Priscila Bentes Sousa

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES IL-10 e IL-10RA
COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA POPULAÇÃO CASO-CONTROLE DO
ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL.
PRISCILA BENTES SOUSA
MANAUS
2014
i
PRISCILA BENTES SOUSA
ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES IL-10 e IL-10RA
COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA POPULAÇÃO CASO-CONTROLE DO
ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas em
Convênio com a Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para
obtenção grau de Mestre em Doenças
Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof. Dr. Rajendranath Ramasawmy
Co-orientadora: Dra. Anette Chrusciak Talhari
MANAUS
2014
ii
Ficha Catalográfica
S725e
Sousa, Priscila Bentes.
Estudo de associação de polimorfismos dos genes IL-10 e
IL-10RA com leishmaniose cutânea em uma população casocontrole do estado do Amazonas, Brasil / Priscila Bentes Sousa.
-- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação
de Medicina Tropical, 2014.
xvii. 83 f. : il.
Dissertação apresentado ao Programa de Pós-Graduação em
Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas –
UEA/FMT, 2014.
Orientador: Profº. Dr. Rajendranath Ramasawmy
1. Leishmaniose Tegumentar Americana 2.IL-10, IL-10RA
Susceptibilidade I. Título.
CDU: 616.9
Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana do N. Silva lotada
na Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA
iii
FOLHA DE JULGAMENTO
ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES IL-10
e IL-10RA COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA POPULAÇÃO
CASO-CONTROLE DO ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL.
PRISCILA BENTES SOUSA
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa
de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado”.
Banca Julgadora:
______________________________________
Presidente
______________________________________
Membro
______________________________________
Membro
iv
DEDICATÓRIA
Dedico a Deus, minha fortaleza, pela força.
A minha querida mãe, meu porto seguro, pelo total apoio e confiança, sem o qual
nada disso seria possível.
Ao meu amado pai (in memoriam) pelo exemplo de caráter e dedicação.
v
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, pelo dom da vida, por toda benção recebida e
pelas pessoas maravilhosas que colocou em minha vida e que me ajudaram em
algum momento que precisava;
À minha mãe e meu orgulho, que sempre esteve ao meu lado me incentivando,
dando forças. Obrigada pela confiança e por toda dedicação, seu amor e suas
orações foram fundamentais para a realização desse sonho. Amo você;
Aos meus irmãos que sempre estiveram ao meu lado, me apoiando, torcendo pelo
meu sucesso.
À minha cunhada querida Lindamir, por todo apoio e conselhos;
À minha família em geral, por todo amor e carinho;
Aos voluntários que participaram deste estudo, pela confiança que depositaram em
nosso conhecimento.
Ao meu eterno orientador Marcelo Távora Mira, meu pai científico, a quem tenho um
enorme orgulho, meu espelho de caráter, honestidade e ética. Você é uma das
peças principais para a realização desse sonho. Nenhuma palavra poderá expressar
o tamanho do meu carinho por você. Obrigada por tudo.
Aos coordenadores e professores do Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical da UEA/FMT-HVD, pelo conhecimento transmitido.
À UEA, pela oportunidade a mim dada e pelo apoio financeiro durante as viagens.
À FMT-HVD, pelo suporte dado à execução do trabalho.
Aos meus orientadores Rajendranath Ramasawmy e Anette Chrusciak Talhari, pela
orientação recebida.
Ao CNPq, pela bolsa de auxílio financeiro que me foi concedida.
Ao Dr. José Felipe Sardinha, que esteve conosco desde o início do projeto e que
nunca nos negou ajuda, sendo ela financeira ou moral.
À dona Maria Zilda, um verdadeiro anjo que Deus colocou em minha vida, por todo
carinho, cuidado e proteção. Você sempre estará em meu coração. Muito obrigada!
As minhas amigas de todas as horas, Karolina Sabino e Luciane Souza, que viveram
comigo momentos de alegrias e tristezas, e que sempre estiveram ao meu lado me
dando forças no momento de fraqueza. Acredito que sem vocês nada disso seria
possível.
vi
Ao meu namorado e confidente Sandro Macedo por toda paciência, incentivo e
confiança, por estar sempre ao meu lado, mesmo nos momentos mais complicados.
Por não me deixar desistir dos meus sonhos, nem baixar a cabeça diante das
dificuldades. Sei que posso contar com você sempre e serei eternamente grata por
tudo que tens feito por mim;
Aos colegas Amélia, Claudemir e Rita, pelo apoio recebido durante o recrutamento e
pelos momentos de descontração.
À gerência de Leishmaniose, em especial ao Prof. Jorge Guerra;
As queridas Geovana Brotto e Heloisa Salomão, que abriram mão dos seus
preciosos tempos para nos ajudarem com as análises dos dados. Que tiveram toda
paciência e cuidado durante as análises. Vocês foram mais que fundamentais para
conclusão desse sonho, foram verdadeiros anjos. Muito obrigada meninas.
À uma pessoa que foi muito, muito, muito importante para a concretização deste
trabalho, Ana Paula Bezerra, que sem nos conhecer abriu as portas da sua casa e
nos recebeu com muito carinho. Sempre muito atenciosa. Sua ajuda foi mega
importante. Muitíssimo obrigada!
Aos meus colegas e amigos da graduação, que mesmo longe me deram apoio e
incentivos.
Enfim, obrigada a todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste
trabalho.
vii
DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS
À Superintendência da Zona Franca de Manaus – SUFRAMA e Fundação de Apoio
Institucional Muraki-FMuraki pelo apoio na estrutura deste Programa de PósGraduação em Medicina Tropical.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, pelo
financiamento desta pesquisa e pela concessão da bolsa de pesquisa.
viii
RESUMO
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa crônica
causada por parasitas do gênero Leishmania sp, representa um conjunto de
doenças com características clínicas e imunopatológicas distintas. A maioria dos
indivíduos expostos ao parasita não desenvolvem a doença, sugerindo um papel de
fatores genéticos nesse controle. Deste modo, o presente estudo teve como objetivo
investigar se variantes dos genes IL-10 e IL-10RA estão associados a
susceptibilidade ou resistência à leishmaniose cutânea. Para a realização do estudo,
foram recrutados pacientes com leishmaniose cutânea e indivíduos sadios. A
amostragem foi obtida por demanda espontânea da Fundação de Medicina Tropical
Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) de pacientes com diagnóstico positivo para
LTA, e o grupo controle foi composto de indivíduos sadios sem história de LTA,
habitantes das mesmas áreas endêmicas dos casos. Foram recrutados 774
voluntários, sendo 392 casos e 382 controles. A extração do DNA foi realizada com
o kit Promega ou pela técnica de “salting-out’’. Concentrações de amostras de
estoque foram determinadas por fotometria. A genotipagem dos SNPs -3575 T/A, 2849 G/A, -2763 C/A, -819 C/T, -592 C/A, -1082 G/A do IL-10, e S138G A/G e IL10R R330G G/A do IL10RA foram realizadas pela técnica de PCR-RFLP. Dos oito
SNPs estudados, três apresentaram-se em desequilíbrio de Hardy-Weinberg (-2763
C/A, -819 C/T e -1082 G/A). Não foi encontrada evidência de associação entre
leishmaniose cutâena e os SNPs do gene IL-10, assim como o S138G A/G do
IL10RA. Houve diferença estatisticamente significativa na distribuição de frequências
alélicas (P= 0.013) e genotípicas (P=0,044) do SNP G330R G/A do gene IL-10RA
entre casos e controles. Os resultados obtidos sugerem que variantes do gene IL10RA podem estar envolvidas na resistência à leishmaniose cutânea.
Palavras chaves: leishmaniose, IL-10, IL-10RA, susceptibilidade.
ix
ABSTRACT
American cutaneous leishmaniasis (ACL) is a chronic infectious disease caused by
parasites of the genus Leishmania, is a group of diseases with distinct clinical
features and immunopathological. Most individuals exposed to the parasite do not
develop the disease, suggesting a role for genetic factors that control. Thus, the
present study aimed to investigate whether variants of IL-10 and IL-10Ra genes are
associated with susceptibility or resistance to cutaneous leishmaniasis. For the study,
patients with cutaneous leishmaniasis and healthy subjects were recruited. The
sample was obtained by spontaneous demand of the Tropical Medicine Foundation
Dr Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) of patients diagnosed positive for ATL and the
control group consisted of healthy individuals with no history of ACL, inhabitants of
endemic areas in the same cases . 774 volunteers were recruited, with 392 cases
and 382 controls. DNA extraction was carried out with the Promega kit and the
technique of "salting-out '. Stock concentrations of samples were determined by
photometry. Genotyping of the SNPs -3575 T/A, -2849 G/A, -2763 C/A -819 C/T, 592 C/A, -1082 G/A of IL-10, and S138G A/G IL-10R R330G G/A a of IL10RA were
performed by PCR-RFLP. Of the eight SNPs studied are presented in three HardyWeinberg disequilibrium (-2763 C/A -819 C/T and -1082 G/A). No evidence of
association between the SNPs cutâena leishmaniasis and IL-10 gene was found, as
well as S138G A / G IL10RA. There was a statistically significant difference in the
distribution of allele frequencies (P = 0.013) and genotype (P = 0.044) of the G330R
SNP G / A of IL-10Ra gene between cases and controls. The results suggest that
variants of the IL-10Ra gene may be involved with resistance to cutaneous
leishmaniasis.
Key words: leishmaniasis, IL-10, IL-10RA, susceptibility.
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Distribuição geográfica da leishmaniose cutânea e mucocutânea no Novo
Mundo. ........................................................................................................................ 2
Figura 2: Formas clínicas de LC: A: cutânea localizada; B: cutânea disseminada e
C: cutânea difusa. ....................................................................................................... 4
Figura 3: A: Formas promastigota (flagelada) de Leishmania; B: Formas amastigotas
de Leishmania no interior de macrófago. .................................................................... 6
Figura 4: Flebotomíneo (fêmea) exercendo o hematofagismo. ................................. 7
Figura 5: Representação esquemática de possíveis rotas imunes acionadas nas
infecções por Leishmania. ......................................................................................... 11
Figura 6: Análise de desequilíbrio de ligação entre os SNPs dos genes IL-10 (A) e
IL-10RA (B). O número no interior do quadro indica a proporção de DL, em
porcentagem, calculado utilizando o parâmetro r2; o código de cores reflete a
intensidade de DL entre dois loci: quanto mais escuro o quadrado, maior o DL entre
os SNPs (92). ............................................................................................................ 32
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Sequência dos iniciadores utilizados nas amplificações por PCR. ........... 23
Tabela 2: Protocolo padronizado contendo as condições de amplificação por PCR
para o SNP IL-10 -3575 T/A, -2849 G/A e -2763 C/A................................................ 24
Tabela 3: Protocolo padronizado contendo as condições de amplificação por PCR
para o SNP IL-10 -819 C/T e -592 C/A...................................................................... 24
Tabela 4: Protocolo padronizado contendo as condições de amplificação por PCR
para o SNP IL-10 -1082 G/A. .................................................................................... 25
Tabela 5: Protocolo padronizado contendo as condições de amplificação por PCR
para o SNP IL-10RA S138G A/G. ............................................................................. 25
Tabela 6: Protocolo padronizado contendo as condições de amplificação por PCR
para o SNP IL-10RA G330R G/A. ............................................................................. 26
Tabela 7: Dados referentes à RFLP ......................................................................... 27
Tabela 8: Dados referentes à digestão dos produtos de PCR. ................................. 28
Tabela 9: Dados da população estudada ................................................................. 31
Tabela 10: Frequências alélicas e genotípicas dos marcadores dos genes IL-10 e IL10RA nas populações casos e controles. ................................................................. 34
Tabela 11: Frequências alélicas e genotípicas do SNP IL-10RA G330R G/A nas
populações casos e controles. .................................................................................. 35
xii
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
% - Por cento
ºC – Grau(s) Celsius
® - Marca registrada
A – Adenina
C- Citosina
C3 – Proteína do sistema complemento
C3bi – Componente inativado sistema complemento
CEP - Comitê de ética em pesquisa
CONEP - Conselho nacional de ética em pesquisa
CR1 – Receptor de complemento 1
CR3 – Receptor de complemento 3
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DMSO – Dimetilsulfóxido
dNTP's – Desoxirribonucleotídeos Fosfatados
EDTA - Ácido Etileno Diamino Tetracético
ELISA - Ensaio imunoenzimático
EV – Via de administração endovenosa
FMT-HVD - Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado
g – Grama
G – Guanina
gp63 – Glicoproteína 63
xiii
h – Hora
hsp70 -Heat-shock protein 70
IC – Intervalo de confiança
IDRM - Intradermorreação de Montenegro
IFI - Imunofluorescência indireta
IFN-γ – Interferon-gama
IL - Interleucina
iNOS – Indutor de óxido nítrico sintase
KCl – Cloreto de sódio
Kg – Quilograma
L. – Leishmania
LC - Leishmaniose cutânea
LCL – Leishmaniose cutânea localizada
LCD - Leishmaniose cutânea disseminada
LM - Leishmaniose mucosa
LPG – Lipofosfoglicano
LTA - Leishmaniose tegumentar americana
LV -Leishmaniose visceral
mg – Miligrama
MgCl2 – Cloreto de magnésio
mL - Mililitros
mm – Milímetros
mM – Milimolar
xiv
n° - Número
ng – Nanogramas
NK - Células natural killer
NO - Óxido nítrico
NOS2 – Óxido nítrico sintase
O2 – Superóxido
OH- - Radical Hidroxila
OR – odds ratio
p – Valor-p
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PCR-RFLP – Reação em cadeia da polimerase – polimorfismos de comprimentos
dos fragmentos de restrição
PEG – Polietilenoglicol
pH – Potencial hidrogeniônico
Pmol – Picomol
Rpm - Rotações por minuto
Primers - Oligonucleotídeos iniciadores
Sbv – Antimoniais pentavalentes
SNPs - Polimorfismos de nucleotídeo único
sp - Espécie
spp – Espécies
T – Timina
T CD4+ - Linfócito T CD4+
xv
TCLE – Termo de consentimento livre e esclarecido
TGF-β – Fator de transformação do crescimento beta
Th - Células T CD4 auxiliares
TNF – Tumor necrosis factor / Fator de necrose tumoral
U – Unidade
μg – Microgramas
μl – Microlitros
V. – Viannia
χ2 - Teste qui-quadrado
xvi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1
1.1 Leishmaniose: Aspectos gerais ............................................................................. 1
1.2 Epidemiologia ........................................................................................................ 1
1.3 Classificação Clínica ............................................................................................. 3
1.3.1 Leishmaniose Cutânea (LC) ............................................................................... 3
1.3.2 Leishmaniose Mucosa (LM) ............................................................................... 5
1.4 Agente Etiológico .................................................................................................. 5
1.5 Vetor ...................................................................................................................... 6
1.6 Diagnóstico............................................................................................................ 7
1.7 Imunopatogênese da leishmaniose tegumentar .................................................... 9
1.8 Tratamento .......................................................................................................... 12
1.9 Genética da Leishmaniose .................................................................................. 12
1.10 Gene IL-10 ........................................................................................................ 14
1.11 Gene IL-10RA ................................................................................................... 17
2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 18
2.1 Geral.................................................................................................................... 18
2.2 Específicos .......................................................................................................... 18
3. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 19
3.1 Desenho do estudo ............................................................................................. 19
3.2 Área de estudo .................................................................................................... 19
3.3. População estudada ........................................................................................... 19
3.3.1 Definição de caso para o estudo ...................................................................... 19
3.3.2 Recrutamento da população ............................................................................ 20
3.3.3 Grupo caso ....................................................................................................... 20
3.3.4 Grupo controle .................................................................................................. 21
3.4 Coleta do material biológico ................................................................................ 21
3.5 Extração de DNA ................................................................................................. 22
xvii
3.6 Genotipagem ....................................................................................................... 22
3.6.1 Amplificação por PCR ...................................................................................... 22
3.6.2 RFLP ................................................................................................................ 26
3.7 Análise estatística ............................................................................................... 29
3.8 Aspectos éticos ................................................................................................... 29
3.9 Suporte financeiro ............................................................................................... 30
4. RESULTADOS ...................................................................................................... 31
4.1 Características gerais da população em estudo.................................................. 31
4.2 Genotipagem ....................................................................................................... 32
4.2.1 Análise da distribuição das frequências alélicas e genotípicas e associação dos
polimorfismos do IL-10 e IL-10RA. ............................................................................ 32
5. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 36
6. CONCLUSÃO........................................................................................................ 41
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 42
8. ANEXOS ............................................................................................................... 52
8.1 ANEXO A: Fluxograma........................................................................................ 52
8.2 ANEXO B: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE....................... 53
8.3 ANEXO C: Questionário ...................................................................................... 57
8.4 ANEXO D: Protocolo de extração de DNA .......................................................... 58
8.5 ANEXO E: Minuta de Artigo ................................................................................ 59
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Leishmaniose: Aspectos gerais
As Leishmanioses são doenças infecciosas, não contagiosas, causadas por
diversas espécies de protozoários do gênero Leishmania (reino Protista, ordem
Kinetoplastida, família Trypanosomatidae). São representadas por um grupo de
doenças com caráter zoonótico, que acometem o homem e diversas espécies de
animais silvestres e domésticos. A doença abrange um grande espectro de
manifestações clínicas, variando desde uma forma assintomática, lesões ulcerativas
na pele, inflamação destrutivas das mucosas da orofaringe (leishmaniose
tegumentar), até a forma visceral (leishmaniose visceral) (1).
As leishmanioses constituem um crescente problema de saúde pública.
Atualmente a doença ocorre nos cinco continentes é considerada endêmica em 98
países(2, 3). Estima-se que, anualmente, 1,5 - 2 milhões de indivíduos sejam
acometidos, e que 0.7 a 1.2 milhões de casos correspondam à forma tegumentar da
doença. Atualmente, 12 milhões de pessoas apresentam alguma forma da doença e
310 milhões estão expostas em todo o mundo (1, 3).
1.2 Epidemiologia
No Novo Mundo, a leishmaniose tegumentar americana (LTA) apresenta uma
ampla distribuição, desde o extremo sul dos Estados Unidos, na América do Norte,
atravessando a América central e chegando até o norte da Argentina, na América do
Sul, onde apenas o Chile e o Uruguai não apresentam registros da doença (Figura
1). Entretanto pouco se sabe sobre suas taxas de prevalência e de incidência na
população comprometida, já que o sistema de notificação da doença é falho, mesmo
tendo seu registro obrigatório em muitos países, entre eles o Brasil (4, 5). A doença
é mais frequente em homens, particularmente trabalhadores em florestas, devido
sua maior exposição ao vetor (6).
