foram finalizados, a análise
estatística foi realizada e estão demonstrados com mais detalhes no manuscrito em
anexo, intitulado Polymorphisms and haplotypes of the interleukin 2 gene are
associated with an increased risk of gastric cancer. The possible involvement of
Helicobacter pylori, submetido à publicação (Anexo D).
5.2.1. Polimorfismo IL-2 -330 (T>G)
As frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo -330 (T>G) da IL-2 e
suas associações estatísticas estão demonstradas nas Tabelas 4, 5 e 6 (Figura 3 e
4). O alelo T e o genótipo T/T foram encontrados com maior frequência, entretanto o
genótipo G/G, bem como o alelo G desse polimorfismo, revelaram uma associação
com o risco de desenvolvimento de câncer gástrico para a análise entre os grupos
Controle vs Câncer (Tabela 4). Resultados semelhantes foram encontrados para as
análises entre os grupos Gastrite vs Câncer (Tabela 5). Apenas as análises entre os
39
grupos Controle vs Gastrite não apresentaram associações estatisticamente
significantes (Tabela 6).
Em concordância com nossos resultados, estudos observaram que os
indivíduos com genótipo GG e alelo G para o polimorfismo -330 foram associados
com a redução da produção de IL-2, sugerindo que a presença desse genótipo e
alelo podem regular negativamente a resposta anti-tumoral podendo desempenhar
um papel na etiologia do câncer mediada por IL-2. (55-57). Sobjanek et al., (2016)
(57) e Zhao et al., (2015) (52), também destacaram que o polimorfismo -330 da IL-2
foi associado com um risco aumentado no desenvolvimento de carcinoma de células
basais, e de câncer (incluindo carcinoma de nasofaringe, câncer de cárdia, linfoma,
linfoma não-Hodgkin, câncer de bexiga, câncer de mama) em pacientes asiáticos,
respectivamente.
Em contraste com os nossos resultados, Wang et al., (2015), (50) relataram
em uma meta-análise que o polimorfismo -330 T>G
não está associado com o
risco de câncer. Esta discrepância nos resultados pode ser explicada principalmente
pela diferença étnica e número amostral. Segundo alguns autores, os fatores
genéticos devem ser considerados e os resultados devem ser analisados de acordo
com a população do estudo. (13).
40
Figura 3
Figura 4
300pb
150pb
131pb
131pb
50pb
100pb
110pb
Fonte: Elaborado pela autora.
Figura 3- Gel de agarose à 2%, corado com brometo de etídio para visualização do produto da PCR
de 131pb referente ao gene IL-2 -330. Slot M: Marcador de peso molecular 50pb; Slots 1-6: Amostras
de biópsia gástrica; Slot C-: Controle Negativo.
Figura 4- Gel de agarose à 2,5%, corado com brometo de etídio para caracterização dos alelos do
gene IL-2, utilizando a enzima BfaI. Slots 1, 4 e 6: Genótipo TG; Slots 2 e 7: Genótipo TT; Slot 3
Genótipo GG ; M Marcador de peso molecular 100pb.
Tabela 3- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo -330 (T>G) da IL-2, no grupo Controle
vs Câncer Gástrico.
Controle (n = 62)
Câncer (n = 51)
Codominante
OR (95% CI), p
Genótipos/Alelos
Hp + (n=52)
Hp – (n=10)
Hp + (n=39)
Hp – (n=12)
T/T
7(70%)
27(51,9%)
15(38,5%)
6(50%)
1,00
T/G
3(30%)
21(40,4%)
12(30,8%)
3(25%)
1,08(0,38-3,12)
G/G
0(0%)
4(7,7%)
12(30,8%)
3(25%)
6,43(1,47-28,10)*
T
17(85%)
75(72,1%)
42(53,8%)
15(62,5%)
G
3(15%)
29(27,9%)
36(46,2%)
9(37,5%)
2,22 (1,26-3,89)
*estatisticamente significante
Fonte: Elaborado pela autora.
0.026*
0.0071*
41
Tabela 4- Distribuição dos genótipos e alelos polimorfismo -330 (T>G) IL-2, no grupo Gastrite vs
Câncer Gástrico.
Gastrite (n= 181)
Câncer (n = 51)
Codominante
OR (95% CI), p
Genótipos/Alelos
Hp +(n=86)
Hp – (n=95)
Hp + (n=39)
Hp – (n=12)
T/T
48(55,8%)
48(50,5%)
15(38,5%)
6(50%)
T/G
33(38,4%)
34(35,8%)
12(30,8%)
3(25%)
1,01(0,48-2,15)
G/G
5(5,8%)
13(13,7%)
12(30,8%)
3(25%)
4,47(1,84-10,84)*
T
129(75%)
130(68,4%)
42(53,8%)
15(62,5%)
G
43(25%)
60(31,6%)
36(46,2%)
9(37,5%)
1,00
1,98 (1,26-3,12)
0,0021*
0.0038*
*estatisticamente significante
Fonte: Elaborado pela autora.
Tabela 5- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo -330 (T>G) da IL-2, no grupo Controle
vs Gastrite.
