arsênio, cádmio, chumbo e mercúrio

Programa de Pós Graduação Stricto Sensu
Mestrado Profissional em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Campus Rio de Janeiro - Maracanã
Tania dos Santos Silva
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS PARA
DETERMINAÇÃO DE CONTAMINANTES INORGÂNICOS (ARSÊNIO, CÁDMIO,
CHUMBO E MERCÚRIO) EM PEIXE.
Rio de Janeiro – RJ
2014
Tania dos Santos Silva
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS PARA
DETERMINAÇÃO DE CONTAMINANTES INORGÂNICOS (ARSÊNIO, CÁDMIO,
CHUMBO E MERCÚRIO) EM PEIXE.
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos necessários para obtenção do título
de Mestre em Ciência e Tecnologia de
Alimentos, no Programa de Pós-Graduação
em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Orientador: Prof. DSc. Simone Lorena Quiterio de Souza
Co-orientador: Prof. DSc. Renata Santana Lorenzo Raices
Rio de Janeiro – RJ
2014
Ficha catalográfica elaborada por
Francielly Domingues Q. Pereira
Revisada por
Cintia dos Santos Madureira
CRB7 6613
S581
Silva, Tania dos Santos.
Desenvolvimento de métodos espectrométricos para
determinação de contaminantes inorgânicos (arsênio,
cádmio, chumbo e mercúrio) em peixe. / Tania dos Santos
Silva. – Rio de Janeiro, 2014.
89 f.: il. color. ; 21 cm.
Dissertação (Mestrado Profissional em Ciência e
Tecnologia de Alimentos) – IFRJ, 2014.
1.
Peixes – Baía de Sepetiba – Rio de Janeiro
(Município). 2. Peixes – Contaminação. I. Título.
IFRJ/CMAR/CoBib
CDU 636.98(815.3)
Tania dos Santos Silva
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS PARA
DETERMINAÇÃO DE CONTAMINANTES INORGÂNICOS (ARSÊNIO, CÁDMIO,
CHUMBO E MERCÚRIO) EM PEIXE.
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos necessários para obtenção do título
de Mestre em Ciência e Tecnologia de
Alimentos, no Programa de Pós-Graduação
em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Data de aprovação: 28 de julho de 2014.
___________________________________________________________
Prof. Dra. Simone Lorena Quitério (Orientador)
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro
___________________________________________________________
Prof. Dra. Renata Santana Lorenzo Raices (Co-orienatdora)
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro
___________________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Adam Conte Junior
Universidade Federal Fluminense
___________________________________________________________
Profa. Dra. Eliane Teixeira Mársico
Universidade Federal Fluminense
___________________________________________________________
Prof. Dr. Adriano Gomes da Cruz
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro – RJ
2014
Dedico este trabalho, com amor, aos meus
queridos pais, pois não mediram esforços para
me apoiar em mais este desafio.
AGRADECIMENTOS
A Deus por iluminar о meu caminho, pela força е coragem nesta longa caminhada,
sempre presente nas horas de angústia.
Ao Paulinho e à Aninha, simplesmente por existirem e tornarem minha vida completa.
Aos meus pais, Mário e Eliete, pela dedicação, incentivo e amor.
Aos meus irmãos, José Mário, Vânia, André e Andréa, por nutrirem por mim
sentimentos de orgulho e de admiração.
Ao meu marido Paulo Sérgio de Souza, companheiro, amigo, e incentivador.
As minhas orientadoras e agora amigas Dra. Simone Lorena, por terem seguido junto a
mim nesta caminhada, sempre com otimismo, paciência e compreensão e à Dra. Renata
Raices, pelo seu senso de organização, preciosas dicas e cuja experiência no assunto foi
fundamental.
Aos amigos de longa data do Laboratório de Físico-Química da Embrapa
Agroindústria de Alimentos, Carmine, Cristiane e José Manoel por estarmos juntos na alegria
e na tristeza.
Aos técnicos do Laboratório de Minerais, Simas, “doutor” em Espectrometria e
Juliana que realizou as análises, sempre com muito empenho, comprometimento e qualidade.
À Dra. Sidinéa Freitas, responsável técnica do Laboratório de Físico - Química e
Minerais da Embrapa Agroindústria de Alimentos.
A minha adorável amiga Adriana Minguita, que, com seu alto-astral, torna tudo bem
mais leve e fácil.
À Dra. Flávia, minha amiga, “irmã” e incentivadora por ter me conscientizado da
importância da pós-graduação.
Aos professores do Instituto, Lucinéia, Iracema, Luciana, Janaína e Eliezer pelos
conhecimentos transmitidos.
Ao professor Adriano Cruz, pelo apoio e amizade.
À Dra. Sonia Couri, que descobri ser uma amiga generosa.
À Dra. Regina Nogueira e ao Sergio Macedo, nosso querido “Filé”, pela utilização dos
equipamentos da planta piloto.
Ao funcionário do IFRJ, Luiz, pela sua gentileza e bom humor.
Às companheiras do mestrado, Amanda, Eliane, Ingrid, Juliana, Luciana, Norma,
Roberta e Taíssa pelos momentos tensos e divertidos e em especial a Elian, pela amizade
verdadeira que construímos.
Ao IFRJ, onde fiz o curso técnico e para onde retornei para fazer o mestrado.
A todos meus amigos, familiares que sempre torceram e confiaram em mim e que,
direta ou indiretamente, foram importantes pela realização deste trabalho.
SILVA, T. dos S. Desenvolvimento de métodos espectrométricos para determinação de
contaminantes inorgânicos (arsênio, cádmio, chumbo e mercúrio) em peixe. 90 p.
Dissertação. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Instituto
Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Campus Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, RJ, 2014.
RESUMO
A ingestão de alimentos ricos em nutrientes é um passo importante para manter um estilo de
vida saudável. Peixes e frutos do mar possuem características nutritivas, além de serem
apreciados por grande parte da população. Entretanto, estes alimentos podem representar
riscos à saúde se estiverem contaminados e os metais podem representar uma das fontes de
contaminação. Alguns deles são altamente tóxicos, mesmo em pequenas quantidades como
arsênio (As), cádmio (Cd), mercúrio (Hg) e chumbo (Pb). Portanto, para estas e outras
substâncias, existem limites máximos estabelecidos para evitar problemas graves de saúde e
garantir o comércio destes produtos brasileiros no mercado internacional. O objetivo deste
trabalho foi desenvolver métodos espectrométricos para determinação de contaminantes
inorgânicos (arsênio, cádmio, chumbo e mercúrio) em peixe e verificar a possível ocorrência
destes metais em uma espécie de peixe da Baía de Sepetiba, Rio de Janeiro, onde é frequente
seu consumo pela população local. As amostras foram liofilizadas e a quantificação de
arsênio, cádmio e chumbo foi feita em Espectrômetro de Emissão Ótica com Plasma
Indutivamente Acoplado (ICP-OES), sendo previamente digeridas com ácido nítrico
concentrado em forno micro-ondas. O mercúrio foi quantificado por espectrofotometria de
absorção atômica, com um método que dispensa o preparo prévio de amostras. Com as
condições adequadamente otimizadas, os métodos foram validados de acordo com o
documento orientativo do INMETRO (DOQ CGCRE 008). A avaliação dos parâmetros de
validação foi satisfatória e demonstrou que os métodos são capazes de quantificar os
elementos nas seguintes faixas: As de 0 a 400 ng g-1, Cd de 0 a 40 ng g-1, Pb de 0 a 120 ng g1e Hg 0 a 30 ng g-1. Na espécie escolhida para estudo foram encontrados valores que
variavam de 5,17 ng g-1 a 14,05 ng g-1 de Hg; 119,23 ng g-1 a 272,74 ng g-1 de As e 6,95 ng g-1
a 10,83 ng g-1 de Cd. Os teores de Pb encontrados estavam abaixo do limite de detecção do
método.
Palavras-chave: Peixe. Metais traço. Validação. Segurança Alimentar.
SILVA, T. dos S. Development of spectrometric methods for determination of inorganic
contaminants (arsenic, cadmium, lead and mercury) in fish. 90 p. Dissertation. Postgraduate
Program in Food Science and Technology, Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Campus Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, 2014.
ABSTRACT
The intake of foods rich in nutrients is an important decision to maintain a healthy lifestyle.
Fish and seafood have nutritional characteristics, and are appreciated by most of the
population. However, these foods can pose health risks if they are contaminated and metals
are one of the sources of contamination. Some of them are highly toxic even in small
quantities, such as arsenic (As), cadmium (Cd), mercury (Hg) and lead (Pb). Therefore, for
these and other substances, there are maximum limits to avoid health problems and ensure
trade of these Brazilian products in the international market. The objective of this work was to
develop spectrometric methods for determination of inorganic contaminants (arsenic,
cadmium, lead and mercury) in fish and to verify the possible occurrence of these metals in a
fish species from Bay Sepetiba, Rio de Janeiro and widely consumed by the local population.
Samples were lyophilized and quantification of arsenic, cadmium and lead was carried out in
Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy, being previously digested with
concentrated nitric acid in microwave oven. Mercury was quantified by atomic absorption, a
method which does not require the prior sample preparation. With the properly optimized
conditions, the methods were validated according to the guidance document of INMETRO
(DOQ CGCRE 008). Evaluation of validation parameters was satisfactory and showed the
methods are able to quantify the elements in the following ranges: As from 0 to 400 ng g-1, Cd
from 0 to 40 ng g-1, Pb from 0 to 120 ng g-1e Hg from 0 to 30 ng g-1. In species chosen for
study, were found values from 5,17 ng g-1 to 14.05 ng g-1 for Hg; 119.23 ng g-1 to 272.74 ng
g-1 for As and 6.95 ng g-1 a 10.83 ng g-1 for Cd. Levels of Pb were below the limit of detection
of the method.
Keywords: Fish. Trace metals. Validation. Food Safety
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
As
Arsênio
CCα
Limite de decisão
CCβ
Capacidade de Decisão
Cd
Cádmio
CEAGESP
Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo
Cr
Cromo
CRM
Certified Reference Material (material de referência certificado)
CONSEA
Conselho Nacional de Segurança Alimentar e Nutricional
CV
Coeficiente de variação
DMAA
Ácido dimetilarsínico
DOQ-CGCRE Documento orientativo – Coordenação Geral de Acreditação
DPR
Desvio Padrão Relativo
EMBRAPA
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EPA
Environmental Protection Agency – Agência de Proteção Ambiental
Americana
FAO
Food and Agriculture Organization of the United Nations – Organização de
Agricultura e Alimentos das Nações Unidas.
FDA
Food and Drug Administration – Administração Federal de Alimentos e
Medicamentos
FIPERJ
Fundação Instituto de Pesca do Estado do Rio Janeiro
Hg
mercúrio
ICP-OES
Inductively Coupled Plasma - Optical Emission Spectrometry - Espectrometria
de Emissão Ótica por Plasma Indutivamente Acoplado
ICP-MS
Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry - Espectrometria de Massas
por Plasma Indutivamente Acoplado
INEA
Instituto Estadual do Ambiente
INMETRO
Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
Kg
Quilograma
LD
Limite de Detecção
LQ
Limite de Quantificação
LMR
Limite Máximo de Resíduos
MAPA
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MMAA
Ácido metilarsônico
MERCOSUL Mercado Comum do Sul
mg
Miligrama
mL
Mililitro
Mn
Manganês
Pb
Chumbo
PNCRC
Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes
OIE
World Organisation for Animal Health) Organização Mundial para Saúde
Animal
OMC
Organização Mundial do Comércio
SAN
Segurança Alimentar Nacional
Se
Selênio
SPS
Sanitary and Phitosanitary Agreement Acordo Sanitário e Fitossanitário
VIM
International Vocabulary of Metrology - Vocabuário Internacional de
Metrologia
WHO
World Health Organization – Organização Mundial de Saúde
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1
Compostos de arsênio. Adaptado de HUGHES et al, 2011
24
Figura 2.2
Estrutura da arsenobetaína
26
Figura 2.3
Regiões Hidrográficas do Estado do Rio de Janeiro
46
Figura 3.1
Etapas de preparo da amostra
50
Figura 3.2
Fluxograma das etapas do preparo de amostra
51
Figura 3.3
Forno micro - ondas
53
Figura 3.4
ICP – OES utilizado para quantificação dos metais As, Cd e Pb
53
Figura 3.5
Analisador de Mercúrio Hydra C Teledyne
54
Figura 3.6
Diagrama de Ishigawa das incertezas para curvas de calibração
59
Figura 4.1
Curva analítica X curva de adição padrão do As
62
Figura 4.2
Curva analítica X curva de adição padrão do Cd.
63
Figura 4.3
Curva analítica X curva de adição padrão do Pb.
63
Figura 4.4
Curva analítica X curva de adição padrão do Hg.
63
Figura 4.5
Contribuição de cada fator para As
67
Figura 4.6
Contribuição de cada fator para Cd
67
Figura 4.7
Contribuição de cada fator para Pb
68
Figura 4.8
Contribuição de cada fator para Hg
68
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1
Limites máximos permitidos pelo MAPA
20
Tabela 2.2
Critérios de aceitação de recuperação (MAPA, 2011)
44
Tabela 2.3
Critérios de Aceitação da Precisão (MAPA, 2011)
44
Tabela 3.1
Faixas de concentração para As, Cd e Pb.
49
Tabela 3.2
Faixas de massas para Hg.
49
Tabela 3.3
Considerações para construção das curvas de calibração
49
Tabela 3.4
Condições de operação do ICP-OES
55
Tabela 3.5
Condições de análise do Analisador de Mercúrio.
56
Tabela 3.6
Condições de operação do micro-ondas.
56
Tabela 3.7
Dados utilizados nos cálculos de incerteza
60
Tabela 3.8
Faixas de concentrações/massas para avaliação de recuperação.
60
Tabela 4.1
Valores do teste de Cochran calculados para cada elemento.
64
Tabela 4.2
Resultados do teste t pareado
64
Tabela 4.3
Valores de R2 para as curvas de calibração.
