Tese
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Ricardo José Morello EFEITO DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO REMOTO NO TRANSPLANTE DE INTESTINO FETAL EM CAMUNDONGOS Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Titulo de Doutor em Ciências. SÃO PAULO 2009 Ricardo José Morello EFEITO DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO REMOTO NO TRANSPLANTE DE INTESTINO FETAL EM CAMUNDONGOS Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Orientadora: Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero Co - Orientadora: Profa. Dra. Márcia K. Koike ii UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRURGIA Chefe do Departamento: Profa Dra. Lydia Massako Ferreira Coordenador do Programa de Pós-Graduação: Prof. Dr. José Luiz Martins iii Ricardo José Morello EFEITO DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO REMOTO NO TRANSPLANTE DE INTESTINO FETAL EM CAMUNDONGOS BANCA EXAMINADORA PRESIDENTE DA BANCA: Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero Professora Afiliada e Livre Docente da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP MEMBROS EFETIVOS: Prof. Dr. José Luiz Martins Professor Livre-Docente e Titular da Disciplina de Cirurgia Pediátrica da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP. Prof. Dr. Manuel de Jesus Simões Professor Associado do Departamento de Morfologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP. Prof. Dr. José Lúcio Martins Machado Professor do Departamento de Cirurgia e ortopedia da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP e Diretor do Curso de Medicina da Universidade Cidade de São Paulo – UNICID. Profa. Dra. Márcia Bento Moreira Professora Adjunta da Fundação Universidade Federal do Vale do São Francisco UNIVASF. MEMBROS SUPLENTES: Profa. Dra. Maria Aparecida Galhardo de Souza Professora Adjunta da Universidade Federal Fluminense - UFF. Profa Dra. Susi Heliene Lauz Medeiros Professora Adjunta da Universidade Federal do Rio Grande - FURG. iv DEDICATÓRIA Aos meus pais, pela dedicação, amor e educação que deram a mim e aos meus irmãos, nos apoiando e incentivando em todos os momentos de nossas vidas. v DEDICATÓRIA À minha amada esposa Tatiana, que ilumina meus dias com muito amor e carinho. . vi AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero, Professora Afiliada e Livre Docente da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, minha eterna gratidão pela sua competência, dedicação e paciência na orientação desta obra, proporcionando meu desenvolvimento na vida acadêmica e pessoal. Profa. Dra. Márcia Kiyomi Koike, Professora dos cursos de Medicina e Biomedicina da Universidade Cidade de São Paulo - UNICID, minha coorientadora, exemplo de perseverança e obstinação em busca de seus objetivos, e que contribuiu impecavelmente em todas as etapas desta obra, sempre disponível e paciente, agradeço pelo apoio e confiança. vii AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. José Luiz Martins, Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação, Professor Titular da Disciplina de Cirurgia Pediátrica da UNIFESP, pelas oportunidades, ensinamentos e constante apoio. À Profa. Dra. Celina Tizuko Fujitama Oshima, Professora do Departamento de Patologia da UNIFESP-EPM, que prontamente abriu as portas do laboratório para realização da imunohistoquímica. Ao Prof. Dr. Manuel de Jesus Simões, Professor Livre Docente da Disciplina de Histologia e Biologia Estrutural da UNIFESP, pelos ensinamentos transmitidos sempre com capacidade e gentileza. Ao colega de Pós-Graduação Dr. Ricardo Camelo, do Programa de PósGraduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP, pela ajuda inestimável durante a realização deste projeto. À colega de Pós-Graduação Dra. Luciana Lamarão Damous, do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP, pelas palavras de apoio, sempre em boa hora. Ao colega de Pós-Graduação Dr. Marcos de Souza Abrahão, do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP, pela amizade e companheirismo. À colega de Pós-Graduação Sônia Maria da Silva, do Programa de PósGraduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP, pelo companheirismo em todas atividades realizadas durante este período. Aos Colegas do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP, pela boa convivência. viii Aos técnicos Antonio Carlos de Sousa, Marcelo Silva e Joaquim Soares de Almeida, do Departamento de Patologia da UNIFESP, pelo processamento e coloração das lâminas de histoquímica e imunohistoquímica. Ao Carlos Eduardo Saldanha de Almeida, médico residente do Hospital São Paulo, que trabalhou com esse modelo experimental durante o PIBIC, pela grande colaboração durante a fase experimental deste trabalho. Ao biomédico Carlos Eduardo Benetti Ramalho da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental, pela amizade. À todos os Professores do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP-EPM, pelos ensinamentos transmitidos. À secretária do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação Valdelice Justiano Soares, pela competência e eficiência e bom humor durante esse período. À Elaine Maria Alves Bazzi Dantas e Adriana Bazzi Pedreira, Benedita Salete Costa Lima Valverde e Rita de Cássia Almeida Bonfim secretárias do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação, pela amizade e apoio durante esse período. Aos meus queridos irmãos Rosana, Sergio, pelo companheirismo e carinho demonstrado durante toda minha vida. À minha querida irmã Vera, que nos deixou muito cedo, mas está presente em nossos corações e pensamentos. À UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO – ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA – UNIFESP-EPM, por me receber como aluno do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação, possibilitando minha titulação. ix À FUNDAÇÃO COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR (CAPES) pela concessão da bolsa de doutorado. Aos animais de experimentação, meu profundo respeito e gratidão, sem os quais essa pesquisa não seria possível. x "Sê humilde para evitar o orgulho, mas voa alto para alcançar a sabedoria”. (Santo Agostinho) xi SUMÁRIO Dedicatória........................................................................................................... v Agradecimentos especiais.................................................................................. vii Agradecimentos.................................................................................................. viii Lista de Figuras................................................................................................... xiv Lista de Quadros.................................................................................................. xvii Lista de abreviaturas e símbolos......................................................................... xviii Resumo............................................................................................................... xix 1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 1 1.1. OBJETIVOS................................................................................................... 4 2 . MÉTODOS....................................................................................................... 5 Animais de experimentação................................................................................ 5 Procedimentos operatórios.................................................................................. 8 Anestesia............................................................................................ 8 Ato operatório no doador.................................................................... 10 Ato operatório no receptor................................................................... 13 Protocolo da imunossupressão .......................................................... 13 Avaliação histológica do enxerto transplantado ................................. 14 Imunohistoquímica do enxerto transplantado...................................... 17 Análise estatística................................................................................................. 20 3. RESULTADOS................................................................................................. 21 Desenvolvimento do enxerto de intestino fetal .................................. 21 Proliferação celular por expressão de PCNA...................................... 29 Apoptose por expressão de Caspase-3 clivada.................................. 35 Rejeição do enxerto de intestino fetal ................................................ 38 xii 4. DISCUSSÃO.................................................................................................... 39 5. CONCLUSÕES................................................................................................. 46 6. REFERÊNCIAS................................................................................................ 47 Abstract................................................................................................................. 54 Apêndices............................................................................................................. 55 Anexos.................................................................................................................. 59 Normas adotadas................................................................................................. xiii 61 Lista de Figuras Figura 1 Distribuição dos grupos estudados. ISO, transplante isogênico; ALO, transplante alogênico; PCI-R, precondicionamento remoto; Tx, grupo controle do transplante; FK, grupo tratado com Tacrolimo; PCI, grupo que recebeu enxerto submetido ao PCI-R; PCI-FK, grupo que recebeu enxerto submetido ao PCI-R e tratamento de Tacrolimo.................................................................... 