Controle (n = 62)
Gastrite (n=181)
Codominante
OR (95% CI), p
Genótipos/Alelos
Hp + (n=52)
Hp – (n=10)
Hp +(n=86)
Hp – (n=95)
T/T
7(70%)
27(51,9%)
48(55,8%)
48(50,5%)
1,00
T/G
3(30%)
21(40,4%)
33(38,4%)
34(35,8%)
1,03(0,54-1,95)
G/G
0(0%)
4(7,7%)
5(5,8%)
13(13,7%)
2,13(0,65-6,92)
T
17(85%)
75(72,1%)
129(75%)
130(68,4%)
G
3(15%)
29(27,9%)
43(25%)
60(31,6%)
1,14 (0,71-1,81)
0,41
0.64
Fonte: Elaborado pela autora.
5.2.2. Polimorfismo IL-2 +114 (T>G)
As frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo +114 (T>G) da IL-2 e
suas associações estatísticas estão demonstradas nas Tabelas 7, 8 e 9 (Figura 5 e
6). O alelo G foi encontrado com maior frequência quando comparado ao alelo T, e o
genótipo GG foi o mais frequente em todas as amostras.
O genótipo T/T, bem como o alelo T desse polimorfismo, revelaram uma
associação com o risco de desenvolvimento de câncer gástrico (Tabela 7), para a
análise entre os grupos Controle vs Câncer. Resultados semelhantes foram
encontrados para as análises entre os grupos Gastrite vs Câncer (Tabela 8).
42
Apenas as análises entre os grupos Controle vs Gastrite não apresentaram
associações estatisticamente significante (Tabela 9).
Na literatura os dados sobre a associação do polimorfismo +114 T>G da IL-2
com o desenvolvimento do câncer gástrico, ainda são escassos. Entretanto o estudo
realizado por Peng, et al. (2014) (82), observou que esse polimorfismo aumenta o
risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular relacionado a hepatite B por
conta da secreção de IL-2. Recentemente em uma meta-análise, Zhang et al.,
(2016) (54), descreveu não existir associação entre o polimorfismo +114 da IL-2 e a
susceptibilidade do câncer.
Figura 5
300pb
Figura 6
262pb
262pb
149pb
113pb
100pb
50pb
Fonte: Elaborado pela autora.
Figura 5- Gel de agarose à 2%, corado com brometo de etídio para a visualização do produto da
PCR de 262 pb referente ao gene IL-2 +114. Slot M: Marcador de peso molecular 100pb; Slots 1-4:
Amostras de biópsia gástrica. C-: Controle negativo.
Figura 6- Gel de agarose à 2,5% corado com brometo de etídio para a caracterização dos alelos do
gene IL-2 +114, utilizando a enzima Mwol. Slot M: Marcador de peso molecular 50pb; Slot 1: Genótipo
TT; Slot 2: Genótipo TG; Slot 3: Genótipo GG.
43
Tabela 6- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo +114 (T>G) da IL-2, no grupo Controle
vs Câncer Gástrico.
Controle (n = 62)
Câncer (n = 51)
Codominante
OR (95% CI), p
Genótipos/Alelos
Hp + (n=10)
Hp – (n=52)
Hp + (n=39)
Hp – (n=12)
G/G
6(60%)
34(65,4%)
15(38,5%)
6(50%)
1,00
T/G
3(30%)
14(26,9%)
8(20,5%)
2(16,7%)
0,93 (0,29-3)
T/T
1(10%)
4(7,7%)
16(41%)
4(33,3%)
5,97(1,60-22,3)*
G
15(75%)
82(78,8%)
38(48,7%)
14(58,3%)
T
5(25%)
22(21,2%)
40(51,3%)
10(41,7%)
3,99 (2,22-7,17)
0,013*
0.0001*
*estatisticamente significante
Fonte: Elaborado pela autora.
Tabela 7- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo +114 (T>G) da IL-2, no grupo Gastrite
vs Câncer Gástrico.
Gastrite (n = 181)
Câncer (n = 51)
Codominante
OR (95% CI), p
Genótipos/Alelos
Hp + (n=86)
Hp – (n=95)
Hp + (n=39)
Hp – (n=12)
G/G
44(51,2%)
51(53,7%)
15(38,5%)
6(50%)
T/G
35(40,7%)
38(40%)
8(20,5%)
2(16,7%)
0,60 (0,26-1,38)
T/T
7(8,1%)
6(6,3%)
16(41%)
4(33,3%)
6,36(2,66-15,2)*
G
123(31,9%)
140(73,7%)
38(48,7%)
14(58,3%)
T
49(68,1%)
50(21,2%)
40(51,3%)
10(41,7%)
1,00
2,95 (1,85-4,69)
*estatisticamente significante
Fonte: Elaborado pela autora.
<0,0001*
0.001*
44
Tabela 8- Distribuição dos genótipos e alelos da IL-2, polimorfismo +114 (T>G) no grupo Controle vs
Gastrite.
Controle (n = 62)
Gastrite (n = 181)
Codominante
OR (95% CI), p
Genótipos/Alelos
Hp + (n=10)
Hp – (n=52)
Hp + (n=86)
Hp – (n=95)
G/G
6(60%)
34(65,4%)
44(51,2%)
51(53,7%)
1,00
T/G
3(30%)
14(26,9%)
35(40,7%)
38(40%)
1,76 (0,9-3,44)
T/T
1(10%)
4(7,7%)
7(8,1%)
6(6,3%)
0,99 (0,31-3,13)
G
15(75%)
82(78,8%)
123(31,9%)
140(73,7%)
T
5(25%)
22(21,2%)
49(68,1%)
50(21,2%)
1,35 (0,83-2,19)
0,22
0,23
Fonte: Elaborado pela autora.