65
Tabela 4.4
Resultados LQ e LD para os elementos estudados (ng g-1)
65
Tabela 4.5
Resultados de CCα, CCβ e incerteza para As, Cd e Pb e Hg,
66
Tabela 4.6
Resultados da incerteza
66
Tabela 4.7
Recuperação As (conc = ng g-1)
69
Tabela 4.8
Recuperação Cd (conc = ng g-1)
69
Tabela 4.9
Recuperação Pb (conc = ng g-1)
70
Tabela 4.10
Recuperação Hg (ng)
70
Tabela 4.11
Resultados de Hg, As e Cd em pescadinha.
71
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 2.1
y = ax+b
39
Equação 2.2
𝐺=
Equação 2.3
C = ∑kmax2 .
40
Equação 2.4
𝐿𝐷 = 𝑥̅ + 𝑡(𝑛−1,1−𝛼) 𝑠
40
Equação 2.5
𝐿𝑄 = 𝑥 + 10𝑠
40
Equação 2.6
CCα = LMR + 1,64 × s𝑟𝑒𝑝𝑟𝑜𝐿𝑀𝑅
42
Equação 2.7
CCβ = LMR + 3,28 × s𝑟𝑒𝑝𝑟𝑜𝐿𝑀𝑅
42
Equação 2.8
Recuperação = (
Equação 2.9
Recuperação(%) =
Equação 2.10
CV(%) =
Equação 3.1
𝑡=
𝑥𝑖 −𝑥̅
39
𝑠
s2
i=1 s
valor encontrado
s
x̅
valor esperado
C1 −C2
C3
) × 100
× 100
× 100
|𝑑𝑚1 −𝑑𝑚2 |
42
42
42
57
2 ( 1 − 1 )
𝑠𝑝
√ 𝑛
𝑔1 𝑛𝑔2
Equação 3.2
𝑠𝑝2 =
𝑆𝑄𝑑1+𝑆𝑄𝑑2
𝑛𝐺1 +𝑛𝐺2
2
2
2 + 𝑢2
Equação 3.3 𝑢(𝐶𝑎𝑛𝑎𝑙 ) = √𝑢𝑚
𝑟𝑒𝑝𝑒 + 𝑢𝑑𝑖𝑙 + 𝑢𝑐𝑎𝑙 57
59
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
19
2.1 QUALIDADE E SEGURANÇA ALIMENTAR
19
2.2 PESCADO: NUTRIENTES X CONTAMINANTES
19
2.3 IMPLICAÇÕES DA PRESENÇA ALGUNS METAIS TÓXICOS NO ORGANISMO E
NO AMBIENTE
23
2.2.1 Arsênio (As)
24
2.2.1.1 Exposição
24
2.2.1.2 Efeitos no organismo e toxicocinética
25
2.2.2 Cádmio (Cd)
26
2.2.2.1 Exposição
27
2.2.2.2 Efeitos no organismo e toxicocinética
27
2.2.3 Chumbo (Pb)
28
2.2.3.1 Exposição
28
2.2.3.2 Efeitos no organismo e toxicocinética
29
2.2.4 Mercúrio
29
2.2.4.1 Exposição
30
2.2.4.2 Efeitos no organismo e toxicocinética
30
2.3 BIOACUMULAÇÃO E BIOMAGNIFICAÇÃO
31
2.4 TÉCNICAS DE ANÁLISE
31
2.4.1 Espectrometria de Emissão e Absorção Atômica
32
2.4.2 Preparo de amostras
33
2.4.3 Quantificação de mercúrio
34
2.5 VALIDAÇÃO
35
2.5.1 Seletividade
38
2.5.2 Linearidade
39
2.5.3 Faixa de trabalho e Faixa linear
40
2.5.4 Limite de Detecção (LD)
41
2.5.5 Limite de Quantificação (LQ)
41
2.5.6 Limite de Decisão e Capacidade de Detecção
42
2.5.7 Exatidão
43
2.5.7 1 Recuperação
43
2.5.7 2 Precisão
43
2.6 ÁREA DA REGIÃO DE SEPETIBA
45
3 MATERIAL E MÉTODOS
48
3.1 AMOSTRAS
48
3.2 REAGENTES E SOLUÇÕES ANALÍTICAS
48
3.3 PREPARO DAS CURVAS DE CALIBRAÇÃO
48
3.4 PREPARO DA AMOSTRA
49
3.5 PROCEDIMENTO ANALÍTICO
54
3.6 VALIDAÇÃO DOS MÉTODOS
56
3.6.1 Seletividade/Efeito Matriz
56
3.6.2 Linearidade
57
3.6.3 Limite de Detecção (LD)
58
3.6.4 Limite de Quantificação (LQ)
58
3.6.5 Limite de Decisão, Capacidade de Detecção e Incerteza
58
3.6.6 Exatidão
60
3.6.6 1 Recuperação
60
3.6.6 2 Repetitividade e Precisão intermediária.
61
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
62
4.1 OUTLIERS
62
4.2 HOMOCEDASTICIDADE
62
4.3 SELETIVIDADE/EFEITO MATRIZ
64
4.4 LINEARIDADE
64
4.5 LIMITE DE DETECÇÃO (LD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LQ)
65
4.6 LIMITE DE DECISÃO, CAPACIDADE DE DETECÇÃO E INCERTEZA
65
4.7 EXATIDÃO
69
4.5.1 Recuperação/Precisão
69
4.6 RESULTADOS DA ANÁLISE DE PESCADO
71
5 CONCLUSÃO
72
REFERÊNCIAS
73
ANEXOS
87
1 INTRODUÇÃO
O peixe é um alimento que sempre fez parte da dieta humana. São ricos em proteínas,
vitaminas, sais minerais e, no caso de algumas espécies, ricas também em ômega 3. Se por um
lado o consumo traz benefícios à saúde, por outro, podem ser fonte de contaminação devido à
possível presença de substâncias nocivas (GUÉRIN et al., 2011). Chumbo, cádmio, arsênio e
mercúrio são metais altamente tóxicos que podem estar presentes como contaminantes e cujas
origens podem ter causas geológicas, naturais ou, principalmente, resultantes de atividades
humanas (BANDOWE et al., 2014; LOPES, 2009).
Uma das principais fontes de exposição humana a metais traço é a ingestão de
alimentos (BRAGA et al., 2005; IKEM e EGIEBOR, 2005). Desta forma, é imprescindível
adotar medidas para garantir que alimentos de qualidade cheguem à população, sendo
fundamental intensificar a fiscalização e o controle de qualidade.
Para atender às questões internas de segurança alimentar e, principalmente, garantir a
entrada dos produtos brasileiros no mercado internacional, um rigoroso controle de qualidade
se faz necessário. Alguns acordos foram estabelecidos para garantir o comércio internacional
de produtos pelos países membros da Organização Mundial do Comércio. Uma destas
medidas é o Sanitary and Phitosanitary Agreement (SPS). Segundo Miranda et al. (2004),
este acordo estabelece o direito de os países adotarem medidas sanitárias e fitossanitárias
necessárias para a proteção de qualquer forma de vida e que estejam em consonância com os
princípios do Acordo.
No Brasil, os processos que envolvem a produção, a qualidade, a segurança e a
inocuidade dos alimentos são fiscalizados pelo Plano Nacional de Controle de Resíduos e
Contaminantes – PNCRC. Dentre outros objetivos, está o de garantir que a eventual presença
de substâncias que trazem riscos a saúde em caso de ingestão esteja em níveis equivalentes
aqueles estabelecidos por organismos internacionais como Codex Alimentarius, FAO (Food
and Agriculture Organization), MERCOSUL (Mercado Comum do Sul), OIE (World
Organisation for Animal Health), OMC (Organização Mundial do Comércio), e WHO (World
Health Organization) (MAPA, 2013).
Este
trabalho
tem
como
objetivo
geral
o
desenvolvimento
de
métodos
espectrométricos para determinação de contaminantes inorgânicos (arsênio, cádmio, chumbo
e mercúrio) em peixe.
16
Como objetivos específicos, pode-se destacar:
a) Estabelecer os métodos de preparo adequados;
b) Estabelecer métodos de quantificação adequados;
c) Validar os métodos pelos critérios do INMETRO;
d) Quantificar As, Cd, Hg e Pb em exemplares de “pescadinha perna de moça”
(Cynoscion leiarchus).
O trabalho realizado será apresentado em três capítulos, a saber:
O primeiro capítulo apresenta a revisão bibliográfica, destacando-se a qualidade e a
segurança alimentar, os aspectos gerais relacionados aos nutrientes e contaminantes,
exposição, efeitos no organismo e no ambiente e toxicocinética dos metais tóxicos estudados
(As, Cd, Pb e Hg), técnicas de análise e instrumentos para validação do método.
No segundo capítulo são descritas as características do local onde estas espécies
podem ser encontradas, a etapa de tratamento das amostras e as análises para verificação dos
parâmetros de validação: seletividade, efeito matriz, linearidade, limite de detecção (LD)
e limite de quantificação (LQ) e exatidão (repetitividade, precisão e precisão
intermediária) dos métodos.
No terceiro capítulo, os resultados relativos à validação do método são apresentados e
discutidos, bem como a análise de amostras de uma espécie comercializada no Rio de Janeiro.
Finalmente, são apresentadas as conclusões do trabalho.
17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 QUALIDADE E SEGURANÇA ALIMENTAR
A alimentação é um importante aliado na manutenção da saúde e na diminuição do
risco de doenças, constituindo, na maioria das vezes, também, fonte de prazer para os
consumidores (WILCOCK et al., 2004).
Uma das expectativas em relação aos alimentos diz respeito à confiabilidade, garantia
de origem, segurança e controle de riscos (NITZKE, 2012).
Portanto, é importante que sejam desenvolvidas ações de segurança alimentar, como a
SAN (Segurança Alimentar Nacional), que estabelece um conjunto de ações planejadas e
sustentáveis com vistas a garantir a oferta e o acesso de alimentos para a população em todo o
território nacional, promovendo nutrição e saúde, isto é, o direito humano à alimentação
adequada. As políticas de segurança alimentar envolvem questões relacionadas aos riscos
associados à ingestão de alimentos, sejam eles químicos, físicos ou biológicos que podem
causar prejuízos à saúde ou mesmo a morte de indivíduos.
Existem ainda as questões relacionadas ao mercado internacional cujas leis rigorosas
podem inviabilizar o comércio de determinados produtos. Ações conjuntas de fiscalização e
controle são essenciais, a fim de se estabelecer procedimentos em prol da saúde da população.
A garantia da qualidade dos produtos alimentares vem tendo cada vez mais atenção de
empresas, governos, organizações de comércio e de padrões internacionais (CASSWELL,
1998).
Desta forma, torna-se pertinente e realização de estudos que avaliem a qualidade e a
segurança dos alimentos a serem comercializados e consumidos.
2.2 PESCADO: NUTRIENTES X CONTAMINANTES
Peixes e outros frutos do mar são importantes fontes de vitaminas, minerais, proteína
de alta qualidade, ômega-3 e ácidos graxos poli-insaturados. A ingestão proporciona diversos
benefícios para a saúde humana, portanto, é recomendada como forma de diminuir o risco de
doenças cardiovasculares e derrames, diminuir os níveis de triglicerídeos e colesterol total,
além de ter ação anti-inflamatória (COPAT et al., 2012; RAHMAN et al., 2012). Os frutos do
mar (que incluem moluscos, crustáceos e todos os tipos de peixes ósseos) auxiliam no
18
controle de peso e no desenvolvimento cognitivo infantil. O consumo frequente de peixes e
frutos do mar tem sido associado à redução do risco de desenvolvimento de doença arterial
coronariana, alguns tipos de câncer, artrite reumatóide e outras doenças inflamatórias
(MACIEL et al., 2014; LUND, 2013; SWANSON e MOUSA, 2012; MOZAFFARIAN e
WU, 2011; DOMINGO, 2007; CAHU et al., 2004). Estes benefícios estimulam ainda mais o
consumo destes alimentos.
Segundo dados da FAO (2012), em 2010, a pesca mundial de captura e a aquicultura
produziram juntas cerca de 148 milhões de toneladas de peixe, das quais, aproximadamente
128 milhões foram destinadas ao consumo humano. Avaliações preliminares indicaram que
estes números aumentaram em 2011 para 154 milhões de toneladas e 131 milhões de
toneladas, respectivamente. Esta notável demanda leva a uma preocupação com as questões
relacionadas à segurança alimentar e com a necessidade de se estabelecer procedimentos e
medidas que minimizem os riscos da ingestão de alimentos desta natureza, uma vez que no
ambiente, onde são encontrados, pode haver a presença de poluentes. Alguns exemplos dos
principais poluentes aquáticos são: orgânicos biodegradáveis, orgânicos refratários,
organismos patogênicos, excesso de nutrientes e metais (BANDOWE et al., 2014; BRAGA et
al.,2005).
Elementos como sódio, cálcio, potássio, ferro, zinco e magnésio, em quantidades
adequadas são importantes para o desempenho das funções fisiológicas, enquanto outros,
como chumbo, cádmio, arsênio, mercúrio e prata podem ser prejudiciais à saúde dos
organismos vivos (KHAN et al., 2014a; TÜRKMEN et al., 2008; IKEM e EGIEBOR, 2005).
Qualquer substância que tenha a capacidade de causar danos aos organismos vivos é
chamada de substância tóxica. Muitas vezes, os metais tóxicos são chamados “metais
pesados”. Esta terminologia, apesar de amplamente utilizada, é obsoleta e refere-se,
erroneamente, a toxicidade do metal, e, algumas vezes, a elementos químicos que não
possuem características metálicas (NORDBERG, 2009a).
Encontram-se, naturalmente, quantidades muito baixas de metais no meio aquático. As
concentrações podem ser oneradas de forma significativa devido às atividades industriais,
agrícolas, de mineração, de transporte, incineração, queima de biomassa, destinação
inadequada dos resíduos e efluentes e deposição atmosférica (OLMEDO et al., 2013;
DJEDJIBEGOVIC et al., 2012; BRAGA et al.,2005).