7 Figura 2 Fotografia dos materiais utilizados no transplante de intestino fetal: observar o microscópio cirúrgico e o colchão térmico....................... 9 Figura 3 Fotografia destacando o instrumental microcirúrgico requerido na técnica de transplante de intestino fetal. ........................................... 9 Fotografias ilustrativas da obtenção do enxerto intestinal fetal. Em A, laparotomia mediana na prenhe; em B, corno uterino retirado do interior da cavidade abdominal, contendo os fetos; em C, feto de camundongo retirado do corno uterino; e em D, intestino exposto via laparotomia transversa, pronto para remoção cirúrgica do intestino. ............................................................................................ 11 Fotografias do intestino fetal e seu transplante no receptor. Em A, intestino com mesentério; em B, enxerto de intestino fetal desvascularizado e livre de mesentério; em C, abertura do espaço entre a parede posterior do músculo reto abdominal e o peritônio parietal, a seta mostra a cavidade pronta para o implante; e em D, o enxerto sendo posicionado no espaço do receptor. ...................... 12 Fotomacrografias do enxerto fetal transplantado. Em A, enxerto localizado no músculo reto abdominal após sete dias e, em B, enxerto removido e isolado. .............................................................. 14 Desenvolvimento do enxerto de intestino fetal no transplante isogênico (ISO) após sete dias de seguimento, avaliados segundo os critérios de Auber et al. (26). ISO-Tx: transplantado sem tratamento; PCI, transplantado submetido ao precondicionamento isquêmico remoto prévio; FK, transplantado tratado com Tacrolimo. *, P<0,05 vs. ISO-Tx; #, P<0,05 vs ISO-PCI. .................................... 21 Fotomicrografia de enxerto de intestino fetal no transplante isogênico após sete dias de seguimento. Em A, enxerto do grupo ISO-Tx; em B, enxerto do grupo ISO-PCI; em C, enxerto do grupo ISO-FK; e em D, enxerto do grupo ISO-PCI-FK. Pode-se observar vilosidades e criptas desenvolvidas e células caliciformes na parede do intestino (setas pretas). A camada muscular está indicada pelas setas brancas. HE...................................................... 22 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Desenvolvimento do enxerto de intestino fetal no transplante alogênico (ALO) após sete dias de seguimento, avaliados segundo xiv Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 os critérios de Auber et al. (26). ALO-Tx, transplantado sem tratamento; PCI, transplantado submetido ao precondicionamento isquêmico remoto prévio; FK, transplantado tratado com Tacrolimo. *, P<0,05 vs. ALO-Tx; #, P<0,05 vs ALO-PCI. .................................. 23 Fotomicrografia de enxerto intestinal fetal alogênico após sete dias de seguimento. Em A, enxerto do grupo ALO-Tx com intenso infiltrado inflamatório; em B, enxerto do grupo ALO-PCI; em C, enxerto do grupo ALO-FK; e em D, enxerto do grupo ALO-PCI-FK. Setas amarelas indicam intenso infiltrado inflamatório; Nas setas brancas observamos a camada muscular. A setas azuis mostram a presença de epitélio sem vilosidades em avançado estágio de rejeição. HE (100X)........................................................................... 24 Contagem de células caliciformes ao longo do epitélio do intestino após sete dias de seguimento de transplante isogênico. ISO-Tx, grupo submetido ao transplante isogênico; PCI, grupo com tratamento prévio de PCI-R; FK, grupo com tratamento de Tacrolimo. *, P<0,05 vs ISO-Tx. ....................................................... 25 Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal isogênico após sete dias de seguimento. Em A, enxerto do grupo ISO-Tx; em B, enxerto do grupo ISO-PCI; em C, enxerto do grupo ISO-FK; e em D, enxerto do grupo ISO-PCI-FK. Setas pretas mostram células caliciformes na parede do intestino. PAS/Alcian Blue (100X). ...................................................................................... 26 Quantificação de células caliciformes ao longo do epitélio intestinal em desenvolvimento no transplante alogênico (ALO). PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. *. P<0,05 vs ALO-FK............................................................................. 27 Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal isogênico após sete dias de seguimento. Em A, enxerto do grupo ALO-FK; em B, enxerto do grupo ALO-PCI-FK. Setas pretas mostram células caliciformes na parede do intestino. PAS/Alcian Blue (100X)........................................................................................ 28 Proliferação celular avaliada por marcação com anticorpo antiPCNA em enxerto de intestino fetal no transplante isogênico (ISO). ISO-Tx, grupo sem tratamento; PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. *, p<0,05 vs ISO-Tx; #, p<0,05 vs ISO-PCI; $, p<0,05 vs ISO-FK........................................................... 29 Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal isogênico após sete dias de seguimento marcados por imunohistoquímica com anticorpo anti-PCNA. Em A, grupo ISOTx; em B: grupo ISO-PCI; em C: grupo ISO-FK; e em D: grupo ISO-FK-PCI. Podem-se observar inúmeras células criptais marcadas positivamente coradas em marrom (100X).... 30 xv Figura 17 Figura 18 Figura 19 Figura 20 Figura 21 Figura 22 Figura 23 Figura 24 ................. Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal isogênico após sete dias de seguimento marcados por imunohistoquímica com anticorpo anti-PCNA. Em A, grupo ISO-Tx; em B: grupo ISO-PCI; em C: grupo ISO-FK; e em D: grupo ISO-FKPCI. Podem-se observar inúmeras células criptais marcadas positivamente coradas em marrom (400X)........................................ 31 Proliferação celular avaliada por marcação com anticorpo antiPCNA em enxerto de intestino fetal no transplante alogênico (ALO). PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. .......................................................................................... 32 Comparação entre os grupos de transplante isogênico (ISO) e alogênico (ALO) quanto aos efeitos do PCI-R (PCI) e/ou tratamento com Tacrolimo (FK) na proliferação celular em cortes do enxerto marcados com anticorpo anti-PCNA.................................................. 33 Proliferação celular avaliada por marcação com anticorpo antiPCNA em enxerto de intestino fetal nos transplantes isogênicos (ISO) e alogênicos (ALO). PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. Em A, grupo ISO-FK; em B: grupo ALOFK; em C: grupo ISO-FK-PCI; e em D: grupo ALO-FK-PCI. Podemse observar inúmeras células criptais marcadas positivamente coradas em marrom. (100x) .............................................................. 34 Apoptose do enxerto avaliada por marcação com anticorpo anticaspase-3 clivada em enxerto de intestino fetal no transplante isogênico (ISO). ISO-Tx, grupo sem tratamento; PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. *, p<0,05 vs ISOTx....................................................................................................... 35 Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal no transplante isogênico (ISO) após sete dias de seguimento: em A, grupo ISO-Tx; em B, grupo tratado com Tacrolimo, C: grupo submetido ao PCI-R e D: grupo com ambos tratamentos. Podemse observar inúmeras células da vilosidade marcadas positivamente para caspase-3 clivada. (100X). ................................ 36 Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal no transplante isogênico (ISO) após sete dias de seguimento: em A, grupo ISO-Tx; em B, grupo tratado com Tacrolimo, C: grupo submetido ao PCI-R e D: grupo com ambos tratamentos. Podemse observar inúmeras células da vilosidade marcadas positivamente para caspase-3 clivada. (400X)................................. 37 Rejeição do enxerto de intestino fetal no transplante alogênico (ALO) após sete dias de seguimento, avaliados segundo os critérios de Auber et al. (26). ALO-Tx, transplantado sem tratamento; PCI, transplantado submetido ao PCI-R prévio; FK, transplantado tratado xvi com Tacrolimo.*, P<0,05 vs. ALO-Tx; #, P<0,05 vs ALO-PCI............. Lista de Quadros Quadro 1 Critérios de classificação do grau de desenvolvimento e de rejeição do enxerto intestinal fetal, descrito por Auber et al, 1998 26..................................................... 16 Quadro 2 Critérios para avaliação imunohistoquímica................. 