5.2.3. Análise em Haplótipo dos polimorfismos IL-2 -330(T>G) e +114
(T>G)
Considerando a análise em haplótipo dos polimorfismos -330 (T>G) e +114
(T>G) da IL-2, e todos os grupos do estudo, somente o grupo de pacientes com
câncer gástrico estava fora do equilíbrio de Hardy–Weinberg. Em relação ao
desequilíbrio de ligação (D’) desses dois polimorfismos, o grupo Controle vs Gastrite
apresentou um D’=0,9062, o grupo Controle vs Câncer D’= 0,0554 e o grupo Gastrite
vs Câncer D’= 0.2346.
Quanto a análise do haplótipo, os dados estão detalhados nas Tabelas 10 e
11.
Em
resumo,
o
haplótipo
-330G/+114T
demonstrou
uma
associação
estatisticamente significante para o desenvolvimento de câncer gástrico a partir da
mucosa gástrica normal e com gastrite, associação esta que também foi observada
por Song, et al. (2012). Porém para outra doença, o Linfoma de Non-Hodkin. Nosso
estudo foi o primeiro sobre a análise de haplótipos dos polimorfismos -330 e +114 da
IL-2 e o risco no desenvolvimento de câncer gástrico.
45
Tabela 9- Análise do haplótipo IL-2 −330 T>G e +114 T>G nos grupos Controle vs Câncer Gástrico
IL-2 : +114 T/G
rs:2069763
IL-2 : -330 T/G
rs:2069762
Frequência
OR (95% CI), p
G
T
0,4452
1,00
G
G
0,2141
1,40 (0,59 – 3,31), 0,45
T
T
0,2141
1,45 (0,64 – 3,27), 0,37, 0,37
T
G
0,1266
10,09 (1,71 – 59,61), 0,012*
Associação global do haplótipo p:0,0028
Fonte: Elaborado pela autora.
Tabela 10- Análise do haplótipo IL-2 −330 T>G e +114 T>G nos grupos Gastrite vs Câncer Gástrico.
IL-2 : +114 T/G
rs:2069763
IL-2 : -330 T/G
rs:2069762
Frequência
OR (95% CI), p
G
T
0,4315
1,00
T
T
0,2495
1,10 (0,57 – 2,13), 0,77
G
G
0,2474
1,07 (0,56 – 2,04), 0,84
T
G
0,0716
10,10 (3,36 – 30,33), <0,0001*
Fonte: Elaborado pela autora.
Diferentemente dos resultados obtidos, na análise entre os grupos Controle vs
Gastrite, nenhuma diferença estatisticamente significante foi observada (Tabela 12).
Tabela 11- Análise do haplótipo IL-2 −330 T>G e +114 T>G nos grupos Controle vs Gastrite.
IL-2 : +114 T/G
rs:2069763
IL-2 : -330 T/G
rs:2069762
Frequência
OR (95% CI), p
G
T
0,4698
1,00
G
G
0,2709
1,4 (0,85 – 2,3), 0,19
T
T
0,2524
1,42 (0,82 – 2,44), 0,21
T
G
0,0069
Raro <0,0001
Associação global do haplótipo p:0,28
Fonte: Elaborado pela autora.
46
5.2.4. Polimorfismo TNF-α -308 (G>A)
As frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo -308 (G>A) do TNF-α e
suas associações estatísticas estão demonstradas nas Tabelas 13,14 e 15 (Figura 7
e 8). O alelo G foi encontrado com maior frequência quando comparado ao alelo A, e
o genótipo GG foi o mais frequente em todas as amostras.
O genótipo A/A, bem como o alelo A desse polimorfismo, revelaram ser um
risco para o desenvolvimento de câncer gástrico (Tabela 13), para a análise entre os
grupos Gastrite vs Câncer. As análises entre os grupos Controle vs Gastrite e
Controle vs Câncer não apresentaram associações estatisticamente relevantes
(Tabela 14 e 15). Em concordância com o nosso trabalho, Yang et al., (2014)
relataram que o polimorfismo -308 do TNF-α pode contribuir para a susceptibilidade
do câncer gástrico na população caucasiana. Vale destacar que no artigo intitulado
“Lack of association among TNF-α gene expression, -308 polymorphism (G>A) and
virulence markers of Helicobacter pylori” (ANEXO E) publicado em 2015,
caracterizamos o TNF-α em 134 amostras de pacientes dispépticos e sugerimos um
papel importante do TNF-α na progressão da gastrite para câncer gástrico.
47
Figura 8
Figura 7
Fonte: Elaborado pela autora.
Figura 7- Gel de agarose à 2%, corado com brometo de etídio para visualização do produto da PCR
de 107pb referente ao gene TNF-α -308. Slot M – Marcador de peso molecular 100pb; Slots 1-4:
Amostras de biopsia gástrica; C-: Controle Negativo.
Figura 8- Gel de agarose à 3%, corado com brometo de etídio para caracterização dos alelos do
TNF-α, utilizando a enzima NcoI. Slots 1, 2 e 5: Genótipo GA; Slots 3,6 e 7: Genótipo GG; Slot 4
Genótipo AA; M Marcador de peso molecular 100pb.
