Revista Científica 001_04.P65 - Associação Catarinense de Medicina

Arquivos Catarinenses de Medicina V. 33. no. 1 de 2004 15
0004-2773/04/33
Arquivos Catarinenses de Medicina
ARTIGO ORIGINAL
Implicação clínica da caracterização genotípica do câncer de
pulmão não pequenas células , baseado na mutação do gene K-ras
Romero Fenili1
Resumo
Abstract
O câncer de pulmão é uma das doenças de maior
índice de mortalidade no mundo. Afeta ambos os sexos,
com predominância no sexo masculino. Atualmente, estudam-se as alterações genéticas implicadas na sua origem. Dentre os genes estudados, destaca-se o K-ras,
objeto deste trabalho.
Objetivo: o objetivo deste estudo é analisar a presença da mutação do oncogen K-ras no Câncer de Pulmão Não Pequenas Células como fator prognóstico, e
determinar a freqüência de mutações.
Material e métodos: foram estudados de forma
retrospectiva 192 pacientes com câncer de pulmão, no
período de janeiro de 1988 a outubro de 1992. Foi extraído e amplificado o ADN utilizando-se a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Posteriormente,
procedeu-se a busca de mutações através da técnica de
Dot-blot.
Resultados: a idade predominante foi de 60 a 69
anos sendo 96% dos pacientes do sexo masculino. O
tipo histológico predominante foi o Carcinoma Escamoso, seguido do Adenocarcinoma. Foram observadas
mutações do oncogen K-ras em 51 pacientes (27%) e
esta aumentou conforme avançava o estadio do paciente. A mutação do codon 12 foi a mais freqüente. A presença do oncogen K-ras mutado fez a sobrevivência cair
de 15 para 8 meses.
Conclusão: a presença do oncogen K-ras mutado
foi um fator prognóstico negativo na série estudada.
Lung cancer is the most lethal neoplasm in the world.
It affects both genders, but the male sex is still the most
affected. Genetic mutations are considered to be responsible by its appearance, and its study try to identify
these genetic mutations. K-ras gene is one of the genes
enrolled in lung cancer appearance.
Objective: The purpouse of this study is to identify
K-ras gene mutations in lung cancer and determine its
prognostic effect.
Material and Methods: We studied retrospectively 192 patients with lung cancer treated between January 1988 to October 1992. DNA samples were collected,
amplified by polimerase chain reaction (PCR). After, Dotblot technique was used to detect mutations in K-ras
gene.
Results: Age was predominant between 60 to 69
years and male was the majority (96%). Squamous cancer followed by adenocarcinoma were the most frequent.
K-ras gene mutations were observed in 51 (27%) of
patients and its frequency increased in advanced stages
of the disease. Codon 12 mutation was the most frequent. K-ras oncogen mutation made survival drop from
15 to 8 months.
Conclusion: we concluded that the presence of Kras gene mutated is an negative prognostic factor.
Keywords:
Descritores:
Introdução
Câncer é uma doença causada por múltiplas alterações genéticas que levam a uma proliferação celular
descontrolada.1,2 O câncer de pulmão é uma das principais causas de morte no mundo e a principal causa de
morte por câncer em pessoas maiores que 35 anos.
1. Doutor em Medicina e Cirurgia. Professor do Departamento de Medicina
da Universidade Regional de Blumenau - FURB.
Financiamento parcial pelo Instituto de Cooperación Ibero Americano
Efeito da mutação do K-ras no Ca pulmão
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pulmão não pequenas células , baseado na mutação do gene K-ras
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Apenas um terço dos pacientes com câncer de pulmão
são diagnosticados a tempo de realizar-se a ressecção
cirúrgica com intento curativo, sendo atualmente a melhor possibilidade terapêutica.3 A maioria dos pacientes
são tratados com quimio e/ou radioterapia, ou simplesmente com tratamento paliativo. Este câncer é a principal causa de morte nos Estados Unidos da América4 e
responsável por alta mortalidade na Comunidade Européia5 e no Japão.6 O sexo masculino é o predominante,
embora com o aumento do consumo de tabaco no feminino, a incidência neste sexo vem aumentando. Diversos fatores etiológicos têm sido observados, desde agentes minerais até irradiação, mas o principal fator etiológico continua sendo o tabaco. O consumo de tabaco é
responsável por cerca de 90% dos casos de câncer pulmonar7, sendo seu risco diretamente relacionado à quantidade de cigarros fumados.