2
Figura 1: Distribuição geográfica da leishmaniose cutânea e mucocutânea no Novo Mundo.
Fonte: OMS, 2013 (7).
No Brasil, a doença apresenta ampla distribuição por todas as regiões
geográficas. Ao analisar a evolução da LTA, observa-se uma expansão geográfica
no início da década de 80, quando foram registrados casos em 19 unidades federais
e, em 2003, todos os estados registraram autoctonia. A partir da década de 90, o
Ministério da Saúde notificou uma média anual de 32 mil novos casos de LTA (8).
O Brasil representa a área endêmica de maior extensão territorial e um dos
países com as mais elevadas taxas de notificação da infecção. As regiões Norte e
Nordeste são responsáveis por cerca de 80% das notificações. Em 2013, na região
Norte foram notificados 9.002 casos, sendo 3.224 no Estado do Pará, 1.537 no
Amazonas, 1.295 em Rondônia, 1.012 no Acre, 837 no Amapá, 552 em Tocantins e
545 em Roraima(9). Em 2013, a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado (FMT-HVD), centro de referência para o tratamento de LTA no Estado do
Amazonas registrou 679 casos da doença, sendo 667 na forma cutânea e 12 na
forma mucosa (10).
Atualmente no Brasil, a LTA apresenta três padrões epidemiológicos
característicos:
3
a) Silvestre – a transmissão ocorre em área de vegetação primária e
é
fundamentalmente uma zoonose de animais silvestres, que pode acometer o ser
humano. Quando este entra em contato com o ambiente silvestre, onde esteja
ocorrendo enzootia.
b) Ocupacional e lazer – a transmissão está associada à exploração desordenada da
floresta e derrubada de matas para construção de estradas, usinas hidrelétricas,
instalação de povoados, extração de madeira, desenvolvimento de atividades
agropecuárias, de treinamentos militares e ecoturismo.
c) Rural e periurbano em áreas de colonização – está relacionado ao processo
migratório, ocupação de encostas e aglomerados em centros urbanos associados a
matas secundárias ou residuais (5).
1.3 Classificação Clínica
A LTA é considerada uma enfermidade polimórfica e espectral da pele e das
mucosas. As principais manifestações observadas nos pacientes podem ser
classificadas de acordo com seus aspectos clínicos, patológicos e imunológicos.
Classicamente, a doença se manifesta sob duas formas: leishmaniose cutânea (LC)
e leishmaniose mucosa (LM), essa última também conhecida como mucocutânea,
que podem apresentar diferentes manifestações clínicas (8, 11).
1.3.1 Leishmaniose Cutânea (LC)
A LC é a forma mais benigna e consiste em lesões encontradas
exclusivamente na pele. O surgimento da lesão inicial pode ocorrer entre um período
de incubação que varia de três meses a um ano, sempre no local da picada do
inseto, onde as formas promastigotas infectantes são inoculadas. Apresenta-se sob
as seguintes formas clínicas: cutânea localizada, cutânea disseminada e cutânea
difusa (12). Como apresentada na figura 2.
4
Figura 2: Formas clínicas de LC: A: cutânea localizada; B: cutânea disseminada e C: cutânea difusa.
Fonte: http://biosalecionario.blogspot.com.br/2010/10/leishmaniose_5360.html; MS, 2008 (13, 14).
1.3.1.1 Leishmaniose Cutânea Localizada (LCL)
Pode ocorrer como lesão única ou múltipla, na mesma região da picada do
vetor ou nos pontos das picadas infectantes. É caracterizada por lesões ulcerosas,
indolores, apresenta-se com bordas elevadas e infiltradas, fundo com tecido de
granulação recoberto por discreto exsudato. Apresenta boa resposta ao tratamento,
podendo acompanhar-se de linfadenopatia regional, linfangite ascendente e
ulceração de alguns nódulos, reproduzindo as lesões iniciais (8, 11, 15).
1.3.1.2 Leishmaniose Cutânea Disseminada (LCD)
Ocorre provavelmente por disseminação hematogênica ou linfática do
parasito. As lesões cutâneas são numerosas e distantes do local das picadas,
distribuindo-se por diversas áreas do corpo; em geral, são pequenas e ulceradas,
podem ter diversos tamanhos e costumam responder bem ao tratamento (8).
1.3.1.3 Leishmaniose Cutânea Difusa
5
Constitui manifestação rara e grave da LC, ocorrendo em pacientes
considerados anérgicos com deficiência específica na resposta imune celular a
antígenos de Leishmania. De início insidioso, como lesão única não responsiva ao
tratamento, evolui de forma arrastada, com formação de placas infiltradas e múltiplas
nodulações não ulceradas, que recobrem grandes extensões cutâneas. Os
pacientes apresentam um polimorfismo lesional característico, ocorrendo associação
de lesões pápulo-nodulares, tuberosas, tumorais, vegetantes, verrucosas, formando
placas. O tratamento é muito difícil ou ineficaz (8).
1.3.2 Leishmaniose Mucosa (LM)
A forma mucosa é geralmente causada por disseminação hematogênica dos
parasitos para as mucosas nasais, orofaringe, palato, lábios, língua, laringe e,
excepcionalmente, traquéia e árvore respiratória superior. Admite-se que cerca de
3% a 4% dos indivíduos com LC possam evoluir para esta forma mais grave. A
forma LM constitui sério problema pelas mutilações que pode provocar, pela
dificuldade terapêutica e possibilidade de êxito letal. Dentre os potenciais fatores de
risco para o desenvolvimento desta forma clínica encontram-se: presença de
múltiplas ou extensas lesões cutâneas, lesões acima da cintura pélvica e tratamento
inadequado da lesão cutânea primária (8, 16, 17).
1.4 Agente Etiológico
A Leishmania é um parasito intracelular obrigatório das células do sistema
fagocítico mononuclear, com duas formas principais: uma flagelada ou promastigota,
encontrada no tubo digestivo do inseto vetor, e outra aflagelada ou amastigota,
observada nos tecidos dos hospedeiros vertebrados (13, 15).
As formas amastigotas apresentam-se tipicamente ovóides ou esféricas. Em
seu citoplasma encontra-se núcleo único esférico ou ovóide disposto em geral em
um dos lados da célula, e o cinetoplasto em forma de um bastão pequeno situado
próximo ao núcleo. O tamanho varia de acordo com as espécies, medindo entre 1,5-
6
6,5µm (15). As formas promastigotas são alongadas em cuja região anterior emerge
um flagelo livre. O núcleo situa-se na região anterior, variando bastante na sua
posição. O tamanho é variável, mesmo dentro de uma mesma espécie, medindo
entre 16,0-40,0µm de comprimento x 1,5-3,0µm de largura, incluindo o flagelo que
frequentemente é maior que o corpo (15). A figura 3 apresenta as duas formas de
Leishmania.
Figura 3: A: Formas promastigota (flagelada) de Leishmania; B: Formas amastigotas de Leishmania
no interior de macrófago.
Fonte: FIOCRUZ, 2008; http://fpslivroaberto.blogspot.com.br/2009/12/parasitas-leishmania-spp-eleishmaniose.html (18, 19).
No Brasil atualmente existem sete espécies do gênero Leishmania causadora
de LTA, seis pertencentes ao subgênero Viannia: Leishmania (Viannia) braziliensis,
Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia)
lainsoni, Leishmania (Viannia) lindenbergi, Leishmania (Viannia) naiffi e uma espécie
do subgênero Leishmania: Leishmania (Leishmania) amazonensis (20-22). No
Estado do Amazonas a principal espécie reconhecida como causadora de LTA é a L.
guyanensis (23-26).
1.5 Vetor
Os vetores da LTA são insetos denominados flebotomíneos (figura 4),
pertencentes à Ordem Díptera, Família Psychodidae, Subfamília Phlebotominae,
Gênero
Lutzomyia,
conhecidos
popularmente,
dependendo
da
localização
7
geográfica, como mosquito palha, tatuquira, birigui, entre outros(13). A transmissão
ocorre pela picada do inseto fêmea infectada, que ao exercer o hematofagismo
libera formas promastigotas no local da picada. A saliva do flebotomíneo possui
neuropeptídios vasodilatadores que atuam facilitando a alimentação do inseto e ao
mesmo tempo imunossuprimindo a resposta do hospedeiro, facilitando a
infectividade das promastigota (15).
Figura 4: Flebotomíneo (fêmea) exercendo o hematofagismo.
Fonte: MS, 2007 (27).
1.6 Diagnóstico
O diagnóstico da LTA é baseado em aspectos clínicos e epidemiológicos, na
visualização do parasito, em provas imunológicas e na detecção de material
genético através da técnica de PCR. O diagnóstico clínico é feito com base nas
características da lesão associadas à anamnese, onde os dados epidemiológicos
são de grande importância. Em todos os casos, no entanto, é necessário um
diagnóstico através da confirmação da presença do agente etiológico em amostras
obtidas do paciente (28, 29).
O exame parasitológico direto é considerado como procedimento de primeira
escolha devido à sua fácil execução, rapidez e baixo custo. A pesquisa direta pode
ser realizada através do raspado das bordas das lesões, biópsia com impressão por
aposição e punção aspirativa. Os raspados são feitos após limpeza local com
substância antisséptica, a fim de diminuir a contaminação bacteriana, seguido da
escarificação da borda da lesão com lâmina estéril, tentando-se evitar sangramento.
Após coleta, o material é depositado em lâmina de vidro limpa, fixado em metanol e
8
corado pelo método Giemsa ou Leishman, a coloração pelo Giemsa é considerada a
melhor no sentido de identificação do parasita. O material deve ser observado sob
microscopia óptica em objetiva 100X sob imersão (5, 15, 30).
A biópsia da lesão pode ser realizada com punch de 4 mm de diâmetro, ou
em cunha, com o uso de bisturi. Esta deve ser efetuada, preferencialmente, na
borda íntegra de lesões ulceradas. Após coleta do material, este deve ser fixado em
formol a 10%, embebido em parafina e, posteriormente, corado pela hematoxilina e
eosina e colorações específicas para Leishmania. A confirmação diagnóstica faz-se
mediante visualização do parasita no tecido. A sensibilidade deste método aumenta
quanto mais recente for a lesão (31)
A intradermorreação de Montenegro (IDRM) é feito com injeção intradérmica
de antígenos de Leishmania no antebraço esquerdo. O teste é interpretado após 4872 horas e considerado positivo quando apresentar induração maior ou igual a 5
mm. A IDRM é positiva em aproximadamente 90% dos casos. A reação continua
positiva mesmo após anos de cura clínica, não servindo de critério diagnóstico para
recidivas. O teste apresenta pequeno valor diagnóstico em casos individuais, mas é
útil em inquéritos epidemiológicos (29, 32).
As reações sorológicas como a técnica de imunofluorescência indireta (IFI) e
ensaio imunoenzimático (ELISA) podem ser muito úteis, principalmente nos casos
com lesões extensas e múltiplas e o diagnóstico precoce das lesões mucosas
secundárias ou primárias (6).
A cultura constitui um método de confirmação diagnóstica de casos de
leishmaniose. O material coletado da lesão pode ser inoculado em meio ágarsangue de Novy e McNeal modificado por Nicolle (NNN), Schneider ou outros, onde
o parasita cresce relativamente bem à temperatura ambiente (24 a 26 oC). A
sensibilidade deste método é de aproximadamente 50% para L. braziliensis. O maior
fator limitante da cultura é a contaminação por fungos ou bactérias, a qual pode ser
evitada com a adição de antibióticos e antifúngicos ao meio de cultivo (33).
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica estabelecida para
detecção do DNA do parasita e caracterização do gênero e espécies de Leishmania.
9
A PCR tem se mostrado como uma nova opção de diagnóstico de LTA,
principalmente em função de sua sensibilidade (15, 34).
1.7 Imunopatogênese da leishmaniose tegumentar
A partir da inoculação das formas promastigotas na pele, inicia-se uma
complexa interação entre o parasito e a resposta imunológica do hospedeiro, que
determinará a expressão clínica da LTA. Vários setores do sistema imunológico são
ativados, mas a resposta imune celular, específica para a Leishmania, tem papel
crucial no controle final da infecção (8).
Inicialmente, a presença das formas promastigotas inoculadas desencadeia,
no local da inoculação, uma resposta inflamatória aguda inespecífica da qual
participam células e fatores séricos – células natural killer (NK), polimorfonucleares
(neutrófilos e eosinófilos) e sistema complemento. Estudos indicam os neutrófilos
como uma das primeiras células a chegarem ao local da infecção e a serem
infectadas pelas leishmanias. Os neutrófilos podem ser considerados como
facilitadores para as formas promastigotas metacíclicas, uma vez que facilitam a
infecção dos macrófagos, além de contribuírem para o processo inflamatório.
A
importância das células NK no controle da infecção deve-se tanto à sua ação
citotóxica e também da produção de citocinas pró-inflamatórias, como IFN-γ e TNFα, o que determina um potencial para desenvolver resposta imune celular adequada
(8, 35, 36).
A interação de Leishmania com o macrófago envolve uma interação ligantereceptor entre as moléculas de superfícies de ambos, seguida por uma série de
reações bioquímicas que pode levar à ativação ou inibição das funções microbicidas
da célula. Dentre as diferentes moléculas da membrana dos parasitos envolvidas
nesta interação encontram-se glicoproteínas e glicolipídeos como gp63 e
lipofosfoglicano (LPG). A ligação de formas amastigotas à superfície da célula
hospedeira desencadeia um fenômeno oxidativo celular, gerando metabólitos tóxicos
de oxigênio, superóxido (O2), radical hidroxila (OH-) e, peróxido de hidrogênio (H2O2)
10
que é a principal atividade leishmanicida do macrófago. Além da resposta oxidativa,
o macrófago possui outros mecanismos microbicidas, como óxido nítrico (NO) (37).
Considerando-se que a Leishmania é um parasita intracelular obrigatório, a
ativação do sistema complemento pode beneficiá-lo, pois ao serem gerados
fragmentos da cascata (C3 e C3bi) que se ligam aos receptores dos macrófagos
(CR1 e CR3) e também se depositam na parede do parasito, tem-se facilitada sua
fagocitose. Além disso, sua entrada, utilizando esses receptores, promove baixo
metabolismo oxidativo no macrófago, o que favorece a continuidade do seu ciclo
biológico. À medida que ocorre o processo de fagocitose, os lisossomas das células
fundem-se aos vacúolos parasitóforos formados, resultando em uma modificação do
seu microambiente, que induz à transformação da forma promastigota para
amastigota, facilitando sua sobrevivência, pois, sob essa nova forma, o parasito
apresenta-se mais resistente e desencadeia menor resposta oxidativa da célula
hospedeira (8).
Os linfócitos T são fundamentais na resposta do hospedeiro a LTA: eles são
decisivos para cura e geração de uma resposta imune protetora ao mesmo tempo
em que são responsáveis pela persistência da doença e a sua patologia. Essa
resposta é caracterizada pelo aumento de células T CD4 +, apresentando um perfil
de citocinas Th1 ou Th2. O padrão de resposta imune do tipo 1 com produção de
IFN-γ, TNF-α e IL-12, tem sido associado com o controle da infecção por ativação
macrofágica e destruição parasitária. A citocina IFN-γ atua em sinergia com TNF-α
ativando óxido nítrico sintase (iNOS ou NOS2) a produzir óxido nítrico (NO),
resultando na morte intracelular do parasito e controle da doença. Por outro lado,
citocinas como IL-4, IL-10 e TGF-β, consideradas do tipo 2, favorecem a
multiplicação parasitária, inibindo a produção de NO por macrófagos ativados por
IFN-γ (36, 38, 39). Estudos vêm mostrando, que tanto na LC como na LM, na fase
ativa da doença, ocorre um aumento das citocinas Th1 e Th2, na tentativa de
eliminação do parasita, porém, na LC os níveis de IL-10 são mais elevados que na
LM (40-42). Sugerindo então como um dos fatores responsáveis pela modulação
inadequada da resposta imune observada na LM, onde ocorre resposta inflamatória
exagerada, caracterizada por altos níveis de IFN-γ e TNF, destruição tecidual e
gravidade da doença.
11
Estudos recentes têm evidenciado o novo subtipo celular conhecido como
Th17, relacionado com a produção de IL-17, IL-22, IL-21, IL-27 e IL-6, a princípio
envolvido com a patogênese de doenças inflamatórias crônicas ou autoimunes. A
resposta Th17 surge provavelmente como uma resposta inicial a um grande número
de patógenos que não são bem resolvidos pela resposta do tipo Th1 e que requerem
inflamação tecidual mais exacerbada para serem eliminados (43, 44).
Em relação a resposta imune humoral na LTA, esta é pouco caracterizada,
dado que o controle da infecção está relacionado a uma resposta por células T e a
correta ativação macrofágica. A intensidade da resposta humoral parece estar
relacionada com a carga parasitária e com a cronicidade da infecção (45).
A vasta gama de citocinas e dos mecanismos imunológicos envolvidos na
resposta imune contra Leishmania destaca a complexidade da doença. Visto que na
LTA a infecção pode ser assintomática ou apresentar um espectro de manifestações
clínicas, acredita-se que o resultado da doença é influenciado pelo balanço entre as
respostas Th1/Th2, por fatores genéticos do hospedeiro, espécie do parasita e sua
virulência, além de características epidemiologias e estado imune do hospedeiro (41,
46). Na figura 5 encontra-se um resumo esquemático da complexidade da resposta
imune contra à Leishmania spp.
Figura 5: Representação esquemática de possíveis rotas imunes acionadas nas infecções por
Leishmania.
Fonte: Hozmuller et al., 2006, adaptada por Covas (47).
12
1.8 Tratamento
As principais drogas utilizadas para o tratamento para leishmaniose são o
antimonial pentavalente, isotianato de pentamidina e a anfotericina B. (6)
Os antimoniais pentavalentes (Sbv) são as drogas de primeira escolha
recomendadas para tratar LTA causada por diferentes espécies, estando disponíveis
em
duas
formulações:
antimoniato
de
N-metilglucamina
(Glucantime)
e
estibogluconato de sódio (Pentostan®). Com o objetivo de padronizar o esquema
terapêutico, a Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que a dose deste
antimonial seja calculada em mg Sb+5/kg/dia. As injeções devem ser feitas por via
parenteral, intramuscular ou endovenosa, com repouso após a aplicação. A via
intramuscular pode apresentar o inconveniente da dor local. Sugere-se, então,
alternância dos locais, preferindo-se a região glútea. Em casos de pacientes
desnutridos, com pouca massa muscular e naqueles com trombocitopenia, deve-se
dar preferência à via endovenosa (EV) (13).
