Avaliação da atividade antimicrobiana e triagem fitoquímica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
UEFS
PPGBIOTEC
JACQUELINE MIRANDA GONÇALVES
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E TRIAGEM
FITOQUÍMICA DOS EXTRATOS DE ESPÉCIES DA FAMÍLIA
ASTERACEAE ENCONTRADAS NO SEMI-ÁRIDO BAIANO
Feira de Santana, BA
2010
JACQUELINE MIRANDA GONÇALVES
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E TRIAGEM
FITOQUÍMICA DOS EXTRATOS DE ESPÉCIES DA FAMÍLIA
ASTERACEAE ENCONTRADAS NO SEMI-ÁRIDO BAIANO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana
como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
a
a
Orientador: Prof . Dr . Ana Paula Trovatti Uetanabaro
a
a
o
o
Co-Orientadores: Prof . Dr . Angélica Maria Lucchese
Prof . Dr . Eraldo Medeiros Costa Neto
Feira de Santana, BA
2010
Aos meus pais, Mota e Zildete, ao
meu
irmão
Cleber,
pelo
amor
incondicional que sempre nos uniu e
ao meu marido Tony por todo apoio,
amor e compreensão em todos os
momentos da minha vida.
AGRADECIMENTOS
Á Deus, em primeiro lugar, que me deu força, coragem, ânimo, sabedoria,
para superar as dificuldades e também por alcançar mais esta vitória em minha vida.
Aos meus pais, pelo alicerce familiar , meus companheiros e amigos de todas
as horas, pela educação e carinho em todos os momentos.
Ao meu irmão Cleber, meu amigo, como eu te admiro e respeito.
Ao meu marido Tony, meu amor, por me ouvir, compreender e ajudar sempre
que eu precisei.
A professora Doutora Ana Paula Trovatti, a quem eu devo um agradecimento
muito especial, pela orientação, por acreditar no meu trabalho, pelo respeito, a
amizade em todos os momentos, um grande exemplo em minha vida como
profissional e mulher. Obrigada Ana!!!
A professora Doutora Angélica, pela co-orientação e pelo apoio em todas as
etapas dos testes fitoquímicos.
A professora Doutora Carla Mendes que me acompanhou também na triagem
fitoquímica, sempre simpática, atenciosa.
A professora Doutora Maria Alice Neves pelo apoio e pela agradável
convivência nas viagens de coleta.
Agradeço também a Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) por
fornecer as estruturas físicas para a realização dos meus experimentos, o
Laboratório de Pesquisa Microbiológica (LAPEM) e o Laboratório de Produtos
Naturais (LAPRON);
A todos os estagiários, professores e funcionários do Laboratório de pesquisa
em Microbiologia (LAPEM), em especial, os Professores Doutores Aristóteles Góes e
Helio Kamida, as funcionárias: Suzana, Clarissa e Goretti, aos biólogos: Carla,
Gisele, João Ronaldo (obrigada pelas fotos), Isabella, Getúlio, pelos momentos de
reciprocidade, de desabafo, de gargalhadas... Perdi a conta de quantas caixas de
ponteiras tivemos que encher... Vocês marcaram esta fase da minha vida! Muito
obrigada!!!
A todos os estagiários, professores e funcionários do Laboratório de pesquisa
de Produtos Naturais (LAPRON), em especial a bióloga Edna Peralta, estagiárias
Monick, jakeline, Rebeca e ao farmacêutico Matheus, pelo apoio e auxílio, e pela
troca de experiências.
As estagiárias Lara Raisa e Tallane teque pelo apoio e ajuda durante os
experimentos e pela convivência agradável e divertida mesmo ficando no laboratório
até tarde.
Ao Projeto Sempre Viva, localizado no município de Mucugê- BA e ao CIEG Centro Integrado de Estudos Geológicos (CPRM) localizados no município de Morro
do Chapéu – BA, por disponibilizar suas dependências para a realização das coletas
de campo das espécies estudadas.
Ao
Programa
de Pós-Graduação
em Biotecnologia
–
PPGBIOTEC-
UEFS/FIOCRUZ- pela minha formação Acadêmica.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ),
pela concessão da Bolsa de estudos oferecida durante o curso de Mestrado.
A todos aqueles que estiveram ao meu lado durante esse período, serei
eternamente grata pelo apoio, compreensão, dedicação, companheirismo..
E a todos aqueles que direta ou indiretamente me ajudaram de alguma forma
a conquistar essa vitória!
Muito obrigada!
“A árvore que plantas dar-te-á, talvez amanhã, o remédio que precises”
Emmanuel.
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .................................................................................................. 9
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. 10
RESUMO................................................................................................................... 12
ABSTRACT............................................................................................................... 13
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14
1.1 OBJETIVOS ........................................................................................................ 17
1.1.1 Objetivo geral ................................................................................................... 17
1.1.2 Objetivos específicos........................................................................................ 17
2 REFERENCIAL TEÓRICO..................................................................................... 18
2.1 PLANTAS MEDICINAIS NO BRASIL: CONTEXTO HISTÓRICO E UTILIZAÇÃO
.................................................................................................................................. 18
2.2 MICRO-ORGANISMOS E RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS.......................... 20
2.3 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ................. 22
2.4 A FAMILIA ASTERACEAE NA MEDICINA TRADICIONAL................................. 26
2.4.1 Achyrocline satureoides L. .............................................................................. 28
2.4.2 Ageratum conyzoides L. .................................................................................. 29
2.4.3 Baccharis trimera (Less.) Dc. ........................................................................... 31
2.4.4 Bidens pilosa L. ............................................................................................... 34
2.4.5 Porophyllum ruderale (Jacq.) Cassini .............................................................. 35
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 36
3.1 COLETA DE MATERIAL BOTÂNICO E IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES ...... 36
3.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS...................................................... 38
3.3 EXTRATO BRUTO METANÓLICO ..................................................................... 39
3.4 TRIAGEM DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO BRUTO ............ 40
3.4.1 Micro-organismos ............................................................................................ 41
3.4.2 Teste da Difusão em Disco .............................................................................. 41
3.4.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM/MIC) .......................... 43
3.5 TRIAGEM FITOQUÍMICA DOS EXTRATOS ...................................................... 46
3.5.1 Cromatografia de Camada Delgada ................................................................ 46
3.5.2 Reagente Anisaldeído – Ácido Sulfúrico (AS) .................................................. 48
3.5.3 Reagente Dragendorf com Ácido Clorídrico (DRG) .......................................... 48
3.5.4 Reagente Liebermannburchard (LB) ............................................................... 49
3.5.5 Reagente Hidróxido de Potássio (KOH) ........................................................... 49
3.5.6 Reagente Produtos Naturais Polietilenoglicol (NP/PEG) .................................. 49
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................... 50
4.1 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS METANÓLICOS ................................ 50
4.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA PELO MÉTODO DE
DIFUSÃO EM DISCO ................................................................................................ 53
4.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA PELA CONCENTRAÇÃO
INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM/MIC) ................................................................................ 58
4.4 DETERMINAÇÃO DA TRIAGEM FITOQUÍMICA DOS EXTRATOS ................... 65
5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 71
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 72
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características de alguns grupos de princípios ativos em plantas
medicinais ................................................................................................................. 24
Tabela 2. Gêneros da Familia Asteraceae e sua atividade fitoquímica .................... 27
Tabela 3 – Identificação botânica, local de coleta e número de voucher no HUEFS
das espécies coletadas. ............................................................................................ 38
Tabela 4. Massa seca (g), massa dos extratos metanólicos e rendimento das
amostras das espécies coletadas. ............................................................................ 52
Tabela 5. Avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos metanólicos bruto das
espécies de Asteraceae estudadas, através dos tamanhos dos halos de inibição (em
mm), pela técnica da difusão em disco. .................................................................... 56
Tabela 6: Resultados das concentrações inibitórias mínimas (mg.mL-1) dos extratos
metanólicos brutos das espécies de Asteraceae avaliadas ...................................... 61
Tabela 7: Resultado da triagem fitoquímica dos extratos das diferentes partes
vegetais das espécies de Asteraceae ....................................................................... 69
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Composição química do óleo essencial do mentrasto. ............................. 30
Figura 2- Composição química do óleo essencial da carqueja................................ 32
Figura 3 - Mapa da Bahia indicando as cidades de coleta ....................................... 37
Figura 4 - Fotos das espécies coletadas: A- Ageratum conyzoides, B- Achyrocline
satureoides, C- Porophyllum ruderale, D- Bidens pilosa e E – Baccharis trimera. . .. 39
Figura 5: Etapas da preparação dos extratos brutos das espécies coletadas no
Semi-árido da Bahia . ................................................................................................ 40
Figura 6. Etapas da obtenção dos extratos metanólicos brutos ............................... 41
Figura 7. Esquema do procedimento realizado para detecção da atividade
antimicrobiana pelo método da difusão em disco...................................................... 43
Figura 8. Determinação da CIM utilizando-se uma pipeta automática multicanal. ... 45
Figura 9: Esquema da placa de 96 poços para determinação da CIM. .................... 46
Figura 10: Sequência de aplicação das amostras em placas de sílica gel para
Cromatografia em Camada Delgada (CCD). RF é o fator de retardamento de cada
mancha, dm é a distância (cm, mm) percorrida pela frente da fase móvel ............... 47
Figura 11: Aplicação das amostras Raiz (B. trimera), Caule e Fruto (P. ruderale),
respectivamente, em placas de sílica gel para eluição em sistemas de solventes. .. 48
Figura 12: Eluição das amostras dos extratos, no sistema Metanol (100%) ............ 48
Figura 13: Revelação das placas eluídas com Reagente DRG.. .............................. 50
Figura 14: Placas do teste de difusão em disco, após o período de incubação, do
extrato metanólico da raiz de Baccharis trimera contra Candida albicans CCMB 286
(A); extrato metanólico da flor de Ageratum conyzoides contra Staphylococcus
aureus CCMB 262 (B) e extrato metanólico do fruto de Porophyllum ruderale contra
Bacillus cereus CCMB 282. ....................................................................................... 54
Figura
15:
Placas
de
determinação
da
concentração
inibitória
mínima.
Representação da diluição em série do extrato metanólico bruto da flor de A.
satureoides: (A) Colunas 1-3 contra E. coli, não apresentou atividade CIM 5,0
mg.mL-1; Colunas 4-6 contra S. aureus CCMB 262 CIM < 0,15 mg.mL-1 e Colunas 79 contra S. aureus CCMB 263 CIM 0,15 mg.mL-1; (B) Colunas 1-3 contra Salmonella
sp. CCMB 281, não apresentou atividade CIM 5,0 mg.mL-1, Colunas 4-6 contra B.
cereus CCMB 282 CIM 0,15 mg.mL-1 e Colunas 7-9 contra E. coli CCMB 284, não
11
apresentou atividade CIM 5,0 mg.mL-1. C1, C2 e C3: controle do crescimento do
micro-organismo-teste; C4: Controle do extrato e C5 e C6: Controle do meio de
cultura (CMH). ........................................................................................................... 60
Figura 16: Cromatogramas dos extratos das espécies: B. trimera (Caule) P. ruderale
(Caule e Fruto) e A. satureoides (Flor), B. trimera (Raiz), B. pilosa (Caule), nesta
ordem: (A) e (B) Tratamento com Reagente AS à luz visível; (C) e (D) Tratamento
com Reagente LB à luz visível e (E) e (F) Tratamento com Reagente NP/PEG à luz
UV365. ...................................................................................................................... 67
Figura 17: Cromatogramas dos extratos das espécies: A. conyzoides (Folha e Flor),
B. pilosa (Raiz e Fruto) e A. satureoides (Raiz e Caule), nesta ordem: (A) e (B)
Tratamento com Reagente AS à luz visível; (C) e (D) Tratamento com Reagente LB
à luz visível e (E) e (F) Tratamento com Reagente NP/PEG à luz UV365. ............... 68
12
RESUMO
A utilização de plantas medicinais nativas no tratamento de enfermidades é uma
prática exploratória e largamente difundida no Brasil. Muitas espécies da família
Asteraceae (Compositae), uma das maiores famílias de plantas, são utilizadas na
medicina popular. A presença de poliacetilenos e lactonas sesquiterpênicas tem
proporcionado o estudo da família quanto à sua composição química e atividade
biológica. Entretanto, não foram encontrados trabalhos sobre atividade
antimicrobiana de representantes da família Asteraceae na região do semi-árido
baiano. Por isso, este trabalho avaliou a atividade antimicrobiana e a triagem
fitoquímica de extratos de diferentes partes vegetais das espécies pertencentes a
família Asteraceae com ocorrência na região Semi-árida da Bahia. Os extratos
metanólicos brutos da raiz, caule, folha, flor e fruto (quando presentes) de
Achyrocline satureioides L., Ageratum conyzoides L., Baccharis trimera (Less.) Dc.,
Bidens pilosa L. e Porophyllum ruderale (Jacq.) Cassini foram testados usando o
método de difusão em disco e concentração inibitória mínima (CIM) frente a
bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras. Os micro-organismos mais
sensíveis pelo teste de difusão em disco e pela CIM foram cepas de bactérias Grampositivas e leveduras. Comparativamente, o método da CIM mostrou-se mais
sensível para a determinação da presença de atividade antimicrobiana para os
extratos testados. A detecção de classes de metabólitos secundários foi realizada
por cromatografia em camada delgada. Dos 19 extratos metanólicos brutos obtidos
12 apresentaram atividade antimicrobiana pelo método de difusão em disco, com
variação entre partes da planta e tipo de micro-organismos inibidos. As amostras
dos extratos também exibiram atividade antimicrobiana na determinação do CIM,
entretanto, em diferentes intensidades, dependendo do micro-organismo e do órgão
vegetal estudado. A presença de terpenos, triterpenos, esteróides e flavonóides
ocorreu em todas as espécies vegetais estudadas. Os resultados in vitro obtidos
neste trabalho indicam que estas espécies podem atuar como agentes
antimicrobianos contra infecções bactérianas e por leveduras.
Palavras-chave: Asteraceae; atividade antimicrobiana; semi-árido.
13
ABSTRACT
The use of native medicinal plants in diseases treatment is an exploratory and wide
spread practical in Brazil. Many species of the Asteraceae family (Compositae), one
of the biggest plants families, are used in popular medicine. The presence of
polyacetylenes and sesquiterpene lactone has proportionate the family study about
its chemical composition and biological activity. However, works on antimicrobial
activity of plants belonging to the Asteraceae family in Bahia semi-arid region had not
been found. Therefore, this work evaluated the antimicrobial activity and the
phytochemistry extract selection of different vegetal parts of some Asteraceae
species with occurrence in Bahia semi-arid region. The crude methanolics extracts
of root, stem, leaf, flower and fruit (when presents) of Achyrocline satureioides L.,
Ageratum conyzoides L., Baccharis trimera (Less.) Dc., Bidens pilosa L. and
Porophyllum ruderale (Jacq.) Cassini were tested using the method of disc diffusion
and minimum inhibitory concentration (CIM) against Gram-positive and Gramnegative bacteria and yeasts. The most sensible microorganisms for the disc
diffusion test and for CIM were of Gram-positive bacteria and yeasts strains.