Tabela 12- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo -308 (G>A) do TNF-α, no grupo
Controle vs Câncer Gástrico.
Controle (n = 62)
Câncer (n = 51)
Codominante
OR (95% CI), p
Genótipos/Alelos
Hp + (n=12)
Hp – (n=52)
Hp + (n=39)
Hp – (n=12)
G/G
9(90%)
36(69,2%)
26(66,7%)
7(58,3%)
1,00
G/A
1(10%)
15(28,9%)
10(25,6%)
4(33,3%)
1,85(0,62-5,51)
A/A
0(0%)
1(1,9%)
3(7,7%)
1(8,4%)
7,42(0,55-9,98)
G
19(95%)
87(83,7%)
62(79,5%)
18(75%)
A
1(5%)
17(16,3%)
1,56 (0,78-3,1)
Fonte: Elaborado pela autora.
16(20,5%)
6(25%)
0,18
0,22
48
Tabela 13- Distribuição dos genótipos e alelos do polimorfismo -308 (G>A) do TNF-α, no grupo
Gastrite vs Câncer Gástrico.
Gastrite (n =181)
Câncer (n = 51)
Codominante
OR (95% CI), p
Genótipos/Alelos
Hp + (n=85)
Hp – (n=96)
Hp + (n=39)
Hp – (n=12)
G/G
62(72,1%)
63(66,3%)
26(66,7%)
7(58,3%)
G/A
23(26,7%)
30(31,6%)
10(25,6%)
4(33,3%)
1,09(0.53-2.24)
A/A
1(1,2%)
2(2,1%)
3(7,7%)
1(8,4%)
5,74(1.12-29.30)*
G
147(85,5%)
156(82,1%)
62(79,5%)
18(75%)
A
25(14,5%)
34(17,9%)
16(20,5%)
6(25%)
1,00
1,36 (0,78-2,35)
0,11
0,30
Fonte: Elaborado pela autora.
Tabela 14- Distribuição dos genótipos e alelos do TNF-α, polimorfismo -308 (T>G) no grupo Controle
vs Gastrite.
Controle (n = 62)
Gastrite (n = 181)
Codominante
OR (95% CI), p
Genótipos/Alelos
Hp + (n=12)
Hp – (n=52)
Hp + (n=85)
Hp – (n=96)
G/G
9(90%)
36(69,2%)
62(72,1%)
63(66,3%)
1,00
G/A
1(10%)
15(28,9%)
23(26,7%)
30(31,6%)
1,34(0,68-2,64)
A/A
0(0%)
1(1,9%)
1(1,2%)
2(2,1%)
1,36(0,13-14,31)
G
19(95%)
87(83,7%)
147(85,5%)
156(82,1%)
A
1(5%)
17(16,3%)
25(14,5%)
34(17,9%)
1,14(0,64-2,03)
Fonte: Elaborado pela autora.
0,69
0,77
49
5.3 Análise da Expressão dos Genes da IL-2 e TNF- α
5.3.1 Expressão Relativa da IL-2
Quanto à análise da expressão do gene da IL-2, primeiramente as amostras
foram comparadas por grupo (controle vs gastrite vs câncer), independentemente da
presença da bactéria H. pylori, e nenhuma diferença estatisticamente significante foi
encontrada (p= 0,3861) (Figura 9). Resultados semelhantes foram encontrados
quando os grupos foram divididos quanto à presença da bactéria (positivos e
negativos H. pylori), e comparados ao grupo controle (mucosa gástrica normal e
negativo para H. pylori). Não houve diferença estatisticamente significante quando
comparados os grupos Controle vs grupo Normal Positivo, grupo Controle vs grupo
Gastrite Positivo, grupo Controle vs grupo Gastrite Negativo e o grupo Controle vs
grupo Câncer (Figura 9).
Gráfico 1- Análise da expressão da IL-2 nos grupos de pacientes controle, gastrite e câncer,
independentemente da presença do H. pylori. E Análise da expressão da IL-2 nos grupos de
pacientes, considerando a presença da bactéria.
Fonte: Elaborado pela autora.
50
Nossos resultados sugerem que a ausência de diferenças estatisticamente
significantes na expressão do gene da IL-2, independente do grupo de pacientes e
da infecção por H. pylori, pode ser explicado pela atuação dos miRNAs 146a e 155
na ativação da via de NF-κB, reduzindo a resposta imune e inflamatória, e a síntese
de citocinas, incluindo a IL-2.
5.3.2 Expressão Relativa do TNF- α
Analisando estatisticamente as amostras por grupo (controle vs gastrite vs
câncer), independentemente da presença da bactéria H. pylori, verificamos uma
diferença estatisticamente significante (p= 0,0001*). Encontramos um aumento da
expressão do TNF- α estatisticamente significante (p= 0,0001*) quando comparado o
grupo Controle (Mediana RQ:1,065) vs grupo Gastrite (Mediana RQ: 1,770), e uma
diminuição estatisticamente significante quando comparados os grupos Controle vs
grupo Câncer (Mediana RQ: 0,65) (p= 0,0423) e grupo Gastrite vs grupo Câncer (p=
0,0003*) (Figura 10).
Resultados semelhantes foram encontrados quando os grupos foram
divididos quanto à presença da bactéria H. pylori, e comparados ao grupo controle.
