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UCS15A, a non-kinase inhibitor of Src signal transduction Sharma, S.V. et al. (2001). Oncogene 20: 2068-2079 Daniela Sofia Santos Bessa Licenciatura em Bioquímica 3º ano Trabalho realizado no âmbito do Projecto Tutorial SRC-non receptor protein tyrosine kinase 1º protoncogene descoberto- pp60c-src C-SRC (cellular-src) 1ª tirosina cinase identificada Oncogene V-SRC (viral-src) Proteína transformadora do Vírus de Sarcoma de Rous Proteína de 60kDa com actividade tirosina cinase constitutiva Estrutura da c-Src e da v-Src tirosina cinases Terminal Amina Principal local de autofosforilação Tyr 416 Terminal carboxílico SH1SH1-cinase SH1-cinase Local de autofosforilação SH1(Cinase) Domínio catalítico (Tyr416) Local de ligação ao ATP SH2 e SH3 Domínios reguladores de ligação a proteínas Funções da c-Src Retirado de http://www.ebi.uc.uk/interpro/potm/ 2003_2/page_1.htm c-Src Envolvida em vias de sinalização relacionadas com a divisão celular CANCRO Regula a actividade osteoclástica OSTEOPOROSE Inibidores da src-cinase podem ser utilizados como agentes terapêuticos - Moléculas que interferem com a actividade cinase; Classe de inibidores - Moléculas que interferem com a estabilidade da src - Moléculas que destroem interacções proteicas. Tecidos com maior expressão da c-src Plaquetas Neurónios Osteoclastos Osteoclastos Envolvidos na reabsorção óssea e no remodelamento ósseo Maior actividade osteoclástica Osteoporose Knock–out do gene src em ratos (src-/src-) Igual número de osteoclastos Diminuição da actividade de reabsorção óssea Expressão de src deficiente na actividade cinase Recuperação parcial do fenótipo Src é um possível alvo para a inibição da reabsorção óssea Identificação de inibidores de via de sinalização de c-src que não afectem a actividade catalítica (actividade cinase) Metodologia de sreening de drogas inibidoras da c-src Super expressão da v-src em S. cerevisiae Compostos produzidos por microrganismos isolados do solo Recuperação do crescimento Adição à estirpe de S. cerevisiae transformada • Herbimicina Compostos isolados Inibição do crescimento Inibição da actividade src Compostos não tóxicos • Radicicol • UCS15A – produzido por Streptomyces sp. Estrutura química da UCS15A (RMN) UCS15A inibe a fosforilação de tirosina em células NIH3T3 transformadas com v-src SDS-PAGE Níveis de proteína semelhantes - controlo Anti -ptyr Aumento dos níveis da proteína fosforilada UCS15A (µM) Tratamento com UCS15A resultou na redução da fosforilação de resíduos de tirosina em varias proteínas UCS15A inibe a fosforilação de resíduos de tirosina da cortactina e Sam68 Proteínas totais Proteínas imunoprecipitadas com anti-sam 68 •Diminuição da proteína fosforilada de 2 substratos da Src Proteínas imunoprecipitadas com anti-cortactin •Níveis de proteína mantêm-se constantes. UCS15A não é citotóxico UCS15A inibe a fosforilação dos resíduos de tirosina da cortactina e sam68 mas não afecta os níveis de proteína total. UCS15A não inibe a actividade da tirosina cinase da v-src PP2 (inibidor da actividade cinase) vs USC15A Ensaio in vitro UCS15A Determinação da actividade cinase da v-src no péptido CDC2 (substrato da src) UCS15A não inibe a actividade cinase da v-src PP2 Ensaio in vivo •Utilização de células 3T3 v-src •Anticorpo específico antifosfotirosina Níveis de fosforilação constante Tyr-416 (essencial à actividade cinase) UCS15A não inibe a actividade cinase da v-src nem in vivo nem in vitro UCS15A não é um agente destabilizador da vsrc Herbimicina destabilizam a v-src Radicicol revertem a morfologia das células transformadas com v-src (UCS1006) UCS15A tem mecanismo de acção diferente de agentes destabilizadores da src UCS15A destrói a interacção entre a v-src e a sam68 e outra proteína não identificada Imunoprecipitação com Src Baixa interacção v-src – sam68 Quebra de interacções entre proteínas Diminuição da Sam68 fosforilada é provocada pela menor associação à Src. Efeito da UCS15A na actividade osteoclástica de MNCs (osteoclast likemultinucleated cells) Src Envolvida na actividade osteoclástica Viabilidade celular e % reabsorção óssea vs [UCS15A] UCS15A inibe a actividade osteoclástica mas não a viabilidade da célula UCS15A não é citotóxico Conclusões • Screening de drogas inibidoras de actividade da Src levou á identificação de um novo composto: UCS15A UCS15A; • UCS15A é um inibidor da Src com potencial de acção terapêutico; • UCS15A aparentemente inibe a fosforilação pela Src de substratos in vivo, incluindo a cortactina e o sam68; • UCS15A não inibe a actividade tirosina cinase da Src; • UCS15A não destabiliza a Src; • UCS15A exerce efeitos inibitórios de interacções de Src associadas com outros substratos Inibição da via de sinalização • UCS15A inibe actividade de reabsorção de osteoclastos; • UCS15A não é citotóxico Possível fármaco no tratamento/prevenção da osteoporose BIBLIOGRAFIA ◊ Alvarez, R. H., Kantarjian, H. M., Cortes, J. E., The Role of Src in Solid and Hematologic Malignances. Development of New-Generaion Src Inhibitors. 2006; 1918-1925 ◊ Seeliger, M. A. et al, High yield bacterial ex◊pression of active c-Abl and c-Src tyrosine kinases. Protein & Science. 2005; 14: 3135-3139