Comparatively, the CIM method revealed more sensible for the determination of the
presence of antimicrobial activity for tested extracts. The detection of secondary
metabolites classes was carried through by thin layer chromatography. Twelve of 19
rude methanol extracts showed antimicrobial activity by disc diffusion and results
variation between parts of the plant and type of inhibited microorganisms. The
extracts samples also showed antimicrobial activity through CIM determination,
however, in different intensities, depending on the microorganism and the vegetal
part studied. The presence of terpenes, triterpenes, steroids and flavonoids occurred
in all plant species studied. The in vitro results indicate that these species can act as
antimicrobial agents against bacterial and yeasts infections.
Keywords: Asteraceae; antimicrobial activity; semi-arid.
14
1 INTRODUÇÃO
Desde o princípio das civilizações, os vegetais têm sido utilizados não só
como fonte alimentícia, como também medicamentosa. As mais diversas
enfermidades têm sido tratadas com chás (infuso, decocto, macerados), sucos,
tinturas, banhos, cataplasmas e unguentos, preparados a partir das plantas
(ALMEIDA, 1993). A referida conduta terapêutica remonta, principalmente, aos
antigos povos da China, Egito, Ásia, Roma, em que os eruditos, com base em seus
conhecimentos, classificaram numerosas espécies vegetais, com a respectiva
indicação do uso medicinal. Posteriormente, os gregos instituíram o emprego
racional das plantas na prática médica, sendo seguido pelos clínicos da Europa
Ocidental (RIBEIRO, 2008). O conhecimento do uso terapêutico dos recursos
naturais pelo homem, ao longo dos tempos, garantiu sua sobrevivência e foi objeto
de especial cuidado por parte das populações tradicionais (PINTO et al., 2005).
Segundo a Secretaria de Vigilância Sanitária, em sua Portaria no. 6 de 31 de
janeiro de 1995, a definição para plantas medicinais diz que “são aquelas que têm
uma história de uso tradicional como agente terapêutico”. A utilização de plantas
medicinais no tratamento das enfermidades é uma prática exploratória e largamente
difundida no Brasil. A maioria das espécies tem sido utilizada de forma extrativista,
sendo que o crescimento da população humana e a ocupação de áreas naturais
vêm aumentando a pressão destrutiva sobre essa flora (ROSA & FERREIRA, 2001).
A importância das plantas medicinais deve-se à sua contribuição como fonte natural
de fármacos e por proporcionar grande possibilidade de obter-se uma molécula
protótipo devido à diversidade de constituintes presentes (YUNES & CALIXTO,
2001).
Nas últimas décadas observou-se um grande interesse pelo potencial
terapêutico das plantas medicinais (YUNES & CALIXTO, 2001). Tal fato é
comprovado pela evidência de que hoje, cerca de 30% dos medicamentos
produzidos pelos países desenvolvidos são provenientes de recursos naturais. Além
disso, no período de 1941 a 2002, dos 90 fármacos analisados no Annual Reports of
Medicinal Chemistry, 61 eram derivados semi-sintéticos de plantas e nove eram
oriundos de produtos naturais (SILVEIRA et al., 2009). Dados da Organização
Mundial da Saúde mostram que atualmente 80% da população dos países em
15
desenvolvimento utilizam práticas medicinais tradicionais, sendo que 85% dessas
práticas envolvem plantas medicinais.
Uma vez que as plantas medicinais produzem uma variedade de substâncias
com propriedades antimicrobianas, é esperado que estudos de fitoquímica e
isolamento possam indicar compostos candidatos para o desenvolvimento de novos
antibióticos (DUARTE, 2006). Entretanto, as investigações científicas que visam
determinar o potencial terapêutico das plantas são limitadas, existindo a falta de
estudos científicos experimentais que confirmem as possíveis propriedades
antibióticas de um grande número dessas plantas (COUTINHO et al., 2004).
Na literatura científica, diversas plantas são referidas quanto à sua
composição química e atividade biológica, sendo que algumas têm proporcionado o
desenvolvimento de novos fármacos, inseticidas entre outros como é o caso da
família Asteraceae como o guaco entre outros (VERDI et al., 2005). A família
Asteraceae ou Compositae é o grupo sistemático mais numeroso dentro das
Angiospermas, possui cerca de 1.600 gêneros e 25.000 espécies, distribuição
cosmopolita, melhor representada em climas temperado e subtropical onde não
existam densas florestas (BREMER, 1994). São muito estudadas quanto à sua
composição química e atividade biológica, pois apresentam poliacetilenos, lactonas
sesquiterpênicas (LSTs), óleos essenciais voláteis, terpenóides, monoterpenos
voláteis, alcalóides, látex com triterpenos, saponinas triterpenóides pentacíclicas,
antocianinas e flavonóides (VERDI et al., 2005). As LSTs são consideradas
marcadores químicos da família, de onde a grande maioria de substâncias com
enorme variedade estrutural foi isolada. Além disso, possuem diversas atividades
biológicas, como antimicrobianas, antitumoral, antiinflamatória (RIVERO et al.,
2002).
Estudos sobre as atividades antimicrobianas de extratos e óleos essenciais
de plantas nativas têm sido relatados em muitos países como Brasil, Cuba, Índia,
México e Jordânia, que possuem uma flora diversificada e uma rica tradição na
utilização de plantas medicinais para uso como antibacteriano ou antifúngico
(DUARTE, 2006).
Em relação à família Asteraceae, muitos trabalhos são conhecidos em
campos rupestres, porém poucos ainda são desenvolvidos no bioma caatinga, um
ambiente tão diverso (LUCCHESE, 2006). No semi-árido brasileiro, estima-se haver
oito mil espécies vegetais sendo que destas, 318 espécies de 42 famílias botânicas
16
são endêmicas da Caatinga. Diante dessa vasta biodiversidade e da necessidade da
descoberta de novas moléculas bioativas, é de fundamental importância o estudo
farmacológico da flora (NOVAIS et al. 2003).
Pelo acima exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a
atividade antimicrobiana e triagem fitoquímica de extratos metanólicos brutos de
diferentes partes vegetais de cinco espécies da família Asteraceae encontradas no
semi-árido do estado da Bahia contra micro-organismos potencialmente patogênicos
ao homem.
17
1.1 OBJETIVOS
1.1.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antimicrobiana e triagem fitoquímica de extratos de
diferentes partes vegetais das espécies: Achyrocline satureioides, Ageratum
conyzoides, Baccharis trimera, Bidens pilosa e Porophyllum ruderale, todas
pertencentes à Família Asteraceae, encontradas na região do semi-árido do estado
da Bahia.
1.1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I.
Testar a atividade antimicrobiana de extratos metanólicos obtidos a partir de
raízes, caules, folhas, flores e frutos (quando presentes) das cinco espécies
de plantas através da técnica de difusão em disco contra bactérias Grampositivas, bactérias Gram-negativas e leveduras.
II.
Determinar a concentração mínima inibitória (CIM) do extrato bruto metanólico
que apresentarem atividade antimicrobiana pela metodologia da difusão em
disco contra os micro-organismos escolhidos;
III.
Detectar por triagem fitoquímica a presença de classes de metabólitos nos
extratos das espécies selecionadas.
18
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 PLANTAS MEDICINAIS NO BRASIL: CONTEXTO HISTÓRICO E UTILIZAÇÃO
O uso de plantas medicinais no tratamento de enfermidades é conhecido
desde a mais remota antiguidade, existem vários registros históricos sobre a
utilização das plantas para tratamento de doenças desde 4.000 a.C (DUARTE,
2006).
Durante um longo período de tempo, plantas têm sido avaliadas como fonte
de produtos naturais para conservar a saúde humana, especialmente nas últimas
décadas, com estudos intensivos para terapia natural. A propósito, o uso de
componentes das plantas na área farmacêutica tem gradualmente aumentado no
Brasil. De acordo com Organização Mundial de Saúde, plantas medicinais deveria
ser a melhor fonte para obter uma variedade de drogas (BERTINI et al., 2005).
No Brasil, o uso das plantas como medicamento teve influência das culturas
indígena, africana e européia (LORENZI & MATOS, 2002). Entre os índios, o pajé ou
feiticeiro utilizava plantas entorpecentes para sonhar com o espírito que lhe revelaria
a erva ou o modo de curar o enfermo e também pela observação de animais que
procuram certas plantas quando doentes. Um exemplo é o uso da raiz de
ipecacuanha, pelos animais, para alívio de cólicas e diarréias. Os pajés associavam
o uso de plantas a rituais de magia e seus tratamentos eram, assim, transmitidos
oralmente de uma geração a outra (JORGE & MORAIS, 2003).
Atualmente, as plantas continuam a ser usadas para o tratamento de doenças
e novos fármacos continuam a ser desenvolvidos com base na pesquisa dos seus
constituintes. Nos países desenvolvidos os testes de screening de elevado
rendimento são usados para o fracionamento biomonitorado de extratos, conduzindo
ao isolamento de compostos ativos que podem vir a transformar-se em agentes
terapêuticos, na forma de produtos naturais ou como análogos sintéticos com
atividade biológica otimizada e / ou com redução dos efeitos adversos, e o uso das
indicações da etnofarmacologia aumenta a eficácia destes screenings (HEINRICH et
al., 2004; PHILLIPSON, 2001). Em 1996, dos 20 fármacos mais prescritos seis eram
produtos naturais (PHILLIPSON, 2001) e durante 2001 e 2002 aproximadamente um
quarto dos fármacos mais vendidos em todo mundo foram produtos naturais ou
derivados de produtos naturais. Nas últimas décadas observou-se um grande
19
interesse pelo potencial terapêutico das plantas medicinais (YUNES & CALIXTO,
2001). Tal fato é comprovado pela evidência de que hoje, cerca de 30% dos
medicamentos produzidos pelos países desenvolvidos são provenientes de recursos
naturais. Além disso, no período de 1941 a 2002, dos 90 fármacos analisados no
Annual Reports of Medicinal Chemistry, 61 eram derivados semi-sintéticos de
plantas e nove eram oriundos de produtos naturais (SILVEIRA et al., 2009). Dados
da Organização Mundial da Saúde mostram que atualmente 80% da população dos
países em desenvolvimento utilizam práticas medicinais tradicionais, sendo que 85%
dessas práticas envolvem plantas medicinais. Segundo a Secretaria de Vigilância
Sanitária, em sua Portaria no. 6 de 31 de janeiro de 1995, a definição para plantas
medicinais diz que “são aquelas que têm uma história de uso tradicional como
agente terapêutico”.
As plantas medicinais podem ser classificadas por categorias, de acordo com
sua ação sobre o organismo: estimulantes, coagulantes, diuréticas, sudoríferas,
hipotensoras,
de
função
reguladora
intestinal,
coletérica,
depurativas,
remineralizantes e reconstituintes (LORENZI & MATOS, 2002).
No passado, a fitoterapia era mais adotada pela população carente da área
rural e urbana, devido à fácil disponibilidade e menores custos. Atualmente, o uso de
plantas como uma fonte de medicamentos é predominante em países em
desenvolvimento como uma solução alternativa para problemas de saúde e está
bem estabelecido em algumas culturas e tradições. Decido ao aumento no interesse
por produtos naturais, o uso de plantas medicinais tornou-se mais difundido. Muitas
destas plantas ainda não foram estudadas e podem ser avaliadas quanto à ação
antimicrobiana, em contraste com plantas nativas da Europa, que já foram
exaustivamente estudadas (DUARTE, 2006).
Segundo a Resolução da Diretoria Colegiada No. 48/2004 da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, fitoterápicos são medicamentos
preparados exclusivamente com plantas ou partes de plantas medicinais (raízes,
cascas, folhas, flores, frutos ou sementes), que possuem propriedades reconhecidas
de cura, prevenção, diagnóstico ou tratamento sintomático de doenças, validadas
em estudos etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas ou ensaios
clínicos.
O Brasil é detentor da maior biodiversidade do planeta. Com cerca de 22% de
todas
as
espécies
vegetais
conhecidas,
possui
um
patrimônio
genético
20
potencialmente capaz de render-lhe elevados benefícios econômicos. Os trabalhos
de pesquisa com plantas medicinais originam medicamentos em menor tempo, com
custos muitas vezes inferiores e, consequentemente, mais acessíveis à população,
que, em geral, encontra-se sem condições financeiras de arcar com os custos
elevados da aquisição de medicamentos que possam ser utilizados como parte do
atendimento das necessidades primárias de saúde, principalmente porque na
maioria das vezes as matérias-primas utilizadas na fabricação desses medicamentos
são importadas. Por esses motivos ou pela deficiência da rede pública de
assistência primária de saúde, cerca de 80% da população brasileira não tem
acesso aos medicamentos ditos essenciais (TOLEDO et al., 2003).
2.2 MICRO-ORGANISMOS E RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS
Os antibióticos são produtos metabólicos naturais de fungos, actinobactérias
e bactérias capazes de impedirem o crescimento, ou de destruírem microorganismos. Dentre os problemas mais comuns que limitam o uso destes
antimicrobianos estão os efeitos colaterais produzidos no organismo e o aumento da
resistência microbiana (MIMS et al., 1999; BLACK, 2002).
A essência da quimioterapia antimicrobiana é a toxicidade seletiva, ou seja,
matar ou inibir o micro-organismo sem afetar o hospedeiro. As drogas
antimicrobianas podem ser classificadas como bactericidas, quando matam o
microrganismo, ou bacteriostáticas, quando impedem o crescimento do mesmo. No
caso das drogas bacteriostáticas, o hospedeiro se defende por si, utilizando
mecanismos como a fagocitose e a produção de anticorpos, normalmente destruindo
o micro-organismo (TORTORA et al., 2003; ALTERTHUM, 2004).
Segundo Mims et al. (1999), a distinção entre agentes bactericidas e
bacteriostáticos tornou-se obscura porque alguns agentes são capazes de destruir
algumas espécies, mas são bacteriostáticos para outros, como o cloranfenicol, que
inibe o crescimento de Escherichia coli e destrói o Haemophilus influenzae.
Resistência de um micro-organismo a um antibiótico significa que um microorganismo antes susceptível à ação de um antibiótico não é mais afetado por ele.
Um fator importante no desenvolvimento de cepas de micro-organismos resistentes
a drogas é que muitos antibióticos são bacteriostáticos em vez de bactericidas.
21
Infelizmente, os micro-organismos com maior capacidade de recuperação escapam
das defesas e desenvolvem resistência aos antibióticos (BLACK, 2002).
Existem dois tipos de resistência bacteriana, natural ou adquirida. A
resistência natural é representada por grupos bacterianos que não são sensíveis a
determinados antibióticos, como por exemplo, os micro-organismos Gram-negativos
resistentes à penicilina G, resistência esta existente antes da antibioticoterapia e é
própria
da
espécie.
A
resistência
adquirida
ou
secundária
ocorre
pelo
desenvolvimento de mecanismos de defesa, seja por mutação ou por aquisição de
material genético exógeno (AMATO NETO et al., 2000).