Encontramos um aumento estatisticamente significante quando comparados os
grupos Controle (Mediana RQ:0,95) vs grupo Normal Positivo (Mediana RQ:2,01),
grupo Controle vs grupo Gastrite Positivo (Mediana RQ:3,16) e o grupo Controle vs
grupo Gastrite Negativo (Mediana RQ:1,26). Uma diminuição estatisticamente
significante foi encontrada quando comparado o grupo Controle vs grupo Câncer
(Mediana RQ:0,48) (Figura 10).
51
Gráfico 2- Análise da expressão do TNF-α, nos grupos de pacientes controle, gastrite e câncer,
independentemente da presença do H. pylori. E Análise da expressão do TNF-α, nos grupos de
pacientes, considerando a presença da bactéria.
Fonte: Elaborado pela autora.
Nossos resultados sugerem que o gene TNF-α tenha um papel mais efetivo
na transição da mucosa gástrica normal para a gastrite, levando em consideração o
processo inflamatório mais acentuado nessa fase, por isso a expressão aumentada
no grupo gastrite quando comparado ao grupo normal e câncer. A infecção pelo H.
pylori parece que também atuou aumentando a expressão do TNF-α, como visto
nos grupos positivos para a infecção, e intensificado no grupo gastrite positivo,
considerando a inflamação causada pela gastrite junto à infecção pela bactéria. Em
concordância com os nossos resultados, Peng et al., (2014), (82) observaram que
os níveis de expressão da IL-32, uma citocina pró-inflamatória como o TNF-α, foram
significativamente
elevados
em pacientes
infectados
pelo
H.
pylori
e
correlacionados com a gravidade da inflamação na mucosa gástrica.
A infecção pelo H. pylori parece induzir um aumento da expressão do TNF-α,
que atua como principal mediador de bactérias Gram negativas, o que pode estar
relacionada com a inibição da secreção do suco gástrico e a um pior prognóstico.
(83). Beales and Calam (15) e Crabtree, Shallcross (14) destacaram que o TNF-α
atua inibindo a secreção de ácido gástrico, podendo afetar a infecção pelo H. pylori,
52
estes autores ainda sugerem que a secreção de ácido gástrico seja um dos mais
importantes fatores no desenvolvimento de doenças gastroduodenais associadas à
infecção por H. pylori.
Segundo Pimentel-Nunes e colaboradores (2013) (84), a contaminação por H.
pylori aumenta significativamente a expressão de TNF-α até mesmo na mucosa
normal. A infecção pela bactéria induz a inflamação do estômago associada à
produção de citocinas, como o TNF-α. (14, 41, 85)
Laddha e colaboradores em 2012 (86), encontraram um aumento na
expressão do TNF-α em pacientes com vitiligo quando comparados a pacientes
controle e sugeriram o envolvimento desta citocina em doenças autoimune e
inflamatórias.
5.4 Análise da Expressão dos miRNAs 146a, 155 e 181c
5.4.1 Expressão Relativa do miRNA 146a
Para à análise da expressão do miRNA 146a, as amostras foram
comparadas por grupo (controle vs gastrite vs câncer), independentemente da
presença da bactéria H. pylori, sendo verificado uma diferença estatisticamente
significante (p= 0,0003*) (Figura11). Encontramos um aumento da expressão do
miRNA 146a estatisticamente significante (p= 0,0002*) quando comparado o grupo
Controle (Mediana RQ:0,92) vs grupo Gastrite (Mediana RQ:2,85), uma diminuição
estaticamente significante da expressão quando comparado o grupo Gastrite vs
grupo
Câncer
(Mediana
RQ:1,00)
(p= 0,0105),
e
nenhuma
diferença
estatisticamente significante foi encontrada quando comparado o grupo Controle vs
grupo Câncer (p= 0,7884) (Figura 11).
Analisando os grupos divididos quanto à presença da bactéria H. pylori, e
comparados ao grupo controle, verificamos um aumento estatisticamente significante
quando comparados os grupos Controle (Mediana RQ: 0,96) vs grupo Normal
Positivo (Mediana RQ: 3,97) e o grupo Controle vs grupo Gastrite Positivo (Mediana
RQ: 4,6).Nenhuma diferença estatisticamente significante foi encontrada quando
comparados os grupos Controle vs grupo Gastrite Negativo (Mediana RQ: 1,03 ) e o
grupo Controle vs grupo Câncer (Mediana RQ: 0,97) (Figura 11).
53
Gráfico 3- Análise da expressão do miRNA 146a, nos grupos de pacientes controle, gastrite e
câncer, independentemente da presença do H. pylori. E Análise da expressão do miRNA 146a, nos
grupos de pacientes, considerando a presença da bactéria.
Fonte: Elaborado pela autora.
Nossos resultados mostraram, independente da presença da bactéria H.
pylori, um aumento significativo da expressão do miRNA 146a em amostras de
mucosa gástrica com gastrite, quando comparado com amostras controle.
Considerando a presença da bactéria H. pylori, verificamos que o aumento
significativo da expressão do miRNA 146a, ocorreu em amostras de gastrite
positivas para a infecção, sugerindo que a presença da bactéria induz o aumento da
expressão do miRNA 146a. Similarmente, Liu et al., (2010) (87), observaram na
população chinesa, um aumento significativo da expressão do miRNA 146a em
amostras infectadas pela bactéria, quando comparadas a amostras não infectadas,
concordando com os resultados de Okubo et al., (2010) (88), na população
japonesa, e com os nossos resultados que mostraram expressão aumentada do
miRNA 146a também em amostras de mucosa gástrica normal positiva para a
bactéria.