No ambiente aquático, os metais tóxicos, podem prejudicar a diversidade das espécies
e os ecossistemas, devido a sua toxicidade, persistência e comportamento acumulativo e desta
19
forma, podem ocasionar problemas de saúde. A preocupação acerca deste assunto é
mundialmente crescente, especialmente os países em desenvolvimento, visto que a
determinação das concentrações destes contaminantes permite avaliar os riscos potenciais aos
quais a população está exposta, principalmente através da alimentação (RAHMAN et al.,
2012).
No Brasil, o Ministério da Agricultura através do Plano Nacional de Controle de
Resíduos Biológicos em Produtos de Origem Animal elaborado pelo Ministério da
Agricultura Pecuária e Abastecimento estabelece limites de contaminantes em vários itens
como leite, carnes, ovos, mel e pescado (Limite Máximo de Resíduos – LMR). Hg, As, Pb e
Cd são denominados pelo MAPA contaminantes inorgânicos. A tabela 2.1 mostra os LMRs
para contaminantes inorgânicos em pescado para 2013:
Tabela 2.1 Limites máximos permitidos pelo MAPA
Contaminante
Limite máximo (µg kg-1)
Peixe de captura
Peixe de cultivo
Mercúrio
1000
500
Arsênio
1000
1000
Cádmio
100
50
Chumbo
300
300
Fonte: MAPA, 2013a
Em ambientes aquáticos, metais traço como As, Cd, Pb e Hg estão amplamente
distribuídos e o grau de contaminação em tecidos de peixes pode ser influenciada pelos
seguintes fatores: localização geográfica, espécie e tamanho do pescado, local de amostragem,
nível trófico, padrões alimentares, tipo de poluente, solubilidade dos produtos químicos e
persistência no ambiente (KEVAN, 1999).
Morgano et al. (2007) determinaram o teor de Hg total em 257 amostras de pescado da
cadeia produtiva da Baixada Santista, São Paulo. A concentração de mercúrio total encontrada
variou de 0,166 a 0,878 mg kg-1. Foram avaliadas 42 amostras de pescada (família
Sciaenidae), a concentração média foi de 0,094 mg kg-1, sendo esta inferior ao valor permitido
pelo MAPA.
20
Morgano et al. (2011) determinaram a concentração de arsênio total, cádmio, cromo,
chumbo e mercúrio total em 240 amostras das espécies de peixes pescada (Macrodon
ancylodon), tainha (Mugil liza), corvina (Micropogonias furnieri) e sardinha (Sardinella
brasiliensis). Estas foram adquiridas no comércio atacadista da Companhia de Entrepostos e
Armazéns Gerais de São Paulo (CEAGESP). Foram obtidas as seguintes faixas de
concentração em mg kg-1: As total (<0,1-8,63); Cd (<0,01-0,287); Cr (<0,02-0,44); Pb (<0,022,92) e Hg total (<0,002-0,285). Foram encontrados em maior concentração As e Cr na
sardinha e na corvina. Segundo a legislação brasileira (ANVISA, Portaria 685 de 27/08/1998),
os limites máximos permitidos (1 e 0,1 mg kg-1) foram ultrapassados em 67% e 7%,
respectivamente. Tal estudo comprova a ocorrência de contaminação por estes metais nas
espécies de pescada, tainha, corvina e sardinha. O maior índice de arsênio foi detectado na
espécie sardinha. Na corvina, os contaminantes As, Cr e Pb foram encontrados em teores mais
elevados no período de inverno do que na época de verão.
Ferreira et al.(2012) avaliaram a concentração de mercúrio em 315 amostras de
pescado marinho de elevado consumo obtidos durantes três anos em frotas pesqueiras de
diversos estados brasileiros. Os maiores teores médios de Hg foram observados nas amostras
de Meca (Xiphias gladius) (0,393 μg g-1), seguido pela raia (Pteroplatytrygon violácea)
(0,224 μg g-1), atum in natura (Thunnus albacares) (0,187 μg g-1), atum em conserva
(Thunnus sp) (0,169 μg g-1), corvina (Micropogonias furnieri) (0,124 μg g-1), peixe-espada
(Thichiurus lepturus) (0,078 μg g-1) e camarão (Litopenaeus vannamei) (0,058 μg g-1).
Constatou-se que 2,4% das amostras de Meca (n=83), ultrapassaram o limite máximo
recomendado para peixes predadores (1,0 μg g-1) pela legislação nacional (ANISA) e
internacional (FDA). Tal espécie é conhecida na literatura por acumular Hg, é uma espécie
predadora (maior taxa de absorção e menor de excreção), que ocupa o topo da cadeia trófica,
podendo acumular maiores concentrações de Hg. Entretanto, tal nível de acumulação está
relacionado com o local onde habita, dependendo assim possivelmente da quantidade e tipo
de
alimento
disponível
na
região,
bem
como
seu
metabolismo,
contribuindo
significativamente para a acumulação de Hg nos tecidos e a biomagnificação no decorrer da
cadeia trófica (BRANCO et al., 2007; DAMIANO et al., 2011). Este é considerado um dos
meios mais importantes de exposição a contaminantes para os predadores, indo da fonte para
o consumidor (KEHRIG et al., 2009; HOPKINS et al., 2005). A espécie demonstra ser um
bioindicador de poluição de ecossistemas (BRANCO et al., 2007; DAMIANO et al., 2011).
21
Medeiros et al. (2012) analisou e avaliou as concentrações de alumínio, zinco, ferro,
manganês, cobalto, cobre, arsênio, selênio, cádmio, bário, chumbo e bismuto em 11 espécies
de peixes (Salmo salar, Sardinella brasiliensis, Pomatomus saltatrix, Micropogonias furnieri,
Cynoscion leiarchus, crysos Caranx, Priacanthus arenatus, Mugil cephalus, Genypterus
brasiliensis, Lopholatilus villarii e Pseudopercis numida) capturados na costa do Rio de
Janeiro. As concentrações de alumínio foram significativamente maiores em todas as
amostras e somente M. cephalus, C. leiarchus e C. crysos apresentaram concentrações de
arsênio abaixo de 1 mg kg-1, limite recomendado pela legislação brasileira (ANVISA).
Kosanovic et al. (2007), detectaram um aumento da concentração de cromo,
manganês, cobalto, cobre, zinco, arsênio, cádmio, mercúrio e chumbo na espécie Red-spot
(Lethrinus lentjan), na região do Golfo Pérsico, embora os valores não tenham ultrapassado o
valor permitido pela legislação (FAO), tal aumento é oriundo da crescente urbanização e
industrialização.
Leung et al. (2014), analisaram 11 espécies de pescado (711 amostras) no Pearl River
Delta (China) e detectaram as seguintes faixas de concentração (mg kg-1, peso seco): As
(0,03–1,53), Pb (0,03–8,62), Cd (0,02–0,06), Ni (0,44–9,75), Zn (15,7–29,5), Cr (0,22–0,65),
Cu (0,79–2,26), Mn (0,82–6,91). Concentrações de chumbo significativamente altas foram
encontradas na espécie tilápia (Oreochromis mossambicus), ultrapassando o limite
estabelecido pela União Européia (0,4 mg kg-1).
2.3 IMPLICAÇÕES DA PRESENÇA ALGUNS METAIS TÓXICOS NO ORGANISMO E
NO AMBIENTE
Muitos elementos químicos, apesar de essenciais para os organismos vivos, podem vir
a ser tóxicos, caso a ingestão exceda os níveis considerados seguros. Cromo, cobre e zinco,
por exemplo, são considerados micronutrientes essenciais ao metabolismo dos organismos
vivos. Entretanto, seu déficit pode provocar doenças ou disfunções e o excesso, intoxicações
(VIRGA et al., 2007).
Esta ingestão pode ocorrer de diversas formas (TÜRKMEN et al., 2008). Vegetais
cultivados em solos contaminados por estes elementos podem absorvê-los através de suas
raízes. Também existe a possibilidade de serem depositados em suas folhas ou ainda,
utilização de água de irrigação contaminada (BANDOWE et al., 2014). Alimentos de origem
22
animal, por sua vez, são atingidos ao se alimentarem de animais, vegetais ou água
eventualmente contaminados (MILLER, 2010).
Arsênio, cádmio, chumbo e mercúrio fazem parte de um grupo de substâncias cujos
riscos estão cientificamente comprovados e afetam negativamente a saúde e o ambiente
(BANDOWE et al., 2014; DJEDJIBEGOVIC et al., 2012; WHO, 2010a).
Uma das consequências mais negativas do processo de poluição do ambiente aquático
diz respeito acumulação de metais tóxicos, pelos organismos vivos (KHANSARIA, GHAZIKHANSARIA e ABDOLLAHIC, 2005; LIMA JUNIOR, 2002), pois isto pode ter duas
consequências: a bioacumulação, um acúmulo de metais a partir da alimentação e a
biomagnificação, a acumulação e absorção direta, indireta que ocorre através da cadeia
trófica. Os peixes predadores localizados no topo da cadeia alimentar apresentam as maiores
concentrações de mercúrio em seus tecidos (KEHRIG et al., 2009).
2.2.1 Arsênio (As)
O arsênio é um elemento natural amplamente distribuído na crosta da Terra, presente
em muitos tipos de rocha. Pode atingir o ar, a água e o solo levado pelo vento ou pelos
processos de lixiviação e escoamento. Erupções vulcânicas e atividades antropogênicas como
mineração, fundição e atividades em usinas de energia movidas a carvão também são
responsáveis pela entrada do arsênio no ambiente. Embora não seja destruído, a forma como
se apresenta no ambiente, pode ser modificada, pela reação com o oxigênio e outras
moléculas ou pela ação de bactérias presentes no ar, na água e no solo. É comum encontrá-lo
combinado com outros elementos como oxigênio, cloro e enxofre formando compostos
inorgânicos ou ligado ao carbono e hidrogênio, formando compostos orgânicos (ATSDR,
2007a). Até o fim do século XX, a forma inorgânica deste elemento foi utilizada na produção
de herbicidas, inseticidas e fungicidas por países desenvolvidos. Alguns países em
desenvolvimento ainda o utilizam para este fim (SAOUDI et al., 2012). Atualmente, a
principal utilização é na produção de preservativos de madeira, elementos formadores de ligas
e em processamentos industriais de vidros, pigmentos, produtos têxteis, papel, adesivos,
metais e munições (WHO, 2012).
2.2.1.1 Exposição
23
O organismo está exposto a pequenas quantidades por inalação ou por ingestão de
água e alimentos contaminados e fumaça de tabaco, porém, a forma mais comum de
exposição humana é a dieta e os principais alimentos através dos quais é possível ingerir a
forma inorgânica são o arroz, farinhas e mariscos (ATSDRa, 2007). É possível também a
presença em sucos e vinho devido ao de pesticidas contendo arsênio em sua formulação, e que
podem ter sido utilizados nas culturas das uvas. A ingestão de compostos orgânicos de arsênio
ocorre, principalmente através dos frutos do mar, uma vez que os organismos marinhos têm a
capacidade de transformar o arsênio inorgânico presente na água em compostos menos
tóxicos (RONKART et al., 2013).
2.2.1.2 Efeitos no organismo e toxicocinética
As características físico-químicas, a toxicidade e a biodisponibilidade variam de
acordo com as espécies químicas formadas pelo arsênio (SANTRA et al., 2013).
Embora se apresente sob diversas formas e valências, os estados de oxidação que são
encontrados no ambiente e aos quais os seres humanos são expostos mais relevantes são As3+
(arsenito) e As5+ (arseniato). Os compostos trivalentes são os de maior potencial tóxico
(HUGHES et al., 2011) e não existem efeitos benéficos conhecidos destas formas (ROSE
et.al, 2007). A figura 2.1 mostra algumas estruturas de compostos de importância ambiental.
Figura 2.1 Compostos de arsênio. Adaptado de HUGHES et al, 2011
A arsenobetaína (figura 2.2), encontrada em organismos marinhos, também é
considerada não tóxica (RONKART et al., 2013).
24
Figura 2.2 Estrutura da arsenobetaína
Os organismos marinhos são capazes de converter biologicamente a metilação do
arsenito e arseniato em compostos de menor toxicidade, tais como o ácido metilarsônico
(MMAA) e ácido dimetilarsínico (DMAA).
Inúmeros problemas de saúde podem estar associados à ingestão ou inalação. Este
elemento pode levar ao desenvolvimento de carcinoma e outras lesões malignas. A exposição
crônica ao arsênio pode causar doenças respiratórias, gastrointestinais, hematológicas,
cardiovasculares, hepáticas, neurológicas e diabetes. Vegetais cultivados com água
subterrânea contaminada podem onerar em muitas vezes a ingestão diária de arsênio
(SANTRA et al., 2013).
Dentre todos os organismos vivos, em geral a concentração de arsênio costuma ser
maior em organismos marinhos (KUNIYOSHI, BRAGA e FAVARO, 2011).
Estudos acerca da toxicocinética do arsênio inorgânico em humanos revelaram que
ambas as formas (As+3 e As+5) são bem absorvidas por via oral e por inalação. O As+3 sofre
oxidação pelas enzimas hepáticas e, posterior metilação, formando MMA e DMA. A maior
parte do arsênio absorvido é excretada pela urina em uma mistura de vários metabólitos e
formas não metiladas. Pequenas quantidades são excretadas nas fezes e uma parte pode
permanecer ligada aos tecidos. Embora existam poucas informações disponíveis sobre a
toxicocinética das formas orgânicas, sabe-se que são bem absorvidas e rapidamente
excretadas na urina e nas fezes e não são convertidas para formas inorgânicas (ATSDR,
2007).