19 xvii 38 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ADP ALO ANOVA ATP BSA o C o GL cm FK g HE IR ISO Kg mg ml mm PAS/Alcian Blue PBS PCI PCI-R PCNA pH TX μl μm Adenosina difosfato Camundongos da linhagem Balb/C do grupo de transplante alogênico Análise de variância Adenosina trifosfato Albumina de soro bovino Graus Celsius Grau Gay-Lussac Centímetro Imunossupressor Tacrolimo - FK506 Grama Coloração de hematoxilina-eosina Isquemia-reperfusão Camundongos da linhagem C57 BL/6 do grupo de transplante isogênico Quilograma Miligrama Mililitros Milímetro Ácido periódico de Schiff complementado pela coloração de Alcian Blue Tampão salina fosfato Precondicionamento isquêmico Precondicionamento isquêmico remoto Antígeno nuclear de proliferação celular Potencial hidrogênio-iônico Transplante controle Microlitro Micrômetro xviii RESUMO Efeito do precondicionamento isquêmico remoto no transplante de intestino fetal em camundongos. Morello RJ, Koike MK, Montero EFS. Objetivo: avaliar os efeitos de precondicionamento isquêmico remoto (PCI-R) no modelo de transplante de intestino delgado fetal. Métodos: foram constituídos dois grupos: transplante isogênico (Iso, camundongos C57BL/6, n=24) e transplante alogênico (Alo, camundongos BALB/c, n=24). Em cada grupo, distribuíram-se os animais com e sem PCI-R, que foi realizado por oclusão da artéria femoral esquerda da fêmea prenhe durante 10 minutos, seguida por tempo igual de reperfusão. O imunossupressor utilizado foi Tacrolimo (Fk, 5 mg/kg/dia v.o.). Ao final obteve-se os seguintes subgrupos: Alo-Tx, Alo-Pci, Alo-Fk, Alo-Pci-Fk, Iso-Tx, Iso-Pci, Iso-Fk e Iso-Pci-Fk. O enxerto foi transplantado no espaço entre o músculo reto-abdominal e préperitoneal dos receptores a meio centímetro do apêndice xifóide, à esquerda da linha mediana. Após o sétimo dia de seguimento, o enxerto foi removido, fixado e embebido em parafina para avaliação histomorfológica (desenvolvimento e rejeição) e análise imunohistoquímica (anti-PCNA e anti-caspase-3 clivada). Os dados foram analisados usando ANOVA e testes complementares e foi considerado significante quando p <0.05. Resultados: A avaliação do desenvolvimento do enxerto no grupo de Iso mostrou que o PCI-R reduziu o desenvolvimento comparado com Iso-Tx (5,2±0,4 vs 9,0±0,8), o Fk e sua associação com PCI-R aumentaram o desenvolvimento do enxerto comparado com PCI-R (11,2±0,7 e 10,2±0,8, respectivamente). No grupo Alo, o Fk e/ou sua associação com PCI-R aumentaram o desenvolvimento comparado com Alo-Tx e Alo com PCI-R (6,0±0,8, 9,0±1,2, 0,0±0,0, 0,5±0,3, respectivamente). A expressão de PCNA foi maior no grupo ISO em animais tratados com Fk e PCI-R comparados a outros grupos (12,2±0,8 vs Tx: 8,8±0,9, PCI-R: 8,0±0,4 e Fk: 9,0±0,6). No grupo Alo, a expressão de PCNA não diferiu entre grupos. A rejeição do enxerto foi menor nos grupos tratados com PCI-R (-18%), Fk (68%) ou ambos (-61%) comparados com Alo-Tx. A expressão de caspase-3 clivada foi menor no grupo Iso em animais tratados com associação de PCI-R e Fk (6,2 ±0,9 vs Tx: 8,6±0,5; PCI-R: 5,8 ±0,9 e Fk: 6,0 ±0,3). Conclusão: O PCIR mostrou efeito benéfico sobre a lesão de isquemia e reperfusão do enxerto intestinal fetal nos transplantes isogênico e alogênico, aumentando o número de células caliciformes e a proliferação celular. No transplante alogênico, aumentou o desenvolvimento do enxerto, diminuiu o grau de rejeição aguda na ausência de imunossupressão, porém não apresentou efeito sinérgico com o imunossupressor. No transplante isogênico houve diminuição do grau de desenvolvimento do enxerto, porém foi efetivo na redução da apoptose. xix Morello, Ricardo José EFEITO DO PRECONDICIONAMENTO ISQUÊMICO REMOTO NO TRANSPLANTE DE INTESTINO FETAL EM CAMUNDONGOS. / Ricardo José Morello. --São Paulo, 2009. xix. 61 f. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação. Título em inglês: Effect of remote ischemic preconditioning on the fetal small bowel transplant in mice. 1. Transplante de tecido fetal. 2. Intestino delgado. 3. Tacrolimo. 4. Precondicionamento isquêmico. 5. Camundongos. 1. INTRODUÇÃO O transplante do intestino tem se tornado um tratamento definitivo para casos de falência intestinal crônica que não pode ser mantido com nutrição parenteral 1. Entretanto, a escassez de órgãos, como um dos fatores limitantes a esta terapêutica, tem estimulado o desenvolvimento de novas estratégias para a expansão do número de doadores 2. A utilização de enxertos de doadores com parada cardíaca é realizada com sucesso para rins e fígado 3. Esta alternativa para a expansão de doadores ainda não tem respaldo para o transplante de intestino, tendo em vista que estudo experimental em porcos mostrou alterações morfológicas da parede intestinal que repercutiram com perda da capacidade absortiva. Isto pode estar relacionado à elevada sensibilidade da mucosa intestinal à lesão isquêmica 2,4 . Desta forma, as condições de preservação do enxerto intestinal têm implicações na ocorrência das complicações pós-transplante 2 e, consequentemente, no processo de adaptação do intestino. No sentido de melhorar a qualidade do enxerto, alguns fatores já estão bem estabelecidos tais como hipotermia, tempo curto de isquemia e a solução de UW - University of Wisconsin 5. Acrescente-se ainda que, estudo recente, comparando esta solução com a solução de HTK - histidina - triptofano cetoglutarato, tenha mostrado eficácia semelhante na preservação do intestino6. Outras formas de proteção do enxerto têm sido pesquisadas com o intuito de minimizar a lesão de isquemia e reperfusão (IR) presente no transplante de intestino. Dentre essas, destaca-se o precondicionamento isquêmico (PCI), que consiste de um ou mais períodos curtos de isquemia com reperfusão intermitente e protege contra a lesão gerada por uma isquemia prolongada seguida de reperfusão 7. O papel do PCI em reduzir lesão isquêmica tem sido amplamente documentado em vários tecidos. Entretanto, o mecanismo envolvido no PCI não está bem esclarecido. Comparado com o transplante de outros órgãos sólidos, a transferência dos resultados, obtidos experimentalmente, no transplante intestinal para a prática clínica tem sido um processo lento 8. No caso do intestino delgado, vários estudos demonstraram que o PCI reduz a lesão associada a IR normotérmica, prevenindo a expressão de 2 P-selectina, adesão leucocitária e reduzindo a liberação de desidrogenase láctica na luz intestinal 7. Contribui também para a manutenção da integridade da mucosa intestinal, anulando a lesão ileal pós-isquemia e prevenindo a translocação bacteriana produzida pela IR, por um mecanismo que é iniciado pela inibição da óxido nítrico sintase induzida 9. Há relato ainda de que o PCI previne a diminuição da altura das vilosidades e melhora a hiperpermeabilidade da mucosa intestinal por meio da diminuição das concentrações locais de adenosina 10 . Adicionalmente, há diminuição dos níveis plasmáticos de lactato e das alterações morfológicas na lesão de IR intestinal normotérmica 11 . O PCI apresenta efeito tardio na microvasculatura intestinal, atenuando distúrbios microvasculares, melhorando a perfusão e diminuindo a interação leucócitoendotelial, associada à lesão de IR 12 . Estudo comparando diferentes tempos de PCI na lesão de IR intestinal mostrou que curtos períodos de PCI, de 10 minutos ou menos, promoveram proteção da mucosa intestinal. Entretanto, o período de 15 minutos promoveu lesão semelhante ao grupo IR, corroborando relato prévio 13,14. O PCI protege os enxertos intestinais da lesão de preservação, isquemia fria, e a subseqüente lesão de reperfusão no modelo de transplante intestinal em ratos. Este efeito protetor pode ser inibido pelo bloqueio da síntese do óxido nítrico em ratos precondicionados, indicando que o óxido nítrico endógeno é um dos mediadores inflamatórios que participam no PCI intestinal 8. Por outro lado, no autotransplante após preservação hipotérmica, foi capaz de atenuar a gravidade do estresse oxidativo e ativar a adaptação celular endógena no tecido intestinal 15 . Ainda observou-se efeito protetor precoce sobre as células epiteliais e a matriz extracelular do enxerto de intestino delgado 16. Estudos experimentais quanto clínicos confirmaram que o PCI desencadeia uma resposta protetora à lesão de IR em vários órgãos e tecidos, com conseqüente aumento da tolerância do órgão à hipóxia. Esta resposta se deve ao fato do PCI promover a manutenção da respiração celular, a diminuição da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, preservação da integridade e do funcionamento das membranas celulares. Assim, há redução da morte celular (necrose e apoptose) decorrentes da isquemia e do aumento do estresse oxidativo, que ocorre no início da reperfusão 17,18. 3 Além do efeito direto no órgão isquêmico, observou-se também repercussão sistêmica do PCI. Em modelos experimentais, o PCI realizado pela oclusão breve das artérias renal e mesentérica resultou na redução da área do infarto do miocárdio em ratos 19 . Este processo ficou conhecido como precondicionamento isquêmico remoto (PCI-R) indicando que o PCI não está limitado a um órgão ou sistema, mas que fatores neuro-humorais podem ser responsáveis pela proteção conferida à distância 20,21. Embora os mecanismos de proteção à distância não sejam completamente conhecidos, o PCI-R, por oclusão da artéria mesentérica superior, parece ocorrer via estímulo neuro-sensorial pela bradicinina sobre o coração isquêmico, o que não se observa quando o PCI é realizado diretamente no órgão 22 . Outro mecanismo proposto seria via supressão da sinalização inflamatória, como observado em leucócitos circulantes humanos após três ciclos de PCI em membro superior 23 . Experimentalmente, o PCI-R com oclusão da artéria ilíaca mostrou reduzir a lesão no transplante autólogo de ovários em ratas, promovendo neovascularização e aumento da capacidade de proliferação celular 24. Tendo em vista que o PCI protege o intestino na preservação hipotérmica, melhorando a condição do enxerto pós-transplante 8 ; que o mecanismo do PCI-R envolve vias diferentes de ação em relação ao PCI; e que, em estudo prévio em nosso laboratório, o PCI-R mostrou aumento da proliferação celular e neovascularização do enxerto ovariano 24 ; decidiu-se verificar o papel do PCI-R no transplante intestinal e sua repercussão no desenvolvimento intestinal e no processo de rejeição aguda alogênica. 