As pentamidinas são diamidinas aromáticas que vêm sendo utilizadas como
drogas de segunda escolha no tratamento da leishmaniose tegumentar em áreas
endêmicas dos continentes americano, asiático e africano. São comercializadas para
uso em humanos nas seguintes formulações: Isotionato (Di-B-Hidroxietano
Sulfonato)
e
Mesilato
(Di-B-Hidroximetil-Sulfonato).
Classicamente
a
dose
recomendada é de 4mg/kg/dia, por via intramuscular profunda, de dois em dois dias,
recomendando-se não ultrapassar a dose total de 2g (13).
1.9 Genética da Leishmaniose
A leishmaniose é uma doença complexa. Em genética, doenças complexas
são aquelas que não apresentam um padrão de herança Medeliana clássica, em
que há perfeita correlação entre genótipo e fenótipo. A identificação de fatores
genéticos que determinam se um paciente irá desenvolver a forma leve ou grave é
importante para uma melhor compreensão da patogênese da Leishmania spp e na
identificação de indivíduos em risco de desenvolver doença grave (48). A ocorrência
13
destas doenças é controlada por componentes genéticos, resultado da ação
integrada de um número variado de genes, associados a fatores ambientais,
socioeconômicos, culturais entre outros (49, 50).
Apesar de diferentes espécies de Leishmania induzirem sintomas distintos, os
indivíduos infectados com a mesma espécie de parasitas podem ter sintomas
diferentes, e podem diferir na sua resposta à terapia. A influência de fatores
genéticos
relacionado
ao
desenvolvimento
dessas
diferentes
formas
de
leishmaniose tem sido evidenciada por meio de estudos de larga escala, na forma
de varredura do genoma dos indivíduos e através de estudo de genes candidatos,
onde é feita uma avaliação do grau de associação entre um variante polimórfica e a
presença da doença propriamente dita ou de alguma característica específica da
doença (51-54). A coexistência de alelos múltiplos em um locus é chamada de
polimorfismo genético. Um alelo pode ser definido como polimórfico se ele estiver
presente em uma frequência maior que 1% na população(55). Os polimorfismos de
nucleotídeo único (SNPs) são os polimorfismos mais estudados devido ao grande
número encontrado ao longo do genoma, perfazem cerca de 90% de toda variação
genética humana. Os SNPs são alterações da sequência de DNA que ocorrem
quando um único nucleotídeo (A, T, C, ou G) na sequência do genoma é trocado por
outro (55, 56).
Análise de segregação complexa realizada em uma amostra de 636 famílias
nucleares recrutadas em uma área endêmica para L. peruviana demonstrou a
existência de componente genético controlando a susceptibilidade na manifestação
clínica da doença (57). Polimorfismo na região promotora do gene TNF-α na posição
-308A/G, foi associado com a ocorrência de LM em uma população venezuelana
(58).
Estudo familiar de ligação realizado em pacientes com leishmaniose visceral
(LV) em uma vila do Sudão, endêmica para L. donovani, demonstrou uma forte
ligação entre a presença da doença sintomática e a região do cromossomo 22q12
(51). Ainda no Sudão um estudo de associação baseado em famílias nucleares
envolvendo 80 trios, detectou uma associação positiva entre um haplótipo formado
por quatro SNPs na região promotora do gene INFGR1 e leishmaniose dermal póskalazar (59). A comparação entre 146 indivíduos brasileiros afetados por
14
leishmaniose tegumentar americana (78 pacientes com leishmaniose cutânea e 58
com leishmaniose mucosa) e 609 indivíduos saudáveis não apresentou associação
com alelos do marcador INFG +874 T/A do gene INFG (60).
Polimorfismo em CCL2 demonstrou associação com o aumento da
susceptibilidade para a forma mucosa da leishmaniose em estudo realizado em área
endêmica para L. braziliensis, na Bahia (61). O polimorfismo -174G/C do gene IL-6
também demonstrou associação com susceptibilidade à LM, em um estudo realizado
na mesma região (62).
Estudos sugerem que a IL-1b, possivelmente, tem um papel chave na
determinação da gravidade da doença em pacientes com leishmaniose cutânea
difusa. E ainda que polimorfismo em IL-1b representa uma variável que pode
influenciar o risco de desenvolver a doença, em pacientes infectados com o parasita
L. mexicana(63).
Variantes dos genes PHF10, C6orf70, DLL1, PSMB1 e TBP localizados no
cromossomo 6q27 foram associados em estudo familiar com LV no Sudão e no
Brasil apenas o gene DLL1 demonstrou associação (64). Alelos dos genes TGFB1 e
IL-8 foram estudados em uma poulação do Estado do Maranhão, os resultados
mostraram que a presença do alelo T na posição -509 do gene TGFB1 conferia um
risco relativo estimado em 1.9 de desenvolver LV (65). Mohamed et al. demostraram
associação de variantes dos genes IL-4 e IL-9 com LV em população sudanesa (66).
Um gene com efeito maior foi sugerido no controle da manifestação da lesão
cutânea primária em um estudo realizado em área endêmica de L. braziliensis na
Bolívia (67). No Brasil, a LM foi associada com uma diminuição da frequência de
HLA-DR2 e um aumento da frequência de HLADQw3 (68).
1.10 Gene IL-10
O gene IL-10 está localizado no cromossomo 1, na região 1q31-q32 e
compreende 5 éxons (69, 70). Sua região promotora é altamente polimórfica, pelo
menos 23 SNPs já foram relatados, e apesar de vários deles estarem em
15
desequilíbrio de ligação, é razoável supor que alguns são de importância biológica.
No entanto os SNPs mais investigados são encontrados na região distal os SNPs 3575 T/A, -2849 G/A, -2763 C/A, e na região proximal os SNPs -819 C/T, -592 C/A, 1082 G/A (71, 72).
O IL-10 codifica uma citocina antiinflamatória, a interleucina 10 (IL-10) (73). A
IL-10 é normalmente produzida por linfócitos Th2, linfócitos Th0, queratinócitos e
células dendríticas. É uma das citocinas com características antiinflamatórias mais
destacadas do sistema imune humano (74-76). A mesma inibe a síntese de citocinas
pró-inflamatórias secretadas normalmente por monócitos e macrófagos ativados, tais
como: TNF-α, IL-1α, IL-β, IL-6, IL-8, IL-12 (75, 77).
Vários estudos têm demonstrado um possível envolvimento tanto de
polimorfismos do gene IL-10 como da citocina (IL-10) na patogênese de doenças
inflamatórias e infecciosas. Estudos recentes têm sugerido que SNPs existentes na
região promotora e codificantes do gene IL10 poderiam explicar os diferentes
padrões de resposta observados, por exemplo, em pacientes com Hanseníase e que
possuam níveis altos de IL-10 (78, 79).
Em um estudo avaliando o polimorfismo -1082A/G foi observado que
mulheres
com
câncer
cervical
portadoras
do
alelo
G
parecem
estar
imunogeneticamente predispostas a produzir altos níveis de IL-10. Além disso, foi
descrito que a frequência do alelo A associado à baixa produção de IL-10 foi menor
no grupo de mulheres com câncer cervical quando comparado ao grupo controle.
Esses achados sugerem que a habilidade, geneticamente determinada, de produzir
altos níveis de IL-10 pode ser um fator importante no desenvolvimento do câncer
cervical (80).
Estudo realizado em áreas endêmicas para doenças de chagas em Minas
Gerais demonstrou que polimorfismo do gene IL-10 (-1082G/A) está associado com
o desenvolvimento de cardiomiopatia em indivíduos infectados com Trypanosoma
cruzi (81).
Schaaf et al em um estudo de caso-controle encontrou associação do
polimorfismo do gene IL-10 (-1082 G/A) com pneumonia. Revelou que o genótipo 1082 GG está associado com a gravidade da doença, com maior risco de
16
desenvolver choque séptico (P=0.024, OR=6.1com IC=95% (1.4-27.2)) A freqüência
do alelo G foi significativamente maior também nos pacientes que morreram em
comparação com os pacientes que sobreviveram (82).
Em um estudo de pacientes internados na unidade de terapia intensiva, o
alelo -592A foi associado com menor liberação de IL-10 e maior mortalidade. Neste
grupo de pacientes, 46,3% desenvolveram sepse e 32,8% morreram (83).
Um estudo detalhado de 659 pacientes com hepatite C revelou uma
associação entre o genótipo -592 AA e infecção autolimitada, enquanto o genótipo 1082 GG foi associado com a infecção persistente (84).
A análise do polimorfismo IL10-819C/T, localizado no promotor de IL-10,
mostrou que o alelo C aumenta o risco de lesões em pacientes com LTA (OR = 2,5
(1,12-5,7), p = 0,003). O genótipo IL10-819C/C foi associado a maiores níveis de IL10 do que os genótipos C/T e T/T. Estas observações demonstram um papel
importante para IL-10 em lesões da pele em indivíduos infectados com L.
braziliensis. Este estudo foi conduzido em uma população da Bahia, que vive em
área
endêmica para leishmaniose cutânea causada por L. braziliensis (85). Porém
em um estudo realizado no Rio de Janeiro não foi encontrada nenhuma associação
do SNP -819C/T com LTA (86).
Variantes dos genes IL-10, IL-23R/IL-12RB2 foram associadas à Doença de
Behçet (BD) em estudo de associação caso/controle na Turquia. Na região do gene
IL-10, 27 SNPs foram genotipados, e 5 localizados na região promotora
apresentaram-se fortementes associados com BD, sendo que o SNP rs1518111
mostrou maior significância (P=3.54x10-18, OR=1.45 e IC=95% (1.34-1.58)). Na
região IL23R/IL12RB2, foram genotipados 11 SNPs, apenas um apresentou
associação (rs924080, p= 6.69x10-9, OR=1.28 e IC=95% (1.18-1.39))(87). Andrew et
al. identifcaram novos sítios de SNPs na região promotora do IL-10, e oitos
haplótipos na região distal do gene apresentaram diferenças significativas em
termos quantitativos na produção de IL-10 em doadores normais. Porém, estes
SNPs são significativamente associados com lúpus eritematoso sistêmico em
Africano-americanos e pode aumentar o risco de lúpus eritematoso sistêmico nesse
grupo (88).
17
1.11 Gene IL-10RA
O gene IL-10RA está localizado no cromossomo 11, na região 11q23.3. A
proteína codificada por este gene é um receptor para a interleucina 10, a IL-10R
(89). A IL-10R (IL-10 receptor) são tetrâmeros constituídos por duas subunidades de
ligação (IL-10R-alfa ou IL-10R1) e duas subunidades de sinalização acessórias (IL10R-Beta ou IL-10R2) (90). A mesma medeia o sinal imunossupressor de
interleucina 10, e, assim, inibe a síntese de citocinas pró-inflamatórias (91, 92).
Estudo de caso-controle em uma população coreana demonstrou associação
dos SNPs dos genes IL-10, IL-10RA e IL-10RB com o risco de acidente vascular
isquêmico em hipertensos (93). Polimorfismos do IL-10RA também foram
associados com filariose linfática, colite ulcerativa muito precose, câncer cervical e
vulvar(94-96).
Análise estrutural da variante S138G revelou que a substituição de serina 138
com glicina pode interferir com a ligação de IL-10 e IL-10R1 (97). Estudo avaliando a
expressão
e função do
receptor
de
interleucina-10
(IL-10R) em
células
mononucleares do sangue periférico de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico
(LES) e indivíduos saudáveis, mostrou níveis semelhantes de expressão de IL-10R
nos dois grupos. No entanto, foram observadas diferenças claras na expressão de
genes induzidos por IL-10R em pacientes com LES e controles, principalmente nos
genes envolvidos na apoptose e os que codificam citocinas e seus receptores (98).
18
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Verificar o papel dos polimorfismos genéticos em IL-10, IL-10RA associados
com leishmaniose cutânea em uma amostra populacional do estado do Amazonas,
Brasil.
2.2 Específicos
 Determinar a frequência dos alelos e genótipos dos SNPs dos genes IL-10 e
IL-10RA entre os pacientes com LC e indivíduos sem leishmaniose;
 Comparar as frequências encontradas dos SNPs e sua possível associação
no controle da susceptibilidade ou resistência à LTA.
19
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Desenho do estudo
Trata-se de um estudo caso-controle, realizado em uma amostra populacional
do Estado do Amazonas recrutado no período compreendido entre novembro de
2008 a dezembro de 2013.
3.2 Área de estudo
Consiste
de
regiões endêmicas para Leishmaniose
localizadas nas
proximidades do município de Manaus, especificamente das rodovias AM-010, que
liga Manaus ao município de ltacoatiara; e BR-174, que liga Manaus a Boa Vista,
capital do estado de Roraima. Estas regiões endêmicas são áreas de floresta
tropical que ao longo dos anos sofreram desmatamento, dando lugar a
assentamentos populacionais, cuja principal fonte de renda é a atividade
agropecuária. Sendo assim, as principais atividades ocupacionais destes indivíduos
e seu tipo de moradia, próximo às áreas de mata, tornaram essa população
altamente exposta à infecção por Leishmania sp.
3.3. População estudada
Foram recrutados pacientes com diagnóstico confirmado para Leishmaniose
cutânea para compor o grupo caso e indivíduos sem sinal ou histórico de
Leishmaniose, para compor o grupo controle, todos provenientes de áreas
endêmicas para Leishmaniose no estado do Amazonas.
3.3.1 Definição de caso para o estudo
20
A Leishmaniose cutânea é definida como a presença de uma ou mais lesões
ulceradas na pele, sem evidência clínica de comprometimento das mucosas, e com
exame direto positivo.
3.3.2 Recrutamento da população
No momento da inclusão dos indivíduos voluntários, foram explicados os
detalhes e potenciais consequências do estudo e os procedimentos aos quais estes
seriam submetidos em caso de concordância em participar. Todos os candidatos
foram solicitados a ler o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo
B), devidamente aprovado pelo Comitê de Ética (CEP) pertinente. Aos que
concordaram em participar, foi assinado o TCLE correspondente ao seu caso
específico, e aplicado questionário (Anexo C). Ao voluntário menor de idade, um
formulário próprio foi apresentado e assinado por um dos pais ou guardião legal.
Para o voluntário não alfabetizado, o TCLE foi lido e explicado e, em caso de aceite,
sua impressão digital foi coletada.
3.3.3 Grupo caso
A população de estudo desse grupo foi recrutada exclusivamente no
ambulatório de dermatologia da FMT-HVD por demanda espontânea. Foram
admitidos apenas pacientes com Leishmaniose cutânea que tiveram seu diagnóstico
confirmado através do exame direto, realizado por técnicos microscopistas
capacitados para este fim. O diagnóstico foi realizado seguindo as recomendações
do Ministério da Saúde.
Após o diagnóstico positivo de LTA, os pacientes que concordaram em
participar do estudo, mediante assinatura do TCLE e aplicação de questionário
foram submetidos a uma coleta de 5 mL de sangue total. Todos os pacientes
receberam tratamento e acompanhamento médico.
21
3.3.4 Grupo controle
Para compor este grupo, foram recrutados indivíduos sem história prévia ou
manifestação da LTA, todos habitantes de áreas endêmicas adjacentes às rodovias
AM-010 e BR-174, de onde procedeu a maioria dos indivíduos do grupo caso.
A seleção dessas localidades foi realizada de forma probabilística, tendo
como base a escolha de regiões com casos confirmados de Leishmaniose,
podendo-se destacar as principais: BR-174 - Ramal do Pau-Rosa e Ramal da
Cooperativa e suas vicinais (Km 21); AM-010 - Ramal Água Branca I (Km 32) e
Ramal Água Branca II (Km 35), Ramal do Leão (Km 37);
O recrutamento foi realizado por meio de visitas da equipe de investigadores
a essas localidades, percorrendo-se toda a extensão do ramal, com a finalidade de
alcançar todas as moradias.
3.4 Coleta do material biológico
Todos os indivíduos que concordaram em participar do estudo, foram
submetidos a uma punção venosa para coleta de 5 mL de sangue periférico. As
amostras de sangue foram coletadas em tubos tipo Vacutainer® contendo EDTA
como anticoagulante, em condições ideais de assepsia.
O sangue coletado foi centrifugado a 3.600 rpm durante 10 minutos para
obtenção do creme leucocitário (buffy-coat) que foi posteriormente aspirado e
transferido para um microtubo de 1,5 mL para extração do DNA genômico.
O processamento das amostras deu-se no Laboratório de Pesquisa em
Doenças Endêmicas (LPDE) da FMT-HVD.
22
3.5 Extração de DNA
O DNA genômico foi extraído a partir do creme leucocitário obtido conforme
descrito anteriormente. As extrações realizadas até o ano de 2011 foram feitas com
o kit comercial de extração de DNA (WIZARD®, Promega Corporation, EUA), de
acordo com as instruções sugeridas pelo fabricante. As amostras obtidas a partir do
ano de 2012 foram extraídas pela técnica de “salting-out”, conforme protocolo de
Sambrook et al. com algumas modificações (Anexo D) (65).
Após a extração de DNA, sua concentração e pureza foram determinadas em
espectrofotômetro. As amostras extraídas foram armazenadas em freezer à -80°C,
localizados exclusivamente em laboratórios da FMT-HVD.
3.6 Genotipagem
Marcadores do tipo Polimorfismos de Nucleotídeos Únicos (SNPs) dos genes
IL-10, IL-10R foram escolhidos com base em material disponível na literatura e
utilizando informações sobre suas sequências em bancos de dados de domínio
público. A genotipagem dos marcadores foi realizada através da técnica de Reação
em Cadeia da Polimerase – Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de
Restrição (PCR-RFLP, de Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment
Length Polymorphism).
3.6.1 Amplificação por PCR
As regiões genômicas contendo os marcadores genéticos em análise foram
amplificadas pela Reação em Cadeia da Polimerase (em inglês, PCR, Polymerase
23
Chain Reaction) sob condições uniformes. As reações de amplificação foram
realizadas em termociclador Mastercycler® ep gradiente S, Eppendorf Germany.
Após a PCR, as amostras foram aplicadas em gel de agarose a 2% em
tampão TBE 1x corados com brometo de etídeo. Foram aplicados 5 µL do produto
amplificado, diluídos em 2 µL de tampão de amostra azul de bromofenol e 5 µL do
marcador de tamanho molecular de DNA de 100 pb. As corridas foram feita a 100V
durante aproximadamente 40 minutos em tampão TBE 1x. A visualização das
bandas foi realizada em transluminador com luz UV e fotografadas em sistema de
fotodocumentação digital. A sequência de todos os iniciadores encontra-se descrito
na Tabela 1. Os oligonucleotídeos utilizados, as condições de clivagem e o
tamanho do fragmento amplificado encontram-se discriminados nas Tabelas de 2 a
6.