2.2.2 Cádmio (Cd)
O cádmio é encontrado na crosta terrestre associado a minérios de zinco, chumbo e
cobre. A sua presença no ambiente também pode ser resultado de atividades industriais ou
agrícolas. É utilizado na fabricação de baterias, pigmentos, revestimentos e ligas não ferrosas,
dentre outras. Estas atividades podem emiti-lo para a água, o solo e o ar, e se acumularem nos
organismos aquáticos e nas culturas agrícolas. Está presente no ar, como partículas ou vapores
25
de cloretos, sulfatos e óxidos e desta forma, se deposita no solo e nas superfícies das águas.
Tem capacidade de se ligar fortemente à matéria orgânica no solo, o que lhe confere
imobilidade, e assim pode ser absorvido pelas plantas. Os níveis de cádmio no ambiente
variam devido a estas características de transporte (ATSDR, 2012).
2.2.2.1 Exposição
A absorção pelo organismo pode ocorrer de várias formas: inalação, ingestão e
dérmica. Na absorção por inalação, as partículas em suspensão, dependendo do tamanho,
podem ser depositadas nos pulmões, nas vias aéreas superiores ou até penetrar nos alvéolos.
Os prejuízos causados nos organismos expostos a cádmio ou a seus compostos dependem de
diversos fatores, que incluem a dose, o tempo e a forma de exposição, idade, sexo e estado de
saúde (ATSDR, 2012).
O cádmio contamina o solo, a água e o ar através de atividades mineradoras, refino,
fabricação e aplicação de fertilizantes fosfatados, queima de combustíveis fósseis, e
incineração de resíduos e disposição, podendo assim, se acumular nos organismos aquáticos e
nas culturas agrícolas. Os alimentos como moluscos, crustáceos e vísceras de mamíferos
marinhos são ricos em cádmio e desta forma, constituem as principais fonte de exposição
(STORELLI, 2011). Consequentemente, a exposição humana a esta substância pode se dar
pelos meios expostos acima, bem como pela exposição ocupacional (ATSDR, 2012).
2.2.2.2 Efeitos no organismo e toxicocinética
O cádmio foi descoberto em 1817 e os seus malefícios tiveram os primeiros registros
em 1858, quando foi observado que pessoas que manipularam produtos contendo este
elemento na composição apresentaram problemas respiratórios e gastrointestinais. Os estudos
toxicológicos iniciaram-se em 1919 e, ao longo dos anos, foram observados também
problemas ósseos e renais (NORDBERG, 2009b).
A ingestão prolongada constitui um fator importante para o desenvolvimento da
doença de itai itai. Este distúrbio é caracterizado por causar fraturas ósseas e disfunções
renais, principalmente em mulheres de meia idade e idosos, sendo relatada pela primeira vez
em 1955 (NOGAWA e SUWAZONO, 2011; INABA et al., 2005). Os rins são os órgãos mais
afetados pela toxicidade do cádmio que pode levar a uma instabilidade genômica e
26
desencadear várias doenças. Sua função biológica é desconhecida (TEMPLETON e LIU,
2010; FILIPIĈ, 2012). Pulmões, fígado e os sistemas cardiovascular, reprodutivo e
imunológico também podem ser afetados (FOWLER, 2009). Animais de laboratórios
apresentaram danos na garganta e na cavidade nasal, problemas renais, anemia, doença
hepática, danos cerebrais e neurológicos, após serem submetidos ao cádmio por inalação ou
ingestão oral (ATSDR, 2012).
Grande parte do cádmio absorvido vai para o rim e fígado e a eliminação de uma
pequena quantidade se dá lentamente pela urina e pelas fezes. O organismo tende a fazer
conversão para uma forma menos prejudicial, desde que não seja uma quantidade
demasiadamente elevada, para que não haja sobrecarga do rim e do fígado (ATSDR, 2012).
O nível de ingestão considerado seguro pela FAO e pela OMS é de 70 microgramas
por dia. Estima-se que as quantidades diárias ingeridas, em condições normais, sejam de 30
microgramas por dia (MILLER, 2010).
2.2.3 Chumbo (Pb)
O chumbo é um elemento natural na crosta terrestre e geralmente se apresenta sob a
forma de compostos, combinados com outros elementos. Suas propriedades físico-químicas
como maciez, baixo ponto de fusão e resistência à corrosão, são convenientes para a
utilização em diversos setores industriais, o que contribuiu para o aumento da presença de
chumbo livre nos sistemas biológicos e no ambiente (FLORA, GUPTA, e TIWARI, 2012).
As quantidades encontradas na natureza vêm aumentando bastante ao longo de três séculos,
devido às atividades antrópicas. Este aumento foi mais intenso entre os anos 1950 e 2000
devido ao uso de gasolina aditivada contendo compostos de chumbo (ATSDR, 2007b).
2.2.3.1 Exposição
A principal via de absorção é pela via oral e respiratória. Uma das formas de
exposição é a ingestão de água contaminada, e alimentos, tais como, hortaliças cultivadas em
solos contaminados (ATSDR, 2007b). Normalmente, a concentração presente em alimentos é
naturalmente pequena, porém existe também a possibilidade de serem contaminados pelas
latas de acondicionamento às quais foram eventualmente soldadas com chumbo (MILLER,
2010).
27
2.2.3.2 Efeitos no organismo e toxicocinética
Os problemas de saúde podem ser desencadeados quando quantidades maiores que 0,5
µg mL-1 entram na corrente sanguínea e pode se acumular na medula óssea. As fontes de
exposição mais comuns são as emissões industriais, gases de exaustão de automóveis e
vegetais de folhas grandes, que podem ter sido contaminados ao serem cultivados em áreas
cujo solo contém este elemento (OYMAK et al., 2009; GAMA, LIMA e LEMOS, 2006).
Este elemento não tem função essencial no organismo, e a deficiência não é prejudicial
à saúde humana (MILLER, 2010). Há mais de um século, vem sendo feitos estudos
científicos sobre a toxicologia deste metal. Todavia, informações sobre os mecanismos de
ação que originam seus efeitos tóxicos ainda são insuficientes (MOREIRA e MOREIRA,
2004). Sabe-se que pode causar graves e irreversíveis danos neurológicos, principalmente em
crianças. Afeta também os sistemas hematológico, gastrointestinal, cardiovascular e renal
(WHO, 2010d).
Além disso, a exposição prolongada pode ocasionar coma e até a morte (RAHMAN et
al., 2012; WHO, 2010d).
2.2.4 Mercúrio
O mercúrio é um elemento que ocorre naturalmente no meio ambiente sob três formas.
Quando não combinado com outros elementos, está na forma pura ou elementar, utilizada em
termômetros, fabricação de ouro e prata e produção de gás cloro. Existem, ainda, duas outras
categorias que o classificam como orgânico, quando combinado com carbono e hidrogênio. O
composto orgânico de mercúrio mais comumente encontrado no ambiente é o metilmercúrio
(ASTDR, 1999).
A forma elementar lhe confere uma característica incomum dos demais metais: é
líquido e volátil à temperatura ambiente e os vapores são tóxicos para os seres humanos.
Apesar de o uso do mercúrio elementar ter sido consideravelmente reduzido em muitas partes
do mundo, no Brasil ainda trata-se de um grande problema ambiental, pois ainda é bastante
utilizado em regiões de mineração de ouro (SYVERSEN e KAUR, 2012).
28
2.2.4.1 Exposição
Todos os organismos estão expostos ao mercúrio, uma vez que é encontrado
naturalmente no ambiente (ATSDR, 1999).
A exposição pode ser por inalação, pela água ou pela ingestão de alimentos
(SYVERSEN e KAUR, 2012), sendo esta última à forma mais comum.
Dietas ricas em peixes e outros frutos expõe algumas pessoas a níveis mais elevados
de mercúrio na forma de metilmercúrio, caso estes alimentos sejam originários de águas
contaminadas. O metilmercúrio acumula-se na cadeia alimentar, e os peixes do topo da cadeia
trófica ou os mais idosos terão mais mercúrio em sua carne (ATSDR, 1999).
Outras formas são: obturações dentárias, algumas práticas religiosas que o utilizam em
seus rituais, manipulação de itens indústrias como barômetros, termômetros, aparelhos de
pressão sanguínea e bulbos de lâmpadas, caso estejam danificados (ATSDR, 1999).
O mercúrio elementar é transformado em vários compostos orgânicos de alquil
mercúrio, principalmente pelo processo de metilação (RANI, BASNET e KUMAR, 2011).
A acumulação é superior em pescado de maior porte devido à bioacumulação na
cadeia alimentar (GRANDJEAN, 2008).
2.2.4.2 Efeitos no organismo e toxicocinética
Não existem, ainda, evidências de que metais, como o mercúrio, exerçam qualquer
função no organismo, mas sabe-se que eles podem afetar o metabolismo de elementos
essenciais como, Cu, Zn, Fe, Mn e Se (MAIHARA e FÁVARO, 2005).
Na década de 1950, problemas gravíssimos de saúde que incluíam ataxia, distúrbio da
fala, e estreitamento do campo visual em habitantes da ilha de Kyushu no Japão, foram
estudados e, investigações sobre os fatos levaram a crer que estes problemas eram
consequência da ingestão de grande quantidade de metilmercúrio ([CH3Hg]+) acumulados em
peixes e moluscos oriundos da Baía de Minamata. Tal contaminação foi resultado do despejo
de produtos químicos de uma indústria localizada nas proximidades desta baía (MURATA e
SAKAMOTO, 2011).
Estudos sugerem que os vapores de mercúrio elementar bem como a forma orgânica
podem causar perda de visão devido ao estreitamento do campo visual (BARBONI et al.,
2008).
29
A exposição de mercúrio metálico por via oral normalmente é pouco absorvida.
Porém, pelas vias respiratórias, cerca de 80% entra na corrente sanguínea e vai para os
pulmões, cérebro e, na maior parte, rins. A maior parte é eliminada na urina e nas fezes e uma
quantidade menor, pela respiração (ASTDR, 1999).
Menos de 10% da forma inorgânica é absorvida via oral, pois não é volátil a
temperatura ambiente. No caso de ingestão, menos de 10% é absorvido pelo intestino e cerca
de 40% é absorvido pelo estômago. Também é excretado pela urina e pelas fezes.
2.3 BIOACUMULAÇÃO E BIOMAGNIFICAÇÃO
Dois processos comuns que ocorrem no ambiente marinho são a biomagnificação e a
bioacumulação. Eles ocasionam o aumento das concentrações de substâncias ao longo da
cadeia trófica, ainda que a substância em questão esteja presente em baixas quantidades na
água (SOUSA, 2009).
A biomagnificação é a transferência de substâncias para um organismo, por meio da
alimentação e a bioacumulação é a absorção de substâncias a partir de todas as formas
ambientais possíveis (GRAY, 2002), sendo retidas pelos organismos. Desta forma, os animais
de maior porte e que pertencem aos níveis mais elevados da cadeia alimentar tendem a
acumular concentrações maiores em relação aos organismos de menor porte (KEHRIG et al.,
2009).
O mercúrio é um dos elementos cujas concentrações podem ser aumentadas ao longo
da cadeia trófica pelo processo de bioacumulação (ZHU et al., 2007). A forma mais tóxica
(metilmercúrio) é também a que mais facilmente é bioacumulada, em comparação com as
outras formas nas quais pode se apresentar (TINOCO, 2008).
A avaliação em tecidos de organismos pertencentes a diferentes níveis tróficos e
oriundos do litoral norte do Rio de Janeiro revelou diferenças significativas entre as
concentrações de mercúrio total contidas nos predadores e em suas presas (KEHRIG et al.,
2009).
2.4 TÉCNICAS DE ANÁLISE
Métodos analíticos geram dados usados para tomar decisões fundamentais e podem ter
aplicação em várias áreas, desde o processamento e controle de qualidade na fabricação
30
produtos até o monitoramento de alimentos (BRETNALL e CLARKE, 2011; GOWIK, 2009).
Para se obter dados confiáveis sobre a ocorrência de contaminantes em alimentos, é de
extrema importância a disponibilidade de métodos analíticos para a determinação, visto que
amostras de alimentos, em conjunto com baixas concentrações são complexas. Desta forma,
necessita-se de técnicas analíticas seletivas, sensíveis e confiáveis (DORNE et al., 2009).
A utilização da técnica mais conveniente depende da exatidão exigida, do tempo de
execução, dos recursos disponíveis, da complexidade e do número de componentes presentes
da amostra. A determinação quantitativa de concentrações desta ordem requer técnicas
avançadas de análise (SKOOG et al., 2006).
2.4.1 Espectrometria de Emissão e Absorção Atômica
Quando a concentração média de um determinado elemento é menor que 100
microgramas por grama, ele é classificado como elemento traço (IUPAC,1979).
A espectroscopia atômica é uma ferramenta bastante eficiente para determinação de
elementos traços. Seu princípio se baseia na medida da intensidade de energia absorvida ou
emitida por um átomo ao ser submetido a elevadíssimas energias, capazes de converterem os
elementos em átomos gasosos num processo chamado atomização. Este processo pode ser
obtido por chama, forno de grafite ou plasma de argônio indutivamente acoplado (HARRIS,
2009). Atualmente, também vem sendo empregados outros atomizadores como os de descarga
de gás a pressão reduzida, descarga luminescente (glow discharge) e lasers de alta potência
(laser-induced breakdown) (SKOOG et al., 2006).
A evolução da espectrometria está relacionada com as suas fontes e sua melhoria e
otimização, assim como com os diferentes tipos de espectrômetros e detectores e formas de
amostragem ideal dos analitos (BINGS, BOGAERTS, BROEKAERT, 2006).
A espectrometria por plasma indutivamente acoplado é uma técnica analítica
amplamente utilizada para analisar matrizes de naturezas diversas, incluindo matrizes
alimentares (SKOOG et al, 2006).
As temperaturas atingidas são muito mais elevadas do que as chamas de combustão,
eliminando muitos dos problemas encontrados com chamas convencionais. A energia é
gerada por uma bobina de indução de radio frequência que envolve uma chama de quartzo
(SKOOG et al, 2006).