O aparecimento de resistência resulta de diversos fatores, tais como: uso
crescente e inadequado de antimicrobianos, procedimentos invasivos, grande
número
de
hospedeiros
susceptíveis
e
falhas
terapêuticas,
entre
outros,
ocasionando aumento da transmissão de organismos multirrresistentes (CATÃO et
al., 2005).
Atualmente, muitas cepas são resistentes a quase todos antimicrobianos e a
perspectiva de aparecimento de uma cepa resistente a todos os antimicrobianos
constitui uma séria preocupação. A necessidade de encontrar novas substâncias
com propriedades antimicrobianas para serem estudadas no combate a esses
micro-organismos
representam
um
desafio
no
tratamento
de
infecções
(SCHAECHTER et al., 2002; CATÃO et al., 2005; ALEKSHUN & LEVY, 2007).
Vários são os mecanismos pelos quais os micro-organismos podem escapar
dos efeitos dos antimicrobianos, entre eles incluem-se: alteração da estrutura
molecular dos antimicrobianos, produção de enzimas que inativam a droga,
alteração das proteínas ligadoras da penicilina ou outros pontos-alvo nas paredes
das células, alvos modificados da DNA-girase, mutações de permeabilidade e
modificações ribossômicas (CATÃO et al., 2005).
Em geral, bactérias têm a habilidade genética de adquirir e transmitir
resistência às drogas utilizadas como agentes terapêuticos. O problema dos microorganismos resistentes está crescendo, e a perspectiva para o uso de antibióticos é
indefinida. Por isso, medidas devem ser tomadas para resolver este problema, por
exemplo, controlar o uso de antibióticos, ampliar pesquisas para melhor entender o
mecanismo genético de resistência e continuar estudos para desenvolver novas
drogas, sintéticas ou naturais (AMOROSO, 2002; NASCIMENTO et al., 2000).
22
Embora as indústrias químicas e farmacêuticas tenham produzido uma
imensa variedade de diferentes antibióticos nos últimos tempos, cada vez mais tem
sido observado um aumento da resistência das bactérias a essas drogas usadas
para fins terapêuticos (ALEKSHUN & LEVY, 2007). O consumo de mais de uma
tonelada diária de antibióticos em alguns países da Europa tem resultado na
resistência de populações bacterianas, causando assim um sério problema de saúde
pública. Há um perigo do retorno a uma era pré-antibiótico, considerando-se que
nenhuma nova classe de antibiótico foi descoberta nos últimos anos, apesar das
intensas pesquisas das indústrias farmacêuticas (DUARTE, 2006).
Durante um longo período de tempo, plantas têm sido avaliadas como fonte
de produtos naturais para conservar a saúde humana, especialmente nas últimas
décadas, com estudos intensivos para terapia natural. A propósito, o uso de
componentes das plantas na área farmacêutica tem gradualmente aumentado no
Brasil (BERTINI et al., 2005).
Sendo assim, pesquisas voltadas para o estudo e avaliação de produtos
naturais como terapêuticos e principalmente com atividade antibiótica devem ser
estimulados no intuito de criar novas drogas.
2.3 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Historicamente, os compostos produzidos pelas plantas têm sido separados
em metabólitos ou produtos primários e secundários. Os metabólitos primários, por
definição, são moléculas que se encontram em todas as células vegetais e são
necessários para a vida da planta. São os açúcares, aminoácidos, proteínas e os
ácidos nucléicos. Os metabólitos secundários, ao contrário, são restritos em sua
distribuição, tanto dentro da planta quanto entre diferentes espécies de plantas. São
importantes para a sobrevivência e a propagação das plantas que os produzem, são
eles: compostos fenólicos, terpenóides, óleos essenciais e alcalóides entre outros.
São esses compostos os responsáveis pelos efeitos medicinais, ou tóxicos, das
plantas, e eles apresentam grande importância ecológica, uma vez que podem atuar
na atração de polinizadores, ou representar uma defesa química contra estresse
ambiental (LÓPEZ, 2006; RAVEN et al., 2007). Esses compostos possuem
importantes funções nos vegetais, já que são constituídos de substâncias que agem
na preservação da integridade das plantas. Por outro lado, esses compostos, ao
23
serem incorporados ao organismo animal, produzem variados efeitos e, quando
benéficos, caracterizam as plantas que os possuem. Muitos desses compostos ou
grupos deles podem provocar reações nos organismos, esses são os princípios
ativos. Algumas dessas substâncias podem ou não ser tóxicas, isto depende muito
da dosagem em que venham a ser utilizadas. Assim, planta medicinal é aquela que
contém um ou mais de um princípio ativo que lhe confere atividade terapêutica
(LORENZI & MATOS, 2002).
Metabólitos secundários são produzidos por plantas, fungos, bactérias,
protozoários, algas, insetos, animais marinhos, e outros seres. Nas plantas o
conjunto de compostos secundários é resultado do balanço entre a formação e
eliminação desses compostos durante o crescimento da planta, sendo que esse
equilíbrio é influenciado por fatores genéticos (que são fixos) e ambientais como luz,
temperatura, tipo de solo, água, além de outros, que são variáveis. Entre as
explicações sobre a origem de metabólitos secundários produzidos pelos
organismos, está a pressão seletiva natural que inclui resposta a interações de
competição, parasitismo, e modificações ambientais que alterem a disponibilidade
de recursos. Como exemplos destes metabólitos, podemos citar as micotoxinas,
toxinas produzidas por fungos, cuja ação pode impedir os insetos predadores, a
ação dos antibióticos na defesa territorial e o odor usado para atrair insetos para
dispersão de esporos (RAVEN et al., 2007).
Nem sempre os princípios ativos de uma planta são conhecidos, mas mesmo
assim ela pode apresentar atividade medicinal satisfatória e ser usada desde que
não apresente efeito tóxico. Existem vários grupos de princípios ativos, alguns de
maior importância são abordados na Tabela 1.
24
Tabela 1. Características de alguns grupos de princípios ativos em plantas medicinais
PRINCIPIO ATIVO
Alcalóides
PROPRIEDADES MEDICINAIS OU TÓXICAS
Atuam no sistema nervoso central (calmante, sedativo,
estimulante, anestésico, analgésico). Alguns podem
ser cancerígenos e outros antitumorais.
Mucilagens
Cicatrizante, antiinflamatório, laxativo, expectorante e
antiespasmódico.
Flavonóides
Antiinflamatório,
fortalece
os
vasos
capilares,
antiesclerótico, antidematoso, dilatador de coronárias,
espasmolítico,
antihepatotóxico,
colerético
e
antimicrobiano.
Taninos
Adstringentes
e
antimicrobianos
(antidiarréico).
Precipitam proteínas.
Bactericida,
Óleos essenciais
antivirótico,
cicatrizante,
analgésico,
relaxante, expectorante e antiespasmódico.
Adaptada de Lorenzi & Matos (2002).
As plantas possuem várias vias metabólicas secundárias que dão origem a
diversos
compostos
como
alcalóides,
flavonóides,
isoflavonóides,
taninos,
cumarinas, glicosídeos terpenos, poliacetilenos, que por vezes, são específicos de
determinadas famílias, gêneros ou espécies, e cujas funções, até pouco tempo,
eram desconhecidas (COWAN, 1999; SOUZA et al., 2003). Com o avanço das
pesquisas, foram atribuídas às referidas substâncias importâncias relevantes no
mecanismo de defesa das plantas contra seus predadores, sejam fungos, bactérias,
vírus, parasitas, insetos, moluscos ou animais superiores (YUNES & CALIXTO,
2001). Além disso, em determinadas circunstâncias, algumas plantas superiores
podem formar substâncias de natureza antimicrobiana, denominadas fitoalexinas.
Estas são produzidas como resposta imediata a agressões por fungos, bactérias,
vírus ou nematóides ou em função de determinados estímulos, como radiações,
agentes químicos e outras injúrias (YUNES & CALIXTO, 2001).
As plantas que contêm compostos aromáticos são usadas tradicionalmente
na medicina popular, na indústria farmacêutica, na industria de alimentos
aumentando a vida útil dos alimentos, mostrando inibição de bactérias, fungos
filamentosos e leveduras, na medicina alternativa e na de terapias naturais
25
(SARTORATTO et al., 2004). O uso de extratos vegetais e fitoquímicos com
finalidade medicinal é uma das mais antigas formas de aplicação medicinal da
humanidade. A OMS estima que mais de 65% da população dos países
desenvolvidos utilizem plantas medicinais para cuidados básicos com a saúde.
Graças à atividade metabólica secundária dos vegetais superiores, estes produzem
substâncias antibióticas como mecanismo de defesa contra predação por microorganismos, insetos e herbívoros (VEIGA JUNIOR et al., 2005).
Os óleos essenciais e os extratos de diversas espécies de plantas podem
controlar o crescimento dos micro-organismos relacionados à pele, à cárie dental,
incluindo as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (SARTORATTO et al.,
2004). Em 2000, Rauha et al. demonstraram a atividade antimicrobiana de extratos
de 29 espécies, comercializadas ou coletadas em diferentes locais da Finlândia,
ricos em flavonóides, frente a nove micro-organismos, sendo esses efetivos contra
Gram-positivos, como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus
subtilis; e Gram-negativos como Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa; e
também fungos filamentosos, como Aspergillus niger, e leveduras tais como Candida
albicans e Saccharomyces cerevisiae.
Existe um número significativo de famílias e espécies de plantas que foram
estudadas recentemente. Entretanto, se levarmos em conta a existência das cerca
de 300.000 espécies de plantas conhecidas, muito trabalho ainda tem de ser feito.
Para a maioria das plantas, somente uma das partes, como folha, raiz ou caule, ou
somente um tipo de preparação como óleo essencial ou extrato foram estudados. A
atividade antimicrobiana tem sido atribuída a pequenos terpenóides e compostos
fenólicos como timol, carvona, carvacrol, mentol e muroleno, que também na forma
pura exibem atividade antibacteriana ou antifúngica. Apesar dos mecanismos de
ação estarem incipientemente caracterizados, estes parecem estar associados ao
caráter lipofílico dos compostos, havendo um acúmulo em membranas e perda de
energia pelas células. As diferenças com respeito às técnicas empregadas para
investigação da ação de compostos de plantas e uma grande variação encontrada
na composição química de algumas preparações vegetais podem resultar em dados
de difícil comparação entre as pesquisas. Não existe também um consenso sobre os
níveis de inibição aceitáveis para compostos de plantas, quando comparados com
antibióticos padrões (DUARTE, 2006).
26
Muitas plantas dos biomas brasileiros, tais como o cerrado, a floresta
amazônica e a mata atlântica têm sido utilizadas como fármacos naturais pelas
populações
locais
no
tratamento
de
várias
doenças
tropicais,
incluindo
esquistossomose, leishmaniose, malária e infecções fúngicas e bacterianas. Além
disso, muitas plantas exóticas foram introduzidas no Brasil desde a colonização e
incorporadas na medicina popular (BUSSMANN, 2004).
No
Brasil,
a
investigação
sobre
produtos
naturais
com
atividade
antimicrobiana também aumentou significativamente nos últimos anos. Entretanto,
apesar da rica biodiversidade, somente estão disponíveis dados sobre 44 espécies
de plantas pertencentes a 20 famílias, com atividade positiva, incluindo espécies
nativas e exóticas. Em virtude da biodiversidade presente nos diferentes biomas
brasileiros, existe uma crescente demanda para produtos naturais por indústrias
farmacêuticas nacionais e internacionais, que impulsiona as investigações científicas
e a busca por drogas naturais. Esta sequência de eventos resultou em uma
legislação “sui generis” a respeito da biodiversidade e conhecimento tradicionais
associados, agora colocados em prática (FERREIRA, 2007).
2.4 A FAMILIA ASTERACEAE NA MEDICINA TRADICIONAL
A família Asteraceae ou Compositae possui cerca de 1.600 gêneros e 23.000
espécies, sendo encontrada em diferentes localidades (FERREIRA et al., 2009). No
Brasil, essa família é representada por 300 gêneros e 2.000 espécies (SOUZA &
LORENZI, 2005). Muitas plantas dessa família são conhecidas pelas suas
propriedades medicinais e diversas espécies possuem atividades analgésica,
antiinflamatória e antimicrobiana (LORENZI & MATOS, 2002) (Tabela 2).
Provavelmente a maior contribuição das Asteraceae para o homem é a
ecológica, uma vez que são responsáveis pela grande diversidade de espécies e,
portanto, favorecem a estabilidade e sustentabilidade produtiva das vegetações em
áreas secas do mundo, tais como os cerrados, capoeiras, campos e semi-áridos,
especialmente
nas
regiões
tropicais
e
subtropicais
(HEYWOOD,
1993).
Economicamente são pouco utilizadas na alimentação; têm potencial medicinal,
toxicológico e alergogênico, destacando-se sem dúvida como planta ornamental ou
daninha.
27
Tabela 2. Gêneros da Familia Asteraceae e sua atividade fitoquímica
Atividade
Antiinflamatória
Inseticida
Antibacteriano
Análgésico
Anti-malária
Anti-ulcerogênico
Anti-helmintico
Antiviral
Anti-chagas
Anti-hepático
Anti-hipertenção
Gêneros
Baccharis,
Coreopsis,
Pluchea,
Vernonia
Achyrocline
Achyrocline, Pluchea, Tagetes
Baccharis, Vernonia
Bidens, Vernonia
Mutisia, Vernonia
Pluchea
Acanthospermum
Trixis
Senecio
Bidens
Adaptado de Rivero et. al, (2002).
Ela apresenta um grande número de espécies, que são utilizadas como
medicinais e a presença de várias classes de metabólitos secundários faz considerar
que a composição química é mais importante do que a morfologia na evolução
dessa família (CRONQUIST, 1988).
A familia Asteracaeae possui diversos usos na medicina, no tratamento de
afecções gastrointestinais, dermatológicas, enfermidades do sistema esqueletomuscular, como também antisépticos, antiinflamatorios, expectorantes, e outros
(RIVERO et al., 2002). Apresentam um grupo diverso de compostos, entre eles, as
lactonas sesquiterpênicas, maior grupo de compostos ativos, com aproximadamente
3.000 estruturas. Estes compostos são de sabor amargo, e já se foi provado sua
atividade biológica e são considerados poderosos antiinflamatórios e relaxantes do
músculo liso in vitro (RIVERO et al., 2002). Outros compostos podem ser
encontrados na família Asteraceae como poliacetilenos, alcalóides, monoterpenos e
vários fenóis semelhantes aos flavonóides que provocam uma inibição da síntese de
prostaglandina. Recentemente, foi mostrado que as lactonas sesquiterpênicas são
potentes inibidores específicos do fator de transcrição NF-k B, antiinflamatório
(BORK et al., 1997).
28
2.4.1 Achyrocline satureoides L.
É uma erva anual, possui ramificações de até 1,5 m de altura coberta de
pilosidades brancas. As folhas são alternas, sésseis, as flores são amarelo-dourado,
fruto é do tipo aquênio, glabro e pardo (DILLON & ALVA, 1991a). É nativa da
América do Sul, sendo muito comum no Peru, Bolívia, Brasil, Uruguai e Argentina,
tanto em vegetação de campos de altitude quanto em restinga (DILLON & ALVA,
1991b). Esta planta é comum no Brasil, ocorrendo de Minas Gerais até o Rio Grande
do Sul (DE SOUZA et al., 2002). Segundo Anderberg (1991), Achyrocline apresenta
em torno de 32 espécies distribuídas na África, Madagascar e América do Sul.