4 1.1 Objetivos Objetivo Geral Avaliar o efeito do PCI-R na lesão de IR do enxerto intestinal do feto após transplante. Objetivos Específicos Avaliar histologicamente o grau de desenvolvimento do enxerto intestinal e o número de células caliciformes após o transplante isogênico e alogênico. Avaliar o grau de rejeição aguda do enxerto intestinal após o transplante alogênico. Avaliar a proliferação celular por marcação imunohistoquímica após o transplante isogênico e alogênico. Avaliar a apoptose por marcação imunohistoquímica após o transplante isogênico. 5 2. MÉTODOS Este trabalho foi realizado de acordo com as normas estabelecidas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação e o protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo sob protocolo CEP 0864/08. Animais de experimentação Todos os camundongos utilizados neste estudo foram obtidos do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais da Universidade Federal de São Paulo. Foram selecionadas quatro fêmeas prenhes da linhagem C57BL/6, com 18 a 20 dias de gestação, submetidas ou não ao PCI-R, que forneceram os fetos doadores de intestino delgado, como receptores utilizou-se camundongos machos, de oito semanas de idade, pesando entre 20 a 22 gramas, sendo da linhagem C57BL/6 (ISO) e da linhagem BALB/c (ALO), que serviram como receptores do transplante de intestino fetal. Os camundongos foram alojados separadamente em gaiolas, mantidos em estante de chapa galvanizada e permaneceram por um período de sete dias de adaptação da transferência para o biotério setorial. O biotério setorial possui salas com temperatura controlada (20º - 22º C) e ciclo claro e escuro com fotoperíodo igual a 12:12 horas. Durante as 12 horas que antecederam os procedimentos operatórios os animais ficaram em jejum. Os camundongos receptores foram submetidos ao transplante de intestino fetal e distribuídos em grupos com seis animais em cada, distribuídos primeiramente conforme a linhagem a que pertenciam e a presença ou não do tratamento com o imunossupressor Tacrolimo (FK). 6 Foram constituídos os seguintes grupos, conforme ilustra a Figura 1: - ISO-Tx - Transplante isogênico controle, sem tratamentos. - ISO-PCI - Transplante isogênico com PCI-R prévio no doador. - ISO-FK - Transplante isogênico com tratamento de Tacrolimo. - ISO-PCI-FK - Transplante isogênico com PCI-R prévio no doador e tratamento com Tacrolimo. - ALO-Tx - Transplante alogênico controle, sem tratamentos. - ALO-PCI - Transplante alogênico com PCI-R prévio no doador. - ALO-FK - Transplante alogênico com tratamento de Tacrolimo. - ALO-PCI-FK - Transplante alogênico com PCI-R prévio no doador e tratamento com Tacrolimo. 7 A Figura 1, abaixo, ilustra a distribuição dos grupos: Prenhe C57BL/6 Prenhe C57BL/6 PCI-R ISO ISO-Tx ISO-FK C57BL/6 ISO ALO ALO-Tx ALO-FK BALB/c ISO-PCI ISO-PCI-FK ALO-PCI C57BL/6 ALO ALO-PCI-FK BALB/c Figura 1 – Distribuição dos grupos estudados. ISO, transplante isogênico; ALO, transplante alogênico; PCI-R, precondicionamento remoto; Tx, grupo controle do transplante; FK, grupo tratado com Tacrolimo; PCI, grupo que recebeu enxerto submetido ao PCI-R; PCI-FK, grupo que recebeu enxerto submetido ao PCI-R e tratamento de Tacrolimo. 8 Procedimentos Operatórios Anestesia Após a pesagem, os animais foram anestesiados mediante administração de um composto anestésico de cloridrato de cetamina (80 mg.Kg-1, Fort Dodge®) e cloridrato de xilazina (10 mg.Kg-1, Bayer®) por via intramuscular, na face lateral da pata traseira direita. O animal foi considerado em plano anestésico na ausência do reflexo de retirada ao estímulo doloroso por preensão da pata traseira contra-lateral. Os animais foram submetidos à tricotomia e à anti-sepsia da parede abdominal com álcool 70 ºGL. Em seguida foram fixados com fita adesiva em decúbito dorsal à bancada cirúrgica, equipada com colchão térmico mantido em 37oC durante todo o experimento. Para a manutenção do plano anestésico, quando necessário, foi utilizada metade da dose inicial. Todo procedimento operatório foi realizado com auxílio de microscópio cirúrgico, no aumento de 16 vezes (Figura 2), e instrumental microcirúrgico (Figura 3). 9 Figura 2 – Fotografia dos materiais utilizados no transplante de intestino fetal: observar o microscópio cirúrgico e o colchão térmico (em verde). Figura 3 – Fotografia destacando o instrumental microcirúrgico requerido na técnica de transplante de intestino fetal. 10 Ato operatório no doador As fêmeas prenhes foram anestesiadas de acordo com o protocolo, em seguida, fixadas em posição dorsal sobre o colchão térmico. Após a anti-sepsia na região inguinal esquerda, realizava-se incisão paralela à prega com exposição dos vasos femorais para a realização ou não do PCI-R. Protocolo de precondicionamento isquêmico remoto O PCI-R foi obtido realizando-se isquemia da pata esquerda por 10 minutos, via clampeamento da artéria femoral com auxílio de um microclampe vascular, seguido por 10 minutos de reperfusão. Este procedimento foi realizado antes da laparotomia na prenhe. Para controle dos procedimentos, a fêmea na qual não foi realizado o PCI-R também foi realizada a dissecção da artéria femoral esquerda e observada pelo mesmo período de tempo. Obtenção do enxerto Após o período do PCI-R ou de observação, sob técnica cirúrgica limpa, foi realizada uma laparotomia para histerotomia e retirada do feto do interior da cavidade uterina. A seguir, foi realizada a remoção cirúrgica do intestino delgado do feto através de laparotomia transversa (Figura 4). O intestino delgado foi imediatamente mantido em solução fisiológica 0,9% a 4 o C. Procedeu-se a retirada cirúrgica do mesentério e o intestino foi dividido em segmentos de 1,0 cm de extensão (Figura 5). Cada feto foi abordado em separado, com o implante dos seguimentos intestinais realizados imediatamente após a obtenção dos mesmos. Após a obtenção dos seguimentos intestinais do último feto, a fêmea e os fetos foram submetidos à eutanásia com dose letal do composto anestésico. 11 B A C D Figura 4 – Fotografias ilustrativas da obtenção do enxerto intestinal fetal. Em A laparotomia mediana na prenhe; em B, corno uterino retirado do interior da cavidade abdominal, contendo os fetos; em C, feto de camundongo retirado do corno uterino; e em D, intestino exposto (seta branca) via laparotomia transversa, pronto para remoção cirúrgica do intestino. 12 A C B D Figura 5 – Fotografias do intestino fetal e seu transplante no receptor. Em A, intestino com mesentério; em B, enxerto de intestino fetal desvascularizado e livre de mesentério; em C, abertura do espaço entre a parede posterior do músculo reto abdominal e o peritônio parietal, a seta mostra a cavidade pronta para o implante; e em D, o enxerto sendo posicionado no espaço do receptor. 13 Ato operatório no receptor Transplante do enxerto intestinal Os camundongos receptores do enxerto de intestino fetal foram anestesiados e submetidos a uma incisão transversa subcostal esquerda da parede abdominal sem abertura do peritônio parietal, com cerca de 5 mm de extensão. A seguir, por divulsão com pinça microcirúrgica curva foi obtido um espaço entre a parede posterior do músculo reto abdominal e o peritônio parietal para implantação do enxerto de forma avascular (Figura 5) sem exteriorização das extremidades, conforme descrito por Kato et al (25) . Procedeu-se a aproximação do músculo reto abdominal por meio de sutura contínua com fio de prolene 8-0 e fechamento da pele por meio de sutura contínua com fio de prolene 7-0. Protocolo da imunossupressão O Tacrolimo comercializado em cápsulas contendo 1 mg foi dissolvido em solução aquosa a 1% de Carboximetil celulose. A dose diária utilizada para o tratamento dos grupos foi de 5 mg.Kg-1, via oral, durante sete dias. 14 Avaliação histológica do enxerto transplantado No sétimo dia pós-transplante, os camundongos foram novamente anestesiados e submetidos à laparotomia para a localização e remoção dos enxertos (Figura 6). Os animais foram sacrificados por dose letal do composto anestésico. A B Figura 6 – Fotomacrografias do enxerto fetal transplantado. Em A, enxerto localizado no músculo reto abdominal após sete dias e, em B, enxerto removido e isolado. 15 As peças foram fixadas por 12 horas em formol tamponado a 10%, desidratadas em álcool etílico e diafanizadas em xilol. Após a inclusão em parafina, foram realizados cortes histológicos de 4 µm. Os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e ácido periódico de Schiff complementado com coloração de Alcian Blue (PAS/Alcian Blue). Para exame morfológico do processo de desenvolvimento e/ou de rejeição do enxerto foi utilizado corte corado com HE, e avaliados sob microscopia de luz segundo o escore de desenvolvimento e rejeição proposto por Auber et al, em 1998 26 (Quadro 1). Para a quantificação das células caliciformes foi utilizada coloração de PAS/Alcian Blue e a histomorfometria foi realizada com auxílio de microscópio de luz acoplado a um sistema computadorizado de obtenção de imagens e programa de Image J obtido gratuitamente do site do The National Institutes of Health. 