Rosa, Viviane de Souza_M

Viviane de Souza Rosa
"Caracterização da expressão de Coup-TFII durante o início
da diferenciação de células-tronco embrionárias"
Campinas, 2015
i
ii
iii
iv
v
vi
Resumo
Células-tronco embrionárias (CTE) são células indiferenciadas que possuem a capacidade
de (1) se proliferarem indefinidamente (auto-renovação) e, quando induzidas, (2) darem
origem a qualquer tipo celular presente no embrião (pluripotência). Uma das abordagens
mais comumente utilizadas para o estudo de diferenciação de CTE é através da formação de
agregados multicelulares esféricos denominados corpos embrióides (CE). CE passam por
um processo de morfogênese semelhante ao observado em embriões, originando derivados
dos três folhetos germinativos. Durante o desenvolvimento embrionário, a formação e o
posicionamento dos três folhetos ocorre por um processo altamente coordenado que
culmina na formação de um embrião polarizado no eixo anteroposterior. Entretanto, um dos
grandes desafios de pesquisas que envolvem o uso da diferenciação de CTE em CE é
encontrar indícios de que esses processos são recapitulados in vitro e se entender como que
células derivadas dos folhetos germinativos, que no embrião ocorrem de forma altamente
organizada, são originadas em estruturas celulares sem nenhuma organização global
evidente, como visto em CE. Coup-TFII (Chicken ovalbumin upstream promotertranscription factor II) é um fator de transcrição o qual possui um papel fundamental na
regulação do desenvolvimento embrionário e na aquisição de destinos celulares específicos
durante a diferenciação de CTE. Utilizando CE como um modelo de estudo, caracterizamos
a expressão de Coup-TFII e seu possível envolvimento durante a determinação de destinos
celulares. Nossos resultados identificaram uma expressão hemisférica de Coup-TFII em CE
em etapas inicias do processo de diferenciação. Esta observação nos levou a caracterizar a
distribuição espacial de marcadores moleculares tecido-específicos nos CE em relação à
expressão hemisférica de Coup-TFII. Interessantemente, praticamente todas as células
identificadas como precursores mesodérmicos e precursores neuroectodérmicos, através da
expressão de Brachyury-T e Nestin, respectivamente, estão contidas nas população de
células Coup-TFII-positivas. Estes resultados sugerem a existência de um mecanismo de
organização global intrínseco nas CTE, onde a expressão de Coup-TFII parece segregar os
CE em dois hemisférios e, provavelmente de forma antagônica com Oct4, determinaria
diferentes destinos celulares ainda em fases iniciais da diferenciação.
vii
viii
Abstract
Embryonic stem cells (ESC) are undifferentiated cells that have the ability to (1) proliferate
indefinitely (self-renewal) and when induced, (2) give rise to any cell type present in the
embryo (pluripotency). One of the most commonly used approaches for the study of ESC
differentiation is through the formation of spherical multicellular aggregates called
embryoid bodies (EB). EB undergo a process similar to that observed in morphogenesis
embryos, giving derivatives of three germ layers. During embryonic development,
formation and placement of the three germ layers is a highly coordinated process by which
culminates in the formation of a polarized embryo in the antero-posterior axis. However,
one of the great challenges of research involving the use of ESC differentiation in EB is to
find evidence that these processes are recapitulated in vitro and in understanding how to
cells derived from the germ layers that occurs in the embryo highly organized manner
originate on cellular structures with no apparent global organization, as seen in the EB.
COUP-TFII (chicken ovalbumin promoter-upstream transcription factor II) is a
transcription factor which plays a key role in the regulation of embryonic development and
determination of specific cell fates during differentiation ESC. Using EB as a model
system, we characterized the expression of Coup-TFII and its possible involvement in the
determination of cell fates. Our results identified a hemispheric expression of Coup-TFII in
EB at the onset of differentiation. This observation led us to characterize the spatial
distribution of tissue-specific molecular markers in EB in relation the hemispheric
expression of Coup-TFII. Interestingly, practically all cells identified as mesodermal and
neuroectodermal precursors by the expression of Brachyury-T and Nestin, respectively, are
contained in the COUP-TFII-positive cell population. These results suggest the existence of
a mechanism of global organization intrinsic to ESC, where the expression of Coup-TFII
segregates the EB into two hemispheres and probably antagonistically with Oct4, determine
different cell fates still in early stages of differentiation.
ix
x
Sumário
DEDICATÓRIA .......................................................................................................... xiii
AGRADECIMENTOS ....................................................................................................... xv
LISTA
DE
ABREVIATURURAS...............................................................................xvii
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ xxi
LISTA DE TABELAS ..................................................................................................... xxiii
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
1.1. Revisão Bibliográfica ................................................................................................... 4
1.1.1. Regulação da pluripotência em CTE murinas ......................................................... 4
1.1.2. Determinação de Destinos Celulares ...................................................................... 9
1.1.3. Formação de CE.................................................................................................... 12
1.1.4. Coup-TFII.............................................................................................................. 17
2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 21
2.1. Objetivo Geral ............................................................................................................ 21
2.2. Objetivos Específico ...................................................................................................21
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 23
3.1. Cultivo das CTE E14-TG2a ....................................................................................... 23
3.2. Diferenciação das CTE E14-TG2a - Método Hanging Drop ..................................... 23
3.3. Imunofluorescência .................................................................................................... 24
3.4. Citometria de Fluxo .................................................................................................... 26
3.5. Extração de RNA e síntese de cDNA ........................................................................ 27
3.6. Real Time PCR .......................................................................................................... 28
3.7. Hibridação in situ (HIS) ............................................................................................. 30
xi
3.8. Análise Estatística ...................................................................................................... 32
4. RESULTADOS ................................................................................................................33
4.1. Caracterização do padrão de expressão de Coup-TFII em CE em diferenciação ...... 33
4.2. Comparação da localização de Coup-TFII com marcadores de precursores dos
folhetos embrionários .......................................................................................................... 49
5. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 55
5.1. Padrão hemisférico de expressão de Coup-TFII em CE ............................................ 55
5.2. Aspectos específicos da expressão de Coup-TFII em CE .......................................... 65
5.2.1. Relação temporal com o desenvolvimento embrionário ....................................... 65
5.3. Influências na organização celular/tecidual dos CE ................................................. 67
5.3.1.Expressão dos fatores de pluripotência nas CTE ................................................... 67
5.3.2. Composição do meio de cultura ............................................................................ 68
5.3.3. Número inicial de células compondo os CE .......................................................... 69
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 71
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 73
xii
Aos meus pais pelo amor incondicional,
exemplo e confiança.
xiii
xiv
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus pela oportunidade de poder fazer o que amo e de sempre
iluminar meu caminho.
Aos meus pais pelo amor, dedicação, ensinamentos e acima de tudo por sempre apoiarem
minhas escolhas e acreditarem que sou capaz. Ao meu irmão Fabrício, pelo apoio e força,
de sempre e a Mirtes, ex-prima e amiga pela ajuda essencial que possibilitou minha
chegada até aqui.
Aos tantos amigos que de alguma forma contribuíram para que eu não enlouquecesse
durante o mestrado, Yanna, Jéssica, Paula, Michele, Isabel, Thiago, Beto, Déia, Belleza,
Lucas e Sílvio e aos que mesmo por um curto período de tempo compartilharam um espaço
em casa, Ivana, Luanda, Silvânia e Mauro, meu muito obrigada pelas conversas, risos,
lágrimas e principalmente pela infinita paciência.
As divas e agora divos da sala de pós-graduação, Bianca, Paula, Lucimara, Marina,
Fernanda, Carol, Mariana, Valquiria, Amanda, Luis, Bruno e Diego, obrigada pela
companhia e gordices, quase que diárias e por tornarem os dias no DHE tão divertidos e
únicos. E aos amigos de copa ou corredor, Cíntia, Dani, Ricardo, Marília, Mainara e
Bárbara.
A Natália, gerenciadora do departamento e amiga, muito obrigada pela ajuda em tudo e
desculpa a bagunça quase que frequente que a minha pessoa consegue fazer. Não sei o que
seria desse departamento sem você rs.
A Lucimara pela enorme ajuda com a In Situ, biologia molecular e com os textos e ao Luís,
que chegou recentemente e ganhou muitas reações de PCR. A Carolina Francelin, pela
ajuda na realização da Citometria, Isabela pelo auxilia na cultura e ao Guilherme Barbosa,
pelas minúsculas dicas que sempre salvam meus experimentos. Muitíssimo obrigada.
xv
Ao INFABIC, nas pessoas da Mariana e do Vitor, pela disponibilidade, disposição e
principalmente pelas lindas imagens.
A professora Marilene Lopes e sua aluna Líliam Cruz, pelo auxílio com anticorpos e
lâminas nas etapas finais do trabalho, muito obrigada.
A todos os docentes do Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual, por terem
disponibilizado espaços para o desenvolvimento desse trabalho e pela ótima convivência
nos últimos seis anos.
Ao meu orientador Henrique Marques, pela oportunidade de estar aqui e poder continuar.
Obrigada pelos ensinamentos, apoio nos momentos em que nada funciona e comemorações
quando algo da certo. Aprendi e cresci muito durante esses dois anos. Muito obrigada por
tudo.
Ao professor Paulo Joazeiro, orientador durante a Iniciação Científica, agradeço pelos
conselhos, histórias e exemplo na conduta profissional. Deixo aqui registrado meu respeito
e admiração que tenho pelo Sr.
À Lilian Panagio, secretária do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e
Estrutural, pelas informações, atenção e suporte a mim prestados.
À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia
Celular e Estrutural por terem disponibilizado espaço e oportunidades para meu
crescimento profissional.
Aos órgãos de fomento à pesquisa CNPq (processo número 134591/2013-5) e FAPESP
cujo apoio financeiro possibilitou a realização deste trabalho.