A carcinogênese do câncer de pulmão passa por diversos fatores etiológicos que levariam a alterações genéticas. Estas provocariam alterações na cascata natural de proliferação e morte celular, levando assim, ao
desenvolvimento da lesão cancerosa. Os genes implicados nestas alterações são os oncogens e os genes supressores tumorais. O primeiro é um gene normal, o proto-oncogene que, quando ativo, leva à transformação
maligna, passando então a chamar-se oncogen.8 Os genes supressores são aqueles cujo produto protéico é necessário para o normal funcionamento celular; quando
perdem sua função promovem o desenvolvimento tumoral. Os gens RAS são oncogenes inicialmente identificados no sarcoma de ratos, de onde deriva seu nome.9
Eles formam uma pequena família da qual fazem parte
os gens H-ras, K-ras e N-ras. Esta família encontra-se
em todos os eucariotas e é uma crítica reguladora de
numerosas funções fisiológicas.10 Sua mutação está implicada na gênese de diversos tipos de tumores, como o
câncer biliar11, o adenoma gástrico12, câncer de ovário13, pâncreas14, cólon15 e pulmão.16
no período de janeiro de 1988 a outubro de 1992. Foram
excluídos do estudo os pacientes dos quais não se obteve material para estudo genético, os pacientes falecidos
no pós-operatório imediato por outras causas, e os pacientes dos quais não se pode obter a evolução clínica. O
seguimento dos pacientes foi realizado a cada três meses no primeiro ano e posteriormente a cada 6 meses.
Foram coletados dados quanto ao tipo do tumor, tratamento empregado, presença de recidiva, tempo de sobrevivência e mutações encontradas. Os pacientes foram estadiados segundo o método TNM e classificados
em estadio I, II, IIIA, IIIB e IV. O estado clínico dos
pacientes foi classificado pelo método de Karnofsky.
As amostras tumorais foram obtidas da peça cirúrgica, em pacientes submetidos a tratamento cirúrgico, ou
do material da biópsia diagnóstica no caso de pacientes
submetidos a tratamento clínico.
A análise do oncogen K-ras realizou-se no laboratório de biologia molecular do Hospital Germans Trias i
Pujol, sendo utilizado o ADN genômico obtido dos tecidos tumorais. Após a obtenção deste material foi realizado um controle de quantidade e qualidade. Após o
controle, foi realizada a amplificação do ADN utilizando-se a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR), onde, através do emprego de exon predeterminado, amplificamos de forma logarítimica a quantidade
do ADN a ser estudado. Após a amplificação, procedeu-se a busca de mutações através da técnica de Dotblot, técnica de hibridação na qual o material da PCR é
hibridado por uma sonda específica revelando se há ou
não mutação.
A análise estatística utilizada para a curva de sobrevivência foi o método de Kaplan e Meier, aplicando as
provas comparativas de Mantel-Cox, Tarone-Ware,
Breslow y Peto-Prentice. O modelo de Cox proportional-hazards foi utilizado para estudar os efeitos prognósticos das diferentes variáveis no fator sobrevivência.
As provas estatísticas na análise comparativa entre proporções de variáveis foram realizadas utilizando o Quiquadrado ou o teste de Fisher.
Objetivos
Objetivo deste estudo é analisar a presença da mutação do oncogen K-ras no Câncer de Pulmão Não Pequenas Células como fator prognóstico, e determinar a
freqüência de mutações.
Pacientes e Métodos
Foram analisados de forma retrospectiva um total de
192 casos de Carcinoma Pulmonar Não Pequenas Células, tratados de forma cirúrgica ou quimioterápica no
Hospital Germans Trias i Pujol – Barcelona – Espanha -
Resultados
Os 192 pacientes foram distribuídos por grupos etários, predominando a faixa etária entre 60 e 69 anos
(58,5%). A distribuição por sexo revelou predominância
do sexo masculino (96%). O coeficiente de Karnofsky
foi maior que 80% em 82% dos pacientes. A distribuição dos estadios da doença I, II, IIIA, IIIB e IV foram
respectivamente 19%, 7%, 38%, 16% e 21%. O tipo
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histológico predominante foi o Carcinoma Escamoso
(56%), seguido do Adenocarcinoma (30%) e do Carcinoma de Células Grandes Indiferenciado (14%).
Dos 192 pacientes, foram observadas recidivas em
150 (78%), sendo que 64% destas foram observadas no
primeiro ano, 23% no segundo ano e o restante nos próximos 3 anos. Do total de recidivas, 85 delas (57%) foram metástases à distância e 65 casos (43%) recidivas
locais. Dentre as localizações das metástases, a mais
freqüente foi a óssea (34 casos). As demais foram fígado, cérebro, pulmão, adrenal e outros. Cento e sete pacientes (56%) foram tratados cirurgicamente.