Tabela 1: Sequência dos iniciadores utilizados nas amplificações por PCR.
GENE
IL-10
POLIMORFISMO
-3575 T/A
rs1800890
INICIADORES
F: 5’-GGAGCAGGGATGGAAGAAGAGAGG-3’
R: 5’-GCCTGGGCACAATTTAGTCCTGTG-3’
Pb
235
-2849 G/A
rs6703630
F: 5’-TTCAGCAAATGGCTTGAGAT-3’
R: 5’-AATAGGGTTGAGGTTAGGATCTG-3’
395
-2763 C/A
rs6693899
F: 5’-TTCAGCAAATGGCTTGAGAT-3’
R: 5’-AATAGGGTTGAGGTTAGGATCTG-3’
395
-592 C/A
rs1800872
F: 5’-GGTGAGCACTACCTGACTAGC-3’
R: 5’-CCTAGGTCACAGTGACGTGG-3’
412
-819 C/T
rs1800871
F: 5’-GACAACACTACTAAGGCTCCTTTGGGA-3’
R: 5’-GTGAGCAAACTGAGGCACAGAAT-3’
315
-1082 G/A
rs1800896
F: 5’-AACTGGCTCCCCTTACCTTC-3’
R: 5’-AGGAGGTCCCTTACTTTCCGC-3’
141
S138G A/G
rs3135932
F: 5’-TCAGCCCTCAAGTCTCATGGTATTC-3’
R: 5’-TCTCATACTCTCGGAAGTGACTGAAGAA-3’
186
G330R G/A
rs117423374
F: 5’-CACCCCCAGGCTGACAGAACGCTGGGAA-3’
R: 5’-CTCAGGTAACCCTGGAATGCCACAG-3’
323
IL-10RA
F (fordward)= primer senso; R(reverse)= primer antisenso; pb= pares de bases
24
Tabela 2: Protocolo padronizado contendo as condições de amplificação por PCR
para o SNP IL-10 -3575 T/A, -2849 G/A e -2763 C/A.
Reagentes
Concentração
Volume
(µL)
Ciclo
Primer F
0,2 µM
0,5
95 ⁰C – 5’
Primer R
0,2 µM
0,5
95 ⁰C – 30’’
Tampão
1x
2,5
62 ⁰C – 15’’
MgCl2
4,0 mM
2,0
72 ⁰C – 30’’
dNTP
40 µM
1,0
72 ⁰C – 7’
Taq Polimerase
1.0 U
0,2
4 ⁰C.
DNA
10-100 ng
1,0
H2O
Suficiente para 23,5 µL
17,3
35X
Tabela 3: Protocolo padronizado contendo as condições de amplificação por PCR
para o SNP IL-10 -819 C/T e -592 C/A.
Reagentes
Concentração
Volume
(µL)
Ciclo
Primer F
0,2 µM
0,5
95 ⁰C – 5’
Primer R
0,2 µM
0,5
95 ⁰C – 15’’
Tampão
1x
2,5
58 ⁰C – 15’’
MgCl2
3,0 Mm
1,5
72 ⁰C – 15’’
dNTP
40 µM
1,0
72 ⁰C – 7’
Taq Polimerase
1.0 U
0,2
4 ⁰C.
DNA
10-100 ng
1,0
H2O
Suficiente para 23,5 µL
17,8
35X
25
Tabela 4: Protocolo padronizado contendo as condições de amplificação por PCR
para o SNP IL-10 -1082 G/A.
Reagentes
Concentração
Volume
(µL)
Ciclo
Primer F
0,2 µM
0,5
95 ⁰C – 5’
Primer R
0,2 µM
0,5
95 ⁰C – 20’’
Tampão
1x
2,5
57 ⁰C – 20’’
MgCl2
3,0 mM
1,5
72 ⁰C – 20’’
dNTP
40 µM
1,0
72 ⁰C – 7’
Taq Polimerase
1.0 U
0,2
4 ⁰C.
DNA
10-100 ng
1,0
H2O
Suficiente para 23,5 µL
17,8
35X
Tabela 5: Protocolo padronizado contendo as condições de amplificação por PCR
para o SNP IL-10RA S138G A/G.
Reagentes
Concentração
Volume
(µL)
Ciclo
Primer F
0,2 µM
0,5
95 ⁰C – 5’
Primer R
0,2 µM
0,5
95 ⁰C – 20’’
Tampão
1x
2,5
58 ⁰C – 20’’
MgCl2
4,0 Mm
2,0
72 ⁰C – 20’’
dNTP
40 µM
1,0
72 ⁰C – 7’
Taq Polimerase
1.0 U
0,2
4 ⁰C.
DNA
10-100 ng
1,5
H2O
Suficiente para 23,5 µL
16,8
35X
26
Tabela 6: Protocolo padronizado contendo as condições de amplificação por PCR
para o SNP IL-10RA G330R G/A.
Reagentes
Concentração
Volume
(µL)
Ciclo
Primer F
0,2 µM
0,5
95 ⁰C – 5’
Primer R
0,2 µM
0,5
95 ⁰C – 20’’
Tampão
1x
2,5
61 ⁰C – 20’’
MgCl2
2,0 Mm
1,0
72 ⁰C – 20’’
dNTP
40 µM
1,0
72 ⁰C – 7’
Taq Polimerase
1.0 U
0,2
4 ⁰C.
DNA
10-100 ng
1,5
H2O
Suficiente para 23,5 µL
17,8
35X
3.6.2 RFLP
Para a realização da análise dos polimorfismos foi realizada a técnica RFLP.
Essa técnica baseia-se na detecção de variantes genéticas com base no resultado
obtido pela digestão do produto amplificado por uma enzima de restrição específica.
Após amplificação gênica, foi realizada a digestão enzimática utilizando
enzimas de restrição específicas para identificação de cada SNPs. Os dados
referentes à RFLP encontram-se na Tabela 7.
Após o período de incubação estabelecido para atuação da endonuclease, os
produtos da digestão foram misturados com 5 µL de tampão de corrida e submetido
à eletroforese em gel de agarose em tampão TBE 1x e corados com brometo de
etídeo. As corridas foram feita a 100V durante o tempo necessário para completa
separação dos fragmentos gerados. Utilizou-se marcador de tamanho molecular de
DNA de 100 pb para facilitar a identificação dos fragmentos gerados em cada
amostra. Ao final as bandas foram visualizadas em transluminador de luz UV e
fotografadas em sistema de fotodocumentação digital. Os dados referentes à
digestão dos produtos de PCR encontram-se na Tabela 8.
27
Tabela 7: Dados referentes à RFLP
GENE
POLIMORFISMO
INICIADORES
-3575 T/A
F: 5’-GGAGCAGGGATGGAAGAAGAGAGG-3’
rs1800890
R: 5’-GCCTGGGCACAATTTAGTCCTGTG-3’
-2849 G/A
rs6703630
IL-10
R: 5’-AATAGGGTTGAGGTTAGGATCTG-3’
F: 5’-TTCAGCAAATGGCTTGAGAT-3’
rs6693899
R: 5’-AATAGGGTTGAGGTTAGGATCTG-3’
-592 C/A
F: 5’-GGTGAGCACTACCTGACTAGC-3’
rs1800872
R: 5’-CCTAGGTCACAGTGACGTGG-3’
rs1800871
235pb
TEMPERATURA
ANELAMENTO
62 ⁰C
62 ⁰C
R: 5’-AGGAGGTCCCTTACTTTCCGC-3’
S138G A/G
F: 5’-TCAGCCCTCAAGTCTCATGGTATTC-3’
rs3135932
R: 5’-TCTCATACTCTCGGAAGTGACTGAAGAA-3’
T:132/75/28
5’...R↓AATTY...3’
5’...GGATC(N)4↓...3’
DdeI
395pb
62 ⁰C
5’...C↓TNAG...3’
3’...GANT↑C...5’
RsaI
412pb
58 ⁰C
5’...GT↓AC...3’
3’...CA↑TG...5’
SspI
315pb
rs1800896
ApoI
3’...CCTAG(N)5↑...5’
58 ⁰C
R: 5’-GTGAGCAAACTGAGGCACAGAAT-3’
F: 5’-AACTGGCTCCCCTTACCTTC-3’
ALELOS: PRODUTOS DIGESTÃO
AlwI
395pb
F: 5’-GACAACACTACTAAGGCTCCTTTGGGA-3’
-1082 G/A
ENZIMA / SÍTIO DE
RESTRIÇÃO
3’...YTTAA↑R...5’
F: 5’-TTCAGCAAATGGCTTGAGAT-3’
-2763 C/A
-819 C/T
PRODUTO
PCR
5’...AAT↓ATT...3’
3’...TTA↑TAA...5’
MnlI
141pb
57 ⁰C
5’...CCTC(N)7↓...3’
3’...GGAG(N)6↑...5’
HindIII
186pb
58 ⁰C
5’...A↓AGCTT...3’
A:207/28
G:241/77/51/26
A:318/51/26
C:114/92/92/49/48
A:163/92/92/48
A:236/176
C:412
T:291/24
C:315
A:92/49
G:141
G:155/31
A:186
3’...TTTGA↑A...5’
IL-10RA
G330R G/A
rs117423374
F: 5’-CACCCCCAGGCTGACAGAACGCTGGGAA-3’
MspI
323pb
R: 5’-CTCAGGTAACCCTGGAATGCCACAG-3’
61 ⁰C
G: 184/61/49/29
5’...C↓CGG...3’
3’...GGC↑C...5’
A:213/61/49
28
Tabela 8: Dados referentes à digestão dos produtos de PCR.
SNP
CONDIÇÕES DE DIGESTÃO
[ ] GEL DE AGAROSE
Tampão 3 -1x
Enzima: ApoI 2U
Produto de PCR: 15 µL
IL-10 -3575 T/A
Volume final: 25 µL
3%
Temperatura: 50 ⁰C
Tempo de digestão: 3 horas
Tampão 4 -1x
Enzima: AlwI 2U
IL-10 -2849 G/A
Produto de PCR: 15 µL
Volume final: 25 µL
3%
Temperatura: 37 ⁰C
Tempo de digestão: 3 horas
Tampão 3 -1x
Enzima: DdeI 2U
IL-10 -2763 C/A
Produto de PCR: 15 µL
Volume final: 25 µL
4%
Temperatura: 37 ⁰C
Tempo de digestão: 3 horas
Tampão SspI -1x
Enzima: SspI 2U
IL-10 -819 C/T
Produto de PCR: 15 µL
Volume final: 25 µL
3%
Temperatura: 37 ⁰C
Tempo de digestão: 3 horas
Tampão 2 -1x
Enzima: RsaI 2U
IL-10 -592 C/A
Produto de PCR: 15 µL
Volume final: 25 µL
3%
Temperatura: 37 ⁰C
Tempo de digestão: 3 horas
Tampão 4 -1x
Enzima: MnlI 2U
IL-10 -1082 G/A
Produto de PCR: 15 µL
Volume final: 25 µL
3%
Temperatura: 37 ⁰C
Tempo de digestão: 3 horas
Tampão 2.1 -1x
Enzima: HindIII 2U
IL-10RA S138G A/G
Produto de PCR: 15 µL
Volume final: 25 µL
Temperatura: 37 ⁰C
3%
29
Tempo de digestão: 3 horas
Tampão 2 -1x
Enzima: MspI 2U
IL-10RA G330R G/A
Produto de PCR: 15 µL
Volume final: 25 µL
3%
Temperatura: 37 ⁰C
Tempo de digestão: 3 horas
[ ]: Concentração; U: Unidade e µL: Microlitro
3.7 Análise estatística
Inicialmente, foi realizado o teste para verificar se as frequências alélicas dos
SNPs estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE), bem como a estimativa do
grau de desequilíbrio de ligação (DL) entre alelos de pares de marcadores usando o
parâmetro r2, foi realizada após implementação do software Haploview v.4.2 (99).
Análise estatística descritiva foi aplicada para ambos os grupos de casos e
controles. Para as variáveis qualitativas foram calculadas as frequências em
porcentagens para cada grupo, e para as variáveis quantitativas obteve-se a média,
desvio padrão, valores mínimo e máximo. As análises de comparação dos
polimorfismos entre grupos casos e controles, o teste do chi-quadrado (χ2) e odds
ratio (OR) foram feitos utilizando o programa SPSS (Satistical Package for the Social
Sciences) v.22. Sendo os valores de OR>1 presença de um fator de risco, OR<1 um
fator protetor e na presença de OR=1 um equilíbrio de ligação, não havendo
associação. Diferença entre os grupos foi estatisticamente significante quando o
valor de P˂0,05. O intervalo de confiança (IC) calculado foi de 95%.
3.8 Aspectos éticos
O estudo foi aprovado pelo CEP da FMT-HVD sob o número do parecer
289.683, CAAE: 09995212.0.0000.0005.
30
3.9 Suporte financeiro
Este estudo faz parte de um projeto maior, intitulado “Estudo da influência de
polimorfismos genéticos na suscetibilidade à leishmaniose tegumentar causada por
Leishmania guyanensis em população de áreas endêmicas de Manaus, estado do
Amazonas, coordenado pelo Prof. Dr Rajendranath Ramasawmy, e financiado pelo
CNPq (MCTI/CNPq/MS-SCTIE –n° 404181/2012-0).
31
4. RESULTADOS
4.1 Características gerais da população em estudo
O estudo resultou no recrutamento de 392 pacientes com leishmaniose
cutânea. Todos os participantes desse grupo foram diagnosticados com LTA, de
acordo
com
parâmetros
clínicos,
epidemiológicos
e
laboratoriais.
Houve
predominância do gênero masculino (311 indivíduos, 79,3%) em relação ao feminino
(80 indivíduos, 20,4%). A idade média do grupo foi de 32.1, com mínima de 5 e
máxima de 70 anos.
Obtivemos 382 indivíduos saudáveis, sem histórico de LTA, habitantes de
áreas endêmicas de Manaus para compor o grupo controle. A predominância do
gênero masculino também existiu no grupo. A idade média foi de 36.3, com mínima
de 5 e máxima de 89 anos. Nota-se que o grupo controle apresenta-se mais velho
que o grupo caso, fator esse positivo para o estudo, pois estes estiveram expostos à
doença a mais tempo que os casos, e não ficaram doentes, ou seja, a probabilidade
é maior de que eles sejam controles genéticos verdadeiros, naturalmente
resistentes. Os dados referentes às características da população estudada
encontram-se na Tabela 9.
Tabela 9: Dados da população estudada
CASOS
CONTROLES
Média[DP]
32.1 [14.0]
36.3 [17.7]
Mediana
30
32
Min – Max
5 _ 70
5 _ 89
M
311 (79,3)
225 (58,9)
F
80 (20,4)
157 (41,1)
Sem informação
1 (0,3)
0
Total
392
382
Idade
Gênero
DP: Desvio padrão; Min: Mínimo; Max: Máximo; M: Masculino; F: Feminino
32
4.2 Genotipagem
Foram genotipados oito SNPs para o presente estudo, IL-10 (-3575 T/A, 2763 C/A, -2849 G/A, -819 C/T, -1082 G/A e -592 C/A) e IL-10RA (S138G A/G e
G330R G/A). Todos os marcadores investigados nesse estudo foram testados
individualmente para equilíbrio de Hardy-Weinberg nos grupos de pacientes e
indivíduos controles. Foi observado que os marcadores rs6693899 (-2763 C/A),
rs1800871 (-819 C/T) e rs1800896 (-1082 G/A) estavam fora de Hardy-Weinberg
com valor de P= 1.0E-4, 4.5681E-10 e 8.0E-4 respectivamente, logo não foi
realizada a analise de associação dos mesmos. Esses desequilíbrios podem
realmente existir ou podem está associados com problemas técnicos ou com baixo
número de genotipagem.
A análise do grau de desequilíbrio de ligação (DL) entre alelos de pares de
marcadores usando o parâmetro r2, foi realizada após implementação do software
Haploview v.4.2, confirmando independência para todos os SNPs analisados.
(Figura 6).
A
B
Figura 6: Análise de desequilíbrio de ligação entre os SNPs dos genes IL-10 (A) e IL-10RA (B). O
número no interior do quadro indica a proporção de DL, em porcentagem, calculado utilizando o
2
parâmetro r ; o código de cores reflete a intensidade de DL entre dois loci: quanto mais escuro o
quadrado, maior o DL entre os SNPs (99).
4.2.1 Análise da distribuição das frequências alélicas e genotípicas e
associação dos polimorfismos do IL-10 e IL-10RA.
33
As frequências alélicas e genotípicas de cada grupo foram calculadas com a
utilização do programa SPSS (Satistical Package for the Social Sciences) v.22. Entre
os SNPs do gene IL-10 (-3575 T/A, -2849 G/A e -592 C/A) não foi encontrada
evidência para associação entre genótipos ou alelos com leishmaniose. Para o SNP
-3575 T/A, as frequências genotípicas foram 3.3% para homozigotos AA, 32.9% para
heterozigotos AT e 63.8% para homozigotos TT no grupo de pacientes, contra
frequências de 4.8, 32.7 e 62.5% para AA, AT e TT, respectivamente, no grupo
controle. A frequência do alelo A foi de 80.2% e 78.9% para pacientes com LC e
controles, respectivamente. Para o SNP -2849 G/A, as frequências genotípicas
foram 2.0% (homozigoto AA), 24.4% (heterozigoto AG) e 73.6% (homozigoto GG)
para os pacientes com LC, e 3.6, 28.0 e 68.4% para AA, AG e GG, respectivamente
para o grupo controle. A frequência do alelo G foi de 85.8 e 82.4% para pacientes
com LC e controles, respectivamente. Finalmente, para o SNP -592 C/A, as
frequências genotípicas foram 15.2% (homozigoto AA), 46.0% (heterozigoto AC) e
38.8% (homozigoto CC) para pacientes com LC, e 13.7, 41.1 e 45.2% para AA, AC e
CC entre controles, respectivamente. A frequência do alelo C foi de 61.8 e 65.7%
para pacientes com LC e controles, respectivamente.
Nenhuma diferença observada para as frequências genotípicas e alélicas foi
estatisticamente significativa para o SNP S138G A/G do gene IL-10RA. As
frequências genotípicas foram 86.0% (homozigoto AA), 12.4% (heterozigoto AG) e
1.6% (homozigoto GG) para pacientes com LC, e 88.2, 10.5 e 1.3% para AA, AG e
GG entre controles, respectivamente. A frequência do alelo A foi de 92.2 e 93.5%
para pacientes com LC e controles, respectivamente. As frequências alélicas e
genotípicas dos marcadores dos genes IL-10 e IL-10RA nas populações casos e
controles estão descritas na Tabela 10.