Liu et al. (2013) (97) e Ma et al., (2011) (89), destacaram que o miRNA 146
tem como alguns de seus alvos, os genes MyD88, TLRs, IRAK1 e TRAF 6, os quais
ativam a via NF-κB, mediando a resposta inflamatória e imune do hospedeiro,
54
alterando a síntese de citocinas inflamatórias, proliferação celular e apoptose.
Similarmente, Crone et al., 2012 (90), relataram que o miRNA 146a inibi a secreção
de quimiocinas e fatores de crescimento controlados por NF-κB, sugerindo portanto,
que esse miRNA atue como supressor tumoral e inflamatório por inibição da
atividade NF-κB e consequentemente, inibição da expressão de citocinas
associadas a tumores e fatores de crescimento.
Ma e colaboradores em (2011) (89), sugeriram que o aumento da expressão
do miRNA 146a, em resposta a infecção por H. pylori, atue diretamente na
diminuição dos seus genes alvos, IRAK1 e TRAF 6, que vão reduzir a atividade de
NF-κB atribuindo ao miRNA 146a um papel de regulador negativo, que atua
reduzindo a resposta imunológica e inflamatória em resposta a bactéria, juntamente
a síntese de citocinas pró inflamatórias, como é o caso das interleucinas (1, 2,6, 8),
do TNF- α e de fatores de crescimento. (2, 87, 91-93) Concordando com nossos
resultados que não apresentaram diferenças significativas na expressão de IL-2 nas
amostras de mucosa gástrica, independente da infecção por H. pylori.
Nossos resultados também mostraram uma diminuição da expressão do
miRNA 146a, em amostras de mucosa gástrica com câncer gástrico quando
comparado com amostras de gastrite. Em concordância com nossos resultados, Li
et al., (2014) (94), relataram uma diminuição da expressão do miRNA 146a em
tecidos com câncer gástrico, na população chinesa. Em estudos anteriores, na
população japonesa, Kogo et al., (2011) (95), sugeriram que o miRNA 146a pode
funcionar como um supressor tumoral em câncer gástrico, sendo útil como
marcador de prognóstico.
Hou et al., (2012) (96), relataram em estudo com a população chinesa, que a
expressão diminuída do miRNA 146a em amostras de câncer, pode estar
relacionada ao tamanho do tumor e a diferenciação das células no câncer gástrico,
quanto menor a expressão desse miRNA, menor seria a diferenciação celular e
maior o tumor. Esse estudo apontou o miRNA 146a como supressor tumoral no
câncer gástrico e sugeriu que sua baixa expressão poderia promover a progressão
do câncer gástrico.
55
5.4.2 Expressão Relativa do miRNA 155
Quando analisadas estatisticamente as amostras por grupo (controle vs
gastrite vs câncer), independentemente da presença da bactéria H. pylori,
observamos uma diferença estatisticamente significante (p= 0,0006) (Figura 12).
Houve um aumento da expressão do miRNA 155 estatisticamente significante
(p<0.0001) quando comparado o grupo Controle (Mediana RQ: 0,970) vs grupo
Gastrite (Mediana RQ: 1,78), e nenhuma diferença estatisticamente significativa
quando comparados os grupos Controle vs grupo Câncer (Mediana RQ: 1,29)
(p= 0,3677) e Gastrite vs grupo Câncer (p= 0,2058) (Figura 12).
Para a análise dos grupos divididos, quanto à presença da bactéria H. pylori,
e comparados ao grupo controle, encontramos um aumento estatisticamente
significante quando comparados os grupos Controle (Mediana RQ: 0,960) vs grupo
Normal Positivo (Mediana RQ: 2,34) e o grupo Controle vs grupo Gastrite Positivo
(Mediana RQ: 2,55). Nenhuma diferença estatisticamente significante foi encontrada
quando comparados o grupo Controle vs grupo Gastrite Negativo (Mediana RQ:
1,15) e Controle vs grupo Câncer (Mediana RQ: 1,29) (Figura 12).
56
Gráfico 4- Análise da expressão do miRNA 155, nos grupos de pacientes controle, gastrite e câncer,
independentemente da presença do H. pylori. E Análise da expressão do miRNA 155, nos grupos de
pacientes, considerando a presença da bactéria.
Fonte: Elaborado pela autora.
Independente da presença da bactéria H. pylori, nossos resultados
mostraram um aumento estatisticamente significativo da expressão do miRNA 155
em amostras de mucosa gástrica com gastrite, quando comparado com amostras
controle. Considerando a presença da bactéria H. pylori, encontramos que o
aumento estatisticamente significativo da expressão do miRNA 155 era em
amostras de gastrite positivo para a infecção, sugerindo que a presença da bactéria
induz o aumento da expressão do miRNA 155, visto que houve um aumento
estatisticamente significativo da expressão desse miRNA também em amostras
normal positivo. Em concordância, Okubo et al., (2010) (88), encontraram na
população japonesa, um aumento significativo da expressão do miRNA 155 em
amostras infectadas pela bactéria, quando comparadas com amostras não
infectadas. Similarmente, Xiao e colaboradores em (2009) (70), relataram a
expressão do miRNA 155 aumentada em células epiteliais gástricas e em tecidos
de mucosa gástrica, na população chinesa.
