Bactérias II - Laboratório de Biologia

18/09/2014
MORFOLOGIA E ULTRAESTRUTURA DE BACTÉRIAS
Microbiologia FFI 0751
Profa. Dra. Ilana Camargo
Continuação (aula 5)
Citoplasma
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Citoplasma
Substância da célula dentro da membrana plasmática
Espesso, aquoso, semitransparente, elástico
80% - àgua
Proteínas (enzimas)
Carboidratos
Lipídeos
Íons inorgânicos
Compostos de peso molecular muito baixo
Principais estruturas:
DNA
Ribossomos
Inclusões
MORFOLOGIA E ULTRA-ESTRUTURA DE BACTÉRIAS
 Parede
 Estruturas internas à parede
 Membrana citoplasmática
 Citoplasma
 Inclusões
 Endósporos
o Estruturas externas à parede
o Glicocálice (ou glicocálix) – Camada limosa e cápsula
o Flagelos
o Fímbrias e Pili
o Locomoção da célula bacteriana
o Flagelar
o Deslizamento
o Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
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Glicocálice
Camada limosa e cápsula
Estruturas externas à parede - Glicocálice
Glicocálice/Glicocalix: Camada de material viscoso que
envolve as células bacterianas.
Produzido na maioria dos casos dentro da célula e
excretado para a superfície celular.
Composto de polímeros (viscoso e gelatinoso) situado
externamente à parede celular.
Cápsula – Se estiver organizado e acoplado firmemente à parede
celular (exclui partículas pequenas como tinta naquim);
Camada limosa – Se estiver desorganizado, sem forma e acoplado
frouxamente à parede celular  tende a ser solúvel em água.
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Estruturas externas à parede - Glicocálice
Podem ser:
espessas ou delgadas,
rígidas ou flexíveis,
dependendo na sua composição química
e grau de hidratação
Estruturas externas à parede - Glicocálice
Evidenciada pela Tinta Nanquim
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Estruturas externas à parede - Glicocálice
Composição:
Único tipo de açúcar –homopolissacarídeos;
Ex.: Streptococcus mutans
Sacarose – glicina = polímero para aderir às
superfícies lisas dos dentes e causa a cárie! Sem
a glicina, a bactéria seria expelida pelo fluxo da
saliva.
Mais de um tipo de açúcar – heteropolissacarídeos;
Ex. Streptococcus pneumoniae
Possui a cápsula tipo VI de Glicose, Galactose e
Ramnose.
Estruturas externas à parede - Glicocálice
A
determinação
dos
constituintes
da
cápsula
é
normalmente um passo importante na identificação de
certas bactérias patogênicas.
Algumas cápsulas são de polipeptídeos.
Ex. Bacillus anthracis (agente do carbúnculo/ antrax)
– Cápsula de ácido glutâmico.
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Funções do glicocálice:
-Aderência à superfícies sólidas;
- Proteção contra o dessecamento temporário se ligando a
moléculas de água;
-Reservatório de alimentos;
-Evita a adsorção e lise da célula por bacteriófagos;
Vírus que atacam bactérias.
-Proteção para as bactérias patogênicas contra fagocitose por
células sanguíneas, aumentando a chance de infecção.
Praga na indústria – responsável pelo acúmulo de lodo nos
equipamentos, afetando a qualidade dos produtos.
http://www.nehmi-ip.com.br/imagens_servicos/bio_7_p.gif
Cápsula
Cápsulas bacterianas. (a) Demonstração da presença de cápsulas por coloração negativa
com tinta nanquim em Acinetobacter, observada em MO de fase. (b) Micrografia eletrônica de
uma seção fina de célula de Rhizobium trifolli, corada com vermelho de rutênio, revelando a
cápsula. Madigan et el., 2004.
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Estruturas externas à parede - Glicocálice
Glicocálice: cápsulas e camadas limosas
– Maior parte de natureza polissacarídica
(exopolissacarídeos = EPS).