xvi
Lista de Abreviaturas
BMP4 e 2: Proteína morfogenética óssea 4 e 2, do inglês Bone morphogenetic protein
BSA: Albumina sérica bovina
cDNA: molécula de DNA complementar, do inglês Complementary DNA
CE: Corpos Embrióides
Coup-TFII: Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor II
CTE: Células Tronco Embrionárias
D: dia de diferenciação
DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole
DBD: domínio de ligação ao DNA, do inglês DNA binding domain
DEPC: dietilpirocarbonato
DMEM: Dulbeco´s Modified Eagle Medium
E: estádio embrionário
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético, do inglês Ethylenediamine tetraacetic acid
FGF/ERk: Fator de Crescimento Fibroblástico/quinase reguladora do sinal extracelular do
inglês Fibroblast growth fator/Extracellular-signal-Regulated Kinases
FGF: Fator de Crescimento Fibroblástico, do inglês Fibroblast growth fator
GMEM: Glasgow Modified Eagle´s Medium
GSK3: glicogênio sintase quinase 3, do inglês Glycogen syntase kinase 3
HIS: hibridação in situ
IF: imunofluorescência
xvii
INFABIC: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fotônica Aplicada à Biologia
Celular
JAK/ STAT3: janus quinase/ transdutor e ativador de transcrição 3, do inglês janus
kinase/Signal transducers and activators of transcription
LBD: domínio de ligação ao ligante, do inglês ligand-binding domain
LIF: fator inibidor de leukemia, do inglês Leukemia inhibitory factor
MAPK: proteína-quinases ativadas por mitógenos, do inglês mitogen-actived protein
kinases
MCI: massa Celular Interna
miRNA: microRNA
mm: milímetros
pb: pares de base
PBS: tampão fosfato salino (do inglês, phosphate buffered saline)
PFA: paraformaldeído
pH: Potencial hidrogeniônico
PI3K/AKT:
fosfatidilinositol
3-quinases/serina-treonina
quinase,
do
inglês
Phosphatidylinositol-3-OH Kinase/ Protein kinase B
RNA: Ácido ribonucleico, do inglês Ribonucleic acid
RPS29: Gene que codifica a proteína ribossomal 29
RT - PCR: Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa, do inglês Reverse
transcription polymerase chain reaction
SFB: Soro Fetal Bovino
SNC: Sistema Nervoso Central
TEM: Transição epitélio-mesênquima
xviii
TGF-β: Fatores de crescimento e transformação β, do inglês Transforming Growth Factorβ
TME: Transição mesênquima-epitélio
Wnt: importante via de sinalização, da combinação dos nomes em inglês dos genes Wg e
Int
μl: microlitros
μm: micrômetros
xix
xx
Lista de Figuras
Figura 1: Padrões de sinalização envolvidos na manutenção da pluripotência em CTE
murinas................................................................................................................................... 8
Figura 2: Formação dos três folhetos germinativos, endoderme, mesoderme e
ectoderme............................................................................................................................. 10
Figura 3: Modelo comparativo entre os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário e
a
diferenciação
de
CTE
através
da
formação
de
CE
in
vitro...................................................................................................................................... 14
Figura 4: Esquema ilustrativo do método de formação de CE, Hanging Drop.................. 24
Figura 5: Caracterização da pluripotência das CTE E14-Tg2a.......................................... 34
Figura 6: Expressão gênica relativa de Coup-TFII em CTE – E14-Tg2a e durante a
diferenciação de CE............................................................................................................ 35
Figura 7: Padrão de expressão de Coup-TFII em CE nos estádios iniciais de diferenciação
............................................................................................................................................. 36
Figura 8: Padrão de expressão de Coup-TFII em CE nos estágios tardios de
diferenciação ....................................................................................................................... 38
Figura 9: Análise comparativa da expressão de Coup-TFII em embrião e CE ................. 40
Figura 10: Localização hemisférica de Coup-TFII em CE ................................................ 41
Figura 11: Localização hemisférica de Coup-TFII observada dentre diversos CE ........... 43
Figura 12: CE D5 formados a partir de diferentes quantidades iniciais de células
apresentando expressão hemisférica de Coup-TFII ............................................................ 45
xxi
Figura 13: CE D7 formados a partir de diferentes quantidades iniciais de células
apresentando expressão hemisférica de Coup-TFII ............................................................ 46
Figura 14: CE D7 com morfologias alongadas apresentando expressão hemisférica de
Coup-TFII ........................................................................................................................... 48
Figura 15: Análise da co-expressão de Brachyury-T e Coup-TFII em CE através de
citometria de fluxo .............................................................................................................. 51
Figura 16: Análise da co-expressão de Nestin e Coup-TFII em CE através de citometria de
fluxo..................................................................................................................................... 52
Figura 17: Expressão de marcadores dos folhetos germinativos em CE ........................... 54
Figura 18: Esquema dos possíveis domínios de localização de Coup-TFII, via de
sinalização Wnt e folhetos germinativos em CE.................................................................. 63
xxii
Lista de Tabelas
Tabela 1: Descrição dos anticorpos utilizados na técnica de IF......................................... 25
Tabela 2: Descrição dos anticorpos utilizados na técnica de citometria de fluxo .............. 27
Tabela 3: Primers utilizados nos experimentos de qPCR, desenhados através do Primer
Blast ..................................................................................................................................... 30
xxiii
xxiv
1.INTRODUÇÃO
Uma das características mais importantes das células-tronco embrionárias (CTE) é a
capacidade de originarem qualquer tipo celular que compõe um organismo adulto. A
diferenciação de CTE pode ser conduzida através da formação de aglomerados celulares
esféricos, denominados de Corpos Embrióides (CE), que se assemelham a embriões no
período de pós-implantação, por apresentarem morfologia tecidual e padrões de expressão
de marcadores derivados dos três folhetos germinativos em uma relação temporal muito
próxima a embriões (Leahy et al., 1999; Itskovitz-Eldor et al., 2000; Pekkanen-Mattila et
al., 2010).
O uso das CTE como sistema modelo para o estudo da Biologia do
Desenvolvimento tem tornado possível o estudo de eventos chaves que regulam a aquisição
inicial de destinos celulares durante o desenvolvimento de embriões, resultando na geração
eficiente e reprodutível de populações celulares diferenciadas in vitro (Murry e Keller,
2008).
Durante a formação de um CE, linhagens celulares são especificadas, populações
celulares são morfologicamente identificadas e, estão presentes derivados dos três folhetos
germinativos, originados no embrião durante o processo de gastrulação. Entretanto, todas
as evidências indicavam que, em CE, a ausência de sinais intra e extra-embrionários
determinantes para a padronização dos eixos embrionários in vivo, levariam à formação dos
diferentes tipos celulares e tecidos aleatoriamente distribuídos nos CE em desenvolvimento
(Leahy et al., 1999; Pekkanen-Mattila et al., 2010; Sajini et al., 2012).
Em 2008, surgiu a primeira evidência da existência de uma organização global em
CE, com a descoberta da localização polarizada da via de sinalização Wnt/β-catenina que,
1
quando modulada, resulta na polarização anteroposterior do CE, com a formação de uma
estrutura similar à linha primitiva que apresenta sinais de transição epitélio-mesenquimal e
formação dos folhetos germinativos, em um processo muito similar à gastrulação (Ten
Berge et al., 2008).
Esta descoberta foi corroborada pelo trabalho de Marikawa et al., (2009), em
células-tronco de carcinoma embrionário mas, contestada por trabalhos mais recentes, que
se basearam na distribuição espacial, aparentemente aleatória, de marcadores dos folhetos
germinativos para sugerir que CE não são estruturas globalmente organizadas, mas sim
uma estrutura esférica formada de organizações teciduais locais, aleatoriamente distribuídas
no interior do CE (Pekkanen-Mattila et al., 2010; Sajini et al., 2012).
No presente trabalho, caracterizamos o padrão de expressão do fator de transcrição
Coup-TFII (Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor II) durante a
diferenciação de CE, devido ao seu papel fundamental durante o desenvolvimento
embrionário (Tsai e Tsai, 1997; Pereira et al., 1999; Pereira et al., 2000; Kanatani et al.,
2008; Naka et al., 2008; Boudot et al., 2011; Lin et al., 2011; Xie et al., 2011) e na
transição entre o estado indiferenciado e o comprometimento celular em CTE humanas
(Rosa e Brivanlou, 2011).
Durante o desenvolvimento, Coup-TFII, também conhecido como NR2F2, atua na
formação cardíaca, determinando a diferenciação da linhagem atrial; na formação vascular,
determinando o desenvolvimento de vasos com características venosas (Pereira et al., 1999;
Pereira et al., 2000), nas células precursoras neurais, atuando na transição entre a
diferenciação neuronal e de células da glia (Naka et al., 2008), dentre outros.
Apesar de amplamente caracterizado durante o desenvolvimento embrionário, o
papel de Coup-TFII na diferenciação de CTE foi explorado apenas por um artigo (Rosa e
2
Brivanlou, 2011), que, utilizando CTE humanas, mostrou que Coup-TFII participa de um
circuito regulatório com o fator de pluripotência Oct4 e com o micro-RNA miR302.
Durante o estado pluripotente e indiferenciado, Oct4 e miR-302 reprimem a expressão de
Coup-TFII transcricional e pós-postranscricionalmente, respetivamente. Com a transição do
estado indiferenciado para a aquisição de destinos celulares específicos, as células passam a
expressar Coup-TFII, que atua diretamente no locus gênico de Oct4, reprimindo a sua
transcrição. Além disso, durante a diferenciação de CTE humanas, Coup-TFII é
inicialmente detectado nas etapas iniciais da indução neural, sendo assim, considerado
como um dos primeiros marcadores neurais humano (Rosa e Brivanlou, 2011; Hu et al.,
2012).
Neste trabalho, identificamos um padrão de expressão hemisférico de Coup-TFII
logo no início da diferenciação de CE que sugere a presença de um mecanismo de
organização global em CE. Esta expressão localizada de Coup-TFII foi então mapeada
junto a marcadores moleculares tecido-específicos, confirmando uma relação entre CoupTFII e a segregação dos folhetos germinativos formados a partir da diferenciação de CTE
em CE.
3
1.1 Revisão Bibliográfica
1.1.1 Regulação da pluripotência em CTE murinas
Células-tronco embrionárias (CTE) são conhecidas pelo seu potencial de replicação
indefinido e habilidade para se diferenciar em todos os tipos celulares presentes no
organismo adulto, características que as definem como células com capacidade de autorenovação e pluripotência, respectivamente (Wobus, 2001; Burdon et al., 2002; Wobus e
Boheler, 2005).
CTE foram inicialmente isoladas através da massa celular interna (MCI) de
blastocistos de embriões de camundongos pré-implantados (Evans & Kaufman, 1981;
Martin, 1981). O caráter pluripotente das CTE pode ser comprovado pela reintrodução
destas células na MCI de embriões de camundongos em estádios iniciais de
desenvolvimento, uma vez que CTE irão integrar a MCI e participar do desenvolvimento
normal do animal, formando camundongos quiméricos (Gossler et al., 1986). Além disso,
se injetadas subcutaneamente em camundongos, essas células se diferenciam em teratomas,
constituídos de vários tipos celulares de origem endodérmica, mesodérmica e ectodérmica,
além de células tronco indiferenciadas (Desbaillets et al., 2000; Bratt-Leal & Carpenedo,
2009).
A manutenção dessas células no estado indiferenciado requer um equilíbrio
dinâmico entre moléculas sinalizadoras como o Fator inibidor de leucemia (LIF, do inglês
Leukemia inhibitory fator), Proteína morfogenética óssea (BMP, do inglês Bone
morphogenic protein), Wnt e fatores de transcrição como Oct3/4, Nanog e Sox2, que
mantêm a pluripotência através da repressão de programas de diferenciação (Boyer et al.,
2005; Wobus e Boheler 2005; He et al., 2009).
4
O LIF é uma glicoproteína solúvel da família das interleucinas 6 (IL-6) da classe
das citocinas. A sinalização de LIF é iniciada através da dimerização do receptor LIFRβ
com a glicoproteína transdutora de sinal gp130, os quais são responsáveis pela ativação de
duas vias que atuam na regulação da auto renovação em CTE: sinalização JAK-STAT e
PI3K/AKT (Niwa, 2001; Burdon et al., 2002; Kristensen et al., 2005; Niwa et al., 2009).
A ativação de janus kinase (JAK) leva a ativação do fator de transdução e ativador
de transcrição 3 (STAT3, do inglês Signal transducers and activators of transcription), que
é translocado para o núcleo onde controla a transcrição de genes alvos que regulam a autorenovação, como Klf4 que por sua vez ativa Sox2. A segunda via é através da ativação de
fosfatidilinositol
3-quinases/serina-treonina
quinase
(PI3K/AKT,
do
inglês
Phosphatidylinositol-3-OH Kinase/ Protein kinase B) a qual, preferencialmente, ativa Tbx3
que leva a estimulação de Nanog, como ilustrado na Fig. 1 (Niwa, 2007; Niwa et al., 2009;
Saunders et al., 2013).