Foram encontradas mutações do oncogen K-ras em
51 pacientes (27%). Observou-se que conforme avançava o estadiamento da doença, aumentava a freqüência de mutações, (Estadio I, 19%; Estadio II, 16%; Estadio IIIA, 25%; Estadio IIIB, 22%, e Estadio IV, 42%).
A mutação do oncogen K-ras foi identificada em 21,5%
dos pacientes tratados cirurgicamente e em 33% dos
pacientes tratados com quimio e/ou radioterapia. No
Carcinoma Escamoso foram detectadas mutações em
32% dos casos, no Adenocarcinoma em 30% e no Carcinoma de Células Grandes em 27%. A mutação do codon 12 do tipo Aspartato e Serina, foi a mais freqüente,
ocorrendo em 15 pacientes, o que corresponde a 30%
das mutações. Quando analisamos a sobrevivência dos
pacientes, encontramos uma sobrevivência média de 43
meses para os pacientes do estadio I, sobrevivência que
piora conforme avança o estadio da doença, caindo para
18 meses no estadio II, 14 no IIIA, 10 no IIIB e 4 no
estadio IV (p<0,0001). O estudo da sobrevivência em
relação ao tipo histológico do tumor mostrou que o Carcinoma de Células Grandes teve o pior prognóstico, com
uma sobrevivência média de 8 meses. O Adenocarcinoma apresentou 9 meses e o Carcinoma Escamoso 15
meses de sobrevivência média (p<0,02). Na análise da
sobrevivência em relação à presença de mutação do
oncogen K-ras, observamos que a sobrevivência média
encontra-se em 15 meses, naqueles sem mutações, e
em 8 meses, nos que apresentavam a mesma mutação
(p=0,003). As mutações do tipo Aspartato e Serina no
codon 12 revelaram pior prognóstico. Os pacientes portadores desta mutação, apresentaram sobrevivência
média de 5 meses contra 10 meses no grupo que apresentava outras mutações (p=0,01). A presença de mutação nos diferentes estadios da doença, revelou-se estatisticamente significativa apenas no estadio IIIA. As
curvas de sobrevivência, segundo a presença da mutação do oncogen K-ras, dividindo os pacientes segundo o
tratamento (cirúrgico ou com quimio e/ou radioterapia),
também não apresentou diferença estatisticamente significativa.
Ao analisar o valor estatístico das variáveis relacionadas com o tempo de sobrevivência média dos 192
pacientes deste estudo, através do modelo de Cox Proprtional Hazards, encontramos que o estadio da doença
apresenta uma p=0,0001, a presença da mutação do
oncogen K-ras p=0,04, e o tipo de mutação p=0,07.
Discussão
A faixa etária predominante (dos 60 aos 69 anos)
concorda com a encontrada na literatura, média de 63,217
e 63,6.18 A distribuição por sexo (96% masculino) também condiz com a encontrada na literatura, onde o sexo
masculino é o mais afetado em diversos estudos, embora na maioria deles em proporções menores. Na Finlândia, estudo de Ridanpää18, 85% dos pacientes eram do
sexo masculino. Quanto ao tipo histológico, a maioria
dos estudos encontra o Carcinoma Escamoso como sendo o mais freqüente18, como neste estudo, onde foi responsável por 56% dos casos. O achado de 78% de recidivas nos nossos pacientes pode ser devido, em parte,
ao fato de que a maioria dos pacientes encontrava-se
em estadios avançados da doença (Estadio IIIA, IIIB e
IV). As localizações das metástases também são coincidentes com a literatura. No Carcinoma Escamoso as
metástases hepáticas são encontradas em 30% dos casos, e somente em 10% no sistema nervoso central, ao
contrário do Adenocarcinoma e do Carcinoma de Células Grandes, nos quais o sistema nervoso central é afetado em 50% dos casos. Devido a maior freqüencia do
Carcinoma Escamoso, predominou o seu padrão de
metastatização.
A predominância do tipo de mutação do oncogen
K-ras corresponde à encontrada na literatura. Rodenhuis19 encontrou mutações do oncogen K-ras em 14%
dos pacientes analisados, sendo que 100% delas foram no codon 12. Bongiorno20 encontrou a mutação
do K-ras no codon 12 em 70 a 80% dos casos de
carcinoma pulmonar.
A freqüência de mutação observada em todos os
tipos histológicos apresenta cifras em torno de 30%.