– Composição variável nas diferentes espécies.
– Proporcionam aderência entre a bactéria e superfícies, por
meio de reações químicas: tecido hospedeiro (células do
pulmão, dentes, implantes, tubulações, raízes e vasos
condutores de plantas, rochas, etc).
EPS
– Dificultam o reconhecimento e destruição pelas células
fagocitárias do sistema imune – relacionado à virulência
(Ex. Streptococcus pneumoniae com e sem cápsula).
– Oferecem resistência à dessecação (tem muitas moléculas
de água associadas).
– Aplicação industrial: espessantes – goma xantana
(Xanthomonas campestris).
EPS e Biofilme
Sob determinadas condições, os microrganismos se aderem, interagem
com as superfícies e iniciam crescimento celular.
Essa multiplicação dá origem a colônias e quando a massa celular é
suficiente para agregar nutrientes, resíduos e outros microrganismos
(camada espessa), está formado o que se denomina BIOFILME.
São complexos ecossistemas microbiológicos embebidos em uma matriz
de polímeros orgânicos, aderidos a uma superfície;
Forma-se
um
cultivo
puro
ou
uma
associação
com
outros
microrganismos.
Os microrganismos em biofilmes estão mais resistentes à ação de
agentes químicos e físicos.
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http://www.textbookofbacteriology.net/biofilm_formation.gif
http://ehp.niehs.nih.gov/realfiles/docs/1998/106-12/innovations.html
Biofilmes bacterianos
Fixação
Crescimento
Separação
Células
planctônicas
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Biofilme
Biofilme
Encontrado onde há água e suporte sólido
Dentes, canos, lentes de contato, sistemas digestivos
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MORFOLOGIA E ULTRA-ESTRUTURA DE BACTÉRIAS
 Parede
 Estruturas internas à parede
 Membrana citoplasmática
 Inclusões
 Endósporos
o Estruturas externas à parede
 Glicocálice (ou glicocálix)
o Fímbrias e Pili
o Flagelos
o Locomoção da célula bacteriana
o Flagelar
o Deslizamento
o Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
Fímbrias e Pili
Estruturas filamentosas compostas por proteínas que se
projetam a partir da superfície de uma célula, podendo
apresentar muitas funções
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/57/caphtm/cap0401.htm
http://www.dbi.ufla.br/Ledson/LBMP/Bact24.htm
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Estruturas externas à parede – Fímbrias
Mais curtas e mais numerosas que flagelo.
Função de adesão.
Pilina: proteína formadora, distribuídas de modo helicoidal
em torno de um eixo.
•
•
•
• Neisseria gonorrhoeae –
agente causador da
gonorréia: fímbrias
ajudam a colonização das
membranas mucosas.
Fímbrias em célula em divisão de
E. coli (Fonte: Tortora et al.,
2005).
http://www.nibib.nih.gov/NewsEvents/ResearchHighlights/Archive/2007/06June07
Estruturas externas à parede – Fímbrias
 Podem ser vistos somente pelo Microscópio Eletrônico
 Penetram na parede celular, mas não possuem ancoragem
complexa como os flagelos

São ocos, mas possuem Pilina, proteínas arranjadas em
forma de espiral em torno de um espaço central para formar a
estrutura.
Em infecção, as fímbrias auxiliam a
bactéria
patogênica
células
superficiais
respiratório,
a
aderir
às
do
trato
intestinal
ou
geniturinário.
http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Fimbriae%2C+Bacterial&lang=1
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Pili
Estruturas externas à parede – Pili
•
•
•
Pili (singular Pilus): mais longos que as fímbrias e há apenas um
ou dois por célula.
Mesma estrutura das fímbrias.
Função sexual: auxilia a aproximação entre duas células
bacterianas para que ocorra transferência de DNA.