31
A demanda contínua de alta sensibilidade em combinação com a capacidade de
detecção multielementar rápida e simultânea levou a novos desenvolvimentos no campo de
espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (BINGS, BOGAERTS,
BROEKAERT, 2006). Íons são produzidos graças às altas temperaturas alcançadas. Na
Espectrometria de Massas por Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-MS), a massa desses
íons é medida, sendo assim possível realizar a quantificação. Tem as vantagens de possuir
limites de detecção muito baixos e de realização de análises multi-elementares simultâneas
(DJEDJIBEGOVIC et al., 2012; AMMANN, 2007). Entretanto, quando se trata de análises
em alimentos, pode haver interferência da matriz devido às altas concentrações de sais e de
compostos orgânicos presentes (NARDI et al., 2009).
Na Espectrometria de Emissão Ótica por Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-OES),
mede-se a luz emitida pelos íons excitados em comprimentos de onda específicos de cada
elemento (SKOOG et al, 2006).
Estas técnicas estão se tornando cada vez mais comuns em laboratórios de análise de
alimentos
com
diferentes
finalidades
para
determinação
de
multielementar
de
macronutrientes, investigação de elementos tóxicos e avaliação de perfil mineral para
identificação de origem (KHAN et al., 2014a, BRESSY et al., 2013; MILLOUR et al, 2011;
SANTOS, 2011; NASREDDINE et al., 2010; NARDI et al., 2009; SOLA-LARRAÑAGA,
NAVARRO-BLASCO, 2009; ATARO et al, 2008; ČERNOHORSKÝ et al., 2008;
LEBLANC et al., 2005; LARA et al., 2005).
Larrea-Marín et al (2010) validaram método de ICP-OES para análise de elementos
traços em algas (Laminaria e Porphyra) de acordo com o guia da Eurachem. A técnica foi
considerada adequada para determinação de metais traços (alumínio, cádmio, cálcio, cromo,
cobre, ferro, níquel, chumbo e zinco) para estudo de caracterização de vinhos da região de
Mendonza na Argentina (LARA et al., 2005).
2.4.2 Preparo de amostras
Antes da quantificação, uma etapa de tratamento (digestão) das amostras deve ser
realizada, para convertê-las da sua forma sólida para a líquida para solubilização dos analitos
de interesse e destruição da matéria orgânica (SANTOS et al., 2010). Devem ser preparadas e
diluídas de forma que a concentração final dos elementos esteja dentro da faixa do método
utilizado e nas mesmas unidades de concentração.
32
O preparo é uma etapa bastante importante para garantir a qualidade dos resultados. A
digeatão pode ser via seca ou via úmida. A digestão por via seca requer temperaturas elevadas
e por via úmida requer o uso de ácidos concentrados e cuidadoso monitoramento da digestão
por períodos variados (NARDI et al., 2009). Podem ser utilizadas misturas ácidas a fim de
digerir amostras de: fórmulas infantis para determinar cálcio, cobre, ferro, potássio, magnésio,
manganês, sódio e zinco, (KIRA e MAIHARA, 2007), leite e iogurtes com o objetivo de
analisar arsênio, chumbo, chumbo, cromo, níquel, zinco, titânio, rubídio, lítio, berílio, bário,
estrôncio, bismuto, césio, gálio, índio, vanádio, cobalto e selênio (KHAN et al., 2014a) e
espécies de peixes, como os coletados no Rio Bangshi em Savar, Bangladesh para avaliar as
concentrações de chumbo, chumbo, níquel, cromo, cobre, zinco, manganês e arsênio,
(RAHMAN et al., 2012). Ambos os métodos são demorados e pode haver perda de analitos
por volatilização (NARDI et al., 2009). Esta técnica exige controle na condução da digestão
relacionado com a utilização de reagentes corrosivos, a fim de garantir que as amostras não
irão à secura evitando risco perdas do analito e de explosão.
Vários autores têm optado pela técnica de digestão por micro-ondas (MACIEL et al.,
2014; KHAN et al., 2013; KARAKAŞ, 2012; MILLOUR et al., 2011). A recuperação por via
úmida e por via seca de diversos metais, para elementos como chumbo e cádmio, tem se
mostrado inferiores em comparação à digestão por micro-ondas (YANG et al., 2013;
ALTUNDAG e TUZEN 2011; VARELA et al, 2009). Dentre as demais vantagens da técnica
por micro-ondas sobre a as técnicas por via úmida e seca, destacam-se rapidez, eficiência,
menor consumo de reagentes, menor risco de contaminação das amostras, perdas por
volatilização praticamente eliminadas e a precisão e reprodutibilidade são melhores
(CINDRIĆ et al., 2012; NARDI et al., 2009).
2.4.3 Quantificação de mercúrio
As análises de mercúrio são de grande interesse principalmente nas áreas ambientais e
de segurança alimentar e técnicas espectrométricas são as formas de investigação da presença
deste elemento. A escolha do método adequado depende da natureza da matriz e da
quantidade que se espera encontrar. As técnicas de a espectrometria atômica, e espectrometria
de fluorescência, e ICP-MS e ICP-OES (MORGANO et al, 2005) são alternativas para
investigação de mercúrio. (MICARONI, SILVEIRA e JARDIM, 2000).
33
Cardoso et al. (2009) determinaram as concentrações de mercúrio no músculo, rim e
cérebro da espécie Trichiurus lepturus na região da praia de Itaipu, Niterói – RJ pela a técnica
de espectrofotômetria de absorção atômica por arraste de vapor frio (EAA-VF), observando
que as concentrações de Hg encontrados nos três órgãos se apresentaram inferiores aos dos
limites máximos permitidos pela legislação brasileira (ANVISA), mesma técnica usada por
Kehrig (2009) para avaliar a transferência trófica de mercúrio em espécies da costa Norte do
Rio de Janeiro.
As técnicas espectrométricas de absorção atômica e plasma indutivamente acoplado
têm em comum a necessidade de utilização de uma etapa prévia de preparo de amostra.
A Environmental Protection Agency (EPA, 2007b) indica a técnica de determinação
de mercúrio pelo Analisador direto (Método EPA 7473). O princípio deste método consiste
em decompor termicamente a amostra com fluxo contínuo de oxigênio e capturar os vapores
de mercúrio por um amalgamador de ouro. Por fim, a determinação é feita através
espectrofotometria de absorção atômica a 253,7 nm. A grande vantagem deste método
consiste em dispensar o preparo de amostra uma vez que as etapas de diluição e a digestão
podem ocasionar a baixa recuperação do analito, sendo então, o método de determinação
direta conveniente, pois reduz eventuais erros desta etapa analítica (HAYNES et al, 2006,
IPOLYI et al., 2004).
Este método vem sendo amplamente utilizado para determinar mercúrio em pescados
e outros frutos do mar (PANICHEV e PANICHEVA, 2014, RUIZ-DE-CEZANO et al., 2014,
TAYLOR, et al., 2014, SHIBER, 2011).
2.5 VALIDAÇÃO
Ensaios analíticos têm por objetivo identificar ou confirmar a presença ou ausência de
um ou mais analitos em uma matriz e, uma vez presente, determinar que concentração. São
amplamente utilizados para fins diversos nas áreas industrial, ambiental e de pesquisa. Devido
à importância da utilização destas informações nestes diversos campos de aplicação, é
imprescindível que sejam executados de tal forma que os resultados gerados estejam o mais
próximo dos valores verdadeiros. Deve-se, portanto, desenvolver critérios e procedimentos
padrão que garantam esta condição.
A validação é a garantia de que métodos de ensaios ou calibração possam ser
utilizados de forma segura em relação aos resultados gerados. Vários organismos nacionais e
34
internacionais definem de maneira bastante semelhante os objetivos para validação. De
acordo com o Vocabulário Internacional de Metrologia (VIM, 2008), é verificar se requisitos
especificados são adequados para um uso pretendido. Para a FDA (Food and Drugs
Administration), validar significa confirmar experimentalmente que um processo produz um
resultado ou um produto que satisfaçam as suas especificações pré-determinadas e que
equipamentos e sistemas auxiliares envolvidos neste processo são capazes de operar de forma
consistente dentro dos limites e tolerâncias estabelecidos, devendo uma evidência objetiva ser
estabelecida e documentada (FDA, 2009).
No Brasil, órgãos importantes ligados à legislação e normalização, também trazem
definições para a validação:
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária):
A validação de um método estabelece, através de estudos sistemáticos de
laboratório, que o método é adequado à finalidade, isto é, suas características de
desempenho são capazes de produzir resultados correspondentes às necessidades do
problema analítico (ANVISA, 2005).
INMETRO:
É a demonstração de que um método analítico tem as características necessárias para
a obtenção de resultados confiáveis e adequados à qualidade pretendida nas
condições em que é praticado (INMETRO, 2011).
MAPA:
É um estudo experimental e documentado que objetiva demonstrar que o
procedimento analítico avaliado é adequado à finalidade proposta, de forma a
assegurar a confiabilidade dos resultados obtidos.
Na área de alimentos, a avaliação dos parâmetros de validação fundamentais nas
questões relacionadas a comércio exterior e segurança alimentar (SOUZA, 2007), e
consequentemente, as de saúde pública, legislação e fiscalização.
Em 1963, a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e a Alimentação
(FAO) e a Organização Mundial da Saúde (OMS) criaram um programa internacional sobre
normalização de alimentos, o Codex Alimentarius, com a finalidade de proteger a saúde da
35
população, assegurando práticas equitativas no comércio regional e internacional de
alimentos, fomentando e coordenando todos os trabalhos referentes à normalização
(PASCHOAL et. al, 2008).
Por outro lado, a União Europeia, exige que seus países membros possuam
laboratórios acreditados na norma ISO/IEC 17025 (SOUZA, 2007). Estes fatos levaram a
adoção de medidas que garantam a segurança do alimento tanto no mercado interno, quanto
no mercado externo e isto inclui a avaliação dos produtos por ensaios validados.
A validação é o processo pelo qual um método deve ser submetido para demonstrar e
confirmar a adequação do mesmo para o propósito pretendido (FDA, 2012). É reconhecida
internacionalmente como necessária para que laboratórios analíticos possam demonstrar sua
qualificação e sua competência (TAVERNIERS, DE LOOSE, BOCKSTAELE, 2004). Antes
de se iniciar a validação de um método, o escopo deve ser fixado e deve-se compreender,
tanto a exigência analítica, quanto o sistema analítico. Uma série de medidas deve ser tomada
por um laboratório para assegurar a sua capacidade de obter dados de qualidade, como definir
o escopo, a finalidade, o método, a concentração do analito, e a matriz e avaliação de
incerteza, comparações interlaboratoriais, calibração com materiais de referências e
comparação de métodos (TAVERNIERS, DE LOOSE, BOCKSTAELE, 2004; SOUZA,
2007). Para o INMETRO (INMETRO, 2011) a validação deverá ser realizada sempre que um
método for desenvolvido, quando não se tratar de um método normalizado, ou quando um
método normalizado ser utilizado fora do escopo para os quais foi originalmente
desenvolvido, ou ainda, para ampliar e modificar métodos normalizados. Segundo Souza
(2007), o guia de validação de métodos da Eurachem (1998), indica que métodos
normalizados revisados devem ser validados com a avaliação dos parâmetros linearidade,
limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ), precisão (repetitividade e
reprodutibilidade) e incerteza de medição (EURACHEM, 1998).
As medidas obtidas por métodos analíticos de determinação de resíduos de
contaminantes em alimentos são úteis para garantir que os produtos avaliados sejam seguros e
que os níveis dos contaminantes estejam enquadrados nas determinações legais (PASCHOAL
et. al, 2008).
Os procedimentos realizados em uma validação devem ser descritos e os estudos para
determinar os parâmetros devem ser realizados com equipamentos e instrumentos
adequadamente calibrados e com os respectivos certificados de calibração válidos. A
36
realização dos estudos deve ser feita por um responsável competente e experiente na área,
com a experiência comprovada (INMETRO, 2011).
A utilização de métodos normalizados sem alterações nos procedimentos ou
equipamentos dispensa a realização de todos os parâmetros validação completa sendo
necessário apenas um estudo de avaliação de desempenho. Desta forma, comprova-se que o
método opera adequadamente nas condições reais do laboratório e demonstra que o
desempenho do método em questão se assemelha ao desempenho originalmente observado
(INMETRO, 2011).
Para validar métodos, medidas ideais devem ser adotadas como utilizar materiais de
referência certificados (CRM) para calibrar um equipamento, verificar as calibrações
existentes, e avaliar de efeitos da matriz. Na ausência de um CRM, outros recursos devem ser
utilizados como, por exemplo, a utilização de uma matriz branca fortificada com o padrão do
analito em estudo (THOMPSON, ELLISON e WOOD, 2006).
Os parâmetros de validação devem constar no procedimento e ser documentado. Para
análise de elementos traços, os parâmetros mínimos, quando aplicáveis, segundo o
INMETRO (2011), estão definidos a seguir.
2.5.1 Seletividade
A seletividade de um método diz respeito a sua capacidade de detectar um analito
específico, mesmo produzindo respostas para vários outros, fornecendo valores independentes
para cada um deles. Se não for assegurada, pode comprometer outros parâmetros como
linearidade, tendência e precisão e, consequentemente, todo o processo de validação
(INMETRO, 2011, MAPA, 2011). Segundo Taverniers, De Loose, e Bockstaele (2004),
alguns autores usam o termo especificidade como sinônimo de seletividade, enquanto outros
definem especificidade como a capacidade de o método distinguir apenas um analito, ao
contrário da seletividade.
A importância deste parâmetro está ligada, principalmente a validação de métodos
cujas matrizes são de origem animal, devido à complexidade das mesmas. Por isto, pode
haver efeito matriz, que são possíveis interferências causadas pelos elementos diversos que a
compõem, diminuindo ou ampliando o sinal de emissão. Para avaliação da seletividade
analisam-se a amostra e os materiais de referência por métodos validados, para verificar a se o
método em questão é capaz de identificar o analito de interesse na presença de interferentes;
37
ou analisar amostras na presença de possíveis interferentes e verificar se haverá aumento ou
diminuição no sinal de resposta (INMETRO, 2011; MAPA, 2011).