É conhecida popularmente como marcela do campo, macela-amarela
(KISSMANN & GROTH, 1999) e é utilizada na medicina popular em infusões como
um agente digestivo, antiespasmódico, antiinflamatório e hipoglicêmico, para tratar
desordens gastrintestinais e reduzir os níveis de colesterol sanguíneo (RITTER et
al., 2002; SIMÕES et al., 1984). Estudos experimentais têm demonstrado atividades
anti-HIV (ADAMOLI, 1998), anti-proliferativa (PESSOA, 2000), além de ações
antioxidantes (DESMARCHELIER et al., 1998), anti-herpéticas (GARCIA et al.,
1999), analgésicas, constipativa e sedativa (SIMÕES et al., 1988), imunomodulatória
(SANTOS et al., 1999), antiviral (GARCIA et al., 1999), colerética e hepatoprotetora
(LOPEZ et al., 1996), antiinflamatória (FALCÃO et al., 2005) e antimicrobiana
(DUARTE et al., 2004). Esta planta também demonstrou in vitro atividade
mutagênica contra Salmonella e Escherichia coli e mutagênico e genotóxico, in vitro
em Salmonella o que pode explicar seu uso popular na disenteria, diarréia e
infecções intestinais (VARGAS et al., 1990). Foi verificada atividade antihiperglicêmica em ratos (CARNEY et al., 2002), antioxidativa, in vitro, citotóxica
contra
carcinoma
hepático
humano
in
vitro,
hepatoprotetor
em
ratos,
antispasmódico, anti-inflamatório (DESMARCHELIER et al., 1998).
A importância desta planta levou sua inclusão na primeira edição da
Farmacopéia Brasileira (BRANDÃO et al., 2006).
A. satureioides é a espécie mais estudada do ponto de vista químico. Foram
encontrados flavonóides (FERRARO et al., 1981; GUGLIUCCI et al., 2002;
KADARIAN et al., 2002), terpenóides, carotenóides, cumarinas e esteróides
(LORENZO et al., 2000; GUGLIUCCI et al., 2002), sesquiterpenos e monoterpenos
(LORENZO et al., 2000; GUGLIUCCI et al., 2002), dibenzofurano (CARNEY et al.,
29
2002), componentes derivados de fenilpirona (SIMÕES et al., 1998), componentes
derivados de tiofeno (MACEDO et al., 1997) e ácido cafeico, clorogênico e
isoclorogênico (DESMARCHELIER et al., 1998; KADARIAN et al., 2002).
2.4.2 Ageratum conyzoides L.
É uma erva ereta, folhas opostas, flores brancas a liláses, espécie nativa das
Américas Central e do Sul, atualmente com distribuição pantropical, ocorrendo
desde o nível do mar até 2.500 m de altitude (NOGUEIRA, 2009). No Brasil é
encontrada em praticamente todos os estados, principalmente em áreas
antropizadas e em lavouras, já que é considerada invasora de culturas e de áreas
não cultivadas (KISSMANN & GROTH,1999). O gênero Ageratum é composto por
cerca de 30 espécies, mas apenas algumas espécies têm sido investigadas
fitoquimicamente (BURKILL, 1985).
Conhecida popularmente como mentrasto, maria-preta, picão-branco, picãoroxo, erva de São João, erva de São José, erva de Santa Lúcia (LORENZI &
MATOS, 2002) é utilizada na medicina popular como laxante, antipirético, tratamento
de úlceras e curativo, além de cicatrização de feridas cutânea (GITHENS, 1948;
OKUNADE, 2002). Suas folhas também foram relatadas em tratamentos de infecção
por parasitas, reumatismo, cefaléia e cólicas (MENUT et al., 1993). As propriedades
antipiréticas e antientéricas também foram relatadas em uma resenha sobre “Plantas
medicinais do Senegal" (KERHARO & ADAMS, 1974). A planta teve seu consumo
aumentado desde a inclusão na lista da Central de Medicamentos, com
propriedades analgésicas e antiinflamatórias (CASTRO et al., 2004).
No Brasil, o chá é utilizado como antiinflamatório, analgésico e anti-diarréico
(YAMAMOTO et al., 1991). Outras soluções são utilizadas contra coceiras, doença
do sono, elixires para dor de dente, tosse, vermífugo, tônica e para matar piolhos
(flores) (KAPUR, 1993). As folhas são utilizadas para aplicação em cortes, feridas
(AHLUWALIA, 1968; RAMAKRISHNAN, 1990; UPADHAY et al., 1998); hemostático
(SURESH et al., 1995); como um inseticida(KAPUR, 1993); nas dores de cabeça
(KAPUR, 1993); em furúnculos (SIDDIQUI et al., 1989); doenças de pele, micose,
em febre tifóide, como antídoto ao veneno (NEOGI et al., 1989); febre amarela; para
problemas uterinos, prolapso anal, infecção de garganta; na cicatrização de feridas e
leucorréia (NOGUEIRA, 2009).
30
A composição química dos óleos varia com as diferentes origens geográficas
(VERA, 1993). Segundo Castro et al. (2004), a composição básica do óleo essencial
de mentrasto é: (E)-cariofileno (1); precoceno I (2); -muroleno (3); -muroleno (4);
óxido de cariofileno (5); precoceno II (6); 6-hidroximetil-7-metoxi-2,2-dimetil-2Hcromeno (7) e cumarina (8) (Figura 1).
Fonte: Adaptação CASTRO et al. (2004).
Figura 1- Composição química do óleo essencial do mentrasto.
31
2.4.3 Baccharis trimera (Less.) Dc.
É um subarbusto até 2,5 m de altura, caules trialados, folhas ausentes ou
reduzidas, flores bege a amareladas, fruto cipselas com cerdas alvas. É originária da
América do sul, provavelmente dos Andes peruanos, não muito exigentes quanto ao
solo, pois cresce em terrenos altos e rochosos, pradarias e em campos arenosos do
sul do Brasil, Paraguai, Bolívia, Uruguai, Peru e da Argentina. No Brasil, ocorre nos
campos meridionais e em vegetações de altitudes, além de áreas antropizadas
(BARROSO & BUENO, 2002).
Conhecida
popularmente
como
carqueja,
carqueja-amarga,
carqueja-
verdadeira é utilizada na medicina popular sob a forma de infusão para problemas
digestivos. Além disso, algumas substâncias químicas isoladas dessa espécie
tiveram ações biológicas eficazes no tratamento contra a cercária de Schistosoma
mansoni (CARREIRA, 2007) e letal para o molusco hospedeiro, além de inibir o
crescimento do protozoário causador da doença de chagas. Além disso, B. trimera é
a espécie que consta da Farmacopéia Brasileira (2003).
Pode ser utilizada na cervejaria caseira na substituição do lúpulo, e serve
também para aromatizar licores e refrigerantes. É muito utilizada na água do
chimarrão. A sua preparação caseira é usada na forma de infusões e de cocções.
Muito utilizada no combate a anemias, cálculos biliares, diarréia, problemas do
fígado, bexiga, rins, utilizado ainda contra má digestão e contra vermes intestinais
(SIMÕES & SPITZER, 2004).
A carqueja tem como constituintes taninos, lactonas, saponinas, óleos
essenciais, diterpenos, lignina, alfa e beta pineno, diterpenos, esteroides, polifenóis,
beta cardineno, calameno, sesquiterpenos, cânfero, ledol, acetato de carquejila,
alccois sesquiterpenicos, nerotidol, hispirulina, campferol, esqualeno, glicosidios,
flavonóides e muitos outros. O principal óleo essencial da espécie é o carquejol, que
é também o seu principal constituinte ativo. Experimentos com camundongos
confirmaram a baixa toxidade do carquejol, mesmo assim , como em outras ervas , é
preciso cuidados com a super dosagem a DL50 do carquejol que é de 1,80g/kg
(VERDI, et al., 2005) (Figura 2).
32
Fonte: Adaptação TEGOS et al. (2002).
Figura 2- Composição química do óleo essencial da carqueja.
Os óleos essenciais extraídos de suas folhas são produzidos e usados em
perfumaria, possuindo alto valor para indústrias de fragrâncias (BOLDT, 1989;
VERDI, et al., 2005).
De acordo com Lorenzi & Matos (2002), espécies de B. trimera são
amplamente utilizadas no Brasil, em medicina popular, hábito herdado de indígenas
que há séculos as utilizavam para o tratamento de várias doenças. O primeiro
registro escrito do uso da carqueja no país é de 1931, empregada na forma de
infusão de folhas e ramos para o tratamento da esterilidade feminina e da
impotência masculina, atribuindo-lhe ainda propriedades tônicas, febrífugas e
estomáquicas (CORRÊA, 1931). A partir daí, o uso medicinal aumentou
principalmente para a solução de problemas hepáticos, disfunções estomacais e
intestinais (SOICKE & LENG-PESCHLOW, 1987; LADEIRA, 2002). A planta ainda é
utilizada como aperiente e contra anemia, diabetes, obesidade, gota, úlceras e
afecções cutâneas (LADEIRA, 2002; DICKEL et al., 2007).
33
As diferentes propriedades atribuídas à carqueja na medicina tradicional vêm
sendo estudadas e algumas foram validadas, como consequência dos resultados
obtidos (LORENZI & MATOS 2002). A validação do efeito hipoglicemiante foi
realizada com extratos de B. trimera nos estudos de Xavier (1967) e Oliveira et al.
(2005a), e confirmados recentemente por Dickel et al. (2007). Soicke & LengPeschlow (1987) fazendo uso do extrato aquoso cru da planta em animais,
validaram suas propriedades hepatoprotetoras. As propriedades digestiva, antiúlcera e antiácida foram validadas em estudos com cobaias, em que foi mostrado
que os extratos da planta reduziram a secreção gástrica e tiveram efeito analgésico
(GAMBERINI et al., 1991) e anti-inflamatório (GENÉ et al., 1995). Bara & Vanetti
(1997)
comprovaram
que
extratos
alcoólicos
de
carqueja
têm
potencial
antimicrobiano e Avancini et al. (2000) confirmaram essa atividade in vitro a partir do
decocto de plantas de B. trimera.
34
2.4.4 Bidens pilosa L.
É um subarbusto com cerca de 40,0 cm de altura, folhas opostas, flores
amarelada, cipselas aristas amarelo-esverdeadas, considerada como invasora de
culturas comerciais (MARTINS et al., 2000). Espécie provavelmente nativa do
Caribe, considerada ruderal e atualmente distribuída em praticamente todas as
regiões tropicais e subtropicais do mundo (MORAES & MONTEIRO, 2006).
Conhecida popularmente como picão, picão-preto, fura-capa, piolho-de-padre
(LORENZI, 1991).
Muitas plantas utilizadas na medicina tradicional popular para tratar várias
desordens orgânicas apresentam sua utilidade ainda não totalmente compreendida.
Bidens pilosa é um exemplo dessas espécies. Embora alguns estudos concentrados
sobre ela tenham sido conduzidos em alguns países, a complexidade da sua
constituição fitoquímica ainda dificulta as conclusões acerca de muitas informações
necessárias para a explicação das suas utilidades populares e mesmo para
prospecção (FRANCO & FONTANA, 2004; VALDÉS & REGO, 2001).
Existem vários relatos populares que apontam para a utilidade de B. pilosa
para contornar inúmeros desconfortos e enfermidades, incluindo inflamações e
tumores. Estes relatos chegam de Cuba, Bahamas, Amazônia e região sul do Brasil
(FRANCO & FONTANA, 2004; VALDÉS & REGO, 2001). Essa planta tem longa
história de uso pelos povos indígenas da Amazônia. Praticamente todas as partes
da planta são utilizadas nas preparações medicinais que são aplicadas por via tópica
e/ou oral. Na Amazônia peruana, o picão-preto é utilizado para o tratamento da
angina, diabetes, disenteria, dismenorréia, edemas, hepatites, icterícia, laringite,
verminoses, febre aftosa em gado bovino. A tribo Cuna da região amazônica
costuma usar uma mistura das folhas da planta esmagadas com água para tratar
dores de cabeça (VASQUEZ, 1990; CORRÊA, 1931). O picão-preto ainda é usado
pelos povos indígenas para: retenção hídrica, lacerações, alívio de calafrios,
blenorragia, leucorréia, tonsilites, obstruções hepáticas, infecções urinárias e
vaginais, como emoliente, adstringente, antipirético (VALDÉS & REGO, 2001;
CORRÊA, 1931). É estimulante, desobstruente, com ação antiescorbútica
(CORRÊA, 1931). As flores são usadas para desconfortos gástricos em intoxicações
alimentares (ALMEIDA, 1993; COIMBRA, 1994; VASQUEZ, 1990). Nas Bahamas e
em Cuba tem sido utilizada para tratar tumores (VALDÉS & REGO, 2001). Também
35
existem relatos do uso popular do picão-preto para o tratamento de tumores por
adeptos da medicina natural do oeste de Santa Catarina e norte do Rio Grande do
Sul (FRANCO & FONTANA, 2004).
Estudos fitoquímicos realizados sobre Bidens pilosa detectaram a presença
de aminas, fitosteróis (β-sitosterol, estigmasterol), fitosterina B, esculetina e lupeol
em material vegetal proveniente do Egito (SARG et al., 1991). Outros estudos
apontam também para a presença de terpenos, flavonóides, glicosídeos de auronas
e chalconas, cujas geninas mais comuns são okanina, lanceolina e buteína
(VALDÉS & REGO, 2001). Todas as partes da planta encerram tanino e duas
resinas aromáticas (CORRÊA, 1931).
2.4.5 Porophyllum ruderale (Jacq.) Cassini
É uma erva anual, folhas alternas, flores com corola vináceae, fruto tipo
cipselas negras com cerdas creme. Possui uma ampla dstribuição, ocorrendo desde
o sul dos Estados Unidos até a Argentina (NICOLSON, 1991). Considera-se seu
lugar de origem a América do Sul, sendo amplamente distribuída por todas as
regiões do Brasil (Paraná, Santa Catarina, Minas Gerais, Pará, Mato Grosso,
Espírito Santo, Bahia e Rio Grande do Sul (FONSECA et al., 2007).
Conhecida popularmente como arnica, couvinha, couve-cravinho, cravo-deurubu, erva-fresca ( LORENZI & MATOS, 2002), sendo utilizada na medicina popular
como cicatrizante, antiinflamatória, adstringente e digestiva, além do uso veterinário
no tratamento de uma doença bacteriana que ataca bovinos (LORENZI & MATOS,
2002), antifúngica (DEVINCENZI et al., 1996), antibacteriana, leishmanicida, no
controle da hipertensão arterial, picadas de ofídios e no tratamento de doenças
reumáticas (MARQUESINI, 1996).