16 Quadro 1 - Critérios de classificação do grau de desenvolvimento e de rejeição do enxerto intestinal fetal, descrito por Auber et al, 1998 26. Desenvolvimento do enxerto: D1 Ausência ou presença de epitélio digestivo (0 - 1) D2 Importância da mucosecreção (0 – 3) D3 Desenvolvimento da camada muscular do intestino (0 – 3) D4 Desenvolvimento das criptas (0 – 3) D5 Desenvolvimento das vilosidades (0 – 3) Total escore: D1 + D2 + D3 + D4 + D5 (0 – 13) Rejeição do enxerto: R1 Tipo do infiltrado (0 – 3) 0 – Ausência do infiltrado; 1 – Infiltrado linfocitário; 2 – infiltrado misto; 3 – Infiltrado polimorfonuclear. R2 Importância do infiltrado peri e subcriptal (0 – 3) R3 Importância da camada muscular (0 – 3) R4 Lesão das criptas e vilosidades (0 – 4) 0 – ausência de lesão; 1 - excesso de células em mitose, sem necrose; 2 – Excesso de células em necrose; 3 - atrofia das vilosidades; 4 – necrose total do enxerto. Total escore: (R1 X R2) + (R1 X R3) + R4 (0 – 22) 17 Imunohistoquímica do enxerto transplantado Para a imunohistoquímica, cortes de 4 μm em lâminas tratadas com 3aminopropiltrietoxisilano foram utilizadas. Os cortes foram desparafinizados em estufa a 60 oC por 12 horas, seguido de banho de xilol em temperatura ambiente por 30 minutos. As lâminas foram hidratadas em banhos de etanol em concentrações decrescentes (etanol 95%, etanol 80%, etanol 70%), lavadas em água corrente e mantidas em tampão salina fosfato (PBS: 1,5 miliMolar de fosfato dibásico de potássio anidro, 8,5 miliMolar de fosfato monobásico de sódio anidro, 138 miliMolar de cloreto de sódio e 2,7 miliMolar de cloreto de potássio em água deionizada, pH 7,2). A recuperação antigênica foi realizada com uso de panela de Pascal, em tampão 0,01 Molar de citrato de sódio, pH 6,0, por 5 minutos, seguida de resfriamento à temperatura ambiente por mais 20 minutos. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizada com solução de peróxido de hidrogênio, 10 volumes, por 4 ciclos de 5 minutos, seguida por lavagem em água corrente e água destilada. Para o bloqueio de sítios inespecíficos, os cortes foram incubados em solução a 1% de albumina de soro bovino em PBS (BSA) por 15 minutos, desprezando o excesso após este tempo. O anticorpo primário foi diluído em solução de BSA na diluição de 1:100 para anticorpo monoclonal de camundongo anti-Caspase-3 Clivada humana (Cell Signaling Technology) e de 1:5000 para anticorpo policlonal de camundongo anti-antígeno de proliferação nuclear humano (PCNA, Cell Signaling Technology), e incubados sobre os cortes em câmara úmida por 18 horas a 4°C. Em seguida, os cortes foram lavados em PBS e incubados com anticorpo secundário biotinilado do Kit Advance (Dako), seguido de incubação com o complexo streptavidina-biotina-peroxidase do mesmo kit. As incubações foram realizadas em câmara úmida à temperatura ambiente por 15 minutos, seguido de lavagens em PBS. 18 A revelação foi realizada com solução a 1% de 3,3’-diaminobenzidina (Sigma) e peróxido de hidrogênio em PBS por 5 min a temperatura ambiente, seguida de lavagem em água corrente. A contracoloração foi realizada com hematoxilina de Harris por 1 minuto, seguida de lavagem extensiva em água corrente. Após desidratação e diafanização, as lâminas foram montadas com resina Entellan (Sigma). A análise da reação imunohistoquímica foi realizada em todo enxerto de intestino fetal considerando-se as vilosidades, criptas do epitélio intestinal e a camada muscular. Empregou-se uma avaliação semiquantitativa, por escore segundo critérios de localização de células marcadas positivamente para os anticorpos utilizados (Quadro 2). 19 Quadro 2 - Critérios para avaliação imunohistoquímica. Proliferação celular – Expressão de PCNA por Imunohistoquímica: P1 Marcação em vilosidades (0 - 4) P2 Marcação em cripta (0 – 4) P3 Marcação em camada muscular do intestino (0 – 3) Total escore: 3xD1 + D2 + D3 (0 – 15) Apoptose – Expressão de Caspase-3 clivada por Imunohistoquímica: P1 Marcação em vilosidades (0 - 4) P2 Marcação em cripta (0 – 4) P3 Marcação em camada muscular do intestino (0 – 3) Total escore: D1 + 3xD2 + D3 (0 – 15) 0 – Ausência de marcação; 1 – raras células marcadas; 2 – poucas células marcadas; 3 – muitas células marcadas; 4 – todas células marcadas 20 Análise estatística Os dados estão expressos em média ± erro padrão. O tipo de distribuição das variáveis e a hipótese de igualdade das variâncias foram testadas em todos os casos. O teste t de Student foi utilizado para a comparação dos dados entre os grupos de transplante isogênico e alogênico tratados com Tacrolimo e submetidos ou não ao PCI-R. A análise de variância (ANOVA ou ANOVA on ranks), complementada por teste de Student-Newman-Keuls ou de Dunn, foi utilizada para o restante das análises estatísticas, que incluíram os dados de escore de desenvolvimento e de rejeição, contagem de células caliciformes, escore de expressão de proliferação celular e apoptose. O nível de rejeição da hipótese de nulidade foi estabelecido pelo valor de P<0,05. Todas as análises foram realizadas pelo programa Sigma Stat Statistical versão 3.1. 21 3. RESULTADOS Desenvolvimento do enxerto de intestino fetal Transplante isogênico Avaliação do desenvolvimento do enxerto de intestino fetal no transplante isogênico após sete dias de seguimento, realizada segundo critérios 26 estabelecidos por Auber et al. , mostrou que o desenvolvimento foi significantemente menor no grupo ISO-PCI quando comparado ao grupo ISOTx. O grupo ISO-FK e o grupo ISO-PCI-FK mostraram maior escore de desenvolvimento do enxerto quando comparado ao grupo ISO-PCI (Figura 7 e 8). Escore de desenvolvimento do enxerto 14 # 12 # 10 8 * 6 4 2 ISO-Tx ISO-PCI ISO-FK ISO-PCI-FK Figura 7 - Desenvolvimento do enxerto de intestino fetal no transplante isogênico (ISO) após sete dias de seguimento, avaliados segundo os critérios de Auber et al. 26. ISO-Tx: transplantado sem tratamento; PCI, transplantado submetido ao precondicionamento isquêmico remoto prévio; FK, transplantado tratado com Tacrolimo. *, P<0,05 vs. ISOTx; #, P<0,05 vs ISO-PCI. 22 A B C D Figura 8 - Fotomicrografia de enxerto de intestino fetal no transplante isogênico após sete dias de seguimento. Em A, enxerto do grupo ISO-Tx; em B, enxerto do grupo ISO-PCI; em C, enxerto do grupo ISO-FK; e em D, enxerto do grupo ISO-PCI-FK. Podem-se observar vilosidades e criptas desenvolvidas e células caliciformes na parede do intestino (setas pretas). A camada muscular está indicada pelas setas brancas. HE. 23 Transplante alogênico Avaliação do desenvolvimento do enxerto de intestino fetal no transplante alogênico após sete dias de seguimento, realizada segundo critérios estabelecidos por Auber et al. significantemente maior nos 26 , mostrou que o desenvolvimento foi grupos tratados com Tacrolimo quando comparados ao grupo ALO-Tx ou ALO-PCI. O PCI-R não modificou de forma significante o desenvolvimento do enxerto na comparação múltipla dos grupos. Entretanto, na comparação entre os dois grupos independentes, ALO-FK e ALO-PCI-FK, observou-se significância (p=0,035) para o efeito benéfico do PCI-R em termos de escore de desenvolvimento (Figura 9 e 10). Escore de desenvolvimento do enxerto 14 *# 12 10 *# 8 6 4 2 0 ALO-Tx ALO-PCI ALO-FK ALO-PCI-FK Figura 9 – Desenvolvimento do enxerto de intestino fetal no transplante alogênico (ALO) após sete dias de seguimento, avaliados segundo os critérios de Auber et al. (26). ALOTx, transplantado sem tratamento; PCI, transplantado submetido ao precondicionamento isquêmico remoto prévio; FK, transplantado tratado com Tacrolimo. *, P<0,05 vs. ALO-Tx; #, P<0,05 vs ALO-PCI. 24 A B C D Figura 10 - Fotomicrografia de enxerto intestinal fetal alogênico após sete dias de seguimento. Em A, enxerto do grupo ALO-Tx com intenso infiltrado inflamatório; em B, enxerto do grupo ALO-PCI; em C, enxerto do grupo ALO-FK; e em D, enxerto do grupo ALO-PCI-FK. Setas amarelas indicam intenso infiltrado inflamatório; Nas setas brancas observamos a camada muscular. A setas azuis mostram a presença de epitélio sem vilosidades em avançado estágio de rejeição. HE. 25 Contagem de células caliciformes A contagem de células caliciformes no epitélio intestinal foi realizada como avaliação complementar do escore de desenvolvimento do enxerto de intestino fetal. No transplante isogênico, a quantidade de células caliciformes por extensão foi maior nos grupos que receberam o tratamento prévio de PCI-R e/ou o tratamento com Tacrolimo (Figura 11 e 12). Células caliciformes/100 μm 8 7 * * 6 * 5 4 3 ISO-Tx ISO-PCI ISO-FK ISO-PCI-FK Figura 11 – Contagem de células caliciformes ao longo do epitélio do intestino após sete dias de seguimento de transplante isogênico. ISO-Tx, grupo submetido ao transplante isogênico; PCI, grupo com tratamento prévio de PCI-R; FK, grupo com tratamento de Tacrolimo. *, P<0,05 vs ISO-Tx. 26 B A C D Figura 12 - Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal isogênico após sete dias de seguimento. Em A, enxerto do grupo ISO-Tx; em B, enxerto do grupo ISO-PCI; em C, enxerto do grupo ISO-FK; e em D, enxerto do grupo ISO-PCI-FK. Setas pretas mostram células caliciformes na parede do intestino. PAS/Alcian Blue (100X). 27 No transplante alogênico, a quantidade de células caliciformes por extensão foi mensurada apenas nos grupos tratados com Tacrolimo. Nestes, o grupo ALO-PCI-FK mostrou maior quantidade de células caliciformes que o grupo ALO-FK (Figura 13 e Figura 14). Células caliciformes/100 μm 6 * 5 4 3 2 1 0 ALO-FK ALO-PCI-FK Figura 13 – Quantificação de células caliciformes ao longo do epitélio intestinal em desenvolvimento no transplante alogênico (ALO). PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. *. P<0,05 vs ALO-FK. 28 A B Figura 14 - Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal alogênico após sete dias de seguimento. Em A, enxerto do grupo ALO-FK; em B, enxerto do grupo ALO-PCI-FK. Setas pretas mostram células caliciformes na parede do intestino. PAS/Alcian Blue (100X). 