Estudos indicam que o miRNA 155, que tem sua expressão aumentada em
resposta ao H. pylori, atua diminuindo a resposta imune e inflamatória contra a
57
bactéria, agindo como um regulador negativo, assim como o miRNA 146a. (2, 70,
89, 92) Esse miRNA principalmente atua sobre o complexo MyD88 e as proteínas
adaptadoras (IRAK-1 e TRAF6) da cascata de sinalização de TLRs, refletindo na
diminuição da atividade de NF-κB, e consequentemente, dos mediadores próinflamatórios, como IL-2, IL-6, IL-6, IL-8, TNF- α, e fatores de crescimento. (2, 70,
87, 97) Em concordância com nossos resultados que apresentam níveis de
expressão sem diferença estatisticamente significativa para o gene da IL-2, em
amostras de mucosa gástrica.
Outra via de atuação do miRNA 155 é através do seu gene alvo IKK sobre o
qual atua reduzindo sua expressão, e agindo diretamente na diminuição da
atividade de NF-κB diminuindo a resposta imune e inflamatória, a fim de controlar o
processo de inflamação na mucosa gástrica. (89) Entretanto, essa inflamação da
mucosa continua em resposta a presença da bactéria H. pylori, que estimula as vias
de ativação de NF- kB através da presença de LPS e de peptideoglicano na sua
membrana, e através da síntese do TNF-α, que atua como principal mediador da
resposta imune contra bactéria Gram negativas. Por esse motivo, o nível de
expressão do gene TNF-α permanece muito aumentado nas amostras de mucosa
gástrica positivas para a infecção da bactéria.
Assim, a expressão do TNF-α
permanece aumentada em nossos resultados, apesar dos miRNA 146a e miRNA
155 atuarem diminuindo a atividade de NF-κB, a bactéria presente na mucosa
gástrica continua induzindo a síntese de TNF-α, que por sua vez ativa a via TRAF 6,
e consequentemente, a atividade de NF-κB.
58
Figura 9- Esquema ilustrando as vias de atuação dos microRNAs 146a e 155 com seus genes alvos.
Fonte: Elaborado pela autora.
5.4.3 Expressão Relativa do miRNA 181c
Para a expressão do miRNA 181c, as amostras foram comparadas por grupo
(controle vs gastrite vs câncer), independentemente da presença da bactéria H.
pylori, e uma diferença estatisticamente significante foi encontrada (p= 0,0024)
(Figura 13). Verificamos uma diminuição da expressão estaticamente significante
quando comparados os grupos Controle (Mediana RQ: 1,02) vs grupo Câncer
(Mediana RQ: 0,595) (p= 0,0044*) e o grupo Gastrite (Mediana RQ:1,07) vs grupo
Câncer (p= 0,0011*). Nenhuma diferença estatisticamente significante (p= 0,2434)
foi encontrada quando comparado o grupo Controle vs grupo Gastrite (p= 0,2058)
(Figura 13).
Analisando os grupos divididos quanto à presença da bactéria H. pylori, e
comparados ao grupo controle, encontramos uma diminuição estatisticamente
significante quando comparado o grupo Controle (Mediana RQ:1,02) vs grupo
Câncer (Mediana RQ:0,62). Nenhuma diferença estatisticamente significante foi
59
encontrada quando comparados os grupos Controle vs grupo Normal Positivo
(Mediana RQ: 0,99), grupo Controle vs grupo Gastrite Positivo (Mediana RQ: 0,69) e
grupo Controle vs grupo Gastrite Negativo (Média do RQ:1,2) (Figura 13).
Gráfico 5- Análise da expressão do miRNA 181c, nos grupos de pacientes controle, gastrite e câncer,
independentemente da presença do H. pylori. E Análise da expressão do miRNA 181c, nos grupos de
pacientes, considerando a presença da bactéria.
Fonte: Elaborado pela autora.
Nossos resultados sobre o miRNA 181c mostraram, independente da
presença da bactéria H. pylori, uma diminuição estatisticamente significativa da
expressão desse miRNA em amostras de mucosa gástrica com câncer gástrico,
quando comparado com amostras controle e gastrite. Considerando a presença da
bactéria H. pylori, observamos um aumento estatisticamente significativo da
expressão do miRNA 181c em amostras de gastrite negativo, quando comparada
com amostras controle, resultado controverso, e que em partes pode ser explicado
pelo desvio padrão das respectivas amostras, principalmente no grupo gastrite
negativo. Também observamos uma diminuição estatisticamente significativa em
amostras de câncer quando comparadas com amostras controle.
Em concordância com nossos
resultados,
Guo et al.,(2012)
(74),
demonstraram uma diminuição significativa da expressão do miRNA 181b, da
60
mesma família do miRNA 181c, em tecidos com câncer gástrico quando comparado
com tecidos não neoplásicos, sugerindo que a diminuição desse miRNA pode se
correlacionar com a carcinogênese do câncer gástrico, em pacientes chineses.
Hashimoto e colaboradores (2013) (98), relataram que a metilação diminui os níveis
de expressão de miRNAs supressores de tumor, como é o caso do miRNA 181c,
que induz o aumento da expressão de genes oncogênicos, como KRAS e NOTVH4.