As espécies do gênero Porophyllum são amplamente utilizadas na medicina
popular das Américas do Sul e Central. No entanto, poucas espécies têm sido
estudadas química e agronomicamente (GUILLET et al., 1998). O óleo essencial
consiste principalmente de limoneno (BEZERRA et al., 2002), sabineno (LOAYZA et
al., 1999), mirceno (SOUZA et al., 2003) e felandreno (FONSECA et al., 2006).
36
3 MATERIAIS E MÉTODOS
O preparo dos extratos vegetais e a triagem fitoquímica foram realizados no
Laboratório de Produtos Naturais (LAPRON) e os testes antimicrobianos no
Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) da Universidade Estadual de
Feira de Santana (UEFS).
3.1 COLETA DE MATERIAL BOTÂNICO E IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES
Foram realizadas excursões a campo abrangendo diferentes localidades do
semi-árido da Bahia (Figura 3).
37
Figura 3 - Mapa da Bahia com as cidades onde foram realizadas as coletas de campo como estão indicadas no
quadro vermelho. Fonte: Funch (2002).
38
Todo tratamento convencional de herborização utilizado foi o descrito em
MORI et al. (1989). O material botânico coletado foi identificado e depositado no
Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana – HUEFS (Tabela 3).
Tabela 3 – Identificação botânica, local de coleta e número de voucher no HUEFS das espécies
coletadas.
Espécies
Local de
Coordenadas
Coleta
Geográficas
Latitude (S) Longitude (W)
Achyrocline satureoides
HUEFS Nº
Mucugê
13° 8’10,3”
41° 29’50,9”
146861
Serrinha
11° 36’3,1”
38° 57’18,7”
140095
(Lam.) DC.
Ageratum conyzoides L.
Baccharis trimera
°
0
Mucugê
13 8’10,3”
41 29’50,9”
146860
Bidens pilosa L.
Ipirá
12° 11,3’
39° 46’
146854
Porophyllum ruderale
Morro do
11° 7’40,2”
41° 0’ 3,7”
146858
(Jacq.) Cass.
Chapéu
(Less.) DC.
(S) - Sul, (W) - Oeste, HUEFS – Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana.
As espécies foram coletadas, anotadas a data, georreferenciamento,
condições climáticas e observações que foram julgadas relevantes das espécies:
Achyrocline satureoides, Ageratum conyzoides, Baccharis trimera, Bidens pilosa e
Porophyllum ruderale (Figura 4).
39
A
D
B
C
E
Figura 4 - Fotos das espécies coletadas: A- Ageratum conyzoides, B- Achyrocline satureoides, CPorophyllum ruderale, D- Bidens pilosa e E – Baccharis trimera. Foto: A autora e Maria Alice Neves
(2008).
40
3.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS
As cinco espécies vegetais coletadas foram secas à temperatura ambiente,
ao abrigo da luz, até peso constante, suas diferentes partes foram separadas,
totalizando 19 amostras, estas foram trituradas, em moinho de facas e logo após
pesadas (Figura 5).
A
B
Secagem a temperatura ambiente sob o abrigo
da luz
Separação das diferentes
partes vegetais
C
Trituração do material vegetal em um moinho
de facas
D
Material vegetal moído
Figura 5: Etapas da preparação dos extratos brutos das espécies coletadas no Semi-árido da Bahia
(A,B,C e D, nesta ordem). Foto: A autora (2008)
41
3.3 OBTENÇÃO DO EXTRATO METANÓLICO BRUTO
O material seco da: raiz, caule, folha, flor e fruto foi macerado em metanol
absoluto no mínimo três vezes, utilizando Lavadora ultra-sonica (USC 2800A) por
30min à temperatura ambiente. A quantidade do solvente utilizada foi proporcional à
quantidade da amostra, de forma que todo material vegetal ficasse imerso no
solvente. O extrato foi filtrado com papel de filtro e em seguida concentrado usando
evaporador rotatório sob pressão reduzida (40-42oC). A Figura 6 mostra as etapas
de preparação dos extratos metanólicos brutos.
A
Recipientes contendo o
material moído e o metanol
absoluto
C
B
Material sendo macerado
em Lavadora Ultra-sônica
D
Coloração dos extratos após a
retirada da lavadora Ultra-sônica
E
Concentração dos extratos
no Rotaevaporador
Filtração dos extratos
F
Extrato metanólico bruto
Figura 6. Etapas da obtenção dos extratos metanólicos brutos (A,B,C,D,E,F nesta ordem).
Foto: A autora (2008).
42
3.4 TRIAGEM DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO BRUTO
As amostras de extratos foram individualmente testadas em uma triagem
inicial contra micro-organismos (bactérias e leveduras) através do método da difusão
em disco e, posteriormente, foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM)
apenas daqueles extratos que apresentaram atividade antimicrobiana previamente
detectada pelo método da difusão em disco.
3.4.1 MICRO-ORGANISMOS
Os micro-organismos–testes utilizados foram:
MICRO-ORGANISMOS
CÓDIGO
PERFIL DE RESISTÊNCIA
Bacillus cereus
CCMB 282
-
Candida albicans
CCMB 286
Fluconazol e Amphotericina B
C. parapsilosis
CCMB 288
Fluconazol e Anfotericina B
C. krusei
CCMB 287
Fluconazol
Escherichia coli
CCMB 261
Sulfonamida
E. coli
CCMB 284
-
Pseudomonas aeruginosa
CCMB 268
-
Staphylococcus aureus
CCMB 262
Estreptomicina e
Dihidrostreptomicina
S. aureus
CCMB 263
Novobiocina
Salmonella sp.
CCMB 281
-
43
3.4.2 TESTE DA DIFUSÃO EM DISCO
Para avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos metanólicos brutos foi
empregado a metodologia de difusão em ágar, utilizando-se discos de filtro de papel
impregnados com as amostras dos extratos vegetais, conforme a metodologia
descrito por Bauer et al. (1966) e CLSI (2003 b), com adaptações. A Figura 7 mostra
esquematicamente a técnica da difusão em disco utilizada no presente estudo para
avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos brutos. Os testes foram realizados em
triplicatas.
B
A
Preparo da suspensão do
Micro-organismo-teste
Impregnação dos discos com
5 µL do extrato bruto
C
D
Padronização do inoculo
microbiano
E
Espalhamento com alça de
Drygalski
Inóculo de 100 µL da suspensão do
micro-organismos em AMH
F
Colocação dos discos de papel
impregnados
Figura 7. Esquema do procedimento realizado para detecção da atividade antimicrobiana pelo
método da difusão em disco (A,B,C,D,E,F nesta ordem). Foto: Vasconcellos- Neto (2009).
44
Com o auxílio de uma alça de repique, 3 a 5 colônias isoladas do microorganismo-teste foram transferidas para um tubo contendo 1,8 mL de solução salina
a 0,45%. Após a homogeneização, a densidade do inóculo foi padronizada com o
auxílio de um colorímetro (Biomérieux). A suspensão do micro-organismo teste foi
ajustada, 0,1 mL de 1,5 x 108 células/mL para bactérias, compatível com a escala
0,5 de McFarland e 0,1 mL de 1,5 x 105 células/mL para leveduras, compatível para
a escala 3 de McFarland. Com o auxílio da alça de Drygalski, 100 µL do inóculo
microbiano foram espalhados sobre a superfície de um meio sólido, ágar Müeller
Hinton (AMH), em placa de Petri (15 X 100 mm). Os extratos obtidos a partir de
folhas, raízes, caules, flores e frutos das diferentes espécies foram ressuspendidos
em metanol na concentração de 200 mg.mL-1, e esterilizados por filtração em
membrana de 0,22 µm em microtubo estéril.
Os discos de filtro de papel (6 mm de diâmetro) foram impregnados com 5 µL
do extrato bruto das amostras das espécies e deixados secar a temperatura
ambiente, por 2 horas. Em seguida, 3 discos de cada extrato foram colocados, com
o auxílio de uma pinça estéril, sobre as placas inoculadas com os micro-organismosteste de forma equidistante. As placas foram incubadas à 28ºC por 48 horas, quando
leveduras, em estufa tipo B.O.D. e à 37ºC por 18-24 horas, quando bactérias em
estufa bacteriológica. Todo procedimento foi realizado dentro de uma cabine de
segurança biológica (classe B2) com material esterilizado em autoclave a 120 ºC por
15 minutos. Os diâmetros das zonas de inibição foram medidos em milímetros com
auxílio de uma régua milimetrada e o valor considerado foi a média aritmética das
triplicatas, também foi calculado o desvio-padrão de cada amostra. As amostras
padrões dos controles positivos, fungicida nistatina e do bactericida cloranfenicol,
foram
utilizadas
para
comparação
de
resultados
entre
os
ensaios,
nas
concentrações de 10 µg/disco e 30 µg/disco, respectivamente.
3.4.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM/MIC)
A determinação da CIM foi realizada utilizando-se a metodologia, com
modificações, descrita na CLSI (2002), para as leveduras, e na CLSI (2003a),
bactérias, para os extratos brutos que apresentaram atividade biológica na triagem
inicial (difusão em disco de papel) (Figura 8). Os testes foram realizados em caldo
Müeller-Hinton (CMH).
45
Figura 8. Determinação da CIM utilizando-se uma pipeta automática multicanal.
Foto: Vasconcellos- Neto (2009).
Em microplacas estéreis com 96 poços de poliestireno foram inicialmente
distribuídos 90 µL do CMH duas vezes concentrado (CMH [2X]) nos poços de
números 1A ao 9A (linhas na horizontal) e dos poços 1B ao 1H (colunas na vertical),
foram distribuÍdos 90 µL do CMH uma vez concentrado (CMH [1X]). Cada poço de
1A a 9A (linhas na horizontal), além dos 90 µL do CMH 2X concentrado, foi
adicionado 90 µL do extrato. Em seguida, foram feitas diluições seriadas retirandose 90 µL dessa mistura caldo/extrato, transferindo-a para os poços seguintes que
continham 90 µL do CMH 1X concentrado, ao chegar aos últimos poços foram
descartados 90 µL da mistura caldo/extrato. Depois de realizadas as diluições em
todos os poços, foram adicionados 10 µL da suspenção do micro-organismo-teste,
tendo cada poço agora um volume final de 100 µL. A concentração utilizada do
extrato foi de 20,00 mg.mL-1, porém a faixa de concentração do extrato estudada foi
de 10,00 mg.mL-1 (primeiros poços, linha A) a 0,078 mg.mL-1 (últimos poços, linha H)
reduzindo sempre a metade. As colunas 10-12 foram separadas para os controles.
Foram preparados controles de esterilidade do meio de cultura (C5 e C6: 100 µL do
CMH [1x] e do CMH [2x] concentrado, respectivamente), da viabilidade microbiana
(C1; C2 e C3: 90 µL CMH [1x] + 10 µL da suspensão microbiana), e da esterilidade
dos extratos (C4: 50 µL CMH [1x] + 50 µL de extrato) como pode ser visto na figura
9. Para os controles positivos foram utilizados o antibiótico cloranfenicol e o
antifúngico nistatina, sendo a concentração estoque destes controles foi de 10
46
mg.mL-1 e 200 mg.mL-1, respectivamente. O volume final de cada poço foi de 100
µL. O controle do DMSO foi realizado em placa separada.
As placas com as bactérias foram incubadas a uma temperatura de 37ºC/1824h e com as leveduras a 28ºC/48h. Após o período de incubação foram utilizados
diferentes reveladores: para as leveduras foram adicionados em cada poço 50 µL de
revelador cloreto de 2,3,5,-trifeniltetrazólio, preparado de acordo com o fabricante; e
para as bactérias, foram adicionados 30 µL do revelador Resazurina 0,01%,
preparado de acordo com o fabricante. As placas foram colocadas de volta à
temperatura de incubação, por um período de 3 horas e fez-se, então, a leitura da
CIM. Foram considerados, neste trabalho, resultados representativos para inibição
do crescimento microbiano nas condições testadas de CIM valores iguais ou
inferiores a 2,5 mg.mL-1 do extrato testado, devido ao valor de CIM apresentado pelo
DMSO.
1
90 µL
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
C1
B
C2
C
C3
90 µL
90 µL
D
90 µL
C4
E
90 µL
F
90 µL
G
C5
H
C6
90 µL
MIC M.O.S. 1
MIC M.O.S. 2
MIC M.O.S. 3
CONTROLES
C1; C2 e C3: Controle dos micro-organismos
C4: Controle do extrato
C5 e C6: Controle do meio de cultura 1x e 2x concentrado,
respectivamente
M.O.S: Micro-organismos
Figura 9: Esquema da placa de 96 poços para determinação da CIM.
47
3.5 TRIAGEM FITOQUÍMICA DOS EXTRATOS
3.5.1 CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA
A cromatografia em camada delgada (CCD) foi a técnica escolhida e
desenvolvida neste estudo para a triagem fitoquímica das classes de compostos
majoritários presentes nos extratos. A presença dos constituintes ativos foi
detectada através de perfis cromatográficos em camada delgada (CCD), utilizando
placas (5 X 20 cm), com base de vidro revestidas com sílica gel 60 com indicador de
florescência (Modelo Alugram Sil G / UV254 – Marca Merck), ativadas em estufa a
120ºC por meia hora. As amostras foram aplicadas nas cromatoplacas com capilares
de vidro, na sequência de aplicação demonstrada pela Figura 10 e Figura 11.
1 - RAIZ
2- CAULE
- - - - - - - - - - - - - - - - - dm
- Rf
3 - FRUTO
0,5
1
2
3
- INÍCIO
Figura 10: Seqüência de aplicação das amostras em placas de sílica gel para Cromatografia em
Camada Delgada (CCD). RF é o fator de retardamento de cada mancha, dm é a distância (cm, mm)
percorrida pela frente da fase móvel. Foto: A autora (2009).
48
Figura 11: Aplicação das amostras Raiz (B. trimera), Caule e Fruto (P. ruderale), respectivamente,
em placas de sílica gel para eluição em sistemas de solventes. Foto: Lucchese (2009).
Foram realizados os pré-testes para saber qual o sistema de solvente que
melhor separava as amostras. As placas foram eluídas em cubas cromatográficas e
os seguintes sistemas de solventes foram utilizados como eluentes (Figura 12):
Metanol (100%) para as amostras das espécies: B. trimera (caule), P. ruderale
(caule e fruto), A. satureoides (flor), B. trimera (raiz) e B. pilosa (caule);
Diclorometano-Metanol (85:15) para as amostras das espécies: A. conyzoides (folha
e flor) e B. pilosa (raiz e fruto); Diclorometano-metanol-ácido acético glacial
(70:30:10) para as amostras das espécies: A. satureoides (raiz e caule).
Figura 12: Eluição das amostras dos extratos, no sistema Metanol (100%). Foto: A autora (2009).
49
Após eluição, as placas foram secas, visualizadas em luz UV254 nm e 365
nm e, posteriormente, reveladas com Reagente Anisaldeído-Ácido Sulfurico (AS),
Reagente Dragendorff com Ácido Clorídrico (DRG), Reagente LiebermannBurchard
(LB),
Reagente
Hidróxido
de
Potássio
(KOH)
e
Reagente
Produtos
NaturaisPolietilenoglicol (NP/PEG) conforme metodologia descrita por Wagner e
Bladt (1995). As colorações dos cromatogramas revelados foram comparadas com
as figuras presentes no Atlas de Wagner e Bladt (1995). Os fatores de retenção
foram determinados através da expressão:
RF = dr
dm
Onde: dr: distância (cm, mm) percorrida pela substância.
dm: distância (cm, mm) percorrida pela frente da fase móvel.