Mitsudomi4 evidenciou a presença do gen K-ras em
20% dos Adenocarcinomas analisados e em 42% de
um grupo que o autor denomina como outros tipos de
Carcinoma não Célula Pequena. Rosell16 encontra valores distintos, observando mutação do gen K-ras em
26,6%, 15,8% e 50%, respectivamente para o Carci17
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noma Escamoso, o Adenocarcinoma e o Carcinoma de
Células Grandes. Entretanto, este autor apresenta apenas 6 casos de Tumores de Grandes Células. Ridanpää18
encontrou em 50 casos de Carcinoma Escamoso pulmonar e em 27 casos de Adenocarcinoma pulmonar,
ativações do gen K-ras em 4% e 49% respectivamente. Todos os estudos estão em desacordo com os dados encontrados por nosso trabalho, a excessão do trabalho de Rossel16, pois todos apresentam baixas taxas
de mutação para o Carcinoma Escamoso. O trabalho
de Rossel é o único que, como o nosso, foi realizado na
Espanha, o que nos faz ponderar a influência da regionalidade neste achado.
Quando analisamos a sobrevivência segundo o estadio encontrado, observamos dados que são concordantes com a literatura e com a história natural da doença,
onde, ao progredir a doença, a taxa de sobrevivência cai
de 43 meses no estadio I para 4 meses no estadio IV.
Quanto à sobrevivência analisada em relação ao tipo
histológico, observamos maior sobrevivência nos pacientes com Carcinoma Escamoso, fato observado em
toda a literatura.
Ao analisar a sobrevivência global quanto à presença
do oncogen K-ras mutado, observamos que aqueles em
que esta mutação foi encontrada a sobrevivência foi praticamente a metade daqueles que não a tinham (8 meses
versus 15 meses). Rosell16 revelou dados similares, apresentando uma sobrevivência média de 15 e 32,9 meses,
respectivamente para os pacientes que apresentavam e
não apresentavam mutações. Rodenhuis21 também demonstrou pior sobrevivência dos pacientes com o oncogen K-ras mutado. Alguns autores como Mitsudomi4 e
Silini22 chegaram a valores sem significação estatística.
Ainda na análise das mutações, observamos que as do
tipo Aspartato e Serina no codon 12 representaram um
fator de pior prognóstico para os pacientes que as apresentavam (5 meses versus 10 meses de sobrevivência).
Este fato é corroborado no trabalho de Mitsudomi4, que
demonstrou que a presença das mutações do codon 12
também era um fator de pior prognóstico. É importante
ressaltar que o estadio da doença e a mutação do oncogen K-ras foram as únicas variáveis estatísticamente significativas no estudo multivariável de sobrevivência.
Atualmente já se conhecem agentes químicos que
podem produzir mutações nos oncogenes K-ras, como é
o caso do 7,12 dimetilbenzantraceno, o benzopireno e o
ozônio, entre outros. Muitos destes agentes são derivados da queima do cigarro, sendo o principal a 4-(metilnitrosamina)-1-(3piridil)-1-butanona (NNK).23
Alguns estudos nos levam a pensar que a mutação
do oncogem K-ras seja um dos passos iniciais no desenvolvimento da neoplasia24, pois ele estaria presente em
tumores iniciais de pele, pulmão e fígado.
Alguns autores tentam utilizar o K-ras como método
de diagnóstico inicial e precoce, buscando assim sua
mutação nos materiais coletados por punção aspiração
com agulha fina (PAAF) ou em lavado broncoalveolar2,
até mesmo em escarro de pacientes.25 Com isto, o que
se observa, tanto através de nosso estudo como da literatura, é a perspectiva de que o K-ras possa tornar-se
um elemento útil tanto para o diagnóstico precoce quanto para o estabelecimento do prognóstico do paciente.
Além disto, a terapia gênica, uma realidade que em determinados tumores já está a nosso alcance, embora com
resultados iniciais discretos, pode vir a tornar-se uma
nova ferramenta no combate aos tumores. Para isto,
temos que conhecer cada vez mais estes novos elementos que são os oncogenes.
Conclusão
A presença de mutação do oncogen K-ras foi um
fator prognóstico significativo. No estudo global, a sobrevivência variou de 15 meses nos pacientes sem a
mutação para 8 meses naqueles que a apresentavam
(p=0.003). Além disto, um grupo específico, aqueles em
que a mutação foi do tipo Aspartato e Serina, apresentaram pior prognóstico que os outros tipos de mutações
(p=0.01).
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Endereço para correspondência:
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