Presença de pilus em célula de E. coli, revelada pela adesão de
bacteriófagos ao pilus. O contato entre duas bactérias conjugantes
é feito pelo pilus, que as aproxima por retração
(despolimerização da pilina). Fonte: Madigan et al., 2004
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Estruturas externas à parede – Pili
• Outras funções:
– aderência
– a classe de pili tipo IV realiza uma forma incomum
de motilidade: motilidade pulsante!!
Por deslizamento: movimento ao longo de uma
superfície sólida através da extensão dos pili
seguida da sua retração.
MORFOLOGIA E ULTRA-ESTRUTURA DE BACTÉRIAS
 Parede
 Estruturas internas à parede
 Membrana citoplasmática
 Inclusões
 Endósporos
o Estruturas externas à parede
 Glicocálice (ou glicocálix)
 Fímbrias e Pili
o Flagelos
o Locomoção da célula bacteriana
o Flagelar
o Deslizamento
o Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
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Flagelos
Estruturas externas à parede – Flagelos
Os flagelos são muitas vezes mais longos que as células, mas o
diâmetro é muito fino e por isso não podem ser vistos com o
microscópio óptico.
Procedimentos
de
coloração
colocam
uma
camada
de
corante
precipitado na superfície dos flagelos fazem com que apareçam mais
espessos e, assim, visíveis ao microscópio óptico.
Os corantes são a base de acetato de pararosanilina e
hidrocloreto de pararosanilina.
Flagelos – corado de vermelho
Não flagelo – corado de azul
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Estruturas externas à parede – Flagelos
Estruturas externas à parede – Flagelos
•
•
•
Associado à locomoção da célula (movimento natatório),
oferece uma vantagem na exploração dos recursos dos
ambientes.
Apêndices longos e finos (~20 nm de espessura).
Único ou vários, em diferentes arranjos
Monotríquio: Flagelo único e polar;
Anfitríquio: Um flagelo em cada extremidade;
Lofotríquio: Dois ou mais flagelos em um pólo da célula;
Peritríquio: Flagelos distribuídos por toda a célula.
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Estruturas externas à parede – Flagelos
Fonte: Tortora et al., 2005
Estrutura do flagelo
procariótico
• Semi-rígida helicoidal (não
fica reto).
• Formado pelo motor,
gancho e filamento.
• Motor: ancorado na
Membrana citoplasmática e
parede, bastão + anéis,
proteínas Mot (rotação) e Fli
(reversão do sentido de
rotação).
• Gancho: base mais rígida.
• Filamento: formado por
subunidades de flagelina.
Anel C
Fonte: Madigan et al, 2004.
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Etapas envolvidas na biossíntese dos flagelos
- 40 genes envolvidos na expressão da motilidade (Salmonella
typhimurium e Escherichia coli).
- Proteína “cap”: auxilia na organização das moléculas de
flagelina adicionadas ao filamento.
- Regeneração após quebra.
Fonte: Madigan et al, 2004.
Estrutura do flagelo procariótico
2002
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Estrutura do flagelo procariótico
Bactéria Gram-negativo
Bactéria Gram-positivo
2002
Tipos de movimentação em procariotos
com flagelação
-Energia para rotação: movimento de prótons na membrana,
passando pelo complexo Mot (força próton motiva). Translocação de
1.000 prótons para cada rotação.
-Velocidade até 60 comprimentos celulares/segundo
-Capazes de girar até 300 revoluções por segundo!!
Fonte: Madigan et al, 2004.
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Velocidade não é constante e pode-se aumentar ou diminuir de acordo com a
intensidade da força próton motiva
Impulsão em meio líquido  0,00017 Km/h
60 comprimentos celulares/segundo!!
Proteus mirabilis
Crescimento da colônia seguido por “ondas”.