3.5.2 REAGENTE ANISALDEÍDO - ÁCIDO SULFURICO (AS)
Para o preparo deste reagente, foi misturado 0,5 mL de anisaldeído com 10
mL de ácido acético glacial, seguido de 85 mL de metanol e 5 mL de ácido sulfúrico
concentrado, nesta ordem. As placas foram borrifadas com cerca de 10 mL desta
solução, aquecidos a 100°C por 5 a 10 min, e então foram observados à luz visível
ou UV 365 nm.
3.5.3 REAGENTE DRAGENDORF COM ÁCIDO CLORÍDRICO (DRG)
Foram preparadas as soluções A e B. Para preparo da solução A, 0,85 g de
nitrato de bismuto básico foi dissolvido em 10 mL de ácido acético glacial e 40 mL de
água sob aquecimento. Quando necessário fltrou-se esta solução. E para a solução
B, 8 g de iodeto de potássio foram dissolvidos em 30 mL de água. Para borrifar nos
cromatogramas, misturou-se então as duas soluções na proporção de 1:1 (v:v), e
acrescentou-se 2 mL de ácido acético glacial e 10 mL de água (Figura 13). As
placas foram borrifadas com cerca de 10 mL desta solução e então foi observado à
luz visível.
50
Figura 13: Revelação das placas eluídas com Reagente DRG. Foto: Lucchese (2009).
3.5.4 REAGENTE LIEBERMANN-BURCHARD (LB)
Foram misturado 5 mL de anidrido acético com 5 mL de ácido sulfúrico, e
adicionados cuidadosamente a 50 mL de etanol absoluto, previamente em banho de
gelo. As placas foram borrifadas com cerca de 10 mL desta solução, aquecidos a
100°C por 5 a 10 min, e então foram observados à lu z UV 365 nm.
3.5.5 REAGENTE HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO (KOH)
Foi preparada uma solução etanólica a 5% de hidróxido de potássio. Este
reagente foi borrifado nas placas, e estas foram observadas à luz visível ou UV 365
nm (com ou sem aquecimento).
3.5.6 REAGENTE PRODUTOS NATURAISPOLIETILENOGLICOL (NP/PEG)
Para o preparo desse reagente o ester difenilborico acido-B-ethylamino foi
solubilizado em metanol a concentração de 1% (NP). Separadamente o
polietilenoglicol-400 foi dissolvido em etanol a uma concentração de 5% (PEG). As
cromatoplacas após eluição foram borrifadas com um pulverizador de vidro que
continha inicialmente cerca de 10 ml da solução PN, acoplado a um compressor
para asperção de volume suficiente para recobrimento da placa: em seguida, as
placas foram borrifadas pelo mesmo sistema com cerca de 10 ml da solução PEG,
sendo então observadas a luz UV 365 nm.
51
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS METANÓLICOS
O material botânico coletado (raiz, caule, folha, flor e fruto) das espécies
estudadas, após a extração mostrou que a raiz de A. satureoides (13,06%), flor de
A. conyzoides (8,71%); raiz de B. trimera (4,17%); fruto de B.pilosa (11,29%) e raiz
de P. ruderale (14,29%) tiveram os melhores rendimentos de extratos brutos, em
relação as outras partes das plantas como pode ser observado na tabela 4.
Considerando o solvente utilizado nas extrações das diferentes partes vegetais, o
metanol, segundo Falkenberg et al. (2000) e Simões et al. (2007), é o que melhor
dissolve, a temperatura ambiente, os extratos, porém o tempo de maceração pode
variar em função da rigidez do material e do tamanho de suas partículas
proporcionando assim um processo mais eficiente para determinados órgãos
vegetais.
52
Tabela 4. Massa seca (g), massa dos extratos metanólicos e rendimento das amostras das espécies
coletadas.
Espécies Vegetais
Achyrocline
satureoides
Ageratum conyzoides
Baccharis trimera
Bidens pilosa
Porophyllum ruderale
Partes da
Planta
Massa
seca (g)
Massa do extrato
Metanólico (g)
Rendimento
%
Raiz
20,36
2,66
13,06%
Caule
556,73
1,04
0,18%
Folha
225,86
2,01
0,88%
Flor
119,82
3,48
2,90%
Raiz
189,93
2,67
1,40%
Caule
471,80
2,34
0,49%
Folha
320,51
5,35
1,66%
Flor
123,61
10,77
8,71%
Raiz
24,68
1,03
4,17%
Caule
266,42
0,66
0,24%
Folha
167,91
2,58
1,53%
Raiz
107,15
1,89
1,76%
Caule
377,90
5,08
1,34%
Folha
137,62
4,15
3,01%
Fruto
18,06
2,40
11,29%
Raiz
27,71
3,96
14,29%
Caule
220,65
1,09
0,49%
Folha
72,12
0,71
0,98%
Fruto
31,03
1,42
4,57%
A etapa inicial do processo de preparação e obtenção dos extratos brutos
metanólicos é a secagem do material vegetal, que tem por finalidade a retirada da
água e, com isso, impedir reações de hidrólise e de crescimento microbiano
(BACCHI, 1996). Todo material vegetal foi seco imediatamente após a coleta, pois
existem nas plantas muitos sistemas enzimáticos próprios que, segundo Calixto et
al. (2001b) mesmo depois da coleta das mesmas, podem continuar atuando e
degradar os princípios ativos.
A secagem é mais rápida quanto mais dividido estiver o material vegetal a
secar, pois, deste modo, oferecerá uma maior superfície de evaporação. Ela pode
53
ser feita ao ar livre, temperatura ambiente, como foi o caso deste trabalho, embora
exija maior vigilância para garantir a uniformidade das condições durante a
operação. Preferencialmente, é feita á sombra, para evitar que a irradiação solar
altere a constituição química do material e é importante dispor o material vegetal
sobre um papel para absorção da umidade (SIMÕES et al, 2007).
A moagem tem por finalidade reduzir, mecanicamente, o material a
fragmentos de pequenas dimensões preparando-o assim para a próxima etapa a
extração. O aumento da área de contato entre o material sólido e o líquido extrator
torna mais eficiente a operação. A estrutura histológica das diversas partes
componentes de uma planta é bastante heterogênea; existem órgãos, como raízes e
os caules, cujos tecidos estão extraordinariamente compactados (xilema) ao passo
que em folhas e flores os tecidos se apresentam com textura mais delicada.
(SIMÕES et al., 2007).
Os extratos são produtos obtidos pelo tratamento de substâncias vegetais,
por um solvente apropriado, o qual é evaporado até a consistência desejada
(COUTINHO et. al, 2004). Antes de executar uma extração, deve-se levar em
consideração uma série de fatores que interferem nesta operação, tais como as
características do material vegetal, o seu grau extrator (solvente) e a metodologia.
Como praticamente todos os constituintes de interesse para a análise fitoquímica
apresentam alguma solubilidade em misturas metanólicas (FALKENBERG et al.,
2000), o metanol foi escolhido para a realização da extração inicial dos compostos
do material coletado.
Para o desenvolvimento deste trabalho a extração foi feita com metanol, pelo
processo de maceração utilizando a lavadora ultra-sônica por 30min, à temperatura
ambiente, já que muitas substâncias são instáveis em altas temperaturas. Este
processo foi utilizado, pois observou-se um bom rendimento dos extratos já que ele
permite o esgotamento da matéria-prima devido a extração exaustiva, como também
as ondas sonoras aumentam a superfície de contato e a maceração designa a
operação na qual a extração da matéria-prima vegetal é realizada em recipiente
fechado, em diversas temperaturas, durante um período prolongado (horas ou dias),
sob agitação ocasional.
54
4.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA PELO MÉTODO DE
DIFUSÃO EM DISCO
Para avaliação do comportamento dos agentes antimicrobianos, foi realizada,
inicialmente, uma triagem com todos os extratos metanólicos brutos das diferentes
partes vegetais através do teste de difusão em disco. Os resultados são mostrados
na Figura 14 e resumidos na Tabela 5.
Através da técnica de Difusão em disco (BAUER-KIRBY, 1966) pode-se
observar de acordo com a figura 14, a formação de zonas de halos de inibição de
tamanhos diferentes. Segundo Black (2002) a atividade antimicrobiana na técnica de
difusão em disco ocorre através da difusão do agente quimioterápico em todas as
direções do ágar, durante a incubação. Porém os agentes de maior peso molecular
se dispersam mais lentamente do que aqueles com um peso molecular menor,
resultando em zonas de inibição com halos de tamanhos diferenciados e estas
zonas não constituem necessariamente uma medida do grau de inibição do agente
bioativo devido à diferença na velocidade de dispersão de seus constituintes. Devido
a esta característica de dispersão, mesmo os menores halos foram considerados
neste trabalho como satisfatório para a qualificação de capacidade inibitória da
amostra.
A
B
C
Figura 14: Placas do teste de difusão em disco, após o período de incubação, do extrato metanólico
da raiz de Baccharis trimera contra Candida albicans CCMB 286 (A); extrato metanólico da flor de
Ageratum conyzoides contra Staphylococcus aureus CCMB 262 (B) e extrato metanólico do fruto de
Porophyllum ruderale contra Bacillus cereus CCMB 282. Foto: Neto (2009).
Apesar de ser caracterizada como uma técnica qualitativa foi realizada a
medição dos halos formados ao redor dos discos impregnados com as amostras
55
para a comparação destes resultados com os obtidos pela CIM, conforme também
foi realizado por Pinto (2008); Nobre (2008) e Magalhães - Gadéa (2008).
Foi utilizado para este teste de difusão bactérias gram-positivas, gramnegativas e leveduras. Segundo Rios e Recio (2005) o método de difusão em disco
é especialmente bom para determinar o potencial relativo dos extratos ou de óleos
essenciais e para estabelecer seu espectro antimicrobiano, pois facilita o uso de
diferentes linhagens frente ao extrato.
Diante dos resultados expressos pela tabela 5 pode-se inferir que todas as
espécies possuíam raiz, o caule e a folha diferenciando apenas a presença ou
ausência da flor e do fruto. Segundo Simões et al. (2007) geralmente essa variação
ocorre em função do estágio em que se encontra a planta, como na plena floração
ou no período que antecede a floração.
Como pode ser visto na Tabela 5, dos 19 extratos obtidos de diferentes partes
vegetais 12 (63%) apresentaram atividade antimicrobiana contra 4 (40%) dos 10
micro-organismos testados. Os 12 extratos vegetais apresentaram atividade
antimicrobiana em sua maioria para bactérias gram-positivas mais comuns, como S.
aureus CCMB 262 e B. cereus CCMB 282 e apenas para uma leveduras como foi o
caso da raiz de B. trimera que apresentou atividade antimicrobiana contra C.
albicans CCMB 286.
56
Tabela 5. Avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos metanólicos brutos das espécies de
Asteraceae estudadas pela técnica da difusão em disco.
Partes
S.a
S.a
B.c.
E.c.
E.c.
P.a.
S.sp.
C.a.
C.k.
C.p.
da
262*
263*
282*
261*
284*
268*
281*
286*
287*
288*
Raiz
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Achyrocline
Caule
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
satureoides
Folha
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Flor
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
Raiz
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ageratum
Caule
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
conyzoides
Folha
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Flor
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Raiz
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
Baccharis
Caule
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
trimera
Folha
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Raiz
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Caule
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Folha
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Fruto
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Raiz
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Porophyllum
Caule
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
ruderale
Folha
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Fruto
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
Espécies
Planta
Bidens pilosa
- : ausência de halo; +: Presença de halo de inibição; Os valores dos halos de inibição excluem o diâmetro do disco (6 mm). *
número de identificação dos micro-organismos pela Coleção de Cultura de Micro-organismos da Bahia (CCMB); B.c.- Bacillus
cereus, C.a. – Candida albicans, C.k. – Candida Kruzei, C.p. – Candida parapsilosis, E.c. – Escherichia coli, P.a. –
Pseudomonas aeruginosa, S.a. – Staphylococcus aureus e S. sp.- Salmonella sp..
As bactérias Gram-positivas, S. aureus CCMB 262 e B. cereus CCMB 282,
foram as mais sensíveis aos extratos metanólicos testados, pois seu crescimento
microbiano foi inibido por 75% e 25 % dos extratos, respectivamente. Já em relação
às bactérias Gram-negativas, todas foram resistentes frente a todos os extratos
testados. A razão para a diferença na sensibilidade entre bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas, como observado na Tabela 5, pode estar ligada a diferenças na
constituição morfológica desses micro-organismos. As bactérias Gram-negativas são
reportadas por apresentarem resistência a muitos dos antibióticos comercializados e
a E. coli é a mais proeminente (MENEZES et al., 2007). A complexidade das Gram-
57
negativas as torna menos suscetíveis a agentes antimicrobianos (MENEZES et al.,
2007). Estes resultados indicam certa especificidade de ação destes extratos, o que
é interessante para uma droga antimicrobiana, pois confere certa seletividade.
As flores presentes em A. satureoides e A. conyzoides e frutos de B. pilosa e
P. ruderale apresentaram atividade para pelo menos um micro-organismo como foi o
caso da flor de A. conyzoides contra S. aureus e no máximo três micro-organismos,
como a flor de A. satureoides contra B. cereus, S. aureus CCMB 262, confirmando
dados da literatura como Wiest et al. (2009), e S. aureus CCMB 263. O fruto de B.
pilosa apresentou atividade antimicrobiana contra contra S. aureus 262 e o fruto de
P. ruderal contra B. cereus CCMB 282.
Os extratos que não apresentaram atividade foram: a folha de A. satureoides,
raiz e caule de A. conyzoides, folha de B. trimera, folha de B. pilosa e raiz e folha de
P. ruderale segundo Cechinel e Yunes (1998) os agentes antimicrobianos se
encontram somente ou em maior quantidade na flor e fruto, pois a constituição
química, na maioria dos casos, difere significativamente em relação às distintas
partes da planta. Entretanto, é importante destacar que mesmo com a ausência de
halo de inibição, a presença de substâncias antimicrobianas nas outras partes não
pode ser descartada, pois moléculas de maior massa molecular difundem-se no
meio com menor velocidade, bem como produtos naturais catiônicos podem interagir
com o disco de papel, interferindo na sensibilidade do método de difusão em disco
(VALGAS et al., 2007).
Diante dos resultados encontrados para bactérias e comparando-os com a
literatura pode-se observar que: a maioria dos trabalhos relacionados a espécie P.
ruderale são sobre teor e composição de seus óleos essenciais (FONSECA, 2007) e
estudo espectofométrico da atividade fotoprotetora de seu extrato (ROSA et al.,
2008) não encontrando trabalhos específicos sobre sua atividade antimicrobiana;
para B. pilosa segundo Haida et al. (2007) seus extratos apresentaram atividade
antimicrobiana contra E. coli e P. aeruginosa.