29 Proliferação celular por expressão de PCNA Transplante isogênico A avaliação da proliferação celular realizada mostrou que a associação entre o PCI-R e o tratamento de Tacrolimo promoveu intensa proliferação quando comparada aos demais grupos (Figura 15, 16 e 17). Escore de células marcadas (PCNA) 14 * #$ 12 10 8 6 4 2 0 ISO-Tx ISO-PCI ISO-FK ISO-PCI-FK Figura 15 – Proliferação celular avaliada por marcação com anticorpo anti-PCNA em enxerto de intestino fetal no transplante isogênico (ISO). ISO-Tx, grupo sem tratamento; PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. *, p<0,05 vs ISO-Tx; #, p<0,05 vs ISO-PCI; $, p<0,05 vs ISO-FK. 30 A B C D Figura 16 - Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal isogênico após sete dias de seguimento marcados por imunohistoquímica com anticorpo anti-PCNA. Em A, grupo ISO-Tx; em B: grupo ISO-PCI; em C: grupo ISO-FK; e em D: grupo ISO-FKPCI. Podem-se observar inúmeras células criptais marcadas positivamente coradas em marrom (100X). 31 A B C D Figura 17 - Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal isogênico após sete dias de seguimento marcados por imunohistoquímica com anticorpo anti-PCNA. Em A, grupo ISO-Tx; em B: grupo ISO-PCI; em C: grupo ISO-FK; e em D: grupo ISO-FK-PCI. Podem-se observar inúmeras células criptais marcadas positivamente coradas em marrom (400X). 32 Transplante alogênico Foi possível realizar a marcação da proliferação celular somente nos grupos tratados com Tacrolimo e a avaliação da proliferação celular não Escore de células marcadas (PCNA) mostrou diferenças entre os grupos (Figura 18). 12 10 8 6 4 2 0 ALO-FK ALO-PCI-FK Figura 18 - Proliferação celular avaliada por marcação com anticorpo anti-PCNA em enxerto de intestino fetal no transplante alogênico (ALO). PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. 33 Transplante isogênico vs. Transplante alogênico A comparação entre os efeitos do PCI-R e/ou associação com tratamento de Tacrolimo na proliferação celular via expressão tecidual de PCNA foi realizada entre os grupos de transplante isogênico e alogênico. O tratamento com Tacrolimo mostrou semelhante escore entre os grupos ISO-FK e ALO-FK (P=0,58). A associação com o PCI-R e o Tacrolimo também não mostrou diferenças entre os grupos ISO-PCI-FK e ALO-PCI-FK (P=0,28; Figura 19). 14 Escore de células marcadas (PCNA) 12 10 8 6 4 2 0 ISO-FK ALO-FK ISO-PCI-FK ALO-PCI-FK Figura 19 - Comparação entre os grupos de transplante isogênico (ISO) e alogênico (ALO) quanto aos efeitos do PCI-R (PCI) e/ou tratamento com Tacrolimo (FK) na proliferação celular em cortes do enxerto marcados com anticorpo antiPCNA. 34 A C B D Figura 20 - Proliferação celular avaliada por marcação com anticorpo anti-PCNA em enxerto de intestino fetal nos transplantes isogênicos (ISO) e alogênicos (ALO). PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. Em A, grupo ISO-FK; em B: grupo ALO-FK; em C: grupo ISO-FK-PCI; e em D: grupo ALO-FK-PCI. Podem-se observar inúmeras células criptais marcadas positivamente coradas em marrom. (100x) 35 Apoptose por expressão de Caspase-3 clivada Transplante isogênico A avaliação da apoptose realizada em cortes marcados com anticorpo anti-Caspase-3 clivada indicou que o PCI-R e/ou o tratamento com Tacrolimo foram efetivos na redução da apoptose quando comparados com o grupo ISOTx (Figura 21, 22 e 23). Escore de células amrcadas (Caspase-3) 16 14 12 * 10 * * 8 6 4 2 0 ISO-Tx ISO-PCI ISO-FK ISO-PCI-FK Figura 21 – Apoptose do enxerto avaliada por marcação com anticorpo anti-caspase3 clivada em enxerto de intestino fetal no transplante isogênico (ISO). ISO-Tx, grupo sem tratamento; PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. *, p<0,05 vs ISO-Tx. Na avaliação da apoptose do transplante alogênico houve falha técnica de imunohistoquímica não sendo possível sua realização. 36 A C B D Figura 22 - Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal no transplante isogênico (ISO) após sete dias de seguimento: em A, grupo ISO-Tx; em B, grupo tratado com Tacrolimo, C: grupo submetido ao PCI-R e D: grupo com ambos tratamentos. Podemse observar inúmeras células da vilosidade marcadas positivamente para caspase-3 clivada. (100X). 37 A C B D Figura 23 - Fotomicrografia representativa do enxerto de intestino fetal no transplante isogênico (ISO) após sete dias de seguimento marcadas por imunohistoquímica com anticorpo anti-caspase-3 clivada: em A, grupo ISO-Tx; em B, grupo tratado com Tacrolimo, C: grupo submetido ao PCI-R e D: grupo com ambos tratamentos. Podemse observar inúmeras células da vilosidade marcadas positivamente para caspase-3 clivada em marrom (400X). 38 Rejeição do enxerto de intestino fetal Transplante isogênico A avaliação da rejeição do enxerto de intestino fetal no transplante isogênico mostrou que não houve rejeição. Transplante alogênico Avaliação da rejeição do enxerto de intestino fetal no transplante alogênico após sete dias de seguimento, realizada segundo critérios estabelecidos por Auber et al. 26 , mostrou que houve menor rejeição nos enxertos submetidos aos tratamentos. O PCI-R reduziu a rejeição quando comparado ao grupo ALO-Tx, porém o tratamento com Tacrolimo em associação com o PCI-R ou não preveniu de maneira mais eficiente a rejeição Escore de rejeição 25 20 15 10 * * # *# 5 0 ALO-Tx ALO-PCI ALO-FK quando comparados com o ALO-PCI (Figura 24). ALO-PCI-FK Figura 24 - Rejeição do enxerto de intestino fetal no transplante alogênico (ALO) após sete dias de seguimento, avaliados segundo os critérios de Auber et al. 26. ALO-Tx, transplantado sem tratamento; PCI, transplantado submetido ao PCI-R prévio; FK, transplantado tratado com Tacrolimo. *, P<0,05 vs. ALO-Tx; #, P<0,05 vs ALO-PCI. 39 4. DISCUSSÃO O presente trabalho mostrou que o PCI-R interfere nos processos de desenvolvimento e de rejeição aguda do enxerto de intestino fetal. Nos enxertos isogênicos mostrou efeito benéfico, promovendo aumento da quantidade de células caliciformes e redução da ocorrência de apoptose. Quando adicionado o tratamento de Tacrolimo, houve maior escore de desenvolvimento do enxerto, evidenciado pelo aumento da proliferação celular, aumento da quantidade de células caliciformes e redução importante de apoptose. Do mesmo modo, nos enxertos alogênicos tratados com Tacrolimo, o PCI-R promoveu aumento do desenvolvimento e redução importante da rejeição. A contribuição fundamental desta pesquisa foi o efeito benéfico do PCI-R sobre o intestino transplantado, tanto de forma isogênica como alogênica. Esses efeitos evidenciados no modelo de transplante de intestino são inéditos e extremamente relevantes, uma vez que podem trazer contribuições efetivas na compreensão da evolução do enxerto intestinal pós-transplante. O escore de desenvolvimento do enxerto, descrito por Auber et al 26 , considera a presença de epitélio digestivo, vilosidades, criptas, camada muscular e importância da secreção mucosa. O prejuízo observado no escore de desenvolvimento promovido pelo PCI-R em enxertos isogênicos pode ser devido à dilatação cística do enxerto, consequente ao expressivo acúmulo de muco no interior da luz do intestino. Este acúmulo pode ser decorrente principalmente de dois fatores: aumento de células caliciformes, promovendo maior quantidade de secreção, e ausência de estoma neste modelo de transplante, comprometendo o aspecto das vilosidades na mucosa, resultando em menor escore de desenvolvimento. Assim, em condições de dilatação cística, como ocorreu neste grupo, a avaliação por escore pode ser subestimada empregando os critérios estabelecidos por Auber et al 26 . Isto indica que ao se realizar estudos com avaliação mais prolongada a confecção de estomias faz-se necessária. Experimentalmente, o emprego do camundongo como modelo de transplante de intestino delgado para estudos imunológicos aumentou desde a 40 década de 90 27 por oferecer vários recursos e vantagens experimentais como a disponibilidade de linhagens (congênicas, isogênicas, transgênicas e knockouts) com características imunológicas únicas, além das tecnologias disponíveis (anticorpos monoclonais e sondas para a biologia molecular) e o custo do animal e de sua manutenção 27,28 . Algumas limitações estão relacionadas a esse modelo animal, tais como desenvolvimento das habilidades microcirúrgicas, diâmetro vascular diminuto, intensidade de rejeição do camundongo menor (fígado, rins) do que no rato, podendo subestimar o processo de rejeição, apresentando uma sobrevida do enxerto mais variável. O transplante intestinal fetal apresenta boa reprodutibilidade e facilidade técnica de ser realizado, em ratos e camundongos, de forma avascular 29 . Apesar da imaturidade do sistema imune e o baixo poder imunogênico do tecido fetal 30 , o modelo de transplante de intestino fetal é aplicável para estudos referentes à modulação da resposta imunológica alogênica 25,26,31 . A ausência de mesentério, que faz parte desta técnica de transplante com um enxerto intestinal livre e um número diminuído de células T na placa de Peyer do intestino fetal do camundongo implica numa menor quantidade de células imunocompetentes, que pode ser agravado com a destruição decorrente da isquemia 25,26,32,33,34 . Entretanto, a resposta de rejeição aguda alogênica mostrou-se semelhante àquela induzida pelo tecido adulto em camundongos 26,31 , apesar de uma reação alogênica mais amena ter sido observada em ratos 32 . Além disso, este modelo é válido para estudo dos fenômenos imunológicos induzidos pelo aloenxerto, ou seja, não ocorre diminuição da imunogenicidade do enxerto, com desenvolvimento normal dos enxertos em 85% dos casos transplantados de maneira isogênica e 100% de rejeição quando transplantados de maneira alogênica corrobora o relato de Auber et al. 26 26 . O presente estudo , uma vez que houve perda completa do enxerto na ausência de imunossupressão no transplante alogênico e ausência de rejeição do enxerto isogênico. Rezende et al. 33 mostraram um desenvolvimento progressivo dos enxertos até o 5° PO, ainda que em níveis inferiores para o alogênico. Em seguida, observava-se o processo de rejeição aguda mais importante do que o processo