Adicionalmente, LIF também atua na inibição da via de proteína-quinases ativadas
por mitógenos (MAPK, do inglês mitogen-actived protein kinases), que quando ativada
tende a promover a diferenciação celular. A inibição de MAPK conduz a ativação de Tbx3
e consequentemente Nanog. Deste modo, o balanço entre a ativação de JAK/STAT3,
PI3K/AKT e inibição das MAPK podem determinar a eficiência da auto renovação em
CTE (Burdon et al., 2002; Niwa et al., 2009).
Embora fundamental, LIF não é suficiente para manter as CTE no estado
indiferenciado de uma maneira homogênea. Em casos de cultura ausentes de fatores
presente no soro fetal bovino (SFB), LIF é insuficiente para inibir a diferenciação de CTE,
principalmente a aquisição de destinos neurais (Ying et al., 2003; Sun et al., 2006). Nessas
condições, BMP pode atuar em combinação com LIF para manter o estado pluripotente e
5
de auto-renovação das CTE. BMP4 e BMP2 atuam através da ativação de fatores Smad,
que por sua vez, ativam a transcrição de genes inibidores da diferenciação (Id). Porém, este
efeito negativo de BMP na diferenciação é dependente de LIF. Na ausência de LIF, BMP
resulta na indução da diferenciação meso e endodérmica, enquanto bloqueia a diferenciação
neural (Ying et al., 2003; Sun et al., 2006; Ying et al., 2008).
Adicionalmente, as vias de sinalização Wnt e de Fatores de Crescimento
Fibroblásticos/quinase reguladora do sinal extracelular (FGF/ERK, do inglês Fibroblast
growth fator/Extracellular-signal-RegulatedKinases) também têm sido descritas na
manutenção da pluripotência das CTE. A proteína glicogênio sintase quinase 3 (GSK3, do
inglês Glycogen syntase kinase 3) atua como um regulador negativo da sinalização Wnt,
por fosforilar β-catenina e direcioná-la à degradação. A inibição de GSK3 leva ao acúmulo
de β-catenina no núcleo, o que resulta na expressão de fatores de transcrição tais como
Oct3/4, Nanog e Rex1, os quais são essenciais na manutenção do estado pluripotente das
CTE (Sato et al., 2004; Wobus e Boheler, 2005; Sineva e Pospelov, 2010; Kirby et al.,
2012). Por outro lado, o bloqueio da sinalização FGF/ERK, responsáveis por conduzir as
CTE a entrar em um estado de transição entre a pluripotência e diferenciação, tanto para
destinos neurais quanto mesodérmicos, retém a expressão de marcadores de pluripotência
Oct4, Nanog e Rex1 (Kunath et al., 2007; Wray et al., 2010).
A inibição combinada de GSK3 e de FGF/ERK tem sido utilizada para aumentar a
eficiência do controle da pluripotência. Quando CTE são cultivadas em meio básico
contendo inibidores de GSK3 e ERK, conhecidos como 2i (dois inibidores), as células são
mantidas em um estado homogêneo de pluripotência, no qual o nível de Nanog se torna
homogêneo entre as CTE, o que não é encontrado, por exemplo, em condições de cultura na
ausência desses inibidores (Ying et al., 2008; Wray et al., 2010).
6
Esses sinais extracelulares conduzem, através de vias de sinalização, a ativação de
fatores de transcrição responsáveis por controlar a pluripotência das CTE. Oct4, Sox2 e
Nanog são definidos como fatores chaves no controle da pluripotência, atuando através de
uma rede de regulação gênica onde, além de influenciarem suas próprias transcrições
através de feedback positivo e negativo, também controlam a ativação de um conjunto de
genes alvos relacionados ao controle da pluripotência tanto in vivo quanto in vitro (Pan e
Thomson, 2007; He et al., 2009).
Níveis precisos de Oct4 são necessários para a manutenção das CTE no seu estado
indiferenciado, sendo que aumentos ou decréscimos na sua expressão conduzem a
diferenciação. A ausência desse gene, tanto em embrião quanto em CTE, leva a perda da
pluripotência e promove a diferenciação em células semelhantes a trofoectoderma (Niwa,
2001; Wobus et al., 2005; Rizzino, 2009). Por sua vez o silenciamento de Sox2 por RNA
de interferência (RNAi), também resulta em diferenciação de CTE em células de múltiplas
linhagens, incluindo trofoectoderma (Ivanova et al., 2006).
Nanog é outro fator chave na regulação da pluripotência em CTE. Durante o
desenvolvimento embrionário, Nanog atua na manutenção da pluripotência das células do
epiblasto e previne a diferenciação em endoderma primitivo. In vitro, Nanog é capaz de
manter o estado pluripotente das CTE mesmo na ausência de LIF além disso, sua ausência,
conduz as CTE à diferenciação espontânea em derivados dos 3 folhetos germinativos (Pan
e Thomson, 2007; He et al., 2009).
7
Figura 1: Padrões de sinalização envolvidos na manutenção da pluripotência em CTE murinas. LIF
atua na ativação de vias de sinalização que conduzem a transcrição de Oct4, Sox2 e Nanog, os quais formam
um complexo auto-regulatório que mantém suas próprias expressões. BMP4 atua na ativação de genes
inibidores da diferenciação (Id). Adaptado de Saunders et al., 2013.
A desregulação nesse circuito leva ao decréscimo na expressão dos fatores que
mantém a pluripotência das CTE com concomitante expressão de genes ligados a
diferenciação celular. Apesar de estar claro que os fatores que regulam a pluripotência e os
fatores que conduzem a diferenciação celular se inter-relacionam, pouco se sabe sobre os
mecanismos que regulam o balanço entre a inativação de genes de pluripotência e a
ativação de genes que direcionam a diferenciação celular (Wobus & Boheler, 2005).
8
1.1.2 Determinação do destino celular
Durante as primeiras etapas do desenvolvimento embrionário, os três folhetos
germinativos, endoderme, mesoderme e ectoderme, são originados e posicionados pelo
processo de gastrulação, caracterizado pela formação da linha primitiva no lado posterior
do embrião e migração das células do epiblasto através dessa linha. Este processo resulta na
formação da endoderme e mesoderme, enquanto que as células que não migraram através
da linha primitiva se diferenciam em derivados ectodérmicos, formando o lado anterior do
embrião. Esses movimentos morfogenéticos são controlados pela ativação e inibição de
vias de sinalização como BMP, Wnt, FGF e membros da família TGF-β (Fatores de
crescimento e transformação β, do inglês Transforming Growth Factor-β), como
Activin/Nodal, ilustrado na Fig. 2 (Hogan, 1996; Tam e Behringer, 1997; Schier e Shen,
2000; Yamaguchi, 2001; Kubiak, 2012).
In vitro, estas vias de sinalização também estão envolvidas na especificação dos
folhetos germinativos. A adição de BMP4 e a ativação da via de sinalização Nodal, através
da adição de Activina, induz a formação de mesoderme e endoderme durante a
diferenciação de CTE caracterizada pela presença de células expressando Brachyury-T
(Kubo et al., 2004; Gadue et al., 2006; Nostro et al., 2008; Turner et al., 2014). Por outro
lado, a adição de BMP4 é capaz de reprimir a diferenciação neural, enquanto FGF2 e FGF4
conduzem a aquisição de destinos neurais (Kunath et al., 2007; Thomson et al., 2011;
Turner et al., 2014).
Resultados similares são obtidos através da adição de Wnt3a no início da
diferenciação que acelera a formação de populações celulares características de linha
primitiva, originando células expressando Brachyury-T e Foxa2, enquanto também é
9
responsável pela inibição da diferenciação de neuroectoderme. Por outro lado, o bloqueio
da sinalização Wnt em CTE inibe a expressão de genes associados a diferenciação de
endoderme, mesoderme, linha primitiva e transição epitélio-mesenquimal, aumentando a
expressão de marcadores neuronais (Aubert et al., 2002; Lindsley et al., 2006; Nostro et al.,
2008; Tem Berg et al., 2008; Atlasi et al., 2012; Zhang et al., 2013).
Figura 2: Formação dos três folhetos germinativos, endoderme, mesoderme e ectoderme: vias de
sinalização e fatores de transcrição que influenciam na especificação de destinos celulares. Adaptado de
Murry and Keller, 2008.
Em cultura de CTE a utilização de ativadores e inibidores dessas vias de sinalização
estão sendo amplamente utilizados para analisar mecanismos que levam as células a
adquirirem diferentes destinos celulares. Essa análise é realizada através da relação que
10
essas vias exercem sobre a expressão de marcadores específicos que diferem entre os três
folhetos germinativos, tais como Pax6, Sox1 e Nestin que caracterizam células de origem
neuroectodérmica; Foxa2 e Gata4 identificando células endodérmicas e Brachyury-T,
utilizado como principal marcador de mesoderme (Leahy et al., 1999; Thomson et al.,
2011; Sajini et al., 2012; Turner et al., 2014).
Brachyury-T é um fator de transcrição expresso no início da gastrulação, na
mesoderme em migração, linha primitiva e notocorda, sendo regulado principalmente por
Wnt3a (Herrmann, 1991; Wilson et al.,1995; Arnold et al., 2000). Foxa2 também é um
fator de transcrição, porém expresso na endoderme definitiva, bem como na parte anterior
da linha primitiva, notocorda e endoderme definitiva, sendo comumente utilizado em
diferenciação de CTE para identificar células de origem endodérmica (Sasaki e Hogan
1993). A localização espacial desses marcadores co-expressos com a via de sinalização
Wnt, tem sido utilizada para demonstrar a possibilidade de CE recapitularem o
estabelecimento de um eixo anteroposterior, semelhante ao observado em embrião (Ten
Berge et al., 2008).
Nestin é um filamento intermediário, originalmente descrito como um marcador de
células progenitoras neurais, durante o desenvolvimento do Sistema Nervoso Central
(SNC) (Lendahl et al., 1990). Porém, sua expressão também é detectada em uma grande
variedade de tecidos durante o desenvolvimento embrionário (Wisie et al., 2004). Em
camundongos, é primeiramente expresso em tecidos neuroectodérmicos no E7 e em todo
SNC no E10 (Kaeagushi et al., 2001). Sua expressão também já foi descrita durante o
desenvolvimento de músculo esquelético (Lendahl et al., 1990, Sejersen e Lendahl, 1993),
durante a angiogênese de células endoteliais (Lardon et al., 2002) e no desenvolvimento de
ilhotas pancreáticas (Lumelsky et al., 2001; Zulewski et al., 2001).
11
Além dos padrões de sinalização envolvidos na determinação de destinos celulares,
os fatores que mantém a pluripotência, Sox2 e Oct4, podem integrar sinais externos e
controlar a seleção de linhagem celular. Células que estão se diferenciando in vitro
expressam diferentes combinações de genes de pluripotência, sendo que a sequência em
que a expressão desses genes diminui difere entre células que adquirem diferentes destinos
celulares (Thomson et al., 2011; Trott e Martinez Arias, 2013).
Análises feitas durante os primeiros dias de diferenciação em CTE murinas
demonstraram que células que mantém a expressão de Sox2 frequentemente co-expressam
Sox1, um marcador de neuroectoderme e raramente expressam Brachyury-T, marcador de
mesoendoderme. Por outro lado, células que mantém altos níveis de Oct4, co-expressam
Brachyury-T, mas não Sox1. Portanto, por modular os níveis de fatores que juntos
bloqueiam o processo de diferenciação, as células podem escolher um destino celular
específico (Thomson et al., 2011; Trott e Martinez Arias, 2013).