Para o SNP G330R G/A do gene IL-10RA houve diferença estatisticamente
significativa na distribuição de frequências alélicas (P= 0.013) e genotípicas (P=
0.044) entre casos e controles. As frequências genotípicas foram 6.4% (homozigoto
AA), 28.3% (heterozigoto AG) e 65.3% (homozigoto GG) para pacientes com LC, e
2.7, 24.6 e 72.7% para AA, AG e GG entre controles, respectivamente. Para verificar
qual alelo estava associado, foi realizada a análise de dominância, onde o domínio
do alelo G apresentou maior significância com P= 0,043 e OR= 0.408. Os resultados
estão apresentados na Tabela 11.
34
Tabela 10: Frequências alélicas e genotípicas dos marcadores dos genes IL-10 e IL10RA nas populações casos e controles.
POLIMORFISMOS
CASOS
CONTROLES
n= 359 (%)
n= 355 (%)
Genótipo
AA
12 (3,3)
17 (4,8)
AT
118 (32,9)
116 (32,7)
TT
229 (63,8)
222 (62,5)
A
142 (19,8)
150 (21,1)
T
576 (80,2)
560 (78,9)
n= 349 (%)
n= 307 (%)
Genótipo
AA
7 (2,0)
11 (3,6)
AG
85 (24,4)
86 (28,0)
GG
257 (73,6)
210 (68,4)
A
99 (14,2)
108 (17,6)
G
599 (85,8)
506 (82,4)
IL-10 -592 C/A
n= 276 (%)
n= 299 (%)
Genótipo
AA
42 (15,2)
41 (13,7)
AC
127 (46,0)
123 (41,1)
CC
107 (38,8)
135 (45,2)
A
211 (38,2)
205 (34,3)
C
341 (61,8)
393 (65,7)
n= 315 (%)
n= 314 (%)
Genótipo
AA
271 (86,0)
277 (88,2)
AG
39 (12,4)
33 (10,5)
GG
5 (1,6)
4 (1,3)
A
581 (92,2)
587 (93,5)
G
49 (7,8)
41 (6,5)
IL-10 -3575 T/A
P
0.617
Alelo
IL-10 -2849 G/A
0.527
0.229
Alelo
0.091
0.301
Alelo
IL-10RA S138G A/G
0.164
0.713
Alelo
P= Valor de P
0.390
35
Tabela 11: Frequências alélicas e genotípicas do SNP IL-10RA G330R G/A nas
populações casos e controles.
IL-10RA G330R G/A
CASOS
CONTROLES
n= 283 (%)
n= 297 (%)
Genótipo
AA
AG
18 (6.4)
80 (28.3)
8 (2.7)
73 (24.6)
GG
185 (65.3)
216 (72.7)
AA + AG
98 (34.6)
81 (27.3)
GG
185 (65.4)
216 (72.7)
GG + AG
265 (93.6)
289 (97.3)
AA
18 (6.4)
8 (2.7)
A
116 (20.5)
89 (15.0)
G
450 (79.5)
505 (85.0)
P
OR (IC 95%)
0,044
Dominância
0,059
1.413 (0.992 – 2.012)
0,043
0.408 (0.174 – 0.953)
0,013
1.463 (1.079 – 1.982)
Alelo
P= Valor de P; OR= odds ratio; IC= Intervalo de confiança.
36
5. DISCUSSÃO
As leishmanioses constituem um importante problema de saúde publica
mundial. E o Brasil representa a área endêmica de maior extensão territorial e um
dos países com as mais elevadas taxas de notificação da infecção. A região Norte é
uma das regiões que apresenta a maior incidência de LTA e o estado do Amazonas
apresenta-se como o segundo estado de maior incidência da região (100).
Sabe-se que a susceptibilidade do ser humano a fenótipos da leishmaniose,
tal como a doença per se, é parcialmente controlada por determinantes genéticos,
entendemos que esforços no sentido de se elucidar os mecanismos moleculares de
controle e interação patógeno/hospedeiro contribuirão de forma crítica para um
maior entendimento da patogênese da doença (48, 50). Por exemplo, a identificação
de fatores de risco genéticos de susceptibilidade à leishmaniose pode conduzir ao
desenvolvimento de novas ferramentas para triagem e detecção de indivíduos
saudáveis, porém sob risco de desenvolvê-la até transmiti-la, com potencial impacto
sobre as estratégias de controle da doença.
Estudos vêm demonstrando que a susceptibilidade ou resistência do
hospedeiro à leishmaniose, bem como a gravidade da doença podem ser
associados com polimorfismos em genes de citocinas (52, 58, 62, 65). Porém a
maioria desses estudos foi realizada com leishmaniose visceral e pouco se sabe
sobre a forma tegumentar da doença. Em busca de uma melhor compreensão sobre
esses fatores genéticos, o presente estudo procurou através de um estudo do tipo
caso-controle de população avaliar a influência dos SNPs da região promotora do
gene IL-10, o qual codifica a IL-10, que exerce um papel central no controle do
processo inflamatório, e é considerada uma das principais citocinas envolvidas na
patogênese da LTA, em função da sua atividade imunossupressora e por ser um
potente inibidor de macrófagos e os SNPs do gene IL-10RA, o qual codifica uma
proteína que é um receptor para a interleucina 10 com a susceptibilidade ou
resistência à LTA(73, 89).
Estudo de caso-controle genético tem sido realizado com muita frequência
para estabelecer associações entre doenças infecciosas e mutações em
determinados genes. Para se ter um resultado fidedigno, as escolhas do controle
37
devem ser bem criteriosas, para garantir que a odds ratios estime corretamente a
associação do polimorfismo com a doença estuda, evitando enviesamento de
estimativa de associação (101).
O grupo de pacientes avaliados neste estudo é oriundo de regiões endêmicas
do Amazonas, sendo a grande maioria advindo do Ramal do Pau-rosa e do Ramal
da Cooperativa e suas respectivas vicinais, ambos localizados no Km 21 da Br 174.
Todos os pacientes foram recrutados na FMT-HVD por demanda espontânea. O
grupo controle foi composto por indivíduos sadios, sem sinal e histórico de LTA,
habitantes das mesmas áreas endêmicas dos casos. Foi observada predominância
do sexo masculino no grupo caso (79,3%), confirmando os achados na literatura, fato
esse justificado pela maior exposição do homem ao vetor, devido suas atividades
extrativistas e agropecuárias (6, 26, 102-104). Segundo o Manual de vigilância da
LTA do Ministério da Saúde, 70% dos casos notificados no Brasil correspondem ao
sexo masculino (13). Em relação à média de idade entre os grupos, um ponto
positivo foi encontrado, pois nosso grupo controle apresentou uma média maior que
o caso, 36.3 e 32.1, respectivamente. Isso torna nossos dados mais confiáveis,
levando em consideração o fato de serem mais velhos e não terem desenvolvido a
doença, mesmo estando expostos. Benicio em seu estudo sobre procedimentos
diagnósticos em leishmaniose, realizado com pacientes atendidos na FMT-HVD
observou uma média de idade de casos de 29 anos, o que mostra proximidade com
os nossos dados (103).
Tarabar et al encontraram associação do polimorfismo da IL-10 -3575 com a
ocorrência de linfoma difuso de grandes células B (linfoma não Hodgkin). Onde foi
demostrada associação com as características clínicas e evolução dos pacientes
com esse tipo de linfoma, sendo os genótipos TA e AA associados com a presença
de sintomas(105). Em Bengala Ocidental, na Índia foi realizado um estudo de
associação do SNP IL-10 -3575 com a susceptibilidade ao arsênio em pessoas
expostas a essa substâncias por meio de água potável, sendo encontrada
associação do polimorfismo com o surgimento de lesões cutâneas induzidas por
arsênio (106).
Moraes et al. analisaram a frequência dos cinco SNPs da região promotora do
gene IL-10 (-3575, -2849, -2763, -1082 e -819), em um estudo caso-controle, onde
38
analisou-se pacientes com hanseníase e indivíduos saudáveis. Foram encontradas
diferenças significativas entre indivíduos do grupo controle e pacientes com
hanseníase e os SNPs -3575, -2849 e -2763. Onde o haplótipo -3575A/-2849G/2763C (AGC) foi associado à resistência, e o haplótipo -3575T/-2849G/-2763C
(TGC) a susceptibilidade, mas não a forma grave da doença (107). Em um estudo
com LTA, realizado no Rio de Janeiro não foi encontrada associação do SNP -819
com a susceptibilidade nem a gravidade da doença (86).
Foi evidenciada associação dos SNP -1082 / -819 / -592 e concentrações
elevadas IL-10 com a leucoplasia vocal (108). Associações dos SNPs -819 e -592
foram encontradas com hepatite B em uma população indiana. Foi realizado análise
de haplótipo, onde o genótipo CC/TA demonstrou-se um fator de risco para a cirrose
(OR = 2,02 a P <0,05) e subsequente desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(OR = 2,20 a P <0,05) (109).
Em um estudo de meta-análise evidenciou-se associação do SNP -1082 com
a susceptibilidade ao câncer gástrico (110). Outros estudam também mostraram
associação do SNP -1082 com várias doenças como HIV/AIDS, periodontite crônica,
leucoplasia vocal, alergia entre outras (108, 111-113).
Em nosso estudo para os SNPs -3575 T/A, -2949 G/A e -592, não foi
encontrada associação com a susceptibilidade nem a resistência com leishmaniose
cutânea, já que os alelos e genótipos para cada um desses SNPs apresentaram a
mesma distribuição esperada na população em estudo. Os mascadores -2763, 1082 e -819 apresentaram-se fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), a
presença de devios de EHW geralmente é associada por um fator ambiental e pode
também ser um indicativo de erros na genotipagem, buscando manter a
confiabilidade dos dados, os mesmo foram retirados da análise estatística.
Em relação ao IL-10RA há poucos estudos de associação disponíveis na
literatura o que torna nosso estudo mais importante, pois é o primeiro realizado com
leishmaniose. A IL-10R proteína codificada por este gene é um receptor para a
interleucina 10, a mesma medeia o sinal imunossupressor de interleucina 10,
inibidindo assim a ativação de citocinas pró-inflamatórias. Vários SNPs nos éxons
desse gene já foram identificados. Tem sido relatado que dois SNPs no gene, as
39
substituições de serina 138 com glicina (S138G) e da glicina 330 por arginina
(G330R), tem implicações funcionais (114). Com base nesses achados, optou-se
pela escolha desses dois marcadores, a fim de se verificar uma possível associação
com o fenótipo LC.
Polimorfismos genéticos em IL10RA foram associados entre transfusão de
sangue e o risco de linfoma não-Hodgkin (NHL). Foi realizado um estudo de casocontrole com mulheres sem transfusão de sangue e mulheres com história de
transfusão. Observou-se que as mulheres com história de transfusão tinham maior
risco de desenvolver NHL, com OR =1.9, IC 95% (1.1-3.2) (115). O SNP -3575 do IL10 também foi associoado com risco de desenvolver NHL, com OR= 1.6, CI 95%
(0.9-2.6) (116). Estudo realizado em uma população coreana analisou variantes dos
genes IL-10, IL-10RA e IL-10RB com hiperplasia bengina da próstata. O marcador
rs2834167 do IL-10RB foi associado com o alto nível de PSA (P = 0,009), e os
rs1518111 e rs1554286 do IL-10 foram associados com elevado volume da próstata.
Não foi encontrada evidências de associação com os maracdores do IL-10RA (117).
O SNP S138G do gene IL-10RA foi associado com a susceptibilidade para
doenças atópicas, o estudo foi realizado com 75 pacientes com doença e 25
indivíduos saudáveis. A comparação dos dois grupos apresentou uma associação
significativa entre a frequência alélica G com asma atópica, dermatite atópica e rinite
alérgica. Foi demostrado também que o SNP S138G pode interferir na ligação da IL10 com IL-10RA e ainda influenciar o papel da IL-10 no desenvolvimento de doenças
atópicas (118). Esse mesmo SNP foi associado com a susceptibilidade a filariose
linfática em uma população do Sul da Índia. Polimorfismos do IL-10 (-1082 G/A, -819
C/T e -592 A/C) também foram analizados nesse trabalho, o alelo A do SNP -1082 e
o alelo T do -819 revelaram-se associados com a susceptibilidade para infecção por
filária. Ressaltando que esse foi o único estudo encontrado em doenças infecciosas
(95). Porém em nosso estudo não foi observada nenhuma diferença estatisticamente
significativa do SNP IL-10RA S138G A/G com LC, mas nossos resultados poderão
colaborar para o melhor entendimento desse polimorfismo em doenças infecciosas.
Hofer et al. em um estudo caso-controle com hepatite C, analisou os SNPs
S138G e G330R do IL-10RA, onde 212 pacientes infectados pelo vírus da hepatite
C (VHC) e 887 controles saudáveis foram comparados. Os resultados demonstraram
40
um envolvimento do SNP G330R na progressão da fibrose hepática em pacientes
com VHC, sendo o alelo G associado ao risco (119). O SNP G330R também foi
associado com esquizofrenia e com a inibição da IL-10 e a produção de TNFα (97,
120).
Em nosso estudo foi observada uma associação do SNP G330R G/A do IL10RA com LC, onde as frequências alélicas e genotípicas entre casos e controles foi
estatisticamente significativa, com os respectivos valores de P: 0.013 e 0.044. Os
genótipos GG e AG foram associados com a resistência à LC, com OR=0.408 (P=
0,043, IC 95% (0.174 – 0.953)). Ressaltando que odds ratio maior que 1 está
relacionada com a susceptibilidade e menor que 1 com resistência e/ou proteção. É
importante salientar que há uma escassez de estudo envolvendo esse polimorfismo
e que o nosso estudo é o primeiro que sugere associação com LC.
Apesar do presente estudo não demonstrar associação entre os polimorfismos
da região promotora do IL-10 e LC, os dados encontrados podem somar com os da
literatura, ajudando a esclarecer como as mutações em genes de citocinas podem
influenciar nas doenças infecciosas, em especial a leishmaniose.
41
6. CONCLUSÃO
 As frequências alélicas e genotípicas dos SNPs -3575 T/A, -2849 G/A e -592
C/A do IL-10 apresentaram-se dentro do esperado (EWB);
 As frequências alélicas e genotípicas dos SNPs S138G A/G e G330R G/A do
IL-10RA apresentaram-se dentro do esperado (EWB);
 Não foi detectada evidência estatisticamente significativa de associação entre
os SNPs da região promotora do gene IL-10 com leishmaniose cutânea na
população estudada;
 Não foi detectada evidência estatisticamente significativa de associação entre
o SNP S138G A/G do gene IL-10RA com leishmaniose cutânea na população
estudada;
 Os resultados obtidos sugerem que o SNP G330R G/A do gene IL-10RA pode
estar associado com a resistência à leishmaniose cutânea.
42
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1.
Desjeux P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives.
Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 2004;27(5):305-18.
2.
World Health Organization - Leishmaniasis 2013 [cited 2013 May 01]; Report
of the Consultative Meeting on Cutaneous Leishmaniasis.]. Available from:
http://www.who.int/leishmaniasis/burden/en/.
3.
Alvar J, Velez ID, Bern C, Herrero M, Desjeux P, Cano J, et al. Leishmaniasis
worldwide and global estimates of its incidence. PloS one. 2012;7(5):e35671.
4.
MD L. Patologia e patogenia das leishmanioses: Universidade de São Paulo USP; 2010.
5.
MS. Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana, Ministério
da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de Vigilância
Epidemiológica. 2a edição; 2010.
6.
Mauro Schechter DVM. Doencas infecciosas: conduta diagnóstica e
terapêutica. 2 ed. Rio de Janeiro - RJ: Guanabara Koogan; 1998.
7.
WHO. Distribuição geográfica da leishmaniose cutânea e mucocutânea no
Novo Mundo.: World Health Organization; 2013.
8.
MS. Atlas de Leishmaniose Tegumentar Americana: Diagnósticos Clínico e
Diferencial. Brasília - DF: Ministério da Saúde; 2006.
9.
MS. Leishmaniose Tegumentar Americana - Casos confirmados Notificados
no Sistema de Informação de Agravos de Notificação em 2013 - Sinan Net. 2014
[23/09/2014];
Available
from:
http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/tabnet/tabnet?sinannet/lta/bases/ltabrnet.def.
10.
FMT-HVD. Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado.
Departamento de Epidemiologia e Saúde Pública. Subgerência de Vigilância
Epidemiológica. Investigação de leishmaniose tegumentar - Sinan NET.
Leishmaniose (LTA) – notificada na FMT-HVD Manaus. 2014.
11.
Silveira FT, Lainson R, Corbett CE. Clinical and immunopathological spectrum
of American cutaneous leishmaniasis with special reference to the disease in
Amazonian Brazil: a review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2004;99(3):239-51. 12. DaCruz AM, Pirmez, C. Dinâmica da Doenças Infecciosas. Leishmaniose tegumentar
ameriacana. 1 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2005.
13.
Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana; Ministério da
Saúde. 2 ed. Brasília: Editora MS; 2007.
14.
Leishmaniose cutânea localizada. Biosalecionario; 2010.
15.
Neves PD. Parasitologia Humana. 11 ed: Atheneu; 2001. p. 41-66.
16.
Marsden PD. Mucosal leishmaniasis ("espundia" Escomel, 1911). Trans R Soc
Trop Med Hyg. 1986;80(6):859-76.
43
17.
Oliveira-Neto MP, Pirmez C, Rangel E, Schubach A, Grimaldi Junior G. An
outbreak of American cutaneous leishmaniasis (Leishmania braziliensis braziliensis)
in a periurban area of Rio de Janeiro city, Brazil: clinical and epidemiological studies.
Mem Inst Oswaldo Cruz. 1988;83(4):427-35.
18.
Fiocruz. Formas promastigotas de Leishmania; 2008.
19.
Wikipédia. Formas amastigotas de Leishmania.
20.
MS. Leishmaniose Tegumentar Americana.
Guia de Vigilância
Epidemiológica. Secretaria de Vigilância em Saúde / MS: Ministério da Saúde.
21.
Focaccia RVR. Tratado de Infectologia. 2 ed. São Paulo: Atheneu; 2004.
22.
Shaw JJ. Taxonomia das leishmânias da Amazônia. Anais Brasileiros de
Dermatologia. 1982;57(3):129-32.
23.