de desenvolvimento. O transplante do tecido intestinal fetal alogênico é um excelente modelo para estudos do processo de rejeição aguda, pois esta 41 rejeição desencadeada pode ser controlada pelo Tacrolimo, permitindo o desenvolvimento normal do enxerto intestinal 35. O modelo de transplante de intestino fetal em camundongos tem-se mostrado um bom modelo para avaliação da imunogenicidade do enxerto, assim como da sua modulação 26,31 . Outro modelo de transplante intestinal avascular foi descrito por Ogasa et al 36 em ratos recém-nascidos, que foi usado para avaliação da preservação hipotérmica do intestino comparando duas soluções de preservação. Em estudos prévios em nosso laboratório, o modelo de transplante de intestino fetal foi utilizado para avaliação do processo de desenvolvimento e rejeição do enxerto em condições isogênica e alogênica 33,37,38,39 e para avaliação da imunomodulação pelo gangliosídeo no processo da rejeição 37,38 . Por outro lado, em nosso laboratório, também, vem sendo estudado o PCI, como forma de modulação da lesão de IR, e o PCI-R, em órgãos como fígado 40 , intestino 11,13 e, mais recentemente, no transplante avascular de ovário 24,41. Além da rejeição sabe-se que as consequências da isquemia em diferentes tecidos dependem da duração e que muitas das lesões são desenvolvidas durante o estágio de reoxigenação decorrente da reperfusão tecidual 21,42 . As mitocôndrias são alvos importantes dos danos provocados pelos processos de IR como diminuição das atividades da nicotinamida adenina dinucleotídeo ligada com hidrogênio desidrogenase, do carreador de adenosina difosfato/adenosina trifosfato (ADP/ATP) e da ATP sintetase, além do aumento na atividade da fosfolipase A2 43. Ocorre ainda, acentuado acúmulo de cálcio e aumento da geração de radicais livres pelas mitocôndrias. A associação destes eventos pode ser responsável pelas lesões e morte celular, decorrente da reperfusão, possivelmente por um fenômeno de transição de permeabilidade da membrana mitocondrial 44. Em 1984 pesquisadores utilizando miocárdio de coelhos, mostraram que um período curto de isquemia, prévio à isquemia cardíaca sustentada, produzia um efeito protetor contra a lesão cardíaca de IR introduzido na literatura por Murry et al. 46 45 , porém, o termo PCI foi e significa indução de um curto período de isquemia seguido por curto período de reperfusão antes de um período mais longo de isquemia. Os autores descreveram o efeito benéfico 42 deste procedimento sobre o tamanho da área de infarto causado por isquemia sem PCI, resultados semelhantes foram descritos por outros autores 47. O mecanismo de manutenção da respiração celular, a diminuição da produção de espécies reativas e a preservação da integridade e do funcionamento das membranas celulares, por meio de diversos mediadores estão sendo estudados como prováveis mecanismos de ação do PCI 17,18 . O PCI confere proteção tecidual possivelmente por melhorar a resistência celular à hipóxia reduzindo as necroses e as apoptoses decorrentes da isquemia e do intenso estresse oxidativo que decorre da reperfusão. Também reduz o consumo das reservas celulares de ATP, a concentração de catabólitos durante a isquemia sustentada, além da expressão de fatores desencadeantes de apoptose (como fator de necrose tumoral alfa, interleucina-1 beta e espécies reativas de oxigênio) e reduz o metabolismo das mitocôndrias 48,49. O PCI promove na reperfusão uma menor conversão da xantina desidrogenase para xantina oxidase em diversos tecidos, diminuindo a produção de ânion superóxido, protegendo os tecidos da lesão durante a fase da reperfusão 50 e suas conseqüências como a redução da peroxidação lipídica em tecido pulmonar medida através de seu produto malondialdeído 51. Também tem sido descrito induzir um menor consumo de ATP e inibição da glicólise, levando a um menor acúmulo de lactato e íon hidrogênio 11,52,53. O PCI também melhora o equilíbrio iônico e ácido-base, reduzindo o acúmulo intracelular de íons sódio e a acidose 54. A manutenção dos níveis de ATP e fosfato de creatina, em conjunto com a redução da taxa de demanda energética pela célula tem-se mostrado como uma hipótese central no mecanismo de ação do PCI no que se refere à respiração celular 46,52,55,56,57,58 . Parece haver, durante os períodos de isquemia do PCI, uma diminuição dos depósitos de glicogênio, sendo a glicólise diminuída no período isquêmico sustentado 18. Por induzir menor condutância ao íon potássio na membrana, leva a uma situação denominada de repouso de membrana, com uma inibição metabólica que permite a célula ser mais tolerante a hipóxia 59 . Parece ainda induzir uma redução na demanda energética durante a isquemia. No coração verificou-se que o PCI ativa canais de potássio sensíveis ao ATP na 43 mitocôndria, regulando os níveis de ATP e cálcio 60 . A mitocôndria tem papel fundamental na geração de espécies reativas de oxigênio, homeostasia do cálcio e liberação de fator indutor de apoptose. Assim, o PCI é capaz de reduzir a morte celular 61. O conceito do PCI tem sido estendido a diferentes órgãos e tecidos surgindo como estratégia de proteção entre órgãos contra os efeitos deletérios da IR aguda 21 . A repercussão sistêmica do PCI pode também atenuar a lesão à distância causada pela IR, este processo é chamado de PCI-R ou PCI à distância e não é limitado a um órgão ou sistema. Este mecanismo possui duas fases de proteção contra a lesão endotelial, uma precoce (curta, de até 4 horas) e outra tardia (mais prolongada, de 24 a 48 horas de duração), sendo ambas mediadas por ativação do sistema nervoso autônomo 55,62. Em 1993, Przyklenk et al.63 descreveram um mecanismo de proteção cardíaco com uso de breves períodos de isquemia em território distante da área de infarto. Posteriormente, Liaw et al.64 observaram que a isquemia de um grupo muscular protegeu o membro contralateral. Estudos subseqüentes mostraram que existia também uma proteção interórgãos, além do intra-órgão já descrita. Gho et al.65 mostraram que a isquemia transitória do músculo esquelético conferia proteção ao miocárdio. Embora os mecanismos de proteção à distância não sejam completamente conhecidos, sugere-se o envolvimento de um amplo espectro de supressão da sinalização inflamatória, que inclui também modificação da expressão gênica. Kimura et al .66 mostraram que na prática clínica o PCI-R promove aumento da vascularização endotelial, podendo ser uma técnica simples, segura e viável para proteção endotelial de vasos periféricos, já sendo considerado de uso seguro e útil em cirurgias eletivas de coração, fígado e pulmão 21,67. O PCI atenua a lesão de IR no fígado e no intestino, estendendo esta proteção aos pulmões 40,68 , quanto ao seu efeito sobre a vascularização, o PCI promoveu angiogênese com subseqüente melhora da função do miocárdio após oclusão coronária, evidenciado pelo aumento da densidade capilar/ arteriolar 69. Embora os mecanismos de proteção à distância não sejam completamente conhecidos, os efeitos do PCI-R, por oclusão da artéria 44 mesentérica superior, parecem ocorrer via estímulo neuro-sensorial pela bradicinina, o que não se observa quando o PCI é realizado diretamente no órgão 22 . Outro mecanismo proposto seria via supressão da sinalização inflamatória, como observado em leucócitos circulantes humanos após três ciclos de PCI em membro superior 23. O método usado para avaliar a proliferação celular, a imunohistoquímica para o PCNA, está baseado na expressão deste antígeno na fase G1 tardia e durante a fase S do ciclo celular. A escolha do anticorpo monoclonal anti-PCNA deveu-se à facilidade de se poder trabalhar com tecido fixado em parafina, ser resistente a fixação em formol, apresentar uma meia vida longa de aproximadamente vinte horas, indicando que o núcleo pode permanecer positivo mesmo após o estímulo 70. Em nosso estudo observou-se que o PCI-R no enxerto isogênico promoveu aumento de células caliciformes e redução da morte celular por apoptose. Por outro lado, na presença de Tacrolimo, o PCI-R estimulou a proliferação celular no enxerto isogênico e o desenvolvimento dos enxertos isogênico e alogênico. Mais recentemente, estudos avaliando os mecanismos intracelulares pelo qual o PCI protege os tecidos da lesão de IR tem sido conduzidos e apresentam resultados controversos. Tanto na isquemia quanto na reperfusão promovem aumento de ocorrência de apoptose nos diferentes tecidos estudados. No coração, a ativação do NF kappa B se relaciona à ocorrência de apoptose 71 . Na mucosa intestinal, a IR promove disfunção da respiração mitocondrial via formação de espécies reativas de oxigênio, em conseqüência, há intensa oxidação da glutationa mitocondrial, aumento da peroxidação lipídica mitocondrial, redução do potencial membrana mitocondrial e aumento da liberação do citocromo c da mitocôndria que culmina na ativação da caspase-9 e caspase-6 72. No coração e no intestino, o PCI não interfere na expressão de NF kappa B, mas eleva a expressão de Bcl-2, um gene antioxidante, com propriedade antiapoptótica, e este aumento se correlaciona inversamente com a ocorrência de apoptose e protege o tecido da peroxidação lipídica PCI também previne do acúmulo de xantina/hipoxantina 73 71 .O , reduz o 45 processo inflamatório e a expressão de caspase- 3 74,75 . Desta maneira, a redução da apoptose promovida pelo PCI no presente estudo pode indicar a preservação da vitalidade das estruturas intestinais no transplante de intestino fetal, e ser capaz de reduzir os riscos da síndrome de disfunção de múltiplos órgãos em outros tipos de transplante. As células caliciformes residentes no epitélio do intestino delgado e grosso