2.5.2 Linearidade
Para garantir linearidade, um método deve ser capaz de produzir resultados
diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo. É
verificada a partir da equação (2.1) da regressão linear determinada pelo método dos mínimos
quadrados (INMETRO, 2011):
𝐲 = 𝐚𝐱 + 𝐛
(2.1)
y = resposta analítica
a = inclinação da reta
x = concentração do analito
b = interseção
O coeficiente de correlação (R2) também é calculado a partir da curva de regressão
linear e verifica a dispersão dos pontos (KHAN et al., 2014b).
Deve-se primeiramente verificar a ausência de outliers (valores discrepantes, valores
extremos ou valores aberrantes) para cada nível de concentração e a homocedasticidade dos
dados através de testes estatísticos apropriados. Outliers podem ser calculados pelo teste de
Grubbs (INMETRO, 2011) através da equação (2.2).
𝐆=
| 𝐱𝐢 − 𝐱̅|
𝐬
(2.2)
Onde
s = desvio padrão
𝒙𝒊 = valor observado
𝑥̅ = valor médio
Para que nenhum valor seja considerado outlier o valor encontrado para G calculado
deve ser inferior ao que o valor de G tabelado (Critério de Aceitação: Gcal < Gtab.).
38
A homocedasticidade, isto é a igualdade estatística dos desvios-padrão das replicatas
das respostas instrumentais em diferentes níveis de concentração (MAPA 2011), deve ser
avaliada. Caso esta igualdade, não se verifique, o método é considerado heterocedástico e a
curva não poderá ser calculada pelo método dos mínimos quadrados. Pode ser determinada
pelo teste de Cochran (INMETRO,2011), Brown-Forsythe ou Levene (SOUZA E
JUNQUEIRA, 2005).
A equação (2.3) é utilizada para o teste de Cochran:
S2
C = ∑KMAXS2
I=1
(2.3)
onde
s2 = variância em cada nível
Para que o método seja considerado homocedástico, o valor encontrado de C deve ser
menor que o valor calculado (Critério de Aceitação: Ccal < Ctab.).
2.5.3 Faixa de trabalho e Faixa linear
A faixa de trabalho é o intervalo é o intervalo de análise que apresenta valores de
concentração confiáveis do analito. Este intervalo deve contemplar os valores de concentração
esperados nas amostras analisadas. Neste intervalo deve existir uma faixa de resposta
chamada faixa linear, na qual, a resposta do sinal terá uma relação linear com o analito
(INMETRO, 2011).
O limite inferior da faixa de concentração pode ser considerado como limite de
quantificação e o limite superior vai depender do sistema de resposta do equipamento.
O protocolo do INMETRO sugere que a determinação das faixas de trabalho e faixa
linear, seja realizada em três etapas cada uma delas com repetições iguais ou maiores que sete,
com concentrações variadas e independente do analito, usando água como branco de reagente,
branco da amostra que é uma matriz da amostra sem o analito de interesse (quando possível)e
material de referência. Estes procedimentos determinam o limite de quantificação, que é o
limite mais baixo da faixa de trabalho método. A concentração estimada da amostra deve se
situar no centro da faixa de trabalho.
39
2.5.4 Limite de Detecção (LD)
É o menor valor de concentração de um analito que pode ser detectado. O valor do
limite de detecção depende da matriz e por este motivo, deve ser obtido experimentalmente,
pelas leituras sucessivas de branco ou pela adição da concentração mais baixa do analito. O
LD é calculado de acordo com a equação (2.4) (INMETRO, 2011).
LD = X̅ + T(N−1,1−Α) S
(2.4)
Onde
𝑥̅ = média das observações
𝑡 = t de student
𝑠 = desvio padrão
n = número de observações
α = 0,05 (intervalo de confiança)
2.5.5 Limite de Quantificação (LQ)
Limite de Quantificação ou Limite de Determinação é nível da curva de calibração de
menor concentração do analito excluindo o branco, com confiabilidade aceitável de precisão e
exatidão, para certa condição analítica. A concentração do analito corresponde ao valor da
média do branco mais 5, 6 ou 10 desvios padrão. Todavia, a maneira mais realista é
determinar o LQ experimentalmente, com base em critérios de aceitação pré-definidos.
Utilizam-se o branco da amostra e um branco com adição de concentrações variadas do
analito, próximas ao LQ. Cada replicata é medida uma vez de maneira independente, para
cada nível de concentração. Para a análise em nível de traços, é recomendado adotar o LQ
como a concentração mais baixa da curva analítica com precisão e exatidão aceito pelo
método. O limite de quantificação deve ser estabelecido para cada matriz estudada
(INMETRO, 2011), de acordo com a equação (2.5):
LQ = x̅ + 10s
(2.5)
A saber:
40
x̅ = média das observações
s = desvio padrão
2.5.6 Limite de Decisão e Capacidade de Detecção
O limite de decisão (CCα) e a capacidade de detecção (CCβ) são parâmetros que
devem ser calculados quando são desenvolvidos métodos para quantificação de substâncias
proibidas ou que tenham limites máximos permitidos. Estes limites medem o desempenho de
um método e estão associados à incerteza do mesmo. Segundo a Decisão 2002/657 (CE), o
CCα é o limite a partir do qual se pode concluir que um resultado é não conforme com uma
probabilidade de erro α. O protocolo do MAPA (2011) estabelece um valor de α = 5% para
substâncias que possuem um limite máximo permitido.
Uma das formas para se calcular CCα é utilizar a leitura de 20 amostras brancas
fortificadas na concentração do limite máximo estabelecido (LMR). A equação é:
CCα = LMR + 1,64 × s𝑟𝑒𝑝𝑟𝑜𝐿𝑀𝑅
(2.6)
Onde
sreproLMR = desvio-padrão amostral
O CCβ é a menor quantidade que pode ser detectada e identificada com uma
probabilidade de erro de β = 5%. Em se tratando de substâncias que tenham não tenham um
limite estabelecido, o CCβ corresponde ao limite de quantificação (LOCO et. al, 2007).
Para as substâncias que possuem LRM, poderá utilizar o CCα calculado a partir dos
resultados de análise de pelo menos 20 matrizes brancas fortificadas na concentração do
LMR, por tipo de matriz analisada no escopo do procedimento validado. Dessa forma, CCβ
será calculado por:
𝐂𝐂𝛃 = 𝐋𝐌𝐑 + 𝟑, 𝟐𝟖 × 𝐬𝒓𝒆𝒑𝒓𝒐𝑳𝑴𝑹
(2.7)
Onde,
𝑢𝑐𝐿𝑀𝑅 = é o desvio-padrão amostral das concentrações do analito dessa série de 20 análises no
nível de concentração do LMR.
41
2.5.7 Exatidão
Ensaios de recuperação podem ser utilizados para avaliar a exatidão, utilizando-se
matrizes fortificadas e serem expressos como a equação (2.8) (INMETRO, 2011).
Recuperação = (
valor encontrado
)×
valor esperado
100
(2.8)
A exatidão de um método pode ser avaliada das seguintes formas (INMETRO, 2011):
2.5.7 1 Recuperação
A recuperação pode ser medida por ensaios realizados com matrizes fortificadas
(THOMPSON, ELLISON e WOOD, 2006). O cálculo será dado pela equação 2.9
(INMETRO, 2011).
Recuperação(%) =
C1 −C2
C3
× 100
(2.9)
Onde
C1 = concentração do analito na amostra fortificada,
C2 = concentração do analito na amostra não fortificada,
C3 = concentração do analito adicionada à amostra fortificada.
2.5.7 2 Precisão
Calcula-se o desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV) para
estimar a precisão de um método pela equação (2.10)
𝐂𝐕(%) =
𝐬
𝐱̅
× 𝟏𝟎𝟎
(2.10)
Onde
s = desvio padrão
𝑥̅ = média das concnetrações
42
Os critérios de aceitação para recuperação e precisão, estão nas tabelas 2.2 e 2.3.
Tabela 2.2 Critérios de aceitação de recuperação (MAPA, 2011)
Critério de
Concentração (c)
aceitação
≤ 1 µg kg-1
-50 % a +20%
1 µg kg-1 < c < 10 µg kg-1
c ≥ 10 µg kg-1
-30 % a +10 %
-20 % a +10 %
Tabela 2.3 Critérios de Aceitação da Precisão (MAPA, 2011)
Critério de Aceitação
Concentração (c)
CV ( %)
c < 1 µg kg-1
35
1 µg kg-1≤ c < 10 µg kg-1
30
10 µg kg-1≤ c < 100 µg kg-1
20
-1
100 µg kg ≤ c < 1 mg kg
-1
15
1 mg kg-1≤ c <10 mg kg-1
10
10 mg kg-1≤ c < 100 mg kg-1
7,3
100 mg kg-1≤ c < 1 g kg-1
5,3
1 g kg-1≤ c < 10 g kg-1
3,7
10 g kg-1 ≤ c < 100 g kg-1
2,7
-1
-1
100 g kg ≤ c < 1 kg kg
2,0
Os laboratórios da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários credenciados para
realizar análises para o Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes – (PNCRC Animal), seguem procedimentos e parâmetros descritos em um guia de validação de métodos
(MAPA, 2013b). Os parâmetros que constam neste guia são semelhantes aos do INMETRO,
com algumas variações referentes à curva de calibração. Este guia prevê o cálculo de CCα e
CCβ, parâmetros relacionados a limite de decisão e capacidade de quantificação,
respectivamente.
43
Os laboratórios que pretendem solicitar credenciamento ou ampliação de escopo, na
área de resíduos e contaminantes devem seguir estes parâmetros (INMETRO, 2011).
Khan et al. (2014b) avaliaram as concentrações de 23 elementos traço, tóxicos e não
tóxicos, em especiarias (canela, cardamomo, cravo, pó de manga) por ICP-MS, após digestão
por de micro-ondas. O método analítico foi validado pela linearidade, limites de detecção,
precisão, exatidão e recuperação, obtendo valores satisfatórios em todos os casos. Karakaş
(2012) determinou em amostra de pasta de tomate por ICP-MS as concentrações de Cd, Cu,
Fe, Pb, Sn e Zn. A percentagem de erros relativos variou entre 1,4 a 9,0% para o NIST SRM
1573A em de folhas de tomate. Foram feitas curvas de calibração, repetitividade e
recuperação e calculadas as incertezas relativas. Após validação dos métodos, amostras de
extrato de tomate de supermercados da Turquia foram avaliadas.
Esses estudos corroboram para a necessidade de se estabelecer métodos validados.
2.6 ÁREA DA REGIÃO DE SEPETIBA
O território do Estado do Rio de Janeiro está dividido em nove Regiões Hidrográficas
(INEA, 2013). A bacia da Baía de Sepetiba (figura 2.3) se localiza no litoral sul do Estado do
Rio de Janeiro, Brasil. A Baía de Sepetiba (latitude 22°54’ a 23°04’S e longitude 43°34’ a
44°10’W), faz parte da Região Hidrográfica do Guandu (RH II). Recebe descargas residuais
de sedimentos de bacias locais, e de água doce de diversos afluentes (MOLISANI et al.,
2007). Por sua geografia particular, é uma região de características estuarinas e por isto, é
capaz de transportar poluentes do continente para o mar, podendo assim, acumular
substâncias poluentes.
44
Figura 2.3 Regiões Hidrográficas do Estado do Rio de Janeiro. Em destaque, região onde se localiza a Baía de
Sepetiba. Fonte: adaptado de GEOPEA/DIMFIS/INEA, 2013
As atividades industriais no seu entorno, se concentram, principalmente nos distritos
industriais de Queimados, Itaguaí, Campo Grande e Santa Cruz (ROCHA et al., 2010). Cerca
de 400 indústrias estão abrigadas nesta região, onde também são fortes as atividades
pesqueiras e turísticas (PARAQUETTI et al., 2004). Esta área sofreu modificações
socioeconômicas causadas pelo desenvolvimento industrial e pela expansão metropolitana.
Uma das consequências destes eventos foi o despejo de efluentes industriais nas águas da baía
(AMADO FILHO et al., 2003, PARAQUETTI et al., 2004).
A região foi, durante muitos anos, contaminada por lixo tóxico, principalmente
metais traços, como zinco, mercúrio, cádmio e chumbo (PINTO, 2005).
Vários fatores são apontados como responsáveis da poluição da Baía de Sepetiba:
tráfego de embarcações no Porto de Itaguaí, transposição do rio Paraíba do Sul nos anos 1950,
poluição causada pelo lançamento de esgoto doméstico e contribuição natural da erosão das
rochas da bacia hidrográfica do rio Guandu (ROCHA et al., 2010). Os poluentes de origem
industrial também tiveram forte influência no aparecimento de substâncias nocivas, como
metais tóxicos.
Um fato de grande importância econômica e ambiental foi à contaminação da baía,
consequência das atividades industriais da Companhia Ingá Mercantil. Nos anos 1960, esta
fábrica se instalou na Ilha da Madeira, em Itaguaí, e iniciou as atividades de beneficiamento
de minérios para obtenção de zinco de alta pureza. Este processo gera resíduos contendo
cádmio e outros metais, acumulados nos pátios da fábrica. Na época, havia denúncias de que a
empresa deliberadamente lançava resíduos em valas de manguezal (PINTO, 2005).
45
Estas ocorrências geram substâncias estranhas nos ambientes, o que, evidentemente,
alteram a composição química, a vida marinha e o meio aquático.
No caso do Hg, a forma orgânica dissolvida na água é a principal forma de transporte
do metal para sistemas aquáticos adjacentes na plataforma continental ou na baía da Ilha
Grande (LACERDA e MALM, 2008). O mercúrio inorgânico é transformado em
metilmercúrio por meio de microrganismos presentes nos sedimentos da água e série de
fatores físico-químicos controla este processo (PARAQUETTI et al., 2004).