Células normais com 2 m e de 6-10 flagelos
Células de expansão com 40 m e de milhares de flagelos  movem-se para a
extremidade do ágar, perdem a diferenciação e voltam ao normal e novas
células de expansão se formam...
http://microblog.me.uk/wp-content/uploads/petri.0.jpg
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Flagelo de Archaea
Motilidade flagelar altamente disseminada com motilidade natatória;
Mais delgados;
Movimento também de rotação;
Estrutura do motor flagelar não conhecida;
Peptideoglicano e membrana externa estão ausentes!!
Várias flagelinas diferentes são encontradas e algumas compostas de
glicoproteínas;
Compartilham determinadas propriedades moleculares com pili tipo IV
bacterianos que atuam em outra forma de motilidade (pulsante)
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Locomoção e taxia
Locomoção microbiana - deslizamento
Movimento mais lento e suave
Requer contato com superfície sólida
Mecanismo proposto para a motilidade por
deslizamento em Flavobacterium johnsoniae –
movimentação de proteínas na superfície celular.
Madigan et al., 2004.
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Locomoção microbiana - deslizamento
Flavobacterium johnsoniae – acima,
massas celulares afastando-se da colônia.
Abaixo, colônia de linhagem mutante,
não deslizante.
Madigan et al., 2004.
Cianobactéria filamentosa
Oscillatoria princeps. Os filamentos
deslizam por meio da secreção de
um polissacarídeo limoso.
Madigan et al., 2004.
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Locomoção microbiana - deslizamento
• Motilidade pulsante com pili tipo IV
Respostas comportamentais - Taxias
•
Movimento de uma bactéria para perto ou longe de um
estímulo particular.
•
Melhor conhecido em bactérias que apresentam locomoção
flagelar.
•
Quimiotaxia – resposta a um agente químico.
•
Fototaxia – resposta a um estímulo luminoso.
•
Outras taxias (p.e., aerotaxia).
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Regulação da quimiotaxia
• Proteínas sensoras localizadas na membrana –
quimiorreceptores – percebem o gradiente químico e
interagem com as proteínas que afetam a direção do
motor flagelar.
• Principais
agentes
quimiotáticos
bacterianos:
nutrientes excretados por células como algas e
protozoários, ou por organismos macroscópicos mortos.
Quimiotaxia
Ocilação
corrida
Gradiente maior
do agente
atrativo
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Fototaxia
Fototaxia positiva de uma colônia inteira da bactéria púrpura
Rhodospirillum centenum, por um período de duas horas. No detalhe,
MET de célula de R. centenum, com flagelação peritríquia induzida.
Madigan et al., 2004.
Parte II: Colorações
Sobre a aula prática
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Colorações
Diferencial
Simples
Um único corante
Para constatação de microrganismo
Positiva
Separação de grupos
Coloração de Gram
Coloração de Ziehl-Neelsen
Negativa
Observar estruturas
Esporos
Cápsulas
Flagelo
Colorações
Simples
Um único corante
Para constatação de microrganismo
Positiva
Azul de metileno (1 – 2 minutos)
Cristal de violeta (20 – 60 segundos)
Carbolfucsina (15 – 30 segundos)
Positiva: baseada na utilização de corantes
carregados positivamente que se ligam às cargas
negativas de superfície de células e de material
nucléico
Negativa
Negativa: baseada na coloração com corantes
acídicos que são repelidos pela carga negativa da
superfície de células. A lâmina de vidro ficará corada
enquanto que o microrganismo aparecerá mais claro
Nigrosina
Tinta nanquim
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Colorações
Diferencial
Dois corantes contrastantes que gerarão
colorações diferentes em grupos
distintos de bactérias
Separação de grupos
Coloração de Gram
Coloração de Ziehl-Neelsen
Observar estruturas
Esporos (Schaeffer-Fulton)
Cápsulas (Gins)
Flagelo (pararosanilina)
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Partindo de cultura líquida
Coloração de células para observação micorscópica.
Madigan et al., 2004.