O único resultado de atividade antimicrobiana frente as leveduras foi a raiz de
B. trimera contra C. albicans. Vários trabalhos na literatura confirmam este dado,
entretanto o estudo geralmente ocorre com óleos essenciais (POCÁ, 2005;
CARREIRA, 2007) e os testes de atividade antimicrobiana realizados são difusão em
poço, bioautografia e CIM (DUARTE et al., 2005; BUDEL et al., 2004; PICOLI et al.,
2008) não encontrando trabalhos com difusão em disco. Segundo Machado (2005) a
58
baixa atividade dos extratos contra as leveduras pode estar relacionada à presença
e estrutura da parede celular, que apresenta quitina e 1,3-β-glicano em sua
morfologia,
podendo
dificultar
a
penetração
do
agente
antimicrobiano.
59
4.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA PELA CONCENTRAÇÃO
INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM/MIC)
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliada através da
determinação de uma pequena quantidade da substância necessária para inibir o
crescimento do micro-organismo teste; esse valor é conhecido como Concentração
Inibitória Mínima (CIM) (OSTROSKY et al., 2008).
O ensaio para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM), ou
“minimum inibitory concentration” (MIC), é obtido através da macro ou microdiluição
de compostos que consiste em se preparar diluições sucessivas do antimicrobiano a
ser testado, em meios de cultura sólida ou líquida, semear o micro-organismo e após
a incubação verificar a menor concentração (maior diluição) do antimicrobiano que
inibiu o crescimento do micro-organismo (CLSI, 2002; 2003). As vantagens desse
método são proporcionar mais informações quantitativas e poder ser aplicado a uma
variedade mais ampla de isolados do que as provas por difusão (KONEMAN et al.,
2001).
Para a determinação dos resultados pode-se usar a verificação visual por
turbidez, mensurar a viabilidade e proliferação das células através de corantes
indicadores de oxi-redução como Resazurina e Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio ou
utilizar aparelhos, como o espectrofotômetro (PFALLER; BARRY, 1994; BAKER;
TENOVER, 1996; CLSI, 2003a; DUARTE et al., 2005). De acordo com Belotti et al.
(1999), as células vivas, através de enzimas, reduzem o corante TTC (Cloreto de
2,3,5-trifeniltetrazólio), incolor, originando o formazano, que fica acumulado no
interior dos grânulos das células, resultando na alteração da coloração do meio para
rósea e segundo Stoppa et al. (2009) a Resazurina (7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona10-óxido) de cor azul é oxidada na presença de células viáveis à resofurina,
substância de coloração vermelha, facilitando a verificação da presença de
crescimento microbiano como pode ser observado na Figura 15.
60
A
B
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C4
C4
C5
C6
C5
C6
Figura 15: Placas de determinação da concentração inibitória mínima. Representação da diluição em
série do extrato metanólico bruto da flor de A. satureoides: (A) Colunas 1-3 contra E. coli, não
-1
-1
apresentou atividade CIM 5,0 mg.mL ; Colunas 4-6 contra S. aureus CCMB 262 CIM < 0,15 mg.mL
-1
e Colunas 7-9 contra S. aureus CCMB 263 CIM 0,15 mg.mL ; (B) Colunas 1-3 contra Salmonella sp.
-1
CCMB 281, não apresentou atividade CIM 5,0 mg.mL , Colunas 4-6 contra B. cereus CCMB 282 CIM
-1
-1
0,15 mg.mL e Colunas 7-9 contra E. coli CCMB 284, não apresentou atividade CIM 5,0 mg.mL . C1,
C2 e C3: controle do crescimento do micro-organismo-teste; C4: Controle do extrato e C5 e C6:
Controle do meio de cultura (CMH).
A Tabela 6 apresenta os resultados da atividade antimicrobiana dos extratos
das diferentes partes vegetais das espécies de Asteraceae frente às cepas Grampositivas: S. aureus CCMB 262, S. aureus CCMB 263, B. cereus CCMB 282; Gramnegativas: E. coli CCMB 261, E. coli CCMB 284, P. aeruginosa CCMB 268,
Salmonella sp. CCMB 281 e às leveduras: C. albicans CCMB 286, C. krusei CCMB
287 e C. parapsilosis CCMB 288.
61
-1
Tabela 6: Resultados das concentrações inibitórias mínimas (mg.mL ) dos extratos metanólicos
brutos das espécies de Asteraceae avaliadas
S.a
*
S.a
B.c.
E.c.
E.c.
P.a.
S.sp.
C.a.
C.k.
C.p.
263*
282*
261*
284*
268*
281*
286*
287*
288
*
Extratos
262
Raiz
2,5
1,25
1,25
5,0
5,0
2,5
2,5
2,5
0,078
1,25
Achyrocline
Caule
2,5
2,5
2,5
5,0
5,0
2,5
5,0
2,5
0,625
5,0
satureoides
Flor
0,15
0,15
0,15
5,0
5,0
5,0
5,0
2,5
0,078
5,0
Folha
2,5
5,0
5,0
5,0
5,0
2,5
5,0
2,5
0,15
5,0
conyzoides
Flor
2,5
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
Baccharis
Raiz
2,5
5,0
2,5
5,0
5,0
5,0
5,0
1,25
5,0
5,0
trimera
Caule
2,5
10
2,5
5,0
5,0
5,0
5,0
2,5
5,0
5,0
Bidens
Raiz
2,5
10
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
2,5
2,5
5,0
pilosa
Caule
1,25
5,0
2,5
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
Fruto
2,5
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
Porophyllum
Caule
5,0
10
2,5
10
5,0
5,0
5,0
2,5
2,5
2,5
ruderale
Fruto
5,0
5,0
2,5
5,0
10
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
Controle
1
0,31
0,62
0,15
0,15
10
0,31
10
N/A
N/A
N/A
2
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
10
0,078
10
Espécies
Ageratum
Controle
* número de identificação dos micro-organismos pela Coleção de Cultura de Micro-organismos da Bahia (CCMB); B.c.- Bacillus
cereus, C.a. – Candida albicans, C.k. – Candida Kruzei, C.p. – Candida parapsilosis, E.c. – Escherichia coli, P.a. –
Pseudomonas aeruginosa, S.a. – Staphylococcus aureus e S. sp.- Salmonella sp.1: Cloranfenicol; 2: Nistatina. N/A- Não se
aplica.
Pela técnica de determinação da CIM, os 12 extratos confirmaram a atividade
observada pela técnica de difusão em disco e, além disso, inibiu, em extensões
variadas, o crescimento de micro-organismos que não se demonstraram inicialmente
sensíveis pela metodologia da difusão em disco. Esta variação pode ser justificada
pela presença de diferentes substâncias nas amostras, pois moléculas mais polares
ou de maior massa molecular podem ser mais solúveis e de mais fácil dispersão em
meio líquido (VALGAS et al., 2007). Há descrição de vários métodos para
demonstrar a atividade antimicrobiana dos extratos de produtos naturais, sendo que
os diferentes métodos não são igualmente sensíveis. Os resultados obtidos no
presente estudo corroboram outros trabalhos (VANDEN BERGHE; VLIETINCK,
1991, VALGAS et al., 2007), no sentido de que as metodologias utilizadas para a o
estudo de atividade antimicrobiana são influenciadas pelos micro-organismos
usados para realizar o teste, pelo método selecionado e pelas características de
solubilidade de cada substância (RIBEIRO et al., 2001; HERSCHLER, 1970).
62
As bactérias Gram-positivas S. aureus CCMB 262 e B. cereus 282 foram as
mais sensíveis aos extratos metanólicos testados e as menos sensíveis S. aureus
263, confirmando a tendência de suscetibilidade observada no teste da difusão
(Tabela 5). Porém, em relação às bactérias gram-negativas, na metodologia de
difusão em disco não apresentou nenhuma atividade e no CIM apresentou para
duas, P. aeruginosa e Salmonella sp. Segundo alguns autores (TORTORA et al.,
2000; BLACK 2002; LOGUERCIO et al., 2005) a diferença de atividade contra
bactérias Gram-positivas e Gram-negativas parecem derivar da constituição da
parede celular bacteriana, composta por peptideoglicano, polímero complexo, além
desta estrutura, as bactérias Gram-negativas apresentam uma membrana externa
que confere a este grupo de micro-organismos uma efetiva barreira de
permeabilidade, restringindo a penetração de alguns compostos. O conhecimento
das diferenças entre as paredes de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas é da
mais alta relevância para o estudo do mecanismo de ação dos quimioterápicos, de
patogenicidade e de outros tantos assuntos relacionados diretamente à composição
química e estrutura da parede bacteriana (SCHAECHTER et al., 2002).
O extrato da flor de A. satureoides e o caule de B. pilosa apresentaram a
menor CIM para a S. aureus CCMB 262 (0,15 e 1,25 mg.mL-1, respectivamente),
assim como os extratos da flor e raiz de A. satureoides também apresentaram
valores baixos de CIM (0,15 e 1,25 mg.mL-1, respectivamente) para B. cereus CCMB
282. O extrato da raiz de A. satureoides apresentou também inibição para S. aureus
CCMB 263 (1,25 mg.mL-1) que não foi observado pela metodologia de difusão em
disco. Já em relação às bactérias Gram-negativas, que pela técnica de difusão em
disco não tinham sido inibidas, foi determinada a CIM para P. aeruginosa (2,5
mg.mL-1) dos extratos da raiz e caule de A. satureoides e folha de A. conyzoides.
Para Salmonella sp. CCMB 281 foi determinada a CIM (2,5 mg.mL-1) do extrato da
raiz de A. satureoides. O mesmo comportamento de menor sensibilidade, em
comparação as bactérias Gram-positivas, foi verificado nos testes de determinação
da CIM dos extratos frente às leveduras C. albicans CCMB 286, C. krusei CCMB 287
e a C. parapsilosis CCMB 288. C. albicans apresentou valores de CIM, variando de
1,25 (menor) a 2,5 (maior) mg.mL-1, C. parapsilosis apresentou valores de CIM,
variando de 1,25 (menor) a 2,5 (maior) mg.mL-1 e C. krusei apresentou os menores
valores de CIM variando entre 0,078 (menor) a 2,5 (maior) mg.mL-1, enquanto que
pela técnica de difusão em disco apenas C. albicans havia sido inibida. Embora a
63
mesma tendência de maior sensibilidade das bactérias Gram-positivas, em relação
às Gram-negativas e às leveduras, tenha sido observada nos dois métodos de
investigação da atividade antimicrobiana, CIM variáveis foram obtidos para alguns
dos micro-organismos considerados resistentes aos extratos no teste de difusão em
disco, como no caso das bactérias Gram-negativas (P. aeruginosa e Salmonella
sp.).
As variações referentes à determinação da CIM de extratos de plantas podem
ser atribuídas a vários fatores. Dentre eles podemos citar a técnica aplicada, o
micro-organismo e a cepa utilizada no teste, à origem da planta, a época da coleta,
se os extratos foram preparados a partir de plantas frescas ou secas e a quantidade
de extrato testada. Assim, não existe método padronizado para expressar os
resultados de testes antimicrobianos de produtos naturais (FENNEL et al., 2004 ;
OSTROSKY et al., 2008).
No presente trabalho, como o controle do DMSO na CIM apresentou atividade
antimicrobiana, é possível que a inibição do crescimento microbiano possa ter
sofrido interferência deste solvente. Não podemos descartar a possibilidade de o
DMSO ter causado por si ou efeito potencializador da atividade antimicrobiana do(s)
composto(s) do extrato (RIBEIRO et al., 2001; HERSCHLER, 1970). Vários trabalhos
descrevem a ação permeante do DMSO em membranas biológicas, bem como sua
utilização como potencializador de drogas antibacterianas, antifúngicas, antivirais e
antiparasitárias (RIBEIRO et al., 2001). Por isso, no presente estudo, foram
considerados como resultados representativos de CIM valores iguais ou inferiores a
2,5 mg.mL-1 do extrato testado, ou seja, concentrações menores ou iguais ao
observadas para o DMSO, equivalente a 5,00 mg.mL-1 na determinação da CIM.
A técnica de diluição para determinação de concentrações inibitórias mínimas
(CIM) junto com outros sistemas de diluição de antibióticos é considerada,
frequentemente, como a melhor metodologia para a avaliação de suscetibilidade ou
de resistência das bactérias aos antimicrobianos (ALVES et al., 2008). O teste de
suscetibilidade de difusão em disco (BAUER-KIRBY, 1966) é considerado, também,
ser de confiança e por ser mais flexível do que a diluição, ele é utilizado
frequentemente como um sistema preliminar ou backup em laboratórios clínicos
(OSTROSKY et al., 2008). Entretanto a CLSI não recomenda o relatório quantitativo
de resultados da difusão em disco, embora o diâmetro da zona em milímetros
correlacione muito bem com o log2 da CIM em µg.mL-1, segundo Fekete et al.
64
(1994). O método da difusão é mais adequado, segundo Alves et al. (2008) para
compostos polares de tamanho molecular pequeno e médio e para determinar o
espectro antimicrobiano, pois neste teste podem ser utilizados vários compostos
contra um micro-organismo. Embora a técnica de difusão em disco seja amplamente
utilizada e recomendada como método de triagem antimicrobiana; segundo Rios e
Recio (2005), para extratos apolares, o uso de técnicas de difusão parece ser
inadequado. O método da diluição é a melhor maneira de determinar a concentração
inibitória de uma amostra, mas a solubilidade do composto no meio é um requisito
óbvio (ALVES et al., 2008).
Considerando-se a atividade das diferentes partes estudadas das plantas
(extratos da raiz, caule, folha, flor e fruto), foi possível notar que, no geral, as
melhores atividades dos extratos de raiz e caule aconteceu contra a bactéria S.
aureus e as leveduras C. albicans e C. krusei, o que corrobora os dados de Cechinel
Filho e Yunes (1998), sobre a variação na constituição química que pode ocorrer
entre as distintas partes da planta. Essa diferença, no entanto, não foi perceptível
para as bactérias Gram-negativas (Tabela 6). Segundo Raven et al. (2007), os
compostos secundários não estão uniformemente distribuídos pela planta, sendo
frequentemente sintetizados em uma parte da planta e armazenados em outra.
A espécie A. satureoides, a “macela do campo’”, foi a que apresentou
melhores resultados de atividade antimicrobiana tanto na difusão em disco como na
CIM, confirmando trabalhos na literatura (descritos a seguir) referentes a esta
espécie. Segundo Wiest et al. (2009) esta espécie apresentou os melhores
resultados de atividade anti-estafilocócica que ele classificou como máxima, dentre
as 39 plantas que deram resultados positivos, como também Mota (2008) estudando
a atividade antibacteriana in vitro da inflorescência desta espécie, observou a
inibição do extrato contra S. aureus confirmando assim seus melhores resultados
para S.aureus no presente trabalho. Sua atividade antimicrobiana contra Salmonella
sp. também foi confirmada por Bettega et al. (2004) estudando a atividade
antibacteriana do extrato vegetal (decocto) frente a micro-organismos de interesse
em Medicina veterinária. Para as leveduras A. satureoides teve os melhores
resultados do CIM. A raiz, caule e flor apresentaram CIM: 2,5 mg.mL-1 para C.
albicans e 0,078 (menor) a 0,625 (maior) para C. krusei. Em relação a C.
parapsilosis somente a raiz apresentou atividade com CIM de 1,25 mg.mL-1. Com
parando com dados da literatura, segundo Sartoratto (2006) a espécie A.