A exposição a tantos fatores afeta de forma negativa tanto o ambiente marinho, com a
alteração da composição de sedimentos, como os organismos vivos que nele habitam. Peixes e
outros animais aquáticos são capazes de interagir substâncias tóxicas presentes no meio
ambiente e ter graves consequência na população, dependendo do grau de contaminação e do
tempo de exposição (FIPERJ, 2011).
46
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 AMOSTRAS
As matrizes utilizadas nestes experimentos são espécies de Cynoscion leiarchus,
conhecida popularmente por pescadinha (perna de moça, pescada branca e outros).
adquiridas nos entrepostos de Pedra de Guaratiba, Rio de Janeiro. Os elementos foram
quantificados em 10 exemplares de pescadinha perna de moça, adquiridas nos entrepostos
de venda da região da Pedra de Guaratiba. Estes peixes são de grande consumo da
população local e são encontrados na baía de Sepetiba. Ocorrem em regiões estuarinas e
estão presentes em toda costa brasileira. Podem alcançar até 60 centímetros de
comprimento e pesar até 2 quilogramas (MENEZES & FIGUEIREDO, 1980).
Para validação do método, foi utilizado atum comercial. A escolha desta matriz
levou em consideração o fato de ser um material considerado próprio para consumo, ou
seja, os teores dos elementos em estudo, caso existissem, seriam em concentrações
menores do que os da faixa de concentração estudada.
3.2 REAGENTES E SOLUÇÕES ANALÍTICAS
Antes da utilização, toda vidraria foi imersa em solução de ácido nítrico na proporção
de 1:1 por 12 horas e em água ultrapura por 2 horas. Em seguida foi lavada abundantemente
com água ultrapura e seca em estufa a 60 °C (com exceção dos balões volumétricos).
O ácido nítrico concentrado (65 % peso/peso) e o peróxido de hidrogênio (30 %)
são grau analítico (VETEC). A pureza do argônio foi de 99,999 %.
Toda água utilizada no preparo de soluções e de material foi desmineralizada no
purificador de água PURELAB Option-Q – ELGA, 18 MΩ cm-1 a 25oC.
As soluções padrão de Hg foram preparadas a partir de diluição apropriada do padrão
estoque de 1000 mg L-1 (SP Science).
As soluções padrão de As, Cd e Pb foram preparadas a partir de diluição apropriada do
padrão estoque de 1000 mg L-1 (Fluka). Todas as soluções são acreditadas pela ISO Guide 34
3.3 PREPARO DAS CURVAS DE CALIBRAÇÃO
47
As curvas de calibração foram construídas nas faixas de concentrações e, no caso
do Hg, nas quantidades indicadas nas tabelas 3.1 e 3.2
Tabela 3.1 Faixas de concentração para As, Cd e Pb.
Elemento
As (λ = 188,979 nm)
Cd (λ = 226,502 nm)
Pb (λ = 220,353 nm)
Concentrações (ng g-1)
11
50 200 300
5
10
20
30
10
20
60
90
0
0
0
400
40
120
Tabela 3.2 Faixas de massas para Hg.
Elemento
Hg (λ = 254nm)
0
Massas de Hg (ng)
10
15
25
30
As curvas de calibração foram construídas de forma que o ponto corresponde aos
respectivos limites de máximos permitidos pelo MAPA. Devido a sensibilidade da técnica, as
amostras analisadas foram diluídas 5 vezes. Os limites são 1000 ng g-1, 300 ng g-1, 100 ng g1
e 1000 ng g-1 de As, Pb e Cd, respectivamente e 1000 ng g-1de Hg (neste caso,
considerando uma tomada de amostra de 0,015 g). As faixas foram escolhidas,
considerando a tomada de amostra, a umidade e a diluição e a presença dos analitos em
torno das quantidades limites, conforme tabela 3.3
Tabela 3.3 Considerações para construção das curvas de calibração
Diluição
(mL)
Peso
(g)
Limite (ng g )
25
25
25
-
5
5
5
0,015
As = 1000
Cd = 100
Pb = 300
Hg = 1000
-1
Valor na curva
(ng g-1); Hg em
ng
200
20
60
15
3.4 PREPARO DA AMOSTRA
48
Matrizes de pescado são bastante complexas, o que exige um preparo muito
cuidadoso, para garantir a homogeneidade e, consequentemente, resultados concordantes.
Primeiramente, o atum enlatado conservado em água foi drenado durante 10
minutos, conforme protocolo de preparo do Laboratório de Físico-Química e Minerais da
Embrapa Agroidústria de Alimentos para material enlatado (figura 3.1a). Em seguida, foi
processado em moinho de facas marca Restch, modelo GRINDOMIX a 8000 rpm por 45
segundos (figura 3.1b). Por fim, foi submetida à liofilização por 30 horas (liofilizador
Edward Pirani 501; pressão, 0,1 bar; faixa de temperatura -40 °C a +30 °C (figura 3.1c)).
Após estarem devidamente preparadas, as amostras foram embaladas em sacos
plásticos, seladas a vácuo e mantidas em refrigeração a 4 °C por 15 dias, quando foram então,
realizadas as análises químicas. Este material foi utilizado para validação do método.
Para aplicação do método validado, amostras de pescadinha foram devidamente
preparadas. Após terem as escamas, cabeças e vísceras retiradas, as amostras de pescadinha
passaram pelos mesmos procedimentos de preparo realizado para o atum enlatado.
Ressalta-se, que antes e depois de liofilizar as amostras, foram realizadas pesagens
para determinação de umidade.
a
b
c
Figura 3.1 Etapas de preparo da amostra
O fluxograma abaixo (figura 3.2) mostra as etapas do processo de preparo das
amostras. Para realização de análises de As, Cd e Pb no ICP-OES foi feita digestão de 0,5
grama de amostras em forno micro-ondas Cem Mars (figura 3.3) com 6 mL de ácido
nítrico concentrado (HNO3) e 2 mL de peróxido de hidrogênio (H 2O2), 1500W de
potência por 40 minutos. O material digerido foi transferido para balão de 25 mL e
avolumado com água.
49
Amostra
Drenagem
10 min
Amostra
drenada
Processamento
8000 rpm/45 s
Amostra
processada
Pesagem da
amostra
processada
1
50
1
Liofilização 30
h/0,1 bar/ -40 °C a
+30 °C
Amostra
liofilizada
Pesagem da
amostra liofilizada
Amostra
liofilizada
Embaladas em sacos plásticos,
seladas a vácuo e armazenadas
a 4 °C por 15 dias
0,015 g de amostra para
análise de Hg
Analise Hg no
Analisador
direto Hg
0,5 g de amostra para análise de de As, Cd e Pb
2
51
2
2,0 mL de
H2O2
Digestão
Forno micro-ondas
6,0 mL de
HNO3 conc
Avolumar 25 mL
Analise As, Cd,
Pb no ICP-OES
Figura 3.2 Fluxograma das etapas do preparo de amostra
52
Figura 3.3 Forno micro-ondas
As análises realizadas no analisador de mercúrio dispensaram digestão prévia.
3.5 PROCEDIMENTO ANALÍTICO
As amostras de peixes foram analisadas em triplicata.
As quantificações de As, Cd e Pb foram realizadas no Espectrômetro Sequencial
de Emissão Ótica por Plasma Indutivamente Acoplado (ICP – OES) marca Perkin Elmer
modelo Optma 2100 DV (figura 3.4) e a quantificação de Hg foi realizada no Analisador
Direto de Mercúrio marca Teledyne Leeman, modelo Hydra C (figura 3.5).
Figura 3.4 ICP – OES utilizado para quantificação dos metais As, Cd e Pb
53
Figura 3.5 Analisador de Mercúrio Hydra C Teledyne.
Os detalhes das condições de operação dos instrumentos são apresentados nas
tabelas 3.4, 3.5, 3.6.
Tabela 3.4 Condições de operação do ICP-OES
Perkin Elmer, modelo DV 2500, leitura
Marca
sequencial
Potência
1300 W
Vazão do Plasma
15 L min-1
Vazão do gás auxiliar
0,2 L min-1
Nebulizador
0,80 L min -1
Purga do argônio
alta
Injetor
Alumina (2.0 mm)
Câmara de nebulização
ciclônica
Nebulizador
SeaSpray®, Fluxo 2 mm min -1
Processamento
área do pico (7 pontos)
Tempo de integração (mín-máx):
As e Cd 1s-5s; Pb 5s-10s
Vista
As e Cd = axial; Pb = radial
54
Tabela 3.5 Condições de análise do Analisador de Mercúrio .
Marca, modelo
Teledyne Leeman, Hydra C
Potência
1300 W
Vazão do gás
13 -15 L min-1
Temperatura de decomposição
850°C
Temperatura do catalisador
600°C
Tempo de integração
180 s
Tabela 3.6. Condições de operação do micro-ondas.
Marca, modelo:
Cem Mars
Potência:
1500 W
Tempo
40 minutos
3.6 VALIDAÇÃO DOS MÉTODOS
Após otimização dos métodos, foram realizados procedimentos para validá-los.
Os parâmetros de validação seguiram o documento orientativo sobre métodos
analíticos do INMETRO DOQ-CGCRE-008, revisão 04, de julho de 2011. O cálculo de
CCα, CCβ e incerteza foram feitos com base no protocolo do MAPA (2011).
3.6.1 Seletividade/Efeito Matriz
Foram realizadas sete leituras de cada ponto da curva analítica construída apenas
com água e ácido nítrico 3% e sete leituras de uma curva analítica construída com matriz
(atum enlatado). As leituras em fase aquosa e em matriz foram comparadas para verificar
se a presença da matriz causaria interferência significativa, isto é aumentaria ou reduziria
os sinais dos analitos estudados.
As respostas das leituras foram avaliadas quanto à presença de outliers pelo teste
de Grubbs, ou seja, a verificação de algum valor discrepante, considerando-se a média e
o desvio padrão de cada nível da curva de calibração. O cálculo do teste de Grubbs é
dado pela equação (2).
55
Caso o valor de G calculado seja menor que G tabelado, o ponto em questão não será
considerado outlier.
As curvas em fase aquosa e em matriz foram comparadas e realizou-se o teste t
para verificar as equivalências das mesmas (variâncias agrupadas).
A equação do teste t é:
|𝑑𝑚1 −𝑑𝑚2 |
𝑡=
2 (
𝑠𝑝
√
1
−
1
𝑛𝑔1 𝑛𝑔2
(3.1)
)
A saber:
𝑑𝑚 = desvio médio de cada grupo
𝑠𝑝2 = variância agrupada
𝑛 = grau de liberdade de cada grupo
A variância agrupada é calculada pela equação (3.2):
sp2 =
SQd1+SQd2
nG1 +nG2
(3.2)
Sendo,
SQ = soma dos quadrados dos resíduos de cada grupo.
Se o valor do t calculado for menor que o valor de t tabelado as curvas serão
consideradas equivalentes, não existindo efeito matriz significativo.
3.6.2 Linearidade
Após os cálculos de verificação de outliers e homocedasticidade, foi verificada a
proporcionalidade das concentrações do analito na amostra, dentro de um intervalo
estudado.
A linearidade será calculada pelo método dos mínimos quadrados, no caso de as
respostas apresentarem homocedasticidade. Em caso de heterocedasticidade, a avaliação
56
será pelo método dos mínimos quadrados ponderados. Estes critérios serão avaliados pela
equação (2.1).
O critério de aceitação será de a obteção de R 2>0,99 (ANVISA, 2003).
3.6.3 Limite de Detecção (LD)
Foram realizadas vinte repetições de leitura de branco e o limite de detecção foi
calculado pela equação (2.4).
3.6.4 Limite de Quantificação (LQ)
O LQ é o menor valor de concentração detectado. Foram realizadas vinte
repetições de leitura de branco e o limite de detecção foi calculado utilizando -se a
equação (2.5). Para Hg, foram feitas 10 repetições de leitura de branco.
3.6.5 Limite de Decisão, Capacidade de Detecção e Incerteza
O CCα e o CCβ foram obtidos pelas equações (2.6) e (2.7), respectivamente. A
incerteza combinada é a soma das incertezas de todos os fatores que influenciam no
resultado (MAPA, 2011). Na figura 3.6 estão representados os fatores que contribuem
para a incerteza da análise e o valor foi calculado pela equação (3.3). A incerteza
combinada para a curva de calibração foi calculada tomando-se como base o guia da
EURACHEM.
57
curva de calibração
coeficiente
linear
diluição
massa
temperatura
coeficiente
angular
balança analítica
volume
conc (ng g-1)
repetitividade
teor do mineral
Figura 3.6 Diagrama de Ishigawa das incertezas para curvas de calibração
2
2
2 + 𝑢2
(𝐶𝑎𝑛𝑎𝑙 ) = √𝑢𝑚
𝑟𝑒𝑝𝑒 + 𝑢𝑑𝑖𝑙 + 𝑢𝑐𝑎𝑙
(3.3)
Onde,
c𝑎𝑛𝑎𝑙 = concentração do analito na amostra
𝑢𝑚 = incerteza associada à massa
𝑢𝑟𝑒𝑝𝑒 = incerteza associada à repetitividade
𝑢𝑑𝑖𝑙 = incerteza do fator de diluição
𝑢𝑐𝑎𝑙 = incerteza associada à curva de calibração
Para cálculo do CCα e o CCβ foram realizadas vinte leituras de amostra branca
fortificada na concentração do LMR para cada um dos elementos.
Para o cálculo das incertezas, foram consideradas as incertezas da balança analítica e
das vidrarias, cujos valores constam no certificado de calibração dos mesmos. A incerteza
expandida é baseada em uma incerteza padrão combinada, multiplicada por um fator de
abrangência k = 2,04, fornecendo um nível de confiança de 95%.
Na tabela 3.7 estão os dados necessários para o cálculo. A incerteza e o fator de
abrangência constam nos certificados de calibração. Para repetitividade foi utilizado o
58
coeficiente de variação das concentrações de LMR. A incerteza combinada é a soma de
todas as incertezas envolvidas.