1.1.3 Formação de Corpos Embrióides
Um dos grandes desafios do estudo do desenvolvimento embrionário é o
entendimento das hierarquias genéticas que regem os eventos iniciais responsáveis por
coordenar a diferenciação celular durante a embriogênese. O estabelecimento de linhagens
de CTE tem possibilitado a criação de novas abordagens experimentais que visam o estudo
de populações de precursores iniciais do desenvolvimento, possibilitando assim, a
manipulação da função gênica que seria letal durante o desenvolvimento in vivo (Keller
1995; Leahy et al., 1999; Bratt-Leal & Carpenedo 2009).
12
A criação de pesquisas com CTE, tem como um dos principais objetivos induzir a
diferenciação dessas células em linhagens celulares específicas, na ausência de LIF, através
da formação de CE (Kurosawa, 2007; Bratt-Leal & Carpenedo, 2009). Nestes agregados,
CTE dão origem a uma variedade de tipos celulares especializados oriundos dos três
folhetos germinativos: endoderme, mesoderme e ectoderme, recapitulando estádios iniciais
do desenvolvimento embrionário (Desbaillets et al., 2000; Itskovitz-Eldor et al., 2000,
Bratt-Leal & Carpenedo, 2009).
Além da capacidade de CE originarem todas as linhagens celulares embrionárias, o
momento em que marcadores do desenvolvimento são expressos nos CE também estão
relacionados com os padrões de expressão observados durante estágios específicos da
embriogênese (Leahy et al., 1999). CE com três dias de desenvolvimento são considerados
equivalentes a embriões de camundongos no período de pré-gastrulação, que compreende
entre 4.5 – 6.5dpc (dias pós coito), enquanto a análise de CE entre 3 e 5 dias de
diferenciação se assemelha a embriões no período de gastrulação (6.5 – 7.5dpc), como
ilustrado na Fig. 3 (Leahy et al., 1999; Sajini et al., 2012)
Leahy e colaboradores (1999) fizeram uma análise detalhada de marcadores dos três
folhetos germinativos e compararam o tempo que esses marcadores são expressos em CE
com o tempo em que estão expressos durante o desenvolvimento embrionário,
comprovando que a expressão de marcadores como Oct3, Fgf5, Gata4, Brachyury-T, Flk1 e
Msx3, expressos no período de pós-implantação e gástrula no embrião, se correlacionam
com suas respectivas expressões in vivo.
13
Figura 3: Modelo comparativo entre os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário e a
diferenciação de CTE através da formação de CE in vitro. Adaptado de Keller 2005.
No embrião, a restrição de destinos celulares é espacialmente organizada através da
expressão regionalizada de marcadores específicos de linhagem (Tsakirids et al., 2014).
Todavia, em CE é fortemente discutido se a diferenciação ocorre de forma organizada ou
não. Alguns estudos afirmam que apesar da capacidade de originar células dos três folhetos
germinativos, em uma relação temporal semelhante com embriões, CE não apresentam
nenhum padrão organizacional que controle a diferenciação como um todo e sim uma
14
distribuição espacial desorganizada de marcadores dos folhetos (Pekkanen-Mattila et al.,
2010; Sajini et al., 2012).
Estudos desenvolvidos por Ten Berge e colaboradores (2008) demonstraram em CE
uma polarização anteroposterior e a formação de uma região semelhante a linha primitiva.
Nessa região as células passam por uma transição epitélio-mesênquimal, caracterizada pela
expressão de Snail e fibronectina e se diferenciam em progenitores de mesoderme,
expressando Brachyury-T e de endoderme, expressando Foxa2, sendo que essa polarização
é dependente da ativação local da sinalização Wnt. Adicionalmente, marcadores de
neuroectoderme, Pax6 e Sox1 se localizam em polos opostos a localização da via Wnt e
marcadores de mesoendoderme, comprovando que CE apresentam um nível organizacional
consistente com o processo observado in vivo, como descrito em Tam e Behringer, (1997) e
Yamaguchi, (2001).
Outro trabalho que corrobora com a existência de uma organização durante a
diferenciação de CTE, foi realizado por Marikawa et al., (2009) através da formação de
agregados originados de células-tronco de carcinoma embrionário. Os autores relatam a
localização de padrões espaciais distintos de expressão gênica, característicos da formação
de mesoderme, com expressão localizada de Brachyury-T e Wnt3a no 6° dia de
diferenciação celular. Adicionalmente, essas expressões coincidiram com uma morfologia
alongada apresentada pelos CE, semelhante ao que ocorre no embrião normal durante a
formação do eixo anteroposterior (Marikawa et al., 2009).
Fuchs et al., (2012) demonstraram que a adesão de CE a uma superfície de matriz
extra-celular (MEC) proveu subsídios para um desenvolvimento morfológico semelhante
ao observado em embriões de camundongo durante a gastrulação. As células desses CE
apresentaram uma auto-organização, estabelecendo uma simetria bilateral e com
15
consequente formação de um eixo anteroposterior nos estágios iniciais de diferenciação, a
qual é quebrada por volta do 6.5° dia de diferenciação, com o início da cardiomiogênese.
Em contrapartida, trabalhos recentes contestam a hipótese de que CE possam
recapitular o nível organizacional encontrado em embriões. Sajini et al., (2012) analisaram
o destino das células que deixavam de expressar Oct4 e, embora constataram que tanto a
sequência de perda de Oct4, como o início da expressão de marcadores de endoderme
(Foxa-2 e AFP) e mesoderme (Brachyury-T) correspondam temporalmente ao que ocorre
em embriões, essas expressões não seguem nenhum padrão global, sendo observado
somente padrões locais de diferenciação.
Pekkanen-Mattila et al., (2010) realizaram uma análise sistemática da distribuição
de marcadores de tipos celulares específicos em CE diferenciados a partir de oito linhagens
de CTE humanas, e reportam que, apesar da distribuição espacial e temporal dos folhetos
germinativos ser semelhantes em todos os CE, nenhuma organização ou trajetória óbvia
destes tecidos foi observada.
Uma vez que a formação de CE tem características semelhantes às do
desenvolvimento embrionário, a interação de diferentes camadas germinativas, a influência
de vias de sinalização e fatores de transcrição sobre a diferenciação celular pode ser
acessada através da diferenciação desse modelo. Isso tem levado a necessidade de se recriar
in vitro, além da relação de expressão gênica já extensivamente comprovada, também a
organização morfológica observada durante a formação dos três folhetos germinativos in
vivo (Hao Qi et al., 2010; Petersen et al., 2012; Poh et al., 2013 e Warmflash et al., 2014).
Recentemente Van den Brink et al., (2014) estabeleceram condições específicas de
cultura que culminaram na formação de CE altamente organizados, com características
muito semelhantes a observada em embriões no período de gastrulação, sendo assim
16
denominados gastrulóides. Esses resultados foram obtidos através do controle de três
fatores que podem influenciar na homogeneidade do padrão de diferenciação de CE: (1)
composição do meio de cultura; (2) tempo de exposição a fatores utilizados na
diferenciação e (3) tamanho inicial dos agregados. CE foram formados a partir de pequenas
quantidades de células (200 – 400) e inicialmente foram cultivados por dois dias em meio
N2B27, comumente utilizado para induzir a diferenciação neural, porém, nesse caso, a
utilização desse meio resultou em uma resposta homogênea a fatores externos (Turner et
al., 2014). Posteriormente, a diferenciação foi controlada com a utilização de inibidores e
ativadores das vias de sinalização Wnt, BMP4 e Actina/Nodal. Os CE obtidos apresentaram
morfologia alongada e expressão polarizada de marcadores de mesoendoderme, tais como
Brachyury-T, Tbx6, Sox17 e neuroectoderme, como Sox1, semelhante a encontrada em
embriões durante o desenvolvimento.
O fato de existir uma padronização global nos CE, além da relação temporal de
expressão gênica comparada com embriões no início do desenvolvimento, os tornam
ferramentas valiosas para o entendimento de como as células escolhem um destino celular
específico durante a gastrulação e quais mecanismos governam esta etapa crucial para
formação de um organismo.
1.1.4 Coup-TFII
O
receptor
nuclear
Coup-TFII
(Chicken
ovalbumim
upstream
promoter
transcription factor II), também conhecido como NR2F2, é um receptor nuclear órfão, por
não possuir um ligante específico identificado. Coup-TFII possui uma estrutura
característica de receptores nucleares, compreendida por um domínio altamente conservado
17
de ligação ao DNA (DBD - do inglês DNA binding domain), permitindo a sua classificação
como um fator de transcrição, e um domínio de ligação ao ligante (LBD – do inglês ligandbinding domain) (Lin et al., 2011; Yamazaki et al., 2013).
Este fator de transcrição possui um papel fundamental em numerosos processos do
desenvolvimento e função celular, estando envolvido no desenvolvimento embrionário em
diversos estádios, regulando a determinação de destinos celulares específicos, como
linhagens originadas das três camadas germinativas, tais como diferenciação neural,
cardiovascular, desenvolvimento do estômago, além de ser essencial para a função
pancreática (Lin et al., 2011).
Durante a diferenciação de CTE humanas em CE, Coup-TFII é primeiramente
detectado no 4° dia de diferenciação e é responsável pela ativação de Pax6, fator de
transcrição importante para especificação de ectoderme neural. Entretanto, o nocaute de
Coup-TFII nessas células não alterou a expressão de Brachyury-T, expresso em células de
origem mesodérmicas e Sox1, expresso em estádios mais tardios da diferenciação neural de
CTE humanas (Rosa e Brivanlou, 2011).
Além de atuar na determinação de destinos celulares, Coup-TFII também se
relaciona com os fatores de transcrição Oct4 e o miRNA miR-302, em um circuito
complexo que regula a pluripotência de CTE humanas, sendo que no estado indiferenciado,
Oct4 regula positivamente o miR-302, este por sua vez, reprime a expressão de Coup-TFII.
Por outro lado, durante a diferenciação, Coup-TFII inibe diretamente Oct4, desencadeando
um ciclo de feedback positivo para a sua própria expressão. Estes dados em conjunto
evidenciam o papel de Coup-TFII na ativação de genes durante estágios iniciais de
especificação celular em CTE humanas, além de atuar no balanço entre o estado
indiferenciado e a diferenciação celular (Hu et al., 2012).
18
In vivo, sua expressão é primeiramente detectada no E7,5 do desenvolvimento no
ectoderma neural, apresentando pico de expressão entre os dias 10-13 com declínio antes
do nascimento (Qiu et al., 1997). Durante o desenvolvimento, Coup-TFII é altamente
expresso em células mesenquimais de órgãos que requerem interações epitéliomesenquimais, porém, não em epitélios terminalmente diferenciados, podendo apresentar
um papel na indução da diferenciação epitelial (Tsai e Tsai, 1997).
A importância da expressão de Coup-TFII, durante o início do desenvolvimento
embrionário, vem sendo comprovada a partir de estudos onde a inativação desse gene em
camundongos leva a letalidade embrionária no 10° dia de desenvolvimento, devido a
defeitos no átrio e no desenvolvimento vascular, apresentando também retardo no
crescimento, hemorragias e edemas, indicando sua importante participação na angiogênese
durante o desenvolvimento (Pereira et al., 1999; Boudot et al., 2011). Camundongos
heterozigotos para Coup-TFII apresentam defeitos em derivados mesodérmicos, incluindo
tecido muscular, adiposo e trato reprodutivo (Takamoto et al., 2005; Xie et al., 2011, Li et
al., 2009).