65
satureoides apresentou atividade antimicrobiana contra C. albicans com CIM >2,0
mg.mL-1.
Duarte et al. (2005), trabalhando com extratos e óleos essenciais de B.
trimera, a carqueja, propôs uma classificação da atividade antimicrobiana como:
forte atividade (MIC ≤ 0,5 mg/mL-1), moderada atividade (MIC 0,51- 1,0 mg/mL-1) e
fraca atividade (MIC ≥ 1,0 mg/mL-1). Aplicando esta classificação nos resultados do
presente trabalho, pode-se verificar que a espécie em questão apresentou uma
moderada atividade contra S. aureus, B. cereus com MIC variando de 1,25 (menor) 2,5 (maior) mg.mL-1. Segundo Picoli et al. (2007) são poucos estudos que relatam a
atividade e a CIM dos extratos e óleos essenciais da carqueja frente a leveduras. No
presente trabalho, B. trimera apresentou atividade antimicrobiana fraca com CIM
1,25 mg.mL
-1
(menor) e 2,5 mg.mL-1 (maior) da raiz e do caule, respectivamente
frente a C.albicans.
Kambij et al. (2008) e Batish et al. (2009), avaliando o extrato metanólico (CIM
variando entre 25 mg/mL-1 (menor) a 100 mg/mL-1 (maior) da planta inteira de A.
conyzoides, o mentrasto, observaram que o mesmo apresentou atividade
antimicrobiana contra S. aureus, E. coli e P. aeruginosa. No presente estudo,
atividade foi confirmada para S. aureus e P. aeruginosa, ambos inibidos com CIM de
2,5 mg/mL-1pelos extratos da folha e flor para S. aureus e folha para P. aeruginosa.
Alguns autores (MACHADO NETO et al., 1988; Haida et al., 2007; Schuch,
2008) têm se referido à atividade antimicrobiana de B. pilosa, o picão preto, como
sendo maior frente às bactérias Gram-positivas, como S. aureus. Este fato também
pôde ser observado no presente trabalho, pois todas as suas partes vegetais (raiz,
caule e fruto) testadas apresentaram atividade antimicrobiana fraca contra S.
aureus, com CIM variando entre 1,25 mg/mL-1 (menor) – 2,5 mg/mL-1 (maior).
Em relação à espécie P. ruderale, a arnica, poucos são os trabalhos de
atividade antimicrobiana, na literatura, a mais recente, de Rondon et al. (2008)
estudando a atividade antimicrobiana do óleo essencial, apresentou inibição contra
S. aureus (CIM 20 µg/mL), E. coli (CIM 100µg/mL) e P. aeruginosa (CIM 200µg/mL).
Na literatura científica é possível encontrar também trabalhos em relação à
composição química dos óleos essenciais, anatomia e estudo espectofométrico
(Duarte et al, 2007; Rosa et al., 2008; Fonseca et al., 2007). No presente trabalho P.
ruderale apresentou bons resultados de CIM, pois inibiu o crescimento de B. cereus
(bactéria Gram-positiva) (2,5 mg/mL-1) e as três leveduras com CIM de 2,5 mg/mL-1.
66
4.4 DETERMINAÇÃO DA TRIAGEM FITOQUÍMICA DOS EXTRATOS
A pesquisa fitoquímica tem por objetivo conhecer os constituintes químicos
das espécies vegetais ou avaliar a sua presença. Quando não se dispõe de estudos
químicos sobre as espécies de interesse, a análise fitoquímica preliminar pode
indicar os grupos de metabólitos secundários relevantes na mesma. Caso o
interesse esteja restrito a uma classe específica de constituintes ou ás substâncias
responsáveis por uma certa atividade biológica, a investigação deverá ser
direcionada
para
o
isolamento
e
a
elucidação
estrutural
das
mesmas
(FALKENBERG et al., 2000). Embora uma planta possa conter centenas de
metabólitos secundários, apenas os compostos presentes em maior concentração
são geralmente isolados e estudados pela fitoquímica clássica. A análise de
substâncias ativas é muito mais complexa e longa, já que geralmente os compostos
presentes em menor proporção na planta são os que apresentam melhores efeitos
biológicos. É indispensável a análise da potência das frações e das substâncias
puras em relação à sua concentração, pois esta avaliação permite dizer se o
principal componente químico responsável pela atividade biológica foi realmente
determinado (CECHINEL FILHO; YUNES, 2001).
De acordo com Adwan et al. (2006) e Maciel et al. (2002), as plantas contêm
inúmeros constituintes, e seus extratos, quando testados, podem apresentar efeitos
sinérgicos entre os diferentes princípios ativos devido à presença de compostos de
classes ou estruturas distintas que podem interagir contribuindo para a mesma
atividade.
A constituição química de espécies vegetais pode ser influenciada
qualitativamente e quantitativamente por variações climáticas, com repercussão
direta sobre a atividade biológica (NASCIMENTO et al., 2008).
A atividade antimicrobiana dos extratos está relacionada à presença dos
agentes antimicrobianos em concentrações variadas após o processo de maceração
dos extratos. Desta forma, para se verificar o perfil químico dos extratos, e visando
estudos posteriores de isolamento dos antimicrobianos, a determinação das classes
de metabólitos presentes nas mesmas foi realizada por cromatografia em camada
delgada (CCD), utilizando reveladores para visualização de terpenos e esteróides
(Reagente Anisaldeído-Ácido Sulfurico- AS), de alcalóides (Reagente Dragendorff
67
com Ácido Clorídrico- DRG), de triterpenos e esteróides (Reagente Liebermann
Burchard - LB), de cumarinas (Reagente Hidróxido de Potássio- KOH) e flavonóides
(Reagente Produtos NaturaisPolietilenoglicol NP/ PEG). Os resultados da triagem
fitoquímica estão apresentados na Figura 16 e 17 e sumariados na Tabela 7.
A
D
C
B
E
F
Figura 16: Cromatogramas dos extratos das espécies: B. trimera (Caule) P. ruderale (Caule e Fruto)
e A. satureoides (Flor), B. trimera (Raiz), B. pilosa (Caule), nesta ordem: (A) e (B) Tratamento com
Reagente AS à luz visível; (C) e (D) Tratamento com Reagente LB à luz visível e (E) e (F) Tratamento
com Reagente NP/PEG à luz UV365.
Na Figura 16A e 16B, com tratamento com Reagente AS, apresentou
indicativo de terpenos/esteróides à luz visível, após aplicação do reagente e
aquecimento a 100°C por 10 minutos, evidenciado pel a presença de zonas típicas
desta classe de compostos por toda a placa. As colorações das zonas variaram de
alaranjadas (com RF≈0,7 na amostra 1, por exemplo), amarelo-marronzadas (com
RF≈0,66 na amostra 2, por exemplo), bem como manchas rosas podendo ser indício
de esteróides e triterpenos (WAGNER, BLADT, 1995). Na figura 16C e 16D, com
tratamento
com
Reagente
LB
à
luz
visível,
apresentou
indicativo
de
triterpenos/esteróides, após aplicação do reagente e aquecimento a 100°C por 10
minutos houve o aparecimento de zonas marrons com RF≈0,75. Na Figura 16E e
16F, tratamento com Reagente NP/PEG a maioria das zonas intensificaram a
fluorescência após a aplicação deste reagente e visualização em luz UV365 nm,
68
podendo ser indicativo de flavonóides (zonas amarelas, amarelo-esverdeadas,
amarelo-alaranjadas) com RF ≈ 1,0 (WAGNER, BLADT, 1995).
A
B
C
D
E
F
Figura 17: Cromatogramas dos extratos das espécies: A. conyzoides (Folha e Flor), B. pilosa (Raiz e
Fruto) e A. satureoides (Raiz e Caule), nesta ordem: (A) e (B) Tratamento com Reagente AS à luz
visível; (C) e (D) Tratamento com Reagente LB à luz visível e (E) e (F) Tratamento com Reagente
NP/PEG à luz UV365.
Na Figura 17A e 17B, com tratamento com Reagente AS, apresentou
indicativo de terpenos/esteróides à luz visível, após aplicação do reagente e
aquecimento a 100°C por 10 minutos, evidenciado pel a presença de zonas típicas
desta classe de compostos por toda a placa. As colorações das zonas variaram de
azul (com RF≈0,6 na amostra 1, por exemplo) a violeta(com RF≈0,66 na amostra 2,
por exemplo), bem como manchas rosas podendo ser indício de esteróides e
triterpenos (WAGNER, BLADT, 1995). Na figura 17C e 17D, com tratamento com
Reagente LB à luz visível, apresentou indicativo de triterpenos/esteróides, após
aplicação do reagente e aquecimento a 100°C por 10 minutos houve o aparecimento
de zonas marrons com RF≈0,70 a cinza com RF≈0,57.
Na Figura 16E e 16F,
tratamento com Reagente NP/PEG a maioria das zonas intensificaram a
fluorescência após a aplicação deste reagente e visualização em luz UV365 nm,
podendo ser indicativo de flavonóides (zonas amarelo-esverdeadas) com RF ≈ 0,30
para amostra 1 e RF ≈ 0,70 para amostra 2 (WAGNER, BLADT, 1995).
69
Tabela 7: Resultado da triagem fitoquímica dos extratos das diferentes partes vegetais das espécies
de Asteraceae
NP/PEG
Flavonóides
KOH
Antraquinona
se
Cumarinas
LB
Triterpenos
e
Esteróides
Amostras
vegetais
DRG
Alcalóides
Terpenos
e
Esteróides
AS
Raiz
+
-
+
-
+
Achyrocline
Caule
+
-
+
-
+
satureoides
Flor
+
-
+
-
+
Ageratum
Folha
+
-
+
-
+
conyzoides
Flor
+
-
+
-
+
Baccharis
Raiz
+
-
+
-
+
trimera
Caule
+
-
+
-
+
Raiz
+
-
+
-
+
Caule
+
-
+
-
+
Fruto
+
-
+
-
+
Porophyllum
Caule
+
-
+
-
+
ruderale
Fruto
+
-
+
-
+
Bidens pilosa
(+) presença das classes de compostos relacionada ao reagente; (-) ausência da classe de composto relacionada ao reagente
Considerando os resultados dos reveladores químicos, apresentados na
tabela 7, é possível sugerir a presença de terpenos, triterpenos, esteróides e
flavonóides. Estas classes de compostos detectadas estão de acordo com a
composição química esperada, conforme relatado na literatura (SILVA et al. 2006;
VENDRUSCOLO et al, 2005; CASTRO et al., 2004; VERDI et al., 2005; MOREIRA et
al., 2004), pois destas espécies já foram isolados ou identificados monoterpenos,
diterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, cumarinas, esteróides, flavonóides, ácido
fenólicos.
A resposta negativa para cumarinas principalmente nos extratos de A.
conyzoides e B. trimera foi um resultado inesperado, uma vez que diversos trabalhos
70
citam a sua presença (CASTRO et al., 2004; VERDI et al., 2005). No entanto,
Cimanga et al. (2004) verificaram variações qualitativas e, principalmente,
quantitativas desta classe, as quais foram atribuídas à influência das condições
dessas espécies vegetais pode ser diferente, dependendo do ambiente.
Todas as espécies estudadas apresentaram perfis semelhantes para algumas
classes de metabólitos, tanto pela presença, caso flavonóides, terpenos, triterpenos
e
esteróides
quanto
pela
ausência
de
alguns
grupos,
como
alcalóides,
antraquinonas e cumarinas. É importante destacar que segundo Cowan (1999),
estudos fitoquímicos pertencentes a maioria destas classes, possivelmente
presentes nos extratos testados, podem apresentar ação antimicrobiana. Os
terpenos são compostos ativos contra bactérias, fungos, vírus e protozoários. O
mecanismo de ação não é inteiramente compreendido, mas especula-se que
envolve o rompimento da membrana pelos compostos lipofílicos. Diversos
flavonóides também têm propriedades antimicrobianas, são conhecidos por serem
sintetizados pelas plantas em resposta à infecção microbiana, não devendo ser
surpresa que, em testes in vitro, esses compostos apresentem ação antimicrobiana
eficaz contra muitos micro-organismos. Sua atividade é, provavelmente, devido a
sua habilidade em complexar com proteínas extracelulares e solúveis e em
complexar com as paredes celulares bacterianas, como para quinonas. Os
flavonóides mais lipofílicos podem também romper as membranas microbianas
(COWAN, 1999).
A maioria dos extratos formou manchas não havendo a formação de uma
banda bem característica, isso pode ser explicado, pois extratos metanólicos brutos
possuem muitos compostos misturados como açúcares, ácidos graxos, que
dificultam sua corrida diferente daqueles extratos que são obtidos a partir da partição
liquido-liquido.
Embora nas amostras analisadas, não se possa apontar ainda qual o(s)
composto(s) responsável(is) pela atividade antimicrobiana, pois estudos posteriores
de isolamento e identificação dos princípios ativos são necessários, é possível
indicar que os extratos metanólicos das diferentes partes vegetais das espécies de
Asteraceae como as mais promissoras na busca de novos antibióticos, pela ação
antimicrobiana observada e pela presença de metabólitos potencialmente ativos.
71
5 CONCLUSÕES
Nas condições experimentais utilizadas neste trabalho podemos concluir que:
As diferentes partes vegetais raiz, caule, folha, flor e fruto, quando
presentes, das espécies avaliadas (Achyrocline satureoides, Ageratum
conyzoides, Baccharis trimera, Bidens pilosa e Porophyllum ruderale)
selecionadas através de pesquisa randômica, apresentam componentes
antimicrobianos que podem ser extraídos por solvente metanólico com
atividade frente a pelo menos uma bactéria gram-positiva, gram-negativa e
levedura;
Dos 19 extratos testados 12 apresentaram atividade contra 8 dos 10
micro-organismos utilizando-se o método da Concentração Inibitória Mínima,
demonstrando maior sensibilidade desta técnica; sendo que os resultados
obtidos pela CIM (organismos mais sensíveis) corroboraram com os achados
da metodologia da difusão em disco;
Pela técnica do CIM os 12 extratos metanólicos brutos demonstraram
atividade, com concentrações variando de 0,078 a 2,5 mg.mL-1, sendo mais
eficientes contra B. cereus CCMB 282, S. aureus CCMB 262, C. albicans
CCMB 286 e C. krusei CCMB 287;
O estudo da triagem fitoquímica sugere a presença de terpenos,
triterpenos, esteróides e flavonóides com atividade antimicrobiana;
Os resultados obtidos neste trabalho apontam o potencial antimicrobiano
das espécies, porém outros trabalhos deverão ser realizados para a
complementação destes estudos e aplicações, com isolamento dos possíveis
agentes antimicrobianos.
72
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