Tabela 3.7 Dados utilizados nos cálculos de incerteza
Instrumento
Incerteza
Fator de
expandida abrangência (k)
(certificado)
(certificado)
temperatura (°C)
0,06
1,73
Balão
volumétrico
Balança
analítica
Fatores
associados
Incerteza
combinada
0,032357379
volume (mL)
2
2,00
tara
0,0005
2,00
massa
0,0005
2,00
0,00035355
3.6.6 Exatidão
Para a avaliação da exatidão do método, foram avaliados os parâmetros
recuperação, repetitividade e precisão intermediária de acordo com os procedimentos
descritos abaixo.
3.6.6 1 Recuperação
A recuperação foi calculada pela equação (2.9) foi estimada avaliando-se os
resultados obtidos pelas amostras fortificadas em três níveis de concentração
correspondentes a faixas de concentrações baixa, média e alta da curva de calibração,
com sete repetições para cada nível, como mostrado na tabela 3.8:
59
Tabela 3.8 Faixas de concentrações/massas para avaliação de recuperação.
Concentração
As
Cd
Pb
Hg1
Baixa
30
5
10
9
Média
70
10
60
15
Alta
300
35
100
25
-1
(ng g )
Nota: 1 valores em ng
3.6.6 2 Repetitividade e Precisão intermediária.
Para avaliação da repetitividade e da precisão intermediária, efetuaram-se análises nas
amostras fortificadas nas faixas de concentração alta, média e baixa. Foram realizadas 7
repetições de leituras em 3 faixas de concentração diferentes e em diferentes. Os critérios
de aceitação constam nas tabelas 2.2 e 2.3.
60
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 OUTLIERS
Através do teste de Grubbs, foi verificado não haver outliers nos grupos de leituras de
sensibilidade/efeito matriz, linearidade ou seja, todos os valores de Gcalc são menores que o de
Gtab. Para 7 leituras, o valor de Gtab é 2,02
4.2 HOMOCEDASTICIDADE
As figuras 4.1, 4.2, 4.3, 4.4 mostram a comparação das curvas de calibração obtidas
para cada elemento estudado, os valores de coeficiente de correlação (R2) e as equações das
retas.
A comparação foi feita em relação às curvas construídas em fase aquosa e aquelas construídas
com matriz (adição de padrão), sendo reveladas que ambas as curvas são homocedásticas.
Figura 4. 1 Curva analítica x curva de adição padrão do As
61
Figura 4.2 Curva analítica x curva de adição padrão do Cd.
Figura 4.3 Curva analítica x curva de adição padrão do Pb.
Figura 4.4 Curva analítica x curva de adição padrão do Hg.
Os resultados do Teste de Cochran foi utilizado para calcular a homocedasticidade
(equação 2.3) das curvas e os resultados encontram-se na tabela 4.1.
62
Tabela 4.1Valores do teste de Cochran calculados para cada elemento.
Tipo de curva
As
Cd
Pb
Água (Ccrit = 0,397)
0,366
0,389
0,358
Matriz (Ccrit = 0,430)
0,379
0,420
0,378
Pelo teste de Cochran verifica-se que os valores de Ccalculado para mercúrio foi 0,336 e
0.424, para as curvas em água e matriz, respectivamente, considerando-se Ccrítco = 0,430, para
ambas as curvas.
Como os valores de Ccalculado são menores que o Ccrítco, para todos os elementos, podese dizer que tanto para as curvas construídas em fase aquosa quanto para aquelas construídas
em matriz, os métodos podem ser considerados homocedásticos.
4.3 SELETIVIDADE/EFEITO MATRIZ
A avaliação de seletividade/efeito matriz foi verificada pelo teste t pareado, conforme
pode ser verificado na tabela 4.2.
Tabela 4.2 Resultados do teste t pareado
As
Cd
Pb
Hg
0,148
0,227
0,07
0,449
Os resultados mostraram que a matriz não tem efeito significativo sobre a
quantificação das amostras no intervalo estudado, comparando-se as curvas construídas com
água e ácido nítrico 3 % e a curva de adição de padrão, pois o valor t cal < ttab (ttab = 2,021).
Desta forma, as análises poderão ser realizadas nas curvas analíticas construídas em água.
4.4 LINEARIDADE
63
Após os cálculos de verificação de outliers e homocedasticidade, foi verificada a
relação linear do intervalo estudado. Na tabela 4.3 encontram-se os valores de R 2, para
cada uma das curvas os elementos.
Tabela 4.3 Valores de R2 para as curvas de calibração.
As
Cd
Pb
Hg
Critério de
aceitação
Água
0,999
0,999
0,999
0,997
0,990
Matriz
0,999
0,999
0,999
0,995
0,990
4.5 LIMITE DE DETECÇÃO (LD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LQ)
Os valores de LD e LQ obtidos para cada elemento encontram-se na tabela 4.4. Para
todos os elementos, LQ e LD estão dentro da faixa de trabalho dos métodos.
Tabela 4.4 Resultados LQ e LD para os elementos estudados (ng g-1)
Elemento
As
Cd
Pb
Hg
r
0,999
0,999
0,999
0,995
Faixa
trabalho
0 - 400
0 - 40
0 - 120
0 - 30
LD
LQ
2,02
0,11
1,9
0,03
8,64
0,49
9,60
-0,14
Para mercúrio, n = 10 e valores em ng
4.6 LIMITE DE DECISÃO, CAPACIDADE DE DETECÇÃO E INCERTEZA
Os valores encontrados para cada um dos respectivos parâmetros estão na tabela 4.5,
considerando-se α e β igual a 5%, valor estabelecido para substâncias permitidas (MAPA
2011).
64
Tabela 4.5 Resultados de CCα, CCβ e incerteza para As, Cd e Pb e Hg,
Analito
As
CCα (ng g-1)
1005,94
CCβ(ng g-1)
1011,89
Cd
100,26
100,52
Pb
301,59
303,19
Hg
1000,10
1000,20
Os valores encontrados para CCα e CCβ foram muito próximos aos seus respectivos
LMRs, estando, portanto, de acordo com a recomendação do MAPA para estes parâmetros.
Os resultados da avaliação da incerteza estão na tabela 4.6
Tabela 4.6 Resultados da incerteza
As
Massa
média (g)
0,5048
Fator de
diluição
2,5
Valor encontrado
(ng g-1)
979,69
Incerteza
(ng g-1)
± 32,30 (3,3%)
Cd
0,5048
2,5
124,71
± 4,0 (3,2%)
Pb
0,5048
2,5
305,28
± 19,52 (6,4%)
Hg
0,1490
-
1071,83
± 109,68 (10,2%)
Analito
A partir de três amostras brancas fortificadas no limite do LMR, foram calculadas as
incertezas para cada um dos elementos. Para todos os elementos o valor encontrado foi abaixo
de 10% com exceção do mercúrio. É de se esperar que a diferença entre o valor encontrado e
o LMR para o cádmio fosse maior que o dos outros elementos, uma vez que a fortificação
deste elemento foi de 25 ng g-1 e não 20 ng g-1, que de acordo com a diluição e o volume
utilizados seria o valor a ser considerado.
As figuras 4.5, 4.6 , 4.7 e 4.8 são apresentam os gráficos com as fontes de incerteza e a
contribuição percentual de cada uma delas
65
Teor de mineral
Repetitividade
Massa
Fator de diluição
Curva de calibração - Amostra
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
Figura 4.5 Contribuição de cada fator para As
Teor de mineral
Repetitividade
Massa
Fator de diluição
Curva de calibração - Amostra
0,00%
20,00% 40,00% 60,00%
Figura 4.7 Contribuição de cada fator para Cd
80,00%
100,00%
66
Teor de mineral
Repetitividade
Massa
Fator de diluição
Curva de calibração - Amostra
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
Figura 4.6 Contribuição de cada fator para Pb
Teor de mineral
Repetitividade
Massa
Fator de diluição
Curva de calibração - Amostra
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00% 100,00%
Figura 4.8 Contribuição de cada fator para Hg
Pelos gráficos apresentados pode-se perceber que cada fator contribuiu de forma
diferente para cada elemento. O mercúrio foi o elemento com maior incerteza associada à
massa, uma vez que a concentração na curva é em massa. Para os demais elementos, no
entanto, o fator de diluição contribui significativamente na incerteza dos resultados.
67
4.7 EXATIDÃO
4.5.1 Recuperação/Precisão
Os critérios de aceitação serão baseados nos critérios do MAPA, de acordo com a
tabelas 2.2 e 2.3. A recuperação será avaliada pela recuperação, calculada pela equação (7),
uma vez que foi utilizada matriz fortificada e a precisão será verificada pelo coeficiente de
variação (CV), calculado pela equação (8).
Desta forma, o critério de aceitação de recuperação para As, Cd, Pb e Hg será entre
80% a 110% e de precisão será de 15%
Os resultados da recuperação e da precisão (repetitividade) de cada elemento são
apresentados nas tabelas, 4.7, 4.8, 4.9 e 4.10 com amostras de controle preparadas de forma
independente em concentrações alta (A), média (M) e baixa (B) lidas nas curvas de
calibração, com seus respectivos desvio padrão (s) e coeficiente de variação (CV) e na tabela
24 estão os resultados da precisão intermediária, expressos como coeficiente de variação.
Tabela 4.7 Recuperação As (conc = ng g-1)
Conc
A
M
B
Dia 1
Dia 2
Média
Média
s
CV
s
recuperação
recuperação
104,53%
103,7%
0,050 4,77%
0,054
104,10%
103,4%
0,014 1,32%
0,018
108,75%
108,3%
0,018 1,63%
0,011
CV
5,22%
1,79%
0,98%
Tabela 4.8 Recuperação Cd (conc = ng g-1)
Conc
A
M
B
Dia 1
Média
s
96,35% 0,055
92,11% 0,014
96,01% 0,015
cv
5,74%
1,53%
1,53%
Média
93,84%
90,00%
95,81%
Dia 2
s
CV
0,023 2,44%
0,039 4,34%
0,016 1,65%
68
Tabela 4.9 Recuperação Pb (conc = ng g-1)
Conc
A
M
B
Média
90,2%
92,4%
90,7%
Dia 1
s
cv
Média
0,065 7,24% 90,9%
0,009 0,98% 90,8%
0,017 1,90% 89,1%
Dia 2
s
0,070
0,022
0,018
CV
7,68%
2,44%
2,02%
Tabela 4.10 Recuperação Hg (ng)
Conc
A
M
B
Dia 1
Média
s
86,66% 0,031
85,64% 0,027
85,55% 0,026
CV
3,55%
3,11%
2,99%
Média
86,38%
82,60%
84,82%
Dia 2
s
CV
0,016 1,86%
0,016 1,98%
0,011 1,27%
Os valores de recuperação foram considerados satisfatórios, em comparação com os
critérios do MAPA para as faixas de concentração estudada, ou seja, para concentrações entre
maiores que 10 µg kg-1, o coeficiente de variação aceitável é de 15 % e a recuperação pode
variar entre 80 a 110%. Não foram observadas diferenças significativas nos dois dias
(precisão intermediária). Os CVs foram inferiores a 15%.
69
4.6 RESULTADOS DA ANÁLISE DE PESCADO
Na tabela 4.11 estão apresentados os resultados das análises em pescadinha.
Tabela 4.11 Resultados de Hg, As e Cd em pescadinha.
Hg
(ng g-1± s)
As
(ng g-1± s)
Cd
(ng g-1± s)
Pb
(ng g-1± s)
A1
12,62 ± 0,50
165,45 ± 7,13
224,17 ± 0,40
Nd
A2
9,91 ±0,30
264,45 ± 9,19
243,96 ± 0,20
Nd
A3
5,34 ± 0,16
242,62 ± 5,60
216,24 ± 0,12
Nd
A4
5,26 ± 0,14
224,80 ± 8,82
224,29 ± 0,66
Nd
A5
11,75 ± 0,44
181,29 ± 5,68
193,91 ± 1,49
Nd
A6
11,04 ± 0,23
266,78 ± 2,65
178,70 ± 0,59
Nd
A7
8,11 ± 0,10
133,66 ± 5,92
138,08 ± 0,50
Nd
A8
12,00 ± 0,16
135,64 ± 8,46
133,55 ± 0,22
Nd
A9
12,59 ± 0,23
144,93 ± 10,15
132,50 ± 0,20
Nd
A10
13,99 ± 0,09
120,06 ± 0,83
120,06 ± 0,74
Nd
ND = não detectável; s = desvio padrão
Os valores encontrados estão abaixo dos valores permitidos pelo MAPA.
70
5 CONCLUSÃO
Foi possível desenvolver as etapas de preparo e de digestão de amostras para análise
de metais em pescado.
Foi possível desenvolver os métodos de quantificação de As, Cd e Pb por ICP-OES e
Hg por analisador direto de mercúrio em pescado .
Os parâmetros mínimos obrigatórios para validação dos métodos foram considerados
satisfatórios.
A avaliação do pescado apresentou resultados muito inferiores aqueles estabelecidos
pelo MAPA, embora a região de origem seja uma área com histórico de contaminação por
metais. Porém, devido ao pequeno número de dados, os resultados não podem ser conclusivos
e nem serem utilizados como indicadores da situação ambiental da Baía de Sepetiba.
71
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85
ANEXO – Tabelas estatísticas
Fonte: http://rgufal.com/estatistica/tabela_t.pdf
86
Fonte: http://www.de.ufpb.br/~ulisses/disciplinas/tabela_cochran_5.pdf
87
TABELA TESTE G
Número de
medidas
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
5% de
Significância
1,15
1,48
1,71
1,89
2,02
2,13
2,21
2,29
2,36
2,41
2,46
2,51
2,55
2,59
2,62
2,65
2,68
2,71
Fonte: http://www.portalaction.com.br/1449-19-teste-de-valor-extremo-grubbs
88