Xie et al., (2011) analisando a participação de Coup-TFII na especificação de
linhagem e diferenciação celular de células mesenquimais multipotentes, relataram que
Coup-TFII controla a plasticidade dos precursores mesenquimais promovendo a
adipogênese e condrogênese, enquanto inibe a miogênese e a osteoblasteogênese. Ainda
durante o desenvolvimento pancreático, Coup-TFII atua na ativação do gene da β-catenina
e demais genes alvo da via Wnt canônica regulando a proliferação celular das células-β
(Boutant et al., 2012).
Coup-TFII também é descrito por participar no desenvolvimento de tumores, porém
seu papel ainda é controverso. Qin et al., 2009 relatam que Coup-TFII atua na progressão
19
tumoral e formação de metástases, devido ao seu potencial de modular a angiogênese.
Entretanto, Zhang et al., 2014, descreve que durante o desenvolvimento de tumores, CoupTFII atua na inibição da TEM, através de inibição da sinalização TGF-β, reduzindo a
capacidade de metástases tumorais (Zhang et al., 2014).
Apesar de diversos trabalhos demonstrarem a participação de Coup-TFII em
diferentes etapas do desenvolvimento embrionário, pouco se sabe sobre sua função em
estágios inicias da aquisição de destinos celulares.
20
2.OBJETIVOS
2.1 – Objetivo geral:
O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o padrão de expressão de CoupTFII durante a diferenciação de CTE através da formação de CE e analisar a possível
participação de Coup-TFII na aquisição de destinos celulares in vitro.
2.2 – Objetivos específicos:
- Caracterização do padrão de expressão de Coup-TFII durante a diferenciação em CE
através de imunofluorescência (IF) e qPCR.
- Comparação do padrão de expressão de Coup-TFII observado em CE com o padrão de
expressão de Coup-TFII durante o desenvolvimento de embriões de camundongo.
- Comparação do padrão de expressão de Coup-TFII com o de marcadores de precursores
dos folhetos germinativos nos estágios iniciais da diferenciação celular por IF dupla e
citometria de fluxo dupla.
21
22
3.MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – Cultivo das CTE E14TG2a
A linhagem de células E14TG2a são mantidas indiferenciadas em cultivo com meio
Glasgow Modified Eagle´s Medium (GMEM) (Sigma, USA), com 1000 U/mL de fator
inibidor de leucemia (LIF) (ESGRO-LIF; ChemiconMillipore), 0.1 mM de βmercaptoetanol, 1% v/v de aminoácidos não essenciais (MEM NEAA), 50 U/mL de
penicilina, 50 μg/mL de streptomicina, 2 de mM L-glutamina, e 15% v/v de soro fetal
bovino (FBS), em incubadora de CO2 5%, à 37 °C. As subculturas das CTE são feitas a
cada dois dias, quando as células em cultura apresentam-se com 80 a 90% de confluência.
As garrafas de cultura utilizadas para o cultivo das CTE são previamente tratadas com 0,1%
m/v de gelatina e mantidas a 4 °C.
3.2 – Diferenciação das CTE E14TG2a - Método Hanging Drop
A indução da diferenciação das CTE e formação dos CE é realizada através do
método Hanging Drop (gotas suspensas). As células são retiradas do GMEM com LIF e
ressuspendidas em DMEM (Dulbeco´s Modified Eagle Medium) suplementado com
0,1mM de β-mercaptoetanol, 1% v/v de aminoácidos não essenciais (MEM NEAA
GIBCO), 50 U/mL de penicilina, 50 ug/mL de streptomicina (GIBCO), 2 mM L-glutamina
(GIBCO), 20% v/v de soro fetal bovino (FBS - GIBCO), sem adição de LIF.
A diferenciação é feita com uma suspensão contendo cerca de 1000 células,
depositadas em gotas de 20 μL de meio na superfície interna da tampa de uma placa de
Petri plástica, totalizando cerca de 60 gotas por tampa. A base da placa de Petri é
preenchida com 10 mL de água miliQ estéril, para evitar alterações no volume do meio das
23
gotas, e a tampa é cuidadosamente invertida de modo a tampar novamente a placa de Petri,
como ilustrado na Fig. 2. Desta forma, as placas contendo as “gotas penduradas” são então
incubadas por dois dias em incubadora de CO2 5%, à 37 oC. Neste período, a força
gravitacional mantém as CTE em contato, e sua capacidade de aderência resulta na
formação de agregados esféricos denominados CE. No terceiro dia, os CE são transferidos
das gotas para uma placa de Petri (não aderente) onde são mantidos em suspensão em meio
de diferenciação por um total de 20 dias. Para as análises realizadas, os CE foram coletados
nos dias de diferenciação D3, D4, D5, D7, D10, D13, D15 e D18, para análise do padrão de
diferenciação.
Figura 4: Esquema ilustrativo do método de formação de CE, Hanging Drop. Cada gota com volume de
20 uL contém 1000 células. Aproximadamente 60 gotas são feitas na tampa da placa de Petri a qual é
posteriormente invertida de modo que a tampa se encaixe na base na base da placa de Petri, a qual contém
água miliQ estéril.
3.3 – Imunofluorescência
As reações de IF foram realizadas em CE de duas maneiras: (1) CE em suspenção,
fixados com PFA4% por 15 minutos; (2) CE que passaram por um processo de dissociação
com Accutase (Gibco – A11105-01). As células dissociadas foram plaqueadas e, após 4
horas fixadas com PFA4% por 15 minutos.
Após etapa de fixação, as células dissociadas e CE em suspensão foram lavados
com PBS permeabilizados com 0,1M, pH 6,8 por três vezes durante 5 minutos cada e então
24
permeabilizadas com Triton 0,5% diluído em PBS 0,1 M, pH 6,8, por 30 minutos. As
amostras foram incubadas em solução tampão de bloqueio contendo Triton 0,2%, glicina
0,3% e BSA 3%, diluídos em PBS 0,1M, pH 6,8, para bloqueio das reações inespecíficas,
por 30 minutos à temperatura ambiente. Para as reações de imunohistoquímica simples, as
amostras foram incubadas por 3 horas com os anticorpos primários específicos para
detecção de Coup-TFII, Oct4, Nanog, Brachyury-T, Foxa2 e Nestin, descritos na tabela 1.
Após lavagem com PBS 0,1 M pH 6,8, os CE foram incubados durante 3 horas com o
anticorpo secundário específico e então lavados e incubados com Faloidina, para evidenciar
filamentos de actina, na diluição de 1:150, e, finalmente, marcados com DAPI, para
evidenciar núcleos, na diluição de 1:1000, ambas incubações de 1 hora. Após lavagem, as
amostras foram mantidas em glicerol 80%.
Para as duplas marcações, os dois anticorpos primários e seus respectivos
secundários foram incubados simultaneamente, como descrito acima. As imagens de CE
em 3D foram obtidas com o microscópio Confocal LSM780 – NLO INFABiC-UNICAMP.
As imagens relatadas representam uma projeção do eixo Z dos CE íntegros (secção ótica).
Tabela 1: Descrição dos anticorpos utilizados na técnica de imunofluorescência.
Anticorpo Primário
Diluição
Anticorpo Secundário
Diluição
Coup-TFII (ab64849)
1:100
1:300
Foxa2 (NBP1-95426)
1:150
Brachyury-T (sc17743)
1:100
Nestin (MAB353)
1:50
Nanog (8822 Cell
Signaling)
Oct4
1:100
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Rabbit
(Invitrogem A-11008)
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Rabbit
(Invitrogem A-11008)
Alexa Fluor® 488 Rabbit Anti-Goat
(Invitrogem A-11078)
Fluoresceína Horse Anti-Mouse
(Vector F1-2000)
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Rabbit
(Invitrogem A-11008)
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Rabbit
(Invitrogem A-11008)
1:200
1:300
1:300
1:300
1:300
1:300
25
3.4 – Citometria de Fluxo
Os CE foram coletados nos 4°, 5°, 6° e 7° dias de diferenciação e as células
dissociadas utilizando solução contendo Tripsina, EDTA 0,02% e 0,1% de colagenase.
Após completa dissociação, as células foram lavadas em solução contendo 5% de SFB
diluídos em PBS 0,1M pH 7.4. As células dissociadas foram submetidas ao protocolo de
marcação intracelular para citometria de fluxo de acordo com o protocolo fornecido pelo
fabricante (E-Bioscence Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set cat# 888824). Brevemente, as células foram incubadas em tampão de permeabilização e fixação
por 30 minutos a 4 oC. Após a incubação, as células foram lavadas com o tampão de
lavagem da permeabilização e incubadas com o anticorpo primário para detecção de CoupTFII, Nestin e Brachyury-T por 16 horas a 4 oC. Para a marcação com anti-Coup-TFII, foi
necessária a utilização de um anticorpo secundário acoplado a fluorescência. Nestes casos,
após a incubação com o anticorpo primário, a suspensão celular foi lavada duas vezes com
o tampão de lavagem e incubada com os respectivos anticorpos secundários durante 40
minutos. Após incubação, as células foram lavadas por 3 vezes em solução de lavagem e
ressuspendidas em PBS. Em seguida, a marcação foi analisada no Citômetro de Fluxo BD
Calibur localizado no laboratório do Prof. Dr. Alessandro dos Santos Farias – IB/Unicamp.
Para realização do controle negativo, foram utilizados controles de isotipos para cada
anticorpo, descritos da tabela 2.
Como controle negativo utilizamos células que não receberam anticorpo (Branco) e
Controle de Isotipo (Ig). A marcação com Nestin foi realizada sem o Controle de Isotipo,
sendo usado somente as células que não receberam anticorpo como controle.
26
Tabela 2: Descrição dos anticorpos utilizados na técnica de citometria de fluxo.
Anticorpo
Diluição
Anticorpo Secundário
Diluição
Controle de Isotipo
Diluição
1:200
1:50
-
Rabbit-IgG NBP224893
Goat-IgG-PE IC108P
-
-
Primário
Coup-TFII
(ab64849)
Brac.T-PE
(IC2085P)
Nestin-PE
(IC2736P)
1:50
10ul/106
cél.
10ul/106
cél.
Alexa Fluor® 488
(A-11008)
-
10ul/106
cél.
-
3.5 – Extração de RNA e síntese de cDNA
O RNA total dos CE no 3°, 4°, 5°, 7°, 10°, 13°, 15° e 18° dias de diferenciação e
das CTE indiferenciadas foi extraído utilizando-se o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo
o protocolo recomendado pelo fabricante. As amostras foram maceradas em eppendorfs
contendo 1mL de Trizol e incubados por 5minutos à temperatura ambiente. Em seguida,
adicionou-se 200μL de clorofórmio a cada amostra, agitou por 15 segundos e incubou
novamente por 3minutos à temperatura ambiente. Na sequência, o material foi centrifugado
a 14000 xG por 15minutos a -4 ºC. Após a centrifugação, a fase aquosa foi removida,
adicionou-se 500 μL de isopropanol e incubou por 10 minutos à temperatura ambiente. O
material foi centrifugado a 14000 xG por 10 minutos a -4 ºC para formação do pellet na
parede do tubo. Após essa etapa, o sobrenadante foi removido, e adicionou-se álcool etílico
70% a 4 ºC e o material foi então novamente centrifugado a 7000 xG por 5 minutos a -4 ºC.
Finalmente, o sobrenadante foi retirado e o pellet permaneceu durante 15 minutos exposto
para secar. Em seguida, o material foi ressuspendido em 50 μL de água DEPC
(Dietilpirocarbonato).
