Papel Dos Receptores do Tipo Toll na Resistência à Quimioterapia

Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI
Projeto Finalista 2013
Papel Dos Receptores do Tipo Toll na Resistência à Quimioterapia e Evolução da
Leukemia Mielóide Aguda
Welbert de Oliveira Pereira
ABSTRACT
Acute myeloid leukemia (AML) is a myeloproliferative diseasecharacterized by expansion of
CD34-positive hematopoietic clones into bone marrow, with subsequent release to peripheral
blood and invasion of other tissues, damaging hematopoiesis and immune system function.
Consequentially, AML patients present recurrent infections during the treatment and after
immunosuppressive therapy postbone marrow transplantation. The chemotherapy reduces the
bulk of blasts to undetectable levels, but episodes of relapses are consistently frequent. The
triggers responsible for AML evolution remain unclear. Toll like receptors (TLR) are able to
recognize pathogen-associated molecules. Because leukemia patients present increased
susceptibility to infections, and preliminary results of our group confirmed the TLR expression in
AML blasts, our hypothesis is that stimulation of TLR could be involved in AML progression and
resistance to chemotherapy. Thus, the objective of this project is to investigate the role of TLR
in the AML progression and chemotherapy resistance of the blast cells. Sorted CD34-positive
blasts from bone marrow of AML patients will be cultured in the presence of TLR agonists.
Differential gene expression, cytokines/chemokines production, immunophenotype and
proliferation rate will be assessed after TLR stimulation. Additionally, we will investigate if TLR
stimulation interferes with the resistance of chemotherapy in leukemia cells. This project aims
to provide pioneers evidences regarding the role of TLR stimulation for AML, linking the
episodes of infection with the progression of the disease.
INTRODUÇÃO
A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela expansão
de células precursoras transformadas (blastos) na medula óssea. Estaexpansão é gradativa,
levando ao comprometimento da hematopoese, consequentemente do sistema imunológico.
Posteriormente, ocorre a liberação dos blastos para o sangue periférico e a invasão de outros
tecidos, formando lesões nodulares. Embora se tenha descrito inúmeras alterações genéticas
e imunofenotípicas, que são consideradas marcadores de diagnóstico e prognóstico, a causa
molecular da LMA é desconhecida.
A quimioterapia com citarabina é o tratamento padrão, e reduz a população de blastos para
níveis indetectáveis. Mas episódios de recaída são frequentes, com clones leucêmicos mais
resistentes às drogas, levando o paciente ao óbito.
O paciente LMA é tipicamente imunossuprimido devido à deficiente hematopoese, à
mieloablação induzida pela quimioterapia e aos imunossupressores pós-transplante. Assim,
pacientes LMA são frequentemente acometidos por infecções.
Os receptores do tipo toll (Toll-like receptors – TLR) são responsáveis por reconhecer padrões
moleculares associados a patógenos. Dados preliminares de nosso grupo demonstraram que
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blastos derivados de pacientes LMA expressam níveis normais ou aumentados de TLR,
sugerindo que estas células seriam capazes de responder à sua estimulação.
Diante dos dados da literatura e de nossos achados, levantamos a hipótese de que as
infecções frequentes em pacientes LMA seriam fontes de agonistas de TLR, e que esta
estimulação poderia ser capaz de modular fenômenos envolvidos com a progressão da
leucemia e com a resistência à quimioterapia, deflagrando com a recaída da LMA.
OBJETIVO
O objetivo geral do projeto é investigar o efeito da estimulação dos TLR para a progressão da
LMA, através da modulação da proliferação e resistência a apoptose induzida por
quimioterapia.
Figura 1: Ilustração da estratégia experimental do projeto de pesquisa: Medulas ósseas de
indivíduos controle e pacientes LMA serão processadas e marcadas para posterior separação
de blastos CD34+ por cell sorting, utilizando o citômetro FACS Aria. Os blastos serão
cultivados na presença ou ausência de agonistas de TLR. Sobrenadantes das culturas dos
blastos serão armazenados para posterior dosagem de citocinas e quimiocinas produzidas
frente à estimulação dos receptores. Com auxílio do software de análise Infinicyt, serão
comparadas as imunofenotipagens antes e depois do estímulo para estudo de marcadores de
prognóstico. Para os experimentos de avaliação da proliferação celular, os blastos serão
marcados com CFSE no tempo zero do tratamento com agonistas de TLR, e a proliferação
será acompanhada por 4 dias através da detecção do decaimento da fluorescência. Análise do
ciclo celular será baseada no conteúdo de DNA, visualizando as fases G1, S, G2 e sub-G0.
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Para ensaios de quimio-resistência, as células serão estimuladas com os agonistas de TLR e
concomitantemente tratadas com citarabina. A taxa de apoptose será quantificada por
citometria de fluxo através de marcação com anexina/iodeto de propídeo e por detecção de
caspase-3 ativada (por citometria e alternativamente por western blot).
RELEVÂNCIA E EXEQUIBILIDADE DO PROJETO
Os resultados gerados serão absolutamente pioneiros neste campo da ciência, e abrirão uma
frente de estudos quanto à relação clínica entre infecções adquiridas pelo paciente e a
progressão da LMA. A viabilidade deste projeto é garantida por um conjunto de fatores, tais
como: i) o parque tecnológico do Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa do Hospital Albert
Einstein conta com os equipamentos necessários para sua execução, incluindo os citômetros
FACS Aria e Fortessa; ii) nosso grupo possui experiência não apenas nos ensaios de biologia
celular e molecular, mas também em citometria de fluxo aplicada ao diagnóstico de neoplasias
hematológicas; iii) facilitado recrutamento de pacientes no Hospital Albert Einstein.
O concurso BD Biosciences Pesquisador SBI visa o reconhecimento e apoio aos
pesquisadores que promovem o constante avanço científico através do incentivo à técnica
de Citometria de Fluxo com Múltipla Marcação no Brasil.
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