Coelho LARC. Caracterização de Leishmania spp. em amostras isoladas de
pacientes portadores de Leishmaniose Tegumentar Americana em área endêmica
da Região Norte, Brasil. [Doutorado em Ciências]. Recife - PE: Centro de Pesquisa
Aggeu Magalhães da Fundação Oswaldo Cruz; 2010.
24.
Romero GA, Vinitius De Farias Guerra M, Gomes Paes M, de Oliveira Macedo
V. Comparison of cutaneous leishmaniasis due to Leishmania (Viannia) braziliensis
and L. (V.) guyanensis in Brazil: clinical findings and diagnostic approach. Clinical
infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of
America. 32(9):1304-12; 2001.
25.
Romero GA, Guerra MV, Paes MG, Macedo VO. Comparison of cutaneous
leishmaniasis due to Leishmania (Viannia) braziliensis and L. (V.) guyanensis in
Brazil: therapeutic response to meglumine antimoniate. The American journal of
tropical medicine and hygiene. 65(5):456-65; 2001.
26.
Camara Coelho LI, Paes M, Guerra JA, Barbosa M, Coelho C, Lima B, et al.
Characterization of Leishmania spp. causing cutaneous leishmaniasis in Manaus,
Amazonas, Brazil. Parasitology research. 2011;108(3):671-7.
27.
Parasitas: Leishmania spp e Leishmaniose. In: Vetor, editor.: Livro Aberto;
2009.
28.
Guedes A.C.M, Carvalho M.L.R, M.N. M. Leishmaniose tegumentar
americana: apresentação pouco comum. Anais Brasileiros de Dermatologia.
85(5):445-9; 2008.
29.
Gontijo B, M.L.R. C. Leishmaniose tegumentar americana. . Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 36(1):71-80; 2003.
30.
Loureiro C, Dadalti P, Gutierrez M, Silva M. Leishmaniose: Métodos
Diagnósticos;
1998.
2(117):[131-4
pp.].
Available
from:
http://www.dermato.med.br/publicacoes/artigos/1998leishmaniose.htm.
31.
Gaafar A, Veress B, Permin H, Kharazmi A, Theander TG, el Hassan AM.
Characterization of the local and systemic immune responses in patients with
44
cutaneous leishmaniasis due to Leishmania major. Clin Immunol. 91(3):314-20;
1999.
32.
Melo MN, Mayrink W, da Costa CA, Magalhaes PA, Dias M, Williams P, et al.
Padronizacao do antigeno de Montenegro [Standardization of the Montenegro
antigen]. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo 19(3):161-4; . 1977.
33.
Gontijo B, Carvalho MdLRd. Leishmaniose tegumentar americana. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 36:71-80; 2003.
34.
BA. G. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) no Diagnóstico da
Leishmaniose Tegumentar Americana Belo Horizonte (MG): Faculdade de Medicina
da Universidade Federal de Minas Gerais; 1997.
35.
Pinheiro RO. Leishmaniose Tegumentar Americana: mecanismos
imunológicos, tratamento e profilaxia. Rio de Janeiro - RJ: Instituto de Ciências
Biológicas -UFRJ; 2004.
36.
Nylen S, Gautam S. Immunological perspectives of leishmaniasis. J Glob
Infect Dis. 2010;2(2):135-46.
37.
Laurenti MD. Patologia e patogenia das leishmanioses. São Paulo - SP: USP;
2010.
38.
Roberts MT, Stober CB, McKenzie AN, Blackwell JM. Interleukin-4 (IL-4) and
IL-10 collude in vaccine failure for novel exacerbatory antigens in murine Leishmania
major infection. Infect Immun. 2005;73(11):7620-8.
39.
Bogdan C, Rollinghoff M, Diefenbach A. The role of nitric oxide in innate
immunity. Immunol Rev. 2000;173:17-26.
40.
Da-Cruz AM, Bittar R, Mattos M, Oliveira-Neto MP, Nogueira R, Pinho-Ribeiro
V, et al. T-cell-mediated immune responses in patients with cutaneous or mucosal
leishmaniasis: long-term evaluation after therapy. Clin Diagn Lab Immunol.
2002;9(2):251-6.
41.
Bacellar O, Lessa H, Schriefer A, Machado P, Ribeiro de Jesus A, Dutra WO,
et al. Up-regulation of Th1-type responses in mucosal leishmaniasis patients. Infect
Immun. 2002;70(12):6734-40.
42.
Carvalho LP, Passos S, Bacellar O, Lessa M, Almeida RP, Magalhaes A, et al.
Differential immune regulation of activated T cells between cutaneous and mucosal
leishmaniasis as a model for pathogenesis. Parasite Immunol. 2007;29(5):251-8.
43.
Bettelli E, Korn T, Oukka M, Kuchroo VK. Induction and effector functions of
T(H)17 cells. Nature. 2008;453(7198):1051-7.
44.
Yang L, Anderson DE, Baecher-Allan C, Hastings WD, Bettelli E, Oukka M, et
al. IL-21 and TGF-beta are required for differentiation of human T(H)17 cells. Nature.
2008;454(7202):350-2.
45.
Castro MCABd. Caracterização imunofenotípica em linfócitos do sangue
periférico de pacientes portadores de leishmaniose tegumentar americana. Recife:
Fundação Oswaldo Cruz; 2011.
45
46.
Almeida LFd. Estudo do polimorfismo em genes envolvidos no processo de
cura de lesões e o desenvolvimento da leishmniose tegumentar americana
[Mestrado]. Salvador - BA: Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina
da Bahia; 2012.
47.
Covas CdJF. Representação esquemática de possíveis rotas imunes
acionadas nas infecções por Leishmania. Rio de Janeiro2010. p. Imagem adaptada
de Hozmuller et al., 2006.
48.
Sakthianandeswaren A, Foote SJ, Handman E. The role of host genetics in
leishmaniasis. Trends in parasitology. 2009;25(8):383-91.
49.
Prevedello FC. Análise de associação entre alelos de polimorfismos dos
genes PARK2 e LTA e a susceptibilidade à hanseníase em uma população
paranaense. [Mestrado]. Curitiba: Pontifícia Universidade Católica do Paraná PUCPR; 2008.
50.
Kamali-Sarvestani E, Rasouli M, Mortazavi H, Gharesi-Fard B. Cytokine gene
polymorphisms and susceptibility to cutaneous leishmaniasis in Iranian patients.
Cytokine. 2006;35(3-4):159-65.
51.
Bucheton B, Abel L, El-Safi S, Kheir MM, Pavek S, Lemainque A, et al. A
major susceptibility locus on chromosome 22q12 plays a critical role in the control of
kala-azar. American journal of human genetics. 2003;73(5):1052-60.
52.
Jamieson SE, Miller EN, Peacock CS, Fakiola M, Wilson ME, Bales-Holst A, et
al. Genome-wide scan for visceral leishmaniasis susceptibility genes in Brazil. Genes
Immun. 2007;8(1):84-90.
53.
Peacock CS, Sanjeevi CB, Shaw MA, Collins A, Campbell RD, March R, et al.
Genetic analysis of multicase families of visceral leishmaniasis in northeastern Brazil:
no major role for class II or class III regions of HLA. Genes Immun. 2002;3(6):350-8.
54.
Campino S, Kwiatkowski D, Dessein A. Mendelian and complex genetics of
susceptibility and resistance to parasitic infections. Semin Immunol. 2006;18(6):41122.
55.
Simmons MJ SP. Fundamentos de genética. Genética Evolutiva. 4 ed. Rio de
Janeiro - RJ: Koogan G; 2006.
56.
Polimorfismo de nucleotídeo único. Wikipédia; [25/04/2013]; Available from:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Polimorfismodenucleotideounico.
57.
Shaw MA, Davies CR, Llanos-Cuentas EA, Collins A. Human genetic
susceptibility and infection with Leishmania peruviana. Am J Hum Genet.
1995;57(5):1159-68.
58.
Cabrera M, Shaw MA, Sharples C, Williams H, Castes M, Convit J, et al.
Polymorphism in tumor necrosis factor genes associated with mucocutaneous
leishmaniasis. J Exp Med. 1995;182(5):1259-64.
59.
Salih MA, Ibrahim ME, Blackwell JM, Miller EN, Khalil EA, ElHassan AM, et al.
IFNG and IFNGR1 gene polymorphisms and susceptibility to post-kala-azar dermal
leishmaniasis in Sudan. Genes Immun. 2007;8(1):75-8.
46
60.
Matos GI, Covas Cde J, Bittar Rde C, Gomes-Silva A, Marques F, Maniero
VC, et al. IFNG +874T/A polymorphism is not associated with American tegumentary
leishmaniasis susceptibility but can influence Leishmania induced IFN-gamma
production. BMC Infect Dis. 2007;7:33.
61.
Ramasawmy R, Menezes E, Magalhaes A, Oliveira J, Castellucci L, Almeida
R, et al. The -2518bp promoter polymorphism at CCL2/MCP1 influences
susceptibility to mucosal but not localized cutaneous leishmaniasis in Brazil. Infect
Genet Evol. 2010;10(5):607-13.
62.
Castellucci L, Jamieson SE, Almeida L, Oliveira J, Guimaraes LH, Lessa M, et
al. Wound healing genes and susceptibility to cutaneous leishmaniasis in Brazil.
Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary
genetics in infectious diseases. 2012;12(5):1102-10.
63.
Fernandez-Figueroa EA, Rangel-Escareno C, Espinosa-Mateos V, CarrilloSanchez K, Salaiza-Suazo N, Carrada-Figueroa G, et al. Disease severity in patients
infected with Leishmania mexicana relates to IL-1beta. PLoS Negl Trop Dis.
2012;6(5):e1533.
64.
Fakiola M, Miller EN, Fadl M, Mohamed HS, Jamieson SE, Francis RW, et al.
Genetic and functional evidence implicating DLL1 as the gene that influences
susceptibility to visceral leishmaniasis at chromosome 6q27. J Infect Dis.
2011;204(3):467-77.
65.
Frade AF, Oliveira LC, Costa DL, Costa CH, Aquino D, Van Weyenbergh J, et
al. TGFB1 and IL8 gene polymorphisms and susceptibility to visceral leishmaniasis.
Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary
genetics in infectious diseases. 2011;11(5):912-6.
66.
Mohamed HS, Ibrahim ME, Miller EN, Peacock CS, Khalil EA, Cordell HJ, et
al. Genetic susceptibility to visceral leishmaniasis in The Sudan: linkage and
association with IL4 and IFNGR1. Genes Immun. 2003;4(5):351-5.
67.
Alcais A, Abel L, David C, Torrez ME, Flandre P, Dedet JP. Evidence for a
major gene controlling susceptibility to tegumentary leishmaniasis in a recently
exposed Bolivian population. Am J Hum Genet. 1997;61(4):968-79.
68.
Petzl-Erler ML, Belich MP, Queiroz-Telles F. Association of mucosal
leishmaniasis with HLA. Hum Immunol. 1991;32(4):254-60.
69.
genecards.
IL10
Gene.
2013
[04/04/2013];
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=IL10.
70.
Wikipedia tfe. Interleukin 10.
http://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_10.
2013
[04/04/2013];
Available
Available
from:
from:
71.
Turner DM, Williams DM, Sankaran D, Lazarus M, Sinnott PJ, Hutchinson IV.
An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter. European
journal of immunogenetics : official journal of the British Society for Histocompatibility
and Immunogenetics. 1997;24(1):1-8.
72.
Crawley E, Kay R, Sillibourne J, Patel P, Hutchinson I, Woo P. Polymorphic
haplotypes of the interleukin-10 5' flanking region determine variable interleukin-10
47
transcription and are associated with particular phenotypes of juvenile rheumatoid
arthritis. Arthritis and rheumatism. 1999;42(6):1101-8.
73.
IL10 interleukin 10 [ Homo sapiens (human) ]. [20/04/2013]; Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3586.
74.
Naoum PC. Citocinas e interleucinas. São José do Rio Preto - SP: Academia
de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto - SP; 2009.
75.
Corso AL. Análise da resposta de fator de necrose tumoral e interleucina 10
no lavado traqueobrônquico de recém-nascidos prematuros submetidos à ventilação
mecânica. Porto Alegre: Pontifícia Universidade Católica do Rio grande do Sul PUCRS; 2003.
76.
Tamires dos Santos Silva AFCdAC, Renata Tavares Burlamaqui Proa,
Mayara Costa Mansur Fernandes, Ana Clara Gurgel, Maria de Mascena Diniz Maia,
Paulo Roberto Eleutério de Souza. Associação do polimorfismo do gene IL-10
posição -1082 (G/A) com a infecção pelo HTLV-1. Pernambuco: Universidade
Federal Rural de Pernambuco.
77.
Tonini G. Polimorfismo no gene da interleucina 10 (IL-10) em mulheres
infectadas pelo papilomavírus humano (HPV). Porto Alegre - RS: Universidade
Federal do Rio Grande do Sul - UFRG; 2009.
78.
Moraes MO, Santos AR, Schonkeren JJ, Vanderborght PR, Ottenhoff TH,
Moraes ME, et al. Interleukin-10 promoter haplotypes are differently distributed in the
Brazilian versus the Dutch population. Immunogenetics. 2003;54(12):896-9.
79.
Pereira AC, Brito-de-Souza VN, Cardoso CC, Dias-Baptista IM, Parelli FP,
Venturini J, et al. Genetic, epidemiological and biological analysis of interleukin-10
promoter single-nucleotide polymorphisms suggests a definitive role for -819C/T in
leprosy susceptibility. Genes Immun. 2009;10(2):174-80.
80.
Stanczuk GA, Sibanda EN, Perrey C, Chirara M, Pravica V, Hutchinson IV, et
al. Cancer of the uterine cervix may be significantly associated with a gene
polymorphism coding for increased IL-10 production. International Journal of Cancer.
2001;94(6):792-4.
81.
Costa GC, da Costa Rocha MO, Moreira PR, Menezes CA, Silva MR, Gollob
KJ, et al. Functional IL-10 gene polymorphism is associated with Chagas disease
cardiomyopathy. J Infect Dis. 2009;199(3):451-4.
82.
Bernhard M. Schaaf FB, Hamed Esnaashari, Ulrike Seitzer, Henning Kothe,
Matthias Maass, Peter Zabel, and Klaus Dalhoff Pneumococcal Septic Shock Is
Associated with the Interleukin-10–1082 Gene Promoter Polymorphism. American
Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2003;168(4):476-80.
83.
Lowe PR, Galley HF, Abdel-Fattah A, Webster NR. Influence of interleukin-10
polymorphisms on interleukin-10 expression and survival in critically ill patients.
Critical care medicine. 2003;31(1):34-8. Epub 2003/01/25.
84.
Knapp S, Hennig BJ, Frodsham AJ, Zhang L, Hellier S, Wright M, et al.
Interleukin-10 promoter polymorphisms and the outcome of hepatitis C virus
infection. Immunogenetics. 2003;55(6):362-9.
48
85.
Salhi A, Rodrigues V, Jr., Santoro F, Dessein H, Romano A, Castellano LR, et
al. Immunological and genetic evidence for a crucial role of IL-10 in cutaneous
lesions in humans infected with Leishmania braziliensis. J Immunol.
2008;180(9):6139-48.
86.
Covas CdJF. Estudo da influência de polimorfismos nos genes IL-10, IL-12,
MIF e TNF na imunopatogênese da leishmaniose tegumentar Americana: Instituto
Oswaldo Cruz 2010.
87.
Remmers EF, Cosan F, Kirino Y, Ombrello MJ, Abaci N, Satorius C, et al.
Genome-wide association study identifies variants in the MHC class I, IL10, and
IL23R-IL12RB2 regions associated with Behcet's disease. Nat Genet.
2010;42(8):698-702.
88.
Gibson AW, Edberg JC, Wu J, Westendorp RG, Huizinga TW, Kimberly RP.
Novel single nucleotide polymorphisms in the distal IL-10 promoter affect IL-10
production and enhance the risk of systemic lupus erythematosus. J Immunol.
2001;166(6):3915-22.
89.
Wikipedia. Interleukin 10 receptor, alpha subunit. [22/04/2013]; Available
from: http://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_10_receptor,_alpha_subunit.
90.
Quiagen.
IL-10.
[22/04/2013];
http://www.sabiosciences.com/pathway.php?sn=IL-10.
Available
from:
91.
Wikipedia. Interleukin 10 receptor, alpha subunit. [22/04/2013]; Available
from: http://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_10_receptor,_alpha_subunit.
92.
IL10RA interleukin 10 receptor, alpha [ Homo sapiens (human) ].
[22/04/2013];
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch
=3587.
93.
Park HK KD, Yun DH, Ban JY. Association between IL10, IL10RA, and
IL10RB SNPs and ischemic stroke with hypertension in Korean population. Molecular
biology reports. 2013;40(2):1785-90.
94.
Christopher J Moran TDW, Cong-Hui Guo, Subra Kugathasan, Christoph
Klein, Dan Turner, Victorien M Wolters, NEOPICS, Robert H Bandsma, Marialena
Mouzaki, Jacob C Langer, Ernest Cutz, Susanne M Benseler, Chaim M Roifman,
Mark S Silverberg, Anne M Griffiths, Scott B Snapper and Aleixo M Muise. IL-10R
Polymorphisms are Associated with Very Early-Onset Ulcerative Colitis. Inflammatory
bowel diseases. 2013;19(1): 115–23.
95.
Sheik Y, Qureshi SF, Venkateshwari A, Nourmohammadi1 S, Nallari BMaP.
Association of IL-10& IL-10RAPolymorphisms with Lymphatic Filariasis in South
Indian Population. International Journal of TROPICAL DISEASE & Health
2012;2(3):182-97.
96.
Hussain SK MM, Johnson LG, Du Q, Galloway DA, Daling JR, Malkki M,
Petersdorf EW, Schwartz SM. Nucleotide variation in IL-10 and IL-12 and their
receptors and cervical and vulvar cancer risk: a hybrid case-parent triad and casecontrol study. Int J Cancer. 2013;133(1):201-13.
49
97.
Gasche C, Grundtner P, Zwirn P, Reinisch W, Shaw SH, Zdanov A, et al.
Novel variants of the IL-10 receptor 1 affect inhibition of monocyte TNF-alpha
production. J Immunol. 2003;170(11):5578-82.
98.
Valencia-Pacheco G, Layseca-Espinosa E, Nino-Moreno P, Portales-Perez
DP, Baranda L, Rosenstein Y, et al. Expression and function of IL-10R in
mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus. Scand J
Rheumatol. 2006;35(5):368-78.
99.
Haploview v.4.2. (Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ (2005) Haploview:
analysis and visualization of LD and haplotype maps Bioinformatics 21:263-265
doi:10.1093/bioinformatics/bth457).
100. Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana. Brasil, Grandes Regiões e
Unidades Federadas. 1990 a 2011. Ministério da Saúde; 2013 [updated
[19/08/2013]];
Available
from:
http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/2012_11_casos_de_lta_entre_1990_e_
2011.pdf.
101. Pacheco A. Estudos de caso-controle genéticos em doenças infecciosas:
escolha de controles adequados e influência nas análises estatísticas com o uso de
controles não previamente expostos ao agente infeccioso 51º Congresso Brasileiro
de Genética Hotel Monte Real - Águas de Lindóia - São Paulo - Brasil 2005.
102. Neves LO. Estudo clínico randomizado comparando antimoniato de
meglumina, pentamidina e anfotericina B para o tratamento da leishmaniose cutânea
ocasionada por Leishmania guyanensis em centro de referência de Manaus,
Amazonas.: Universidade do Estado do Amazonas; 2010.
103. Benicio Ede A, Gadelha EP, Talhari A, Silva RM, Jr., Ferreira LC, Santos MC,
et al. Combining diagnostic procedures for the management of leishmaniasis in areas
with high prevalence of Leishmania guyanensis. Anais brasileiros de dermatologia.
2011;86(6):1141-4.
104. Figueira LP SF, Naiff MF, Silva SS, Espir TT, Pinheiro FG, Fanco AMR.
Distribuição de casos de leishmaniose tegumentar no munícipio de Rio Preto da
Eva, Amazonas, Brasil. . Revista de Patologia Tropical. 2014;43:173-81.
105. Tarabar O, Cikota-Aleksic B, Tukic L, Milanovic N, Aleksic A, Magic Z.
Association of interleukin-10, tumor necrosis factor-alpha and transforming growth
factor-beta gene polymorphisms with the outcome of diffuse large B-cell lymphomas.
International journal of clinical oncology. 2014;19(1):186-92.
106. Banerjee N, Nandy S, Kearns JK, Bandyopadhyay AK, Das JK, Majumder P,
et al. Polymorphisms in the TNF-alpha and IL10 gene promoters and risk of arsenicinduced skin lesions and other nondermatological health effects. Toxicological
sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 2011;121(1):132-9.
107. MO Moraes AP, JJM Schonkeren, PR Vanderborght, JAC Nery, AR Santos,
ME Moraes, JR Moraes, THM Ottenhoff, EP Sampaio, TWJ Huizinga and EN Sarno.
Interleukin-10 promoter single-nucleotide polymorphisms as markers for disease
susceptibility and disease severity in leprosy. Genes and Immunity 2004(5):592–5.
50
108. Zhou J, Tao L, Zhang D, Chen B, Tang WJ, Lu LM. [Association of IL-10
promoter polymorphism and plasma levels with susceptibility to vocal cords
leukoplakia]. Zhonghua er bi yan hou tou jing wai ke za zhi = Chinese journal of
otorhinolaryngology head and neck surgery. 2013;48(12):1017-21.
109. Saxena R, Chawla YK, Verma I, Kaur J. Association of interleukin-10 with
hepatitis B virus (HBV) mediated disease progression in Indian population. The
Indian journal of medical research. 2014;139(5):737-45.
110. Pan F, Tian J, Pan YY, Zhang Y. Association of IL-10-1082 promoter
polymorphism with susceptibility to gastric cancer: evidence from 22 case-control
studies. Molecular biology reports. 2012;39(6):7143-54.
111. Chambrone L, Ascarza A, Guerrero ME, Pannuti C, de la Rosa M, SalinasPrieto E, et al. Association of -1082 interleukin-10 gene polymorphism in Peruvian
adults with chronic periodontitis. Medicina oral, patologia oral y cirugia bucal. 2014.
112. Naicker DD, Wang B, Losina E, Zupkosky J, Bryan S, Reddy S, et al.
Association of IL-10-promoter genetic variants with the rate of CD4 T-cell loss, IL-10
plasma levels, and breadth of cytotoxic T-cell lymphocyte response during chronic
HIV-1 infection. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious
Diseases Society of America. 2012;54(2):294-302.
113. Gaddam SL, Priya VH, Babu BM, Joshi L, Venkatasubramanian S, Valluri V.
Association of interleukin-10 gene promoter polymorphism in allergic patients.
Genetic testing and molecular biomarkers. 2012;16(6):632-5.
114. He JQ, Shumansky K, Zhang X, Connett JE, Anthonisen NR, Sandford AJ.
Polymorphisms of interleukin-10 and its receptor and lung function in COPD. The
European respiratory journal. 2007;29(6):1120-6.
115. Bi X, Zheng T, Lan Q, Xu Z, Chen Y, Zhu G, et al. Genetic polymorphisms in
IL10RA and TNF modify the association between blood transfusion and risk of nonHodgkin lymphoma. Am J Hematol. 2012;87(8):766–9.
116. Wang SS, Cozen W, Cerhan JR, Colt JS, Morton LM, Engels EA, et al.
Immune mechanisms in non-Hodgkin lymphoma: joint effects of the TNF G308A and
IL10 T3575A polymorphisms with non-Hodgkin lymphoma risk factors. Cancer
research. 2007;67(10):5042-54.
117. Yoo KH, Kim SK, Chung JH, Chang SG. Association of IL10, IL10RA, and
IL10RB polymorphisms with benign prostate hyperplasia in Korean population.
Journal of Korean medical science. 2011;26(5):659-64. Epub 2011/05/03.
118. Hussein PY, Zahran F, Ashour Wahba A, Ahmad AS, Ibrahiem MM, Shalaby
SM, et al. Interleukin 10 receptor alpha subunit (IL-10RA) gene polymorphism and IL10 serum levels in Egyptian atopic patients. Journal of investigational allergology &
clinical immunology. 2010;20(1):20-6.
119. Hofer H, Neufeld J, Oesterreicher C, Grundtner P, Wrba F, Gangl A, et al. Biallelic presence of the interleukin-10 receptor 1 G330R allele is associated with
cirrhosis in chronic HCV-1 infection. Genes and Immunity. 2005;6(3):242-7.
51
120. Schosser A, Aschauer HN, Wildenauer DB, Schwab SG, Albus M, Maier W, et
al. Homozygosity of the interleukin-10 receptor 1 G330R allele is associated with
schizophrenia. Am J Med Genet B. 2007;144B(3):347-50.
52
8. ANEXOS
8.1 ANEXO A: Fluxograma
Recrutamento de
pacientes e indivíduos
controle
Entrevista e coleta
de material
Extração e
quantificação de
DNA
Genotipagem de
IL-10
Genotipagem de
IL-10RA
Processamento
dos dados
Análise
Estatística
53
8.2 ANEXO B: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE
Número do Prontuário______________
Número da Ficha______________
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
POLIMORFISMOS GENÉTICOS DOS GENES ENVOLVIDOS NA RESPOSTA IMUNE E NA
CICATRIZAÇÃO DAS LESÕES EM PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA
POPULAÇÃO CASO-CONTROLE DE MANAUS, AMAZONAS.
Introdução: Você está sendo convidado para participar do projeto de pesquisa citado acima. Este
estudo será coordenado pelo Dr. Rajendranath RAMASAWMY pesquisador visitante sênior e
professor permanente do programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais e Infecciosas da
UEA/FMT-HVD. Antes de tomar qualquer decisão, é importante que você leia e compreenda as
seguintes explicações sobre o procedimento proposto. Esta declaração descreve o objetivo,
procedimento, benefícios e riscos do estudo, e o seu direito de sair do estudo a qualquer momento.
Estas informações estão sendo dadas para esclarecer quaisquer dúvidas sobre a pesquisa proposta,
antes de obter o seu consentimento.
Justificativa: Leishmaniose tegumentar ou ferida braba é uma doença causada por um pequeno
parasita que fica na pele, mas existem diferentes espécies de parasito que podem causar a mesma
doença, assim sendo, é importante saber qual o tipo de parasito que pode estar causando sua
doença, ou se você não teve essa doença queremos saber se você tem mais possibilidade de
contraí-la de que outra pessoa.
Dessa forma, queremos que você participe deste estudo permitindo que seja retirada uma pequena
amostra de sangue da sua veia pra fazermos testes que vão nos dizer se você tem mais chance de
ter leishmaniose causada pela parasita Leismania guyanensis do que outra pessoa. Caso você tenha
essa doença queremos saber se você tem no seu organismo (na parte genética) capacidade de boa
cicatrização, após ter sido tratado com um medicamento específico para essa doença.
Métodos: Caso você concordar em participar desse estudo, você será submetido a um exame
médico, e uma coleta de 5 mL de sangue do seu antebraço, com uma agulha nova descartável, após
a assepsia local (limpeza). Se o médico suspeitar que você tenha leishmaniose, você poderá ser
submetido ainda a uma coleta para biópsia de pele realizada por um dos médicos (Dr. Jorge Guerra
ou Dra Anette Talhari) integrantes da equipe. Os indivíduos não afetados por leishmaniose e sem
histórico de leishmaniose, que procurem o ambulatório de dermatologia da FMT-HVD, serão
selecionados para e, caso aceitem participar, comporão o grupo controle. Os indivíduos que, depois
de examinados pelo dermatologista, forem caracterizados como não afetados por leishmaniose, e
que não apresentarem história de infecções crônicas, inflamação e doenças auto-imunes, serão
considerados candidatos.
A biópsia será utilizada para identificação do parasita que está causando sua doença. A biópsia é um
procedimento no qual se colhe uma pequena quantidade de pele, isto é, uma amostra, de tecido ou
células, para posterior estudo em laboratório. A grande maioria dos pequenos procedimentos de
biópsia é muito segura, tendo apenas um pequeno risco de sangramento ou infecção no local da
biópsia. Ela é feita após anestesia local na borda local da ferida e depois de isso retirar um pequeno
pedaço de pele com auxilio de instrumento cortante esterilizado chamado de punch. A amostra de
sangue servirá para saber o que queremos através de testes feitos no laboratório, alem disso, com
sua autorização, informações de prontuários clínicos também poderão ser lidas pelos participantes do
estudo para comparar o resultado dos testes feitos em seu sangue e a resposta de seu tratamento.
1) Local do estudo
Os procedimentos descritos acima serão realizados no ambulatório de Dermatologia
(avaliação clínica e biópsia) sob a responsabilidade do Dr. Jorge Guerra ou Dra. Anette Talhari,
médicos integrantes da equipe de pesquisa e nos laboratórios da FMT-HVD sob a responsabilidade
do Dr. Rajendranath Ramasawmy.
Rubrica do pesquisador
Rubrica do participante
Número do Prontuário______________
Número da Ficha______________
54
2) Permissão para estocagem
Está sendo solicitada a sua permissão para estocagem (guarda ou armazenamento) de sua
amostra de biópsia, soro e de DNA na FMT-HVD sob a responsabilidade do Dr. Rajendranath
Ramasawmy de acordo com a resolução CNS Nº441de 12 de maio de 2011 e da portaria
Nº00212/2012-GDP/FMT-HVD. Se assinar esse termo de consentimento, você está autorizando
estocagem de longo prazo das amostras para estudos futuros. Isso evitará procedimentos como
nova coleta de sangue bem como a diminuição de recursos financeiros para novos procedimentos.
A sua amostra de DNA será mantida indefinidamente. Isto significa que a sua amostra não
será destruída após um determinado período de tempo, mas sim será estocada pelo tempo que ela
durar. Amostras estocadas serão usadas exclusivamente para fins de pesquisas e poderão ser
utilizadas para outros estudos a respeito da susceptibilidade à leishmaniose. O uso de sua amostra
estocada terá como condição uma nova avaliação e aprovação do projeto de pesquisa pelo Comitê
de Ética pertinente. Sua permissão será solicitada. Se você concorda, você será pedir de assinar
um novo TCLE com as justificativas e especificidades.
3) Risco físico para saúde/desconfortos
Os riscos físicos para a saúde na participação deste estudo são limitados ao procedimento de
biópsia e coleta de sangue, ambos de rotina nos laboratórios clínicos. Em ambos os casos, você
poderá sentir um desconforto temporário devido à introdução da agulha. A grande maioria dos
procedimentos de biópsia é muito segura, tendo apenas um risco de sangramento ou infecção no
local da biópsia. Ela é feita após anestesia local na borda local da ferida e depois de isso retirar um
pequeno pedaço de pele com auxilio de instrumento cortante esterilizado chamado de punch. Durante
a realização de biopsia, pode ocorrer pequeno sangramento que acostuma regredir em seguida.
Pode também acontecer infecção se não haver cuidado de limpeza durante e depois desse
procedimento. De qualquer maneira, você receberá uma pomada de antibiótico para evitar infecção.
Entretanto, caso você tenha febre ou dor, "inchaço" (edema), rubor ou sangramento no local de
biópsia deve procurar a equipe da pesquisa (Dr. Jorge Guerra ou Dra Anette Talhari). Existe também
a possibilidade de risco de perda da confidencialidade tal como outras pessoas poderiam ter acesso
aos seus dados e identificá-lo. Entretanto, serão tomados cuidados especiais para que isso não
aconteça pois, sua identificação será feita por meio códigos. O seu nome não estará visível nos
frascos contendo as amostras biológicas, elas serão codificadas para evitar o risco de perda da
confidencialidade.
4) Indenização e compensação por danos
Se você desenvolver uma infecção localizada devido ao procedimento de coleta de sangue
ou biópsia, você será assistido pelo Dr. Jorge Guerra ou a Dra Anette Talhari, médicos integrantes da
equipe de pesquisa no FMT-HVD. O custo desse tratamento será totalmente coberto pelo projeto.
Qualquer dano decorrente de sua participação somente neste estudo referente a qualquer
procedimento relacionado, você será assistido na FMT-HDV e terá direito a indenizações ou
ressarcimentos em casos de danos decorrentes de sua participação no estudo.
5) Desligamento
A sua participação neste estudo é voluntária e sua recusa em participar ou seu desligamento
do estudo não envolverá penalidades ou perda de benefícios os quais você tenha direito.
Se você estiver afetado pela leishmaniose, acesso a procedimentos médicos para
diagnósticos e tratamento da doença será providenciado mesmo que não queira participar deste
estudo.
Se você não estiver afetado pela leishmaniose, você está sendo convidado a participar do
estudo como parte do grupo controle ou como familiar do afetado. Neste caso, sua decisão de
participar ou não, ou de cessar sua participação a qualquer momento, não irá interferir de nenhuma
forma nos procedimento médicos para diagnóstico ou tratamento da leishmaniose que você possa
necessitar no futuro. Da mesma forma, sua decisão não irá refletir no acesso a procedimentos
médicos necessários a algum familiar ou contato afetado pela leishmaniose.
Rubrica do pesquisador
Rubrica do participante
Número do prontuário:________________
Número da Ficha:__________________
55
6) Custo para os participantes
No caso de você decidir participar do estudo, você não terá nenhum custo. Custos com testes
laboratoriais e análises de suas amostras na pesquisa serão cobertos pelo estudo.
7) Benefícios
Em longo prazo, os procedimentos médicos e laboratoriais aos quais você será submetido
poderão facilitar a detecção de resistência à leishmaniose e seu tratamento, tornando possível evitar
tratamentos inadequados. Além disso, espera-se que conhecimentos científicos adicionais sejam
alcançados, com consequente melhoria do tratamento de pessoas afetadas pela leishmaniose.
8) Reembolso
Já que não haverá gastos adicionais de transporte e alimentação devido a sua participação
no estudo, você não será reembolsado por participar deste estudo.
9) Exclusividade de uso de material genético e biológico
Amostras de DNA serão utilizadas apenas para pesquisa de susceptibilidade à leishmaniose.
Todos os resultados obtidos no estudo, após análise do conjunto completo dos dados, serão
publicados em artigos científicos. É importante reafirmar que o alvo de nossos estudos é a
identificação do fator de risco genético à leishmaniose e contribuição no entendimento do mecanismo
da doença
10) Confidencialidade dos dados
Os registros de sua participação neste estudo serão mantidos confidencialmente até onde é
permitido por lei e todas as informações estarão restritas à equipe responsável pelo projeto.
Nenhuma informação genética individual será tornada pública. As informações serão codificadas e
mantidas em local protegidas o tempo todo. Somente os pesquisadores envolvidos neste estudo
terão acesso às informações. Após o término deste estudo, as informações serão transcritas dos
questionários para os arquivos de computador, mantidos em local restrito com acesso permitido
apenas aos mesmos pesquisadores. Os dados deste estudo poderão ser discutidos com
pesquisadores de outras instituições, mas nenhuma identificação será fornecida. Você tenha direto de
conhecer os resultados dos testes laboratoriais que serão realizados. Os resultados da pesquisa em
nenhum momento irão interferir no tratamento já preconizado.
POLIMORFISMOS GENÉTICOS DOS GENES ENVOLVIDOS NA RESPOSTA IMUNE E NA
CICATRIZAÇÃO DAS LESÕES EM PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA
POPULAÇÃO CASO-CONTROLE DE MANAUS, AMAZONAS.
Você receberá uma cópia deste Termo de Consentimento para mantê-lo consigo. Se você tiver
qualquer dúvida no futuro sobre sua participação neste estudo, você pode e deve utilizar os seguintes
meios de contato com os pesquisadores responsáveis:
Dra Anette TALHARI
Dr Jorge GUERRA
Dr Rajendranath RAMASAWMY
Telefone: (92) 2127 3429
(92) 2127 3429
(92) 2127 3447
Email:
[email protected] [email protected]
[email protected]
Para quaisquer informações, fica disponibilizado o endereço do CEP/FMT-HVD, sito à Av. Pedro
Teixeira nº25 Dom Pedro I, Cep 69040-000, Manaus-AM, que funciona de 2ª a 6ª feira, das 08:00 às
14:00 horas, telefone (92)2127-3572, e-mail: [email protected]
56
Consentimento
Li e entendi as informações precedentes. Tive a oportunidade de fazer perguntas e todas as minhas
dúvidas foram respondidas a contento. Este formulário está sendo assinado voluntariamente por mim,
indicando o meu consentimento em participar do estudo, até que eu decida o contrário.
Assinatura ou impressão digital do voluntário
Nome completo e nº do prontuário
Assinatura do entrevistador
Nome do entrevistador
Assinatura testemunha 1
Data: ____/____/_____
Assinatura testemunha 2
57
8.3 ANEXO C: Questionário
FMT-HVD
Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado
Instrumento de Coleta de Dados
Projeto Genética da Leishmaniose
Identificação do voluntário:
1.
2.
3.
4.
5.