Sugerindo que o miRNA 181c desempenha papel na carcinogênese gástrica via
regulação de genes oncogênicos. (98) Contrário aos nossos resultados, Cui et al.,
(2013) (99), relataram níveis de expressão significativamente maiores do miRNA
181c em tecido e plasma de pacientes chineses com câncer gástrico, quando
comparados com tecidos com gastrite.
Ma et al., (2011) (89), descreveram em estudo, que o miRNA 181b, é
induzido por um fator de transcrição chamado STAT em um ciclo de feedback
positivo, resultando na inibição da produção de CYLD que é um gene envolvido na
progressão do tumor agindo como um regulador negativo do NF-κB. Com isso,
ocorre o aumento a atividade de NF-κB que passa a trabalhar completando o ciclo
positivo, e consequentemente, aumentando a resposta imune e inflamatória, assim
como a síntese de citocinas pró inflamatórias.
61
CONCLUSÕES
62
6.
CONCLUSÕES
1) a) Não houve diferença estatisticamente significante na expressão do
gene da IL-2 nos grupos de pacientes estudados (controle, gastrite e câncer
gástrico), considerando ou não a presença da bactéria H. pylori.
b) Quando analisada a expressão do gene TNF- α, independente do H.
pylori, foi observado um aumento estatisticamente significante no grupo de
pacientes com gastrite em relação ao grupo controle, e uma diminuição
estatisticamente significante no grupo de pacientes com câncer gástrico em
relação ao grupo controle. Considerando a presença da bactéria H. pylori,
verificamos um aumento estatisticamente significante no grupo de pacientes
normal positivo em relação ao grupo controle, no grupo gastrite positivo em
relação ao grupo controle, e no grupo de pacientes gastrite negativo em relação
ao grupo controle. Encontramos também uma diminuição estatisticamente
significante no grupo câncer gástrico em relação ao grupo controle.
2) a) Analisando a expressão do miRNA 146a em amostras de mucosa
gástrica, independente da presença da bactéria H. pylori, houve aumento
estatisticamente significante no grupo gastrite em relação ao grupo controle, e
uma diminuição estaticamente significante no grupo câncer gástrico em relação
ao grupo gastrite. Considerando a presença da bactéria, foi verificado um
aumento estatisticamente significante no grupo de pacientes normal positivo em
relação ao grupo controle, e no grupo gastrite positivo em relação ao grupo
controle.
b) Para o miRNA 155, em amostras de mucosa gástrica, independente da
presença da bactéria H. pylori, foi observado um aumento estatisticamente
significante na expressão para o grupo gastrite em relação ao grupo controle.
Considerando a presença da bactéria, houve um aumento estatisticamente
significante no grupo de pacientes normal positivo em relação ao grupo controle, e
no grupo gastrite positivo em relação ao grupo controle.
63
c) Com relação à expressão do miRNA 181c, em amostras de mucosa
gástrica, independente da presença da bactéria H. pylori, foi encontrado uma
diminuição estatisticamente significante no grupo câncer gástrico em relação ao
grupo controle, e no grupo câncer gástrico em relação ao grupo gastrite.
Considerando a presença da bactéria, houve um aumento estatisticamente
significante no grupo gastrite negativo em relação ao grupo controle, e uma
diminuição estatisticamente significante no grupo câncer gástrico em relação ao
grupo controle.
3) Houve uma associação significativa entre a presença da bactéria H.
pylori e desenvolvimento de gastrite e câncer gástrico, entretanto para o marcador
de virulência cagA, não houve uma associação significativa.
4) Para o polimorfismo +114 T>G da Interleucina 2, o genótipo T/T e o
alelo T demonstrou um risco no desenvolvimento de câncer gástrico. Resultados
similares foram encontrados para o polimorfismo -330 T>G, mas para genótipo
G/G e o alelo G. O haplótipo -330G/+114T revelou uma associação significante
para o desenvolvimento de câncer gástrico em pacientes com gastrite e mucosa
gástrica normal. Quanto ao polimorfismo -308 do TNF-α, o risco no
desenvolvimento de câncer gástrico foi encontrado para o genótipo A/A e alelo A,
apenas para os grupos Gastrite vs Câncer.
5) Quanto à correlação da expressão dos micros e dos genes da IL-2 e
TNF- α, verificamos que os miRNAs 146a e 155 atuam reduzindo a atividade de
NF-κB, e consequentemente da resposta imune e inflamatória, e a síntese de
citocinas, incluindo a IL-2 e TNF- α. Com relação ao miRNA 181c, não houve
relação com as citocinas IL-2 e TNF- α.
6) Nossos resultados mostraram que a infecção pelo H. pylori, na mucosa
gástrica, atua aumentando a expressão do TNF-α, e dos miRNAs 146a e 155.
Para a IL-2 e o miRNA 181c não houve mudança estatisticamente significativa em
decorrência da presença do H. pylori.
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ANEXO A- COMITÊ DE ÉTICA
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ANEXO B- ARTIGO PUBLICADO DURANTE O MESTRADO
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ANEXO C- ARTIGO PUBLICADO DURANTE O MESTRADO
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ANEXO D- ARTIGO SUBMETIDO DURANTE O MESTRADO
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ANEXO E- ARTIGO PUBLICADO