A avaliação da integridade das amostras de RNA total obtidas foi feita por meio da
eletroforese em gel de agarose a 1% na cuba horizontal, com corrente contínua a 100V
durante 20 minutos e a concentração e pureza do RNA foi analisada utilizando o
27
espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 UV-Vis (Nanodrop Technologies), a partir da
absorbância a 260 nm, e razões 280/260 nm e 260/230 nm, respectivamente.
Para síntese de cDNA foi utilizado o kit RevertAid H Minus First Strand cDNA
Synthesis Kit (Fermentas), a partir de amostras de RNA total especificadas acima. A síntese
de cDNA foi realizada a partir de 0,5 μg de RNA total, acrescido de 1 μL de Primer Oligo(dT)18 (100uM) e quantidade suficiente de água DEPC para um volume final de 12 μL.
Essa mistura foi incubada à 5 minutos por 65 oC para desnaturação. Após este período de
incubação, foram adicionados 4 μL de Tampão de Reação (5X), 1 μL de dNTP (10mM), 1
μL de Inibidor de RNAse Ribolok (20 U/μL) e 1 μL de RivertAid H Minus Transcriptase
Reversa (200 U/μL). As amostras foram incubadas por 1 hora a 42 oC e, novamente, por 5
minutos a 70 oC. O cDNA originado foi quantificado por espectofotometria no Nanodrop,
como descrito anteriormente.
3.6 – Real Time PCR
Os primers utilizados foram desenhados com o auxílio da ferramenta Primer Blast
do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) com base no banco de dados do
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e confeccionados comercialmente. Os primers foram
desenhados de forma a produzirem amplicons entre 90 e 150 pb, pois acima deste tamanho,
a eficiência da reação de qPCR pode ser prejudicada (Cosseau et al., 2009). Os primers
sintetizados foram selecionados pela ausência de formação de dímeros, cross-dímeros,
harpins, com temperatura de anelamento em torno de 60 oC, e conteúdo de GC entre 5055%. As sequências dos primers utilizados se encontram na tabela 3.
A eficiência de amplificação (E) de cada um dos pares de primers foi determinada
por meio da confecção de uma curva padrão de cinco pontos, gerada a partir de reações em
28
duplicatas de qPCR nas quais são utilizadas diluições seriadas (1, 1:5, 1:25, 1:125, 1:625)
de cDNA de grupos onde o gene de interesse apresenta alto nível de expressão, no caso do
teste de primers para Coup-TFII utilizamos CE D13. Eficiências com valores entre 90% e
110% foram consideradas como ideais.
O gene de referência utilizado como controle endógeno foi o Rps29. Os
resultados foram normalizados usando os valores de Ct (threshold cycle) desse gene de
referência. Para quantificar a expressão gênica relativa, foi utilizado o modelo matemático
2-ΔΔCt, considerando o grupo de células indiferenciadas Tg2a como calibrador.
As reações de qPCR foram realizadas com 100 ng de cDNA de CTE e CE em
diferentes estágios de diferenciação, sintetizado conforme descrito anteriormente. As
reações foram realizadas em triplicatas biológicas e duplicatas técnicas no equipamento
StepOnePlus™ Real Time PCR System (Applied Biosystems®) com o kit KAPA™
SYBR® FAST Universal qPCR 2X (Master Mix), contendo Platinum® Taq DNA
Polymerase, SYBR® Green I dye, Tris-HCl, KCl, 6 mM MgCl2, 400 μM dCTP, 800 μM
dUTP, uracil DNA glicosilase (UDG) e estabilizadores. Para um volume final de 10 μL de
reação foram adicionados 5 μL de SYBR® Green Master Mix, 0,25 μL de primer forward
(10μM), 0,25 μL de primer reverse (10μM) e 3,5 μL de H2O tratada com DEPC. As reações
foram então adicionadas em placas ópticas MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction
Plate with Barcode (0.1 mL) (Applied Biosystems®). Uma vez preparadas, as reações
foram submetidas às seguintes condições de ciclagem: uma etapa inicial de desnaturação a
95 oC por 10 min, 40 ciclos de 95 oC por 1 min, 60 oC por 15 s e 72 oC por 20 s, seguindo
de uma etapa final para a construção da curva de melting de 72 oC por 20 s, 60 oC por 1min
e 95 oC por 15 s.
29
Tabela 3: Primers utilizados nos experimentos de qPCR, desenhados através do Primer Blast.
Gene
Sequência
Coup-TFII
Foward
TCGGAAAGCTCTTGCTTCGT
Rps29
Reverse
Foward
GGCCAGTTAAAACTGCTGCC
GGGCGTCTGAAGGCAAGATGG
Reverse
TTGGAGCAGACGCGGCAAGAG
3.7 – Hibridação in situ (HIS)
A sonda utilizada para detecção de Coup-TFII já havia sido previamente sintetizada
em nosso laboratório. Para evitar possíveis contaminações e fontes de RNAse, água e
soluções foram tratadas com DEPC, por 16 – 24 horas e em seguida, esterilizadas em
autoclave (ex.: águaDEPC e PBSDEPC).
Os CE foram fixados em PFA 4% overnight e lavados em PBT (PBS + Tween 20 0,1%) por três vezes de 5 minutos cada. Posteriormente foram desidratados em uma
sequência de soluções de metanol em PBT a 25%, 50%, 75% e 100% por 5 minutos cada e
clareados por 10 minutos em solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) 6% à temperatura
ambiente.
Os CE foram então reidratados através de banhos seriados decrescentes de metanol
em PBT (100% I, 100% II, 75%, 50% e 25%) por 5 minutos em cada solução e duas
lavagens em PBT por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, deixou-se os CE em
solução de digestão (0,5 µL Proteinase K / mL PBS) durante 1,5 minuto a 37 °C. Após
digestão, os CE foram incubados por 10 minutos a 37 °C em solução de glicina 0,2% em
PBSDEPC. Decorrido o tempo de incubação, os CE foram novamente fixados em solução de
PFA 4% + glutaraldeído 0,2% por 15 minutos a temperatura ambiente e lavados em PBT.
Na etapa seguinte, os CE refixados foram incubados em tampão de Pré-Hibridação
(formamida 50%, SSC 5X pH 4,5, 50 µg/mL de tRNA de levedura, SDS 1% e 50 µg/mL de
30
heparina) durante 3 horas a 55 ºC. A hibridação realizou-se em Tampão de Hibridação
(tampão de Pré-Hibridação contendo 1µg/mL da ribossonda), durante pelo menos 16 horas
a 55 ºC.
No dia seguinte, os CE foram lavados durante 30 minutos em tampão de PréHibridação a 55 °C; 30 minutos em tampão de Pré-Hibridação diluído em tampão SSC 2X
a 55 °C; 30 minutos em tampão SSC 2X a 55 °C e finalmente, lavados por duas vezes de 10
minutos em Solução X (formamida 50%, SSC 2X pH 4,5 e SDS 1%) pré-aquecida a 55 °C.
Após o tratamento com Solução X, os CE foram lavados por três vezes durante 5 minutos
em PBTDEPC e mais quatro vezes de 10 minuutos cada, em solução tampão MABT (ácido
maléico 100mM, NaCl 150mM, Levamisole 2mM e Tween 20-0,1%, em pH 7,5) à
temperatura ambiente
Após essa etapa, os CE foram incubados em reagente de bloqueio Boehringer
Mannhein (BBR) a 2% em tampão MABT durante 2 horas à temperatura ambiente, para
bloquear sítios aos quais o anticorpo pode eventualmente se ligar inespecificamente. Após
o bloqueio, os CE foram então incubados em solução contendo 2% de BBR em tampão
MABT, 1% de soro de ovelha inativado e anticorpos anti-DIG conjugados à fosfatase
alcalina na titulação de 1:2000 durante pelo menos 16 horas a 4 °C.
No dia seguinte, os CE foram lavados em tampão MABT, quatro lavagens de 30
minutos cada e mais duas lavagens, de 10 minutos cada, em tampão NTMT (NaCl 100mM,
Tris 100mM pH 9,5, MgCl2 50mM, Tween-20 0,1%, Levamisole 2mM) à temperatura
ambiente. Após essas lavagens, os CE foram tratados com Tampão NTMT juntamente ao
substrato para fosfatase alcalina, NBT/BCIP (18.75 mg/mL de NBT, 9.4 mg/mL de BCIP),
a 37 °C, protegidos da luz, a fim de detectar a ação da fosfatase alcalina até a reação atingir
a intensidade desejada. Para interromper a reação, os CE foram lavados em PBT 1X,
31
fixados em PFA 4% a 4 ºC por pelo menos 20 minutos. Após a fixação, os CE foram
lavados em PBS 1X, diafanizados em série crescente de glicerol em PBT (25%, 50% e
80%) e armazenados em glicerol 80%.
3.8 – Análise Estatística:
A análise da expressão de Coup-TFII no qPCR foi feita a partir do ranqueamento de
dados e análise semiparamétrica pela Análise de Variância de 1 via (ANOVA) seguido do
teste de Tukey.
O resultados obtidos na citometria de fluxo foram submetidos à Análise de
Variância de 1 via (ANOVA), seguida pelo teste de comparações múltiplas de Holm
Sidacks’s através do software GraphPad Prism 5.0. A significância estatística foi definida
como P≤0,05. Os dados serão apresentados como média ± erro-padrão da média (SEM±).
32
4. RESULTADOS
4.1 – Caracterização do padrão de expressão de Coup-TFII em CE em
diferenciação
O padrão de expressão de Coup-TFII foi caracterizado através de marcação celular
por IF e nível de expressão gênica por qPCR durante o 3°, 4°, 5°, 7°, 10°, 13°, 15° e 18°
dias de diferenciação dos CE, visando determinar, em detalhe, (1) o início da expressão, (2)
o pico de expressão de Coup-TFII, (3) a distribuição espacial das células expressando
Coup-TFII e (4) a correlação com o padrão de expressão encontrado em embriões.
A princípio, analisamos a pluripotência das CTE E14-Tg2a através da detecção dos
fatores de transcrição Oct4 e Nanog, dois dos fatores responsáveis por atuar na manutenção
da pluripotência dessas células (Boyer et al., 2005; He et al., 2009). A expressão nuclear de
Oct4 foi observada na maioria das células (Fig. 5c), entretanto a expressão de Nanog,
também nuclear, foi observada de forma heterogênea, expressa em alguns núcleos e ausente
em outros (Fig. 5b). Não foi detectada expressão de Coup-TFII nas CTE E14-Tg2a (Fig.
5d).
33
Figura 5: Caracterização da pluripotência das CTE E14-Tg2a. a: CTE E14-Tg2a. b: expressão de Nanog.
c: expressão de Oct4. d: ausência de expressão de Coup-TFII. Barras: 50 µm.
Durante a diferenciação, inicialmente buscamos estabelecer uma relação temporal
entre o padrão de expressão de Coup-TFII em CE com o padrão de expressão de Coup-TFII
em embriões de camundongos. In vivo, a expressão de Coup-TFII é primeiramente
detectada por volta do E7.5, apresentando pico de expressão entre os estágios E13 – E15 e
decaindo antes do nascimento (Qiu et al., 1997). Para determinar, quantitativamente, o dia
de início e o pico de expressão de Coup-TFII, realizamos uma análise quantitativa da
34
expressão gênica de Coup-TFII em células indiferenciadas e durante o período de
diferenciação compreendido entre os dias D3 e D18, através de qPCR.