Partindo de cultura sólida
Adicione uma gota de solução fisiológica e em
seguida adicione uma porção de uma colônia
com o auxílio de uma agulha de inoculação,
misture e espalhe sobre a lâmina
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Coloração de Gram
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
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Vi Lulu Ali A Fumar !
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Vi Lulu Ali A Fumar !
Vi Lulu Ali A Fumar !
Coloração de Gram
Fixação das bactérias na lâmina
Pelo calor (Fogo)
Cristal Violeta – 1 minuto
Lugol (Iodo) – 1 minuto
Álcool Cetona
Água destilada
Fucsina - 30 segundos
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Cristal Violeta
Se infiltra na parede celular e cora as células de roxo!
Solução de Iodo (Lugol)
Mordente
Substância que fixa o corante na célula!
Forma um complexo com o Cristal Violeta e se fixam
na camada peptideoglicana!! (
força de ligação)
O tratamento de álcool (ou álcool cetona) extrai os lipídeos
resultando
em
uma
porosidade
ou
permeabilidade
aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativo. O
complexo Cristal Violeta – Iodo (CV-I) é retirado
com a
lavagem e as bactérias Gram-negativo são descoradas.
As
bactérias
composição
Gram-positivas
diferente
e
se
têm
parede
desidrata
celular
de
durante
o
tratamento com o álcool, diminuindo a porosidade e o
complexo CV-I não pode ser extraído.
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Última etapa: coloração pela Fucsina
G+ - a célula não é afetada, permanecendo violeta
G- - a célula adquire o corante, tornando-se vermelha/rosa.
Cocos Gram-negativo
Cocos Gram-positivo
FUNÇÃO: Observar as características morfológicas das
bactérias isoladas – Excelente também como exame
direto para avaliar o material clínico (escarro).
Coloração de Gram
Lugol
água
Fucsina
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Coloração de Gram
Cocos
Gram-positivo
Espiral
Gram-negativo
Bacilo
Gram-positivo
Coloração de Gram
Cocos
Gram-positivo
Bacilo
Gram-negativo
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Coloração de Gram
Muito utilizada no estudo taxonômico das bactérias;
Cocos são, na maioria das vezes, GRAM POSITIVO;
Bacilos são na maioria das vezes, GRAM NEGATIVO;
O mecanismo da coloração de Gram se refere à
composição da parede celular:
 Gram-positivo
possuem
uma
espessa
camada
de
peptideoglicana e ácido teicóico;
 Gram-negativo
possuem
uma
fina
camada
de
peptídeoglicana, sobre a qual se encontra uma camada
composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e
lipopolissacarídeos.
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Gram positivos retém o cristal violeta e as bactérias Gram-negativo não.
No entanto, isto não é um fenômeno absoluto. Muitas vezes, culturas de
bactérias GRAM (+) parecem Gram (-) ou misturadas (+ e -).
Existem algumas razões para isto:
1 – Super descoloração
2 – Fixação pelo calor muito drástica
3 – esfregaço muito espesso
4 – Passos de lavagens impróprios
5 – Cultura muito velha
6 - Cultura misturada ou impura
Como a coloração de Gram depende da estrutura da parede celular, sempre
que houver um dano na parede a coloração de Gram poderá variar.
Uma bactéria Gram-positivo poderá aparecer Gram-negativo, porém, uma
bactéria Gram-negativo será sempre Gram-negativo.
As características morfológicas das bactérias:
- Tamanho: Pequeno, médio e grande (de 0,5 a 1,0 m de
diâmetro ou largura);
- Forma:
cocos
(esféricas),
bacilos
(cilíndricas)
ou
espirilos (espiraladas);
Bactérias pleomórficas  mudam de forma a medida que
a cultura envelhece. Por exemplo: Arthrobacter.
- Arranjo: estafilo..., estrepto..., diplo..., tétrade, sarcina,
paliçada.
Podem ser determinadas por microscopia e colorações!
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