Nome: ___________________________________________________________
Gênero: Masc ( ) Fem ( )
D/N:___/___/_____
Idade:_____________
Etnia: Branco: ( ); Misto: ( ); Índio: ( );
Outro(qual):_____________________________
6. Tipo e local de trabalho:_____________________________________________
Dados para contato:
1.Telefone:_______________________________________________________
2. Endereço:______________________________________________________
________________________________________________________________
3. Referência:_____________________________________________________
4. Tempo de Residência:______________________________
5. Histórico de Residência (onde já morou e por quanto tempo):_____________
________________________________________________________________
Dados Clínicos:
7. Já teve Leishmaniose? Sim ( )
Não ( )
a. Se Sim ( grupo caso):
i. Caso ativo ou histórico? Ativo ( ) Histórico ( )
ii. Teve mais de uma vez (se sim, responder iii a viii para cada episódio): Sim ( )
Não ( )
iii. Data de diagnóstico:____/____/_______
iv. Forma clínica: cutânea ( ) Mucosa ( )
v. Local provável de infecção:____________________________________
vi. Tratamento:_________________________________________________
vii. Resposta ao tratamento: Sim ( ) Não ( )
viii. Se caso histórico – cicatriz? Sim ( ) Não ( )
b. Se não (grupo controle) - confirmado por ausência de cicatriz
8. Já teve malária? Sim ( )
Não ( )
a. Se Sim quantas:_______________________
9. Já teve outras doenças? _____________________________________________
10. Prontuário da FMT-HVD: ___________________________
58
8.4 ANEXO D: Protocolo de extração de DNA
PROCEDIMENTO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE SANGUE HUMANO
PROTOCOLO DE SAMBROOK_ “SALTING-OUT”,
a) Após centrifugação das amostras de sangue total para separação do plasma, o
“buffy-coat” será retirado e transferido para microtubo de 2,0 mL.
b) Ao “buffy-coat” serão adicionados 160 μL de tampão de proteinase K 5X (NaCl
5M; EDTA 0,5M pH 8,0), 40 μL de proteinase K, 40 μL de SDS 20% e 300 μL de
H2O destilada. Em seguida, os tubos serão incubados em banho-maria a 37°C
durante toda a noite. Retirar os tubos do banho-maria e esperar resfriar a
temperatura ambiente.
c) Adicionar 200 μL de NaCl 6M para precipitação de proteínas, centrifugando-se
em seguida a 13.000 rpm por 20 minutos, e após, transferir o sobrenadante para
um microtubo de 1,5 mL. Centrifugações adicionais (13.000 rpm durante 10 e 5
minutos respectivamente) serão realizadas até a remoção completa das proteínas
residuais, sendo o sobrenadante dividido em dois novos tubos de 1,5 mL.
d) Adicionar em cada tubo 900 μL de etanol 99,5% (temperatura ambiente). Deixar
o DNA precipitar invertendo o tubo gentilmente por, no máximo, 2 minutos. Após
esta etapa, o DNA precipitado será lavado mais uma vez com etanol a 70%.
e) Após remover o etanol, com as paredes do tubo já secas, ressuspender o DNA
em 200 μL de H2O destilada.
f) Em seguida, realizar leitura para quantificação do DNA, e aliquotar as amostras,
armazenando-as em temperatura de -70 °C, localizados exclusivamente em
laboratórios da FMT-HVD o acesso às amostras será restrito aos investigadores
listados no projeto e ao pessoal técnico autorizado.
59
8.5 ANEXO E: Minuta de Artigo
Associação do polimorfismo G330R G/A do gene IL-10RA com leishmaniose
cutânea em uma população amazonense.
Priscila Bentes Sousa1, Karolina da Costa Sabino1, Luciane Macedo de Souza1,
Anette Chrusciak Talhari2, Rajendranath Ramasawmy3.
1
Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas - Programa de Pós-Graduação em
Medicina Tropical; Universidade do Estado do Amazonas/ Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.
2
Doutora em Doenças Tropicais e Infecciosas e Dermatologista na Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.
3
Doutor em genética, Pesquisador da Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor
Vieira Dourado.
Resumo
As Leishmanioses são doenças infecciosas, não contagiosas, causadas por diversas
espécies de protozoários do gênero Leishmania. A maioria dos indivíduos expostos
ao parasita não desenvolvem a doença, sugerindo um papel de fatores genéticos
nesse controle. Nosso objetivo foi determinar se o SNP IL-10R G330R G/A está
associado com susceptibilidade ou resistência à leishmaniose cutânea. Foram
recrutados 774 voluntários, sendo 392 pacientes com leishmaniose cutânea e 382
controles. A extração do DNA foi realizada com o kit Promega ou pela técnica de
“salting-out’’. A genotipagem foi realizada pela técnica de PCR-RFLP. Houve
diferença estatisticamente significativa na distribuição de frequências alélicas (P=
0.013) e genotípicas (P=0,044) do SNP G330R G/A do gene IL-10RA entre casos e
controles. Os resultados obtidos sugerem que variantes do gene IL-10RA podem
estar envolvidas na resistência à leishmaniose cutânea.
Introdução
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa crônica
causada por parasitas do gênero Leishmania sp, representa um conjunto de
doenças com características clínicas e imunopatológicas distintas (1). As
leishmanioses constituem um crescente problema de saúde pública. Estima-se que,
anualmente, 1,5 - 2 milhões de indivíduos sejam acometidos e que 0.7 a 1.3 milhões
casos correspondam à forma tegumentar da doença (2, 3). A Ocorrência da doença
está ligada a mudanças ambientais, como desmatamento, construção de barragens,
sistemas de irrigação e urbanização (2).
A maioria dos indivíduos expostos ao parasita não desenvolvem a doença, e
os indivíduos infectados com a mesma espécie de parasitas podem ter sintomas
diferentes, e podem diferir na sua resposta à terapia, sugerindo um papel de fatores
60
genéticos nesse controle (4-6). A vasta gama de citocinas e dos mecanismos
imunológicos envolvidos na resposta imune contra Leishmania destaca a
complexidade da doença. Visto que na LTA a infecção pode ser assintomática ou
apresentar um espectro de manifestações clínicas, acredita-se que o resultado da
doença é influenciado pelo balanço entre as respostas Th1/Th2, por fatores
genéticos do hospedeiro, espécie do parasita e sua virulência, além de
características epidemiologias e estado imune do hospedeiro (7, 8).
O gene IL-10RA está localizado no cromossomo 11, na região 11q23.3. A
proteína codificada por este gene é um receptor para a interleucina 10, a IL-10R (9).
A IL-10R (IL-10 receptor) são tetrâmeros constituídos por duas subunidades de
ligação (IL-10R-alfa ou IL-10R1) e duas subunidades de sinalização acessórias (IL10R-Beta ou IL-10R2) (10). A mesma medeia o sinal imunossupressor de
interleucina 10, e, assim, inibe a síntese de citocinas pró-inflamatórias (11, 12).
Vários SNPs nos éxons do desse gene já foram identificados. Tem sido relatado que
dois SNPs no gene, as substituições de serina 138 com glicina (S138G) e da glicina
330 por arginina (G330R), tem implicações funcionais (13, 14).
Materiais e métodos
População estudada
A amostragem foi obtida por demanda espontânea da Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) de pacientes com diagnóstico positivo
para LTA, e o grupo controle foi composto de indivíduos sadios sem história de LTA,
habitantes das mesmas áreas endêmicas dos casos.
Genotipagem
O DNA foi extraído utilizando o Kit comercial Promega e pela técnica de
“salting-out’’. A genotipagem do SNP G330R G/A foi realizada através da técnica
PCR-RFLP. Os ensaios de PCR foram realizados no volume de 25 µL, com 10-100
ng de DNA, 0,2 µM de cada iniciador, 40 µM de dNTP, 2,0 Mm de MgCl2, Tampão de
PCR 1x e 1.0 U de Taq Polimerase. As reações de amplificação foram realizadas em
termociclador Mastercycler® ep gradiente S, Eppendorf Germany, com a
desnaturação inicial a 95 ⁰C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de 20 seg a 95
⁰C, 20 seg a 61 ⁰C 20 seg a72 ⁰C para o anelamento específico e uma extensão final
a 72⁰C durante 4 min.
Para a digestão de restrição, 15 uL do produto de PCR foi digerido com 2U de
enzima de restrição MspI a 37 ⁰C durante três horas, as amostras foram separadas
em gel de agarose a 3% para a identificação dos fragmentos. Os dados referentes a
PCR-RFLP encontram-se na tabela 1.
Análise estatística
Os testes para desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg e o desequilíbrio de
ligação (r2) foram realizados usando o software Haploview v.4.2 (15). As análises de
comparação dos polimorfismos entre grupos casos e controles, o teste do chiquadrado (χ2) e odds ratio (OR), foram feitos utilizando o programa SPSS (Satistical
Package for the Social Sciences) v.22.
61
Tabela 1: Dados referentes à PCR-RFLP.
POLIMORFISMO
INICIADORES
G330R G/A
F: 5’-CACCCCCAGGCTGACAGAACGCTGGGAA-3’
rs117423374
R: 5’-CTCAGGTAACCCTGGAATGCCACAG-3’
PRODUTO
PCR
323pb
TEMPERATURA
ANELAMENTO
61 ⁰C
ENZIMA / SÍTIO DE
RESTRIÇÃO
ALELOS: PRODUTOS DIGESTÃO
MspI
G: 184/61/49/29
5’...C↓CGG...3’
3’...GGC↑C...5’
A:213/61/49
62
Resultados
Características gerais da população em estudo
Foram recrutados 774 voluntários, sendo 392 pacientes com leishmaniose
cutânea diagnosticados na FMT-HVD, de acordo com parâmetros clínicos,
epidemiológicos e laboratoriais e 382 indivíduos saudáveis, sem histórico de LTA,
habitantes de áreas endêmicas de Manaus, com idade média de 32.1 e 36.3,
respectivamente. Houve predominância do gênero masculino em ambos os grupos.
Os dados referentes às características da população estudada encontram-se na
Tabela 2.
Tabela 2: Dados da população estudada
CASOS
CONTROLES
Média[DP]
32.1 [14.0]
36.3 [17.7]
Mediana
30
32
Min – Max
5 _ 70
5 _ 89
M
311 (79,3)
225 (58,9)
F
80 (20,4)
157 (41,1)
Sem informação
1 (0,3)
0
Idade
Gênero
Total
392
DP: Desvio padrão; Min: Mínimo; Max: Máximo; M: Masculino; F: Feminino
382
Distribuição genotípica e análise de associação do polimorfismo IL-10RA
G330R G/A.
Houve diferença estatisticamente significativa na distribuição de frequências
alélicas (P= 0.013) e genotípicas (P= 0.044) entre casos e controles. As frequências
genotípicas foram 6.4% para homozigotos AA, 28.3% para heterozigotos AG e
65.3% para homozigotos GG no grupo de pacientes, contra frequências de 2.7, 24.6
e 72.7% para AA, AG e GG, respectivamente, no grupo controle. A frequência do
alelo G foi de 79.5% e 85.0% para pacientes com LC e controles, respectivamente.
Na análise de dominância uma associação significativa entre o alelo G
(GG+AGvsAA) foi observada com P= 0,043 e OR= 0.408. A distribuição genotípica,
as frequências alélicas e OR do SNP G330R G/A em pacientes e controles
apresentam-se na Tabela 3.
63
Tabela 3: Frequências alélicas e genotípicas do SNP IL-10RA G330R G/A nas
populações casos e controles.
IL-10RA G330R G/A
CASOS
CONTROLES
n= 283 (%)
n= 297 (%)
Genótipo
AA
AG
18 (6.4)
80 (28.3)
8 (2.7)
73 (24.6)
GG
185 (65.3)
216 (72.7)
AA + AG
98 (34.6)
81 (27.3)
GG
185 (65.4)
216 (72.7)
GG + AG
265 (93.6)
289 (97.3)
AA
18 (6.4)
8 (2.7)
A
116 (20.5)
89 (15.0)
G
450 (79.5)
505 (85.0)
P
OR (IC 95%)
0,044
Dominância
0,059
1.413 (0.992 – 2.012)
0,043
0.408 (0.174 – 0.953)
0,013
1.463 (1.079 – 1.982)
Alelo
P= Valor de P
DISCUSSÃO
As leishmanioses constituem um importante problema de saúde publica
mundial. E o Brasil representa a área endêmica de maior extensão territorial e um
dos países com as mais elevadas taxas de notificação da infecção. A região Norte é
uma das regiões que apresenta a maior incidência de LTA e o estado do Amazonas
apresenta-se como o segundo estado de maior incidência da região (16).
Estudos vêm demonstrando que a susceptibilidade ou resistência do
hospedeiro à leishmaniose, bem como a gravidade da doença podem ser
associados com polimorfismos em genes de citocinas (5, 6, 17, 18). Porém a maioria
desses estudos foi realizada com leishmaniose visceral e pouco se sabe sobre a
forma tegumentar da doença. Em busca de uma melhor compreensão sobre esses
fatores genéticos, o presente estudo procurou através de um estudo do tipo casocontrole de população avaliar a influência do SNP IL-10RA G330R G/A com a
susceptibilidade ou resistência à LTA.
Hofer et al. em um estudo caso-controle com hepatite C, analisou os SNPs
S138G e G330R do IL-10RA, onde 212 pacientes infectados pelo vírus da hepatite
C (VHC) e 887 controles saudáveis foram comparados. Os resultados demonstraram
um envolvimento do SNP G330R na progressão da fibrose hepática em pacientes
com VHC, sendo o alelo G associado ao risco (19). O SNP G330R também foi
associado com esquizofrenia e com a inibição da IL-10 e a produção de TNFα (14,
20).
64
Em nosso estudo foi observada uma associação do SNP G330R G/A do IL10RA com LC, onde as frequências alélicas e genotípicas entre casos e controles foi
estatisticamente significativa, com os respectivos valores de P: 0.013 e 0.044. Os
genótipos GG e AG foram associados com a resistência à LC, com OR=0.408 (P=
0,043, IC 95% (0.174 – 0.953)). Ressaltando que odds ratio maior que 1 está
relacionada com a susceptibilidade e menor que 1 com resistência e/ou proteção. É
importante salientar que há uma escassez de estudo envolvendo esse polimorfismo
e que o nosso estudo é o primeiro que sugere associação com LC.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos sugerem que o SNP G330R G/A do gene IL-10RA pode
estar associado com a resistência à leishmaniose cutânea.
REFERÊNCIAS
1.
Desjeux P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives.
Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 2004;27(5):305-18.
2.
OMS OMdS-. Leishmaniasis. 2014 [cited 2014 27.09.2014]; OMS:[Available
from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs375/en/.
3.
Alvar J, Velez ID, Bern C, Herrero M, Desjeux P, Cano J, et al. Leishmaniasis
worldwide and global estimates of its incidence. PloS one. 2012;7(5):e35671.
4.
Bucheton B, Abel L, El-Safi S, Kheir MM, Pavek S, Lemainque A, et al. A
major susceptibility locus on chromosome 22q12 plays a critical role in the control of
kala-azar. American journal of human genetics. 2003;73(5):1052-60.
5.
Jamieson SE, Miller EN, Peacock CS, Fakiola M, Wilson ME, Bales-Holst A, et
al. Genome-wide scan for visceral leishmaniasis susceptibility genes in Brazil. Genes
Immun. 2007;8(1):84-90.
6.
Castellucci L, Jamieson SE, Almeida L, Oliveira J, Guimaraes LH, Lessa M, et
al. Wound healing genes and susceptibility to cutaneous leishmaniasis in Brazil.
Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary
genetics in infectious diseases. 2012;12(5):1102-10.
7.
Almeida LFd. Estudo do polimorfismo em genes envolvidos no processo de
cura de lesões e o desenvolvimento da leishmniose tegumentar americana
[Mestrado]. Salvador - BA: Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina
da Bahia; 2012.
8.
Bacellar O, Lessa H, Schriefer A, Machado P, Ribeiro de Jesus A, Dutra WO,
et al. Up-regulation of Th1-type responses in mucosal leishmaniasis patients. Infect
Immun. 2002;70(12):6734-40.
9.
Wikipedia. Interleukin 10 receptor, alpha subunit. [22/04/2013]; Available
from: http://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_10_receptor,_alpha_subunit.
10.
Quiagen.
IL-10.
[22/04/2013];
Available
from:
http://www.sabiosciences.com/pathway.php?sn=IL-10.
11.
Wikipedia. Interleukin 10 receptor, alpha subunit. [22/04/2013]; Available
from: http://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_10_receptor,_alpha_subunit.
12.
IL10RA interleukin 10 receptor, alpha [ Homo sapiens (human) ].
[22/04/2013];
Available
from:
65
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch
=3587.
13.
He JQ, Shumansky K, Zhang X, Connett JE, Anthonisen NR, Sandford AJ.
Polymorphisms of interleukin-10 and its receptor and lung function in COPD. The
European respiratory journal. 2007;29(6):1120-6. Epub 2007/03/03.
14.
Gasche C, Grundtner P, Zwirn P, Reinisch W, Shaw SH, Zdanov A, et al.
Novel variants of the IL-10 receptor 1 affect inhibition of monocyte TNF-alpha
production. J Immunol. 2003;170(11):5578-82.
15.
Haploview v.4.2. (Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ (2005) Haploview:
analysis and visualization of LD and haplotype maps Bioinformatics 21:263-265
doi:10.1093/bioinformatics/bth457).
16.
Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana. Brasil, Grandes Regiões e
Unidades Federadas. 1990 a 2011. Ministério da Saúde; 2013 [updated
[19/08/2013]];
Available
from:
http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/2012_11_casos_de_lta_entre_1990_e_
2011.pdf.
17.
Cabrera M, Shaw MA, Sharples C, Williams H, Castes M, Convit J, et al.
Polymorphism in tumor necrosis factor genes associated with mucocutaneous
leishmaniasis. J Exp Med. 1995;182(5):1259-64.
18.
Frade AF, Oliveira LC, Costa DL, Costa CH, Aquino D, Van Weyenbergh J, et
al. TGFB1 and IL8 gene polymorphisms and susceptibility to visceral leishmaniasis.
Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary
genetics in infectious diseases. 2011;11(5):912-6.
19.
Hofer H, Neufeld J, Oesterreicher C, Grundtner P, Wrba F, Gangl A, et al. Biallelic presence of the interleukin-10 receptor 1 G330R allele is associated with
cirrhosis in chronic HCV-1 infection. Genes and Immunity. 2005;6(3):242-7.
20.
Schosser A, Aschauer HN, Wildenauer DB, Schwab SG, Albus M, Maier W, et
al. Homozygosity of the interleukin-10 receptor 1 G330R allele is associated with
schizophrenia. Am J Med Genet B. 2007;144B(3):347-50.