são responsáveis pela produção e manutenção do muco protetor, secretando glicoproteínas de alto peso molecular, as mucinas 76,77 . É atribuída às células caliciformes intestinais o papel de manutenção da barreira intestinal, seja pela produção de mucinas, seja pela expressão de proteínas de adesão (ocludina e claudina-3) 78. Isto pode ser comprovado pela cinética de reparação do epitélio após a lesão de IR 77 . Em estudo experimental, Ikeda et al. 77 mostraram que, imediatamente após a lesão de IR, pode ser observado intenso descolamento dos enterócitos. Após cerca de 20 minutos, o epitélio começa a ser recoberto por células caliciformes e após 75 minutos, observa-se restituição completa do epitélio, sugerindo que as células caliciformes tem papel fundamental na reparação e na manutenção do epitélio intestinal após processo de IR. Os resultados obtidos neste estudo mostram uma proteção do enxerto intestinal fetal pelo PCI-R, aumentando o desenvolvimento e o número de células caliciformes, além de diminuir a apoptose e atenuar o processo de rejeição. Ainda observou-se indução da proliferação celular no enxerto, o que permitiu o processo de manutenção do reparo celular após a lesão de IR. 46 5- Conclusões O PCI-R mostrou efeito benéfico sobre a lesão de isquemia e reperfusão do enxerto intestinal fetal; O PCI-R mostrou efeito benéfico no transplante alogênico, aumentando o desenvolvimento do enxerto intestinal fetal, contrário ao que ocorreu no transplante isogênico em que houve diminuição do grau de desenvolvimento do enxerto; O PCI-R mostrou efeito benéfico nos transplantes isogênico e alogênico, aumentando o número de células caliciformes; O PCI-R mostrou efeito benéfico no transplante alogênico, diminuindo o grau de rejeição aguda do enxerto intestinal na ausência de imunossupressão, porém não apresentou efeito sinérgico com o imunossupressor; O PCI-R mostrou efeito benéfico nos transplantes isogênico e alogênico, aumentando a proliferação celular do enxerto intestinal fetal; O PCI-R no transplante isogênico foi efetivo na redução da apoptose. 47 6. 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Am J Physiol, 2006; 291:G938-G949. 54 ABSTRACT Effect of remote ischemic preconditioning in the fetal small bowel transplant in mice. Morello RJ, Koike MK, Montero EFS Purpose: to evaluate the effect of remote ischemic preconditioning (R-IPC) in the fetal small bowel transplantation model. Methods: two groups were constituted: the Isogenic transplant (Iso, C57BL/6 mice, n=24) and the allogeneic transplant (Alo, BALB/c mice, n=24). In each group, the animals were distributed with and without R-IPC, that was accomplished by occlusion of the left femoral artery of the pregnant female during 10 minutes, followed for similar time of reperfusion. The imunossupressor used was Tacrolimo (Fk, 5 mg/kg/day v.o.) It was obtained the following subgrups: Alo-Tx, Alo-IPC, Alo-Fk, Alo- IPC Fk, Iso-Tx, Iso- IPC, Iso-Fk and Iso- IPC-Fk. The graft was transplanted in the space between the straight-abdominal muscle and preperitoneal of the receivers to half centimeter of the xiphoid appendix, left of the medium line. After seven days follow-up, the graft of small bowel was removed and embedded in paraffin to histomorphological evaluation (the graft development and rejection) and immunohistochemical analysis (anti-PCNA and anti-caspase3 cleaved). Data were analyzed using ANOVA and post-hoc tests, and it was considered significant when p<0.05. Results: The graft development evaluation in Iso group showed that R-IPC reduced the development compared with Iso-Tx (5.2±0.4 vs 9.0±0.8) and Fk and its association with R-IPC increased the graft development compared with R-IPC (11.2±0.7 and 10.2±0.8, respectively). In Alo group, Fk and its association with R-IPC increased the development compared with Alo-Tx and Alo with R-IPC (6.0±0.8, 9.0±1.2, 0.0±0.0, 0.5±0.3, respectively). The PCNA expression was increased in Iso group only in animals treated with Fk and R-IPC compared to other groups (12.2±0.8 vs Tx: 8.8±0.9, R-IPC: 8.0±0.4 and FK: 9.0±0.6). In Alo group, PCNA expression did not differ among groups. The graft rejection was lower in groups treated with R-IPC (18%), Fk (-68%) or both (-61%) compared with Alo-Tx. The caspase-3 cleaved expression was lower in Iso group in animals treated with association of R-IPC and/or Fk (Tx: 8.6±0.5 vs R-IPC: 5.8 ±0.9; Fk: 6.0 ±0.3; R-IPC-Fk: 6.2 ±0.9). Conclusion: R-IPC showed benefic effect on the ischemy and reperfusion lesion of the fetal intestinal graft in the Isogenic and Allogeneic transplants, increasing the number of goblet cells and the cellular proliferation. In the Allogeneic transplant, it increased the development of the graft, it reduced the degree of acute rejection without Immunosuppression, however it didn't present synergic effect with the imunossupressor. In the Isogenic transplant there was decrease of the degree of development of the graft, however it was effective in the apoptosis reduction. 55 APÊNDICES Apêndice 1 -Valores individuais da avaliação do desenvolvimento do enxerto intestinal fetal isogênico, obedecendo aos critérios de Auber et al., 1998. 26 Camundongos Tx PCI FK PCI-FK 1 8 5 10 13 2 10 4 12 11 3 7 6 12 8 4 10 4 13 11 5 7 6 9 10 6 12 6 11 8 Média 9,0±0,8 5,2±0,4 11,2 *±0,7 10,2 *±0,8 Tx, grupo transplante controle isogênico; FK, tratamento com Tacrolimo; PCI, submetido ao PCI-R; *, p<0,05 vs PCI. Apêndice 2 -Valores individuais da avaliação do grau de desenvolvimento do enxerto intestinal fetal alogênico, obedecendo aos critérios de Auber et al., 1998.26 Camundongos Tx PCI FK PCI-FK 1 0 1 5 5 2 0 0 10 9 3 0 0 6 10 4 0 0 5 12 5 0 2 5 12 6 0 0 5 6 Média 0,0±0,0 0,5 ±0,3 6,0 ±0,8 9,0 ±1,2 Tx, grupo transplante controle alogênico; FK, tratamento com Tacrolimo; PCI, submetido ao PCI-R. Apêndice 3 -Valores individuais da contagem de células caliciformes ao longo do epitélio intestinal fetal. Camundongos Tx PCI FK PCI-FK 1 4,3 4,9 5,6 5,3 2 4,2 6,1 5,1 5,3 3 4,2 3,3 4,6 5,7 4 4,9 3,6 5,9 6,7 5 4,5 7,4 5,4 6,3 6 4,4 5,9 Média 4,4±0,1 5,1±0,8 5,3 ±0,2 5,9 ± 0,2 Tx, grupo transplante controle isogênico; FK, tratamento com Tacrolimo; PCI, submetido ao PCI-R; *, p<0,05 vs PCI. 56 Apêndice 4 -Valores individuais da contagem de células caliciformes ao longo do epitélio intestinal fetal no transplante alogênico. Camundongos FK PCI-FK 1 2,6 3,9 2 2,8 4,2 3 3,0 3,5 4 4,3 4,4 5 3,5 5,1 6 2,6 5,3 Média 3,1 ±0,4 4,4 ± 0,3 PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. *. P<0,05 vs ALO-FK. Apêndice 5 -Valores individuais da avaliação da positividade para marcação de PCNA em células da vilosidade, criptais e da camada muscular do intestino fetal transplantado. Camundongos Tx PCI FK PCI + FK 1 9 6 8 10 2 5 5 6 11 3 7 8 5 12 4 5 5 7 8 5 7 9 6 10 7 7 Média 7,1±0,7 6,0 ±0,7 7,0 ±0,7 10,3 ±0,9 Tx, grupo transplante controle isogênico; FK, grupo isogênico tratado com Tacrolimo; PCIR, grupo; p<0,05 vs ISO; p<0,05 vs PCIR e, p<0,05 vs FK. Apêndice 6 -Valores individuais da avaliação da positividade para marcação de PCNA em células da vilosidade, criptais e da camada muscular do intestino fetal no transplante alogênico. Camundongos FK PCI + FK 1 11 5 2 7 12 3 6 9 4 0 10 5 12 5 6 7 Média 7,2 ±0,9 8,2 ±1,4 PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. 57 Apêndice 7 - Valores da avaliação da positividade para marcação de PCNA na comparação entre os grupos de transplante isogênico (ISO) e alogênico (ALO) tratados com Tacrolimo (FK). Camundongos ISO-FK ALO-FK ISO- PCI-FK ALO- PCI-FK 1 9 11 12 5 2 7 7 13 12 3 5 6 15 10 4 8 0 9 9 5 11 12 5 5 6 7 Média 8,0±1,7 7,2 ±2,3 10,8 ±1,7 8,2 ±1,4 FK, grupo tratado com Tacrolimo; PCI, tratamento prévio de PCI-R. Apêndice 8 -Valores individuais da avaliação da apoptose celular no intestino fetal transplantado. Camundongos Tx PCI FK PCIR - FK 1 7 9 7 7 2 8 4 5 9 3 9 6 6 6 4 7 4 6 5 5 9 6 6 4 6 9 7 11 Média 8,6±0,5 5,8 ±0,9 6,0 ±0,3 6,2 ±0,9 Tx, grupo transplante controle isogênico; PCI, tratamento prévio de PCI-R; FK, tratamento com Tacrolimo. *, p<0,05 vs ISO-Tx. Apêndice 9 -Valores individuais da avaliação da rejeição do intestino fetal transplantado. Camundongos Tx PCI FK PCI - FK 1 0 0 0 0 2 0 4 0 0 3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 5 0 0 0 0 6 0 0 4 0 7 0 Média 0,0±0,0 0,7 ±0,7 0,7 ±0,7 0,0 ±0,0 Tx, grupo transplante controle isogênico; FK, grupo isogênico tratado com Tacrolimo; PCI, tratamento prévio de PCI-R. 58 Apêndice 10 -Valores individuais da avaliação do grau de rejeição do enxerto intestinal fetal, obedecendo aos critérios de Auber et al., 1998. Camundongos ALO-Tx PCIR FK PCIR + FK 1 16 14 4 5 2 16 16 5 10 3 22 14 5 7 4 16 16 8 5 5 16 12 7 7 6 22 16 6 8 Média 18,0±1,3 14,7 ±0,7 5,8 ±0,6 7,0 ±0,8 ALO-Tx, transplantado sem tratamento; PCI, transplantado submetido ao PCI-R prévio; FK, transplantado tratado com Tacrolimo. *, P<0,05 vs. ALO-Tx; #, P<0,05 vs ALO-PCI. 59 ANEXOS 60 61 NORMAS ADOTADAS INTERNATIONAL COMMITTEE OF MEDICAL JOURNAL EDITORS. Uniform requirements for manuscripts submitted to biomedical journals. Philadelphia: Ann Intern Med 1997; 126:36-47. PÓS-GRADUAÇÃO EM CIRURGIA E EXPERIMENTAÇÃO – UNIFESP-EPM. Fagundes DJ. Normas para elaboração de relatório de pesquisa [edição eletrônica –disquete]. 2001 São Paulo (SP): UNIFESP-EPM-TOCE. Como elaborar sua tese: estrutura e referências, 2a ed. São Paulo: BC Gráfica e Editora Ltda; 2005. DeCS- Descritores em Ciências da Saúde. [serial online] 2001. Disponível em: URL:http://www.bireme.br COLÉGIO BRASILEIRO DE EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL (COBEA). Manual para técnicos em bioterismo. São Paulo (SP): Yellow Grafth; 1996.