Como pode ser notado na Fig. 6, durante a diferenciação de CE, a expressão de
Coup-TFII é inicialmente detectada no D3 a níveis basais, sendo que no D5 tem-se um
aumento da transcrição de Coup-TFII, que continua aumentando até o D13 e reduzindo no
D18. Apesar de não ter sido detectado através da técnica de IF observou-se expressão de
Coup-TFII nas células E14-Tg2a através de qPCR.
Figura 6: Expressão gênica relativa de Coup-TFII durante a diferenciação de CE e em CTE – E14Tg2a. Durante a diferenciação, Coup-TFII é inicialmente expresso no D3, com pico de expressão no D13.
Valores foram expressos como média ± SEM. * P<0,05 e ** P<0,01.
A marcação de Coup-TFII por IF é observada a partir do D4, onde algumas células
apresentam marcação citoplasmática e algumas, em menor número, apresentam marcação
aparentemente nuclear (Fig. 7 e–h, seta e detalhe em g). CE D3 foram analisados e não
apresentaram sinal de marcação de Coup-TFII (Fig. 7 a–d).
O padrão observado em CE D4 é mantido em D5, com um aparente aumento de
células com marcação nuclear (Fig. 7 i-l, seta e detalhe em k). Em D7, um maior número de
35
células apresentam marcação positiva para Coup-TFII, sendo que a expressão passa a ser
localizada no núcleo na maioria das células, com pouca marcação citoplasmática observada
(Fig. 7 m-p, seta e detalhe em o). Esta localização nuclear da expressão do Coup-TFII se
mantém até o final do período de diferenciação analisado, como observado em CE dos dias
10, 13, 15 e 18 dias de diferenciação, (Fig. 8 a-d; e-h; i-l, m-p).
Figura 7: Padrão de expressão de Coup-TFII em CE nos estágios iniciais de diferenciação. CE nos dias 3
(a-d); 4 (e-h); 5 (i-l) e 7 (m-p) de diferenciação. Observe no D5 (detalhe em k) a expressão de Coup-TFII se
acumulando nos núcleos e no D7 (detalhe em o) a expressão localizada majoritariamente no núcleo das
células. Coup-TFII em verde, Faloidina em vermelho, evidenciando filamentos de actina e DAPI em azul
marcando núcleo. Barras: 50µm.
36
Com a progressão da diferenciação, os CE passam a apresentar diferentes fenótipos
celulares e teciduais, onde Coup-TFII começa a ser diferencialmente expresso. No D15 e
D18, diferentes conformações teciduais podem ser observadas, a Fig. 8 i-l representa um
CE D15 onde Coup-TFII está expresso em todo CE, exceto em uma pequena população de
células, identificada por asterisco. A Fig. 8 m-p corresponde a um CE D18, onde é possível
observar uma camada de células com características epiteliais na periferia circundando todo
o CE. Nessas células, a expressão de Coup-TFII está fraca ou ausente (setas), quando
comparado com as células do interior do CE (asterisco), onde a expressão de Coup-TFII
está mais evidente.
37
Figura 8: Padrão de expressão de Coup-TFII em corpos embrióides nos estágios tardios de
diferenciação. CE nos dias 10 (a-d); 13 (e-h); 15 (i-l) e D18 (m-p) de diferenciação. Observe no D15 a
ausência de expressão de Coup-TFII em uma população isolada de células (l, asterisco) e no D18 em uma
população de células ao redor do CE (p, seta), enquanto expresso em células no interior do CE (p, asterisco).
Coup-TFII em verde, Faloidina em vermelho, evidenciando filamentos de actina e DAPI em azul marcando
núcleo. Barras: 50 µm.
Nestes estágios, observamos vários CE com a formação de estruturas com
características epiteliais e mesenquimais (Fig. 9b e c setas e asteriscos, respectivamente).
Na maioria dos órgãos e regiões onde Coup-TFII é expresso no embrião, sua expressão
encontra-se majoritariamente localizada no núcleo de células mesenquimais, enquanto
38
dispersa pelo citoplasma ou completamente ausente do núcleo de células epiteliais (Fig. 9a,
dados não publicados). A Fig. 9a demonstra um embrião E14.5 marcado para Coup-TFII e
contra-corado com DAPI. Nota-se, no detalhe da imagem, que mostra o pulmão em
desenvolvimento, que os núcleos das células mesenquimais está marcado em vermelho,
indicando a localização de Coup-TFII, enquanto que os núcleos das células que compõem o
epitélio de revestimento dos ductos pulmonares estão marcadas em azul, indicando a
ausência da marcação nuclear de Coup-TFII nestas células. Nos CE D15 e D18 mostrado
em Fig. 9b e c Coup-TFII está presente no núcleo de células com característica
mesenquimal localizadas no interior do CE (asteriscos em Fig. 9b e c), enquanto
completamente ausente ou fracamente expresso nas células com características epiteliais
localizadas na periferia do CE (Fig. 9b e c setas).
39
Figura 9: Análise comparativa da expressão de Coup-TFII em embrião e CE. Embrião E14.5 no qual
Coup-TFII está expresso principalmente em células mesenquimais, como destacado em detalhe do pulmão
(detalhe em a). b e c: Expressão de Coup-TFII presente em células mesenquimais em CE D15 e CE D18
(asteriscos em b e c, respectivamente) enquanto ausente de células com características epiteliais (setas em b e
c). Em a: Expressão de Coup-TFII em vermelho e DAPI em azul. Em b e c: Expressão de Coup-TFII em
verde, DAPI em azul e Faloidina em vermelho.
Interessantemente, como pode ser notado em Fig. 7e-p e Fig. 10 a-c, a expressão de
Coup-TFII em D4, D5 e D7 possui um padrão de expressão hemisférico. Nos estágios
iniciais (D4-D5), notamos que a marcação majoritariamente citoplasmática de Coup-TFII já
encontra-se localizada preferencialmente em um dos hemisférios dos CE (Fig. 10 a e b).
Conforme a localização de Coup-TFII passa a ser nuclear, nos próximos dias de
diferenciação, a localização hemisférica da expressão de Coup-TFII fica ainda mais
evidente, como mostrado no D7 (Fig. 10 c).
40
Figura 10: Localização hemisférica de Coup-TFII em CE. Nos dias 4 (a) e 5 (b) a marcação aparenta ser
citoplasmática e algumas células apresentam marcação nuclear. No dia 7 (c) a marcação se encontra
majoritariamente nos núcleos de células localizadas em um dos hemisférios do CE. Coup-TFII em verde,
Faloidina em vermelho, evidenciando filamentos de actina e DAPI em azul marcando núcleo. Barras: 50 µm.
Este padrão hemisférico foi confirmado na maioria dos CE analisados. A Figura 11
mostra um conjunto de CE selecionados aleatoriamente dentre CE marcados para CoupTFII e contra-corados com DAPI e Faloidina, nos dias 5 e 7 de diferenciação (Fig. 11 a’–e’;
a’’–e’’, respectivamente). Em praticamente todos os CE analisados, a expressão de CoupTFII se encontra polarizada. Em um dos CE aleatoriamente selecionados, mostrado em Fig.
41
11 e’ e e’’, a marcação de Coup-TFII não apresenta um padrão hemisférico nítido. A partir
do D10, células expressando Coup-TFII encontram-se distribuídas por todo o volume dos
CE.
42
Figura 11: Localização hemisférica de Coup-TFII observada dentre diversos CE. CED5 (a’–e’) e CED7
(a’’–e’’) dias de diferenciação. Os CE mostrados nas figuras e’ e e’’ correspondem a CE em que não
observamos marcação hemisférica. Em verde, Coup-TFII, vermelho, faloidina evidenciando filamentos de
actina e em azul DAPI evidenciando núcleos. Barras: 50µm.
43
O tamanho inicial dos CE, ou seja, a quantidade inicial de células que são utilizadas
para formar um CE, tem sido relatada por ser um dos fatores, além da composição do meio
de cultura, que interferem na polarização e na diferenciação de CE (Van den Brink et al.,
2014; Fuchs et al., 2012).
Para analisar como o tamanho inicial dos CE interfere na expressão hemisférica de
Coup-TFII realizamos um teste com diferentes quantidades inicias de células na formação
de CE. Partimos de 500, 1000 e 2000 células inicias e analisamos CE com 5 e 7 dias de
diferenciação (Fig. 12 e 13).
Em ambos os dias analisados, CE formados com 500, 1000 e 2000 células
apresentaram um padrão de expressão de Coup-TFII semelhante com o que já havíamos
relatado anteriormente (Fig. 12 e 13). No D5 é possível observar uma marcação pontuada
localizada mais dispersa pelo CE, enquanto células com marcação nuclear se localizam
preferencialmente em uma das extremidades (Fig. 12 a-f, setas). O mesmo é observado no
D7 (Fig. 13 a-f, setas), onde a expressão de Coup-TFII já se encontra majoritariamente no
núcleo de células que se localizam em uma das extremidades dos CE. Portanto, não
identificamos uma interferência nítida no padrão de expressão de Coup-TFII com a
variação na quantidade inicial de células. Como em toda diferenciação realizada, alguns CE
não apresentaram um padrão hemisférico nítido (dados não demonstrados).
44
Figura 12: CE D5 formados a partir de diferentes quantidades iniciais de células apresentando
expressão hemisférica de Coup-TFII. 500 células inicias (a-b); 1000 células iniciais (c-d) e 2000 células
iniciais (e-f). Setas indicam a localização de Coup-TFII em células que se localizam preferencialmente em
uma região do CE. Em verde, Coup-TFII; vermelho, faloidina evidenciando filamentos de actina e em azul,
DAPI evidenciando núcleos. Barras: 50um
45
Figura 13: CE D7 formados a partir de diferentes quantidades iniciais de células apresentando
expressão hemisférica de Coup-TFII. 500 células inicias (a-b); 1000 células iniciais (c-d) e 2000 células
iniciais (e-f). Setas indicam a localização de Coup-TFII em células que se localizam preferencialmente em
uma região do CE. Em verde, Coup-TFII; vermelho, faloidina evidenciando filamentos de actina e em azul,
DAPI evidenciando núcleos. Barras: 50um.
46
Durante a análise da variação do número inicial de células na localização espacial
da expressão de Coup-TFII, encontramos vários CE D7 formados com 2000 células iniciais
que apresentaram um formato alongado, nos quais a expressão de Coup-TFII apresenta-se
restrita a uma das extremidades dessas estruturas (Fig. 14A a-d, setas).
A morfologia alongada já havia sido observada em CE formados a partir de 1000
células e submetidos a ensaios de HIS, com o objetivo de confirmar a expressão
hemisférica de Coup-TFII em CE D7. Como pode ser visto na Fig. 14B, em todos os CE a
expressão de Coup-TFII está localizada em uma das extremidades dos CE. Em alguns casos
o CE parece ter sido formado pela junção de dois CE (Fig.14B, cabeças de setas),
entretanto, esta marcação é também observada em CE originados de um único CE (Fig.
14B, setas), semelhantes aos observados na imunofluorescência na Fig. 14A.
47
Figura 14: CE D7 com morfologias alongadas apresentando expressão hemisférica de Coup-TFII. Em
A, imunofluorescência em CE formados com 2000 células (a-d), setas evidenciam a expressão de Coup-TFII
restrita a um dos polos dos CE. Em B, IHS para Coup-TFII, as setas indicam CE alongados, nos quais a
expressão de Coup-TFII localiza-se em um dos polos. Cabeças de setas indicam estruturas com possível
junção entre dois CE. Em verde, Coup-TFII; vermelho, faloidina evidenciando filamentos de actina e, em
azul, DAPI evidenciando núcleos. Barras: 50um e 1mm.
48
4.2 Comparação da localização de Coup-TFII com marcadores de precursores
dos folhetos embrionários
A expressão hemisférica observada para Coup-TFII neste estudo corrobora com a
observação de Ten Berge et al., (2008), que demonstraram uma polarização da via Wnt/βcatenina em CE D4. Visando explorar a natureza e possível função da expressão
hemisférica de Coup-TFII nos CE, assim como correlacionar esta expressão com as
observações de Ten Berge et al., (2008), buscamos associar esta expressão com a expressão
de marcadores dos 3 folhetos embrionários.
Foxa2 foi escolhido por ser primeiramente expresso na região anterior da linha
primitiva e endoderme definitiva. Brachyury-T é um marcador de precursores
mesodérmicos, e encontra-se expresso nestas células em estádios iniciais da diferenciação.
Nestin é uma proteína de filamento intermediário expressa em células tronco do sistema
nervoso
em
desenvolvimento,
utilizado
para
evidenciar
células
de
origem
neuroectodérmica.
Inicialmente, a co-localização de Coup-TFII e precursores dos folhetos
germinativos foi analisada através da técnica de Citometria de Fluxo. As análises foram
realizadas em CE com 4, 5 e 6 dias de diferenciação. A primeira análise realizada foi para
Brachyury-T e Coup-TFII, onde foram utilizados cerca de 900 CE, totalizando
aproximadamente 2 milhões de células em cada dia de análise. Esta análise revelou que no
4° dia de diferenciação aproximadamente 69% das células expressam Coup-TFII, no 5° dia
66%, no 6° dia 65% e no 7° dia 61%, enquanto que cerca de 27% das células dos CE
expressam Brachyury-T no 4o dia, 18% no 5° dia, 19% no 6° dia e 9% no 7° dia.
Interessantemente, em todos os dias de análise, a maioria das células positivas para
49
Brachyury-T estão contidas na população de células positivas para Coup-TFII, sendo que
96%, 98%, 97% e 99% das células Brachyury-T-positivas co-expressam Coup-TFII no 4°,
5°, 6° e 7° dia de diferenciação, respectivamente (Fig. 15).
O mapeamento dos precursores neuroectodérmicos dentre as populações Coup-TFII
positivas e negativas foi realizado com a dupla marcação de Coup-TFII e Nestin. Nesta
análise, 63% das células expressam Coup-TFII no D4, 72% no D5 e 72% no D7, enquanto
que Nestin está expresso em 57% das células no D4, 28% no D5 e 37% no D7. Assim
como observado para Brachyury-T, o mesmo padrão de co-localização com Coup-TFII foi
observado para a marcação com Nestin, onde 77%, 94% e 96% das células expressando
Nestin, nos dias 4, 5 e 7 de diferenciação, respectivamente, estão contidas nas células
positivas para Coup-TFII (Fig. 16).
50
Figura 15: Análise da co-expressão de Brachyury-T e Coup-TFII em CE através de citometria de fluxo.
A: subpopulações celulares positivas para Coup-TFII, Brachyury-T e ambas as marcações. B: representação
gráfica da porcentagem de células positivas para Brachyury-T, Coup-TFII e ambas as marcações. Controle
negativo foi realizado com células que não receberam anticorpo (Branco) e Controle de Isotipo. Resultados
expressos em média ± SEM. * p ≤ 0,05 e ** p≤0.01.
51
Figura 16: Análise da co-expressão de Nestin e Coup-TFII em CE através de citometria de fluxo. A:
subpopulações celulares positivas para Coup-TFII, Nestin e ambas as marcações. B: representação gráfica da
porcentagem de células positivas para Nestin, Coup-TFII e ambas as marcações. Controle negativo foi
realizado com células que não receberam anticorpo (Branco). Resultados expressos em média ± SEM. * p ≤
0,05 e ***p≤0.001.
52
A co-expressão de Coup-TFII com marcadores de precursores dos folhetos
germinativos foi então analisada através da técnica de IF dupla para se determinar a relação
espacial entre estas populações celulares. Primeiramente, a localização simples de
Brachyury-T em CE no D5 revelou que Brachyury-T é detectado no núcleo de células, e
que, em alguns CE, pode ser observado uma restrição hemisférica das células Brachyury-Tpositivas (Fig. 17AI e II, setas).
A expressão de Foxa2 em CE no D4 também se encontra nuclear, porém, a
localização dessas células não se restringe a uma região específica, formando populações
de células Foxa2 positivas distribuídas por todo o CE (Fig. 17B I e II).
O protocolo utilizado para detecção de marcadores dos folhetos em CE íntegros não
foi reproduzível para a expressão de Nestin. Para detectar a expressão desse marcador,
dissociamos as células de CE D5, plaqueamos e após 4 horas realizamos a imunomarcação.
A expressão de Nestin foi observada como filamentos ao redor do núcleo (Fig. 17C I, II).
53
Figura 17: Expressão de marcadores dos folhetos germinativos em CE. A: Expressão de Brachyury-T no
núcleo de células que se localizam, preferencialmente, em uma das extremidades dos CE, I e II. B: Expressão
de Foxa2 no núcleo de populações de células distribuídas por todo o CE, I e II. C: Expressão do filamento
intermediário, Nestin em células de CE D5 dissociadas e aderidas. Barras: 50 µm.
54
5. DISCUSSÃO
5.1 – Padrão hemisférico de expressão de Coup-TFII em CE
A diferenciação de CTE em CE tem sido um dos principais modelos in vitro para o
estudo do desenvolvimento embrionário em mamíferos (Leahy et al., 1999). Apesar de
possuirmos um vasto conhecimento quanto às bases moleculares, celulares e teciduais do
desenvolvimento embrionário, e também sobre as bases moleculares da diferenciação
celular de CTE, ainda existem grandes lacunas de conhecimento na interface entre os
mecanismos intrínsecos das CTE, que seriam capazes de reproduzir os processos biológicos
que ocorrem no embrião, em uma placa de petri. Uma das questões ainda em aberto seria o
quanto dos mecanismos de padronização dos eixos embrionários seria intrínseco às CTE, a
ponto de identificarmos domínios de expressão e movimentos morfogenéticos organizados
de uma forma global nos CE, como observamos nos embriões. Alguns trabalhos já
exploraram esta questão, mas o assunto ainda é tema de conclusões contraditórias (Ten
Berge et al., 2008; Marikawa et al., 2009; Sajini et al., 2012; Van den Brink et al., 2014).
Os resultados desta dissertação corroboram com a existência de um mecanismo de
organização global em CE similar aos mecanismos de padronização embrionária em
camundongos. Neste trabalho, identificamos que o fator de transcrição Coup-TFII, que
possui um papel fundamental na diferenciação celular em embriões, CTE e tumores,
encontra-se expresso em um hemisfério de CE entre o 4o e 7 o dias de diferenciação.
Primeiramente identificamos a dinâmica temporal da expressão de Coup-TFII ao
longo da diferenciação de CE por PCR quantitativo em Tempo Real (qPCR), para
quantificar o acúmulo de transcrito gênico (Fig. 6), e por IF, para detectar a localização do
55
conteúdo proteico (Fig. 7 e 8). A quantificação da expressão de Coup-TFII revelou que,
CTE indiferenciadas e CE D3 apresentam uma quantidade basal de transcritos (Fig. 6).
Entretanto, este nível de transcrição basal não foi suficiente para detectarmos marcação
para Coup-TFII por IF nas CTE (Fig. 7d) e nos CE D3 (Fig. 7a-d).
No D5, observou-se um maior nível de transcrição de Coup-TFII, que atingiu um
pico no D13, estando em menor nível no D18. Esta dinâmica transcricional foi também
observada por técnica de IF. Nesta análise Coup-TFII começa a ser expresso no D4, tendo
um padrão disperso e indicando uma localização citoplasmática e em algumas células,
aparentemente nuclear. Esta marcação se torna evidentemente nuclear a partir do D5, e o
número de células positivas para Coup-TFII aumenta com o passar do tempo. Apesar de
não termos realizado quantificações na marcação por IF, um maior número de células
positivas para Coup-TFII pode ser observado entre D10 e D15 (Fig. 8 a-h).
O mais fascinante desta caracterização foi perceber que, entre D4 e D7, a expressão
de Coup-TFII encontra-se restrita a um hemisfério dos CE. Notamos que, mesmo antes da
localização do conteúdo proteico estar acumulada no núcleo das células, a tradução da
proteína já aparenta estar acontecendo somente em um dos hemisférios do CE (Fig. 10).
A caracterização do padrão de transcrição de Coup-TFII nos CE, através da técnica
de hibridação in situ, revelou que a polarização de Coup-TFII já ocorre no nível de
regulação transcricional, uma vez que os transcritos encontram-se localizados em um
hemisfério do CE (Fig. 14B). O próximo passo foi então utilizar marcadores tipos
celulares-específicos para estabelecer uma relação entre a expressão hemisférica de CoupTFII com os principais marcadores dos folhetos germinativos no embrião.
Marcadores moleculares que identificam células precursoras dos folhetos
germinativos já foram amplamente caracterizados durante a diferenciação de CE
56
diferenciados a partir de CTE de camundongos (Leahy et al., 1999; Fuchs et al. 2012;
Sajini et al., 2012) e humanas (Itskovitz-Eldor et al., 2000; Pekkanen-Mattila et al., 2010).
Em poucos casos foi identificado padrões de regionalizações globais destes precursores,
levantando uma forte hipótese de que a formação das linhagens germinativas nos CE segue
um padrão de localização estocástico, variando de CE para CE.
Portanto, estabelecendo-se uma relação entre a expressão de Coup-TFII com a
expressão destes marcadores, poderíamos acessar se a divisão de CE em hemisférios
moleculares teria algum impacto na formação dos folhetos germinativos que,
aparentemente, não refletem qualquer organização global. Alternativamente, esta expressão
hemisférica de Coup-TFII nestes CE poderia representar um artefato molecular, como o
read-out de algum mecanismo de polarização embrionária que, nos CE, não chega a
estabelecer relação com a formação dos diferentes tipos celulares. Para esta análise
utilizamos as técnicas de citometria de fluxo e IF dupla.
Apesar de o laboratório ter adquirido pelo menos três anticorpos para marcadores de
cada folheto germinativo, baseando a escolha nas publicações mais recentes que relatam o
sucesso do uso destes para estes fins, a maioria dos anticorpos não funcionaram como
esperávamos. Até o momento, assumimos que tal insucesso está relacionado com os
anticorpos adquiridos, uma vez que o laboratório possui ampla experiência em IF duplas
com diversos anticorpos primários e secundários, e por termos contado com a colaboração e
suporte do grupo do pesquisador Alessandro Farias, que realiza citometria de fluxo
rotineiramente em seu laboratório. Apesar disso, os protocolos seguem sendo aperfeiçoados
no laboratório buscando-se obter sucesso no uso destes anticorpos.
De qualquer modo, o uso da técnica de citometria de fluxo nos possibilitou
estabelecer uma relação entre a expressão de Coup-TFII e células expressando os
57
marcadores Brachyury-T e Nestin (Fig.15 e 16). Esta análise revelou que ambas populações
de células expressando estes marcadores estão contidas na população Coup-TFII-positiva.
99,6% de todas as células Brachyury-T positivas também expressam Coup-TFII, enquanto
95% das células Nestin-positivas também expressam Coup-TFII. Interessantemente, se
considerarmos somente as células Coup-TFII-positivas, na comparação com Brachyury-T,
27% das células Coup-TFII-positivas seriam precursores mesodérmicos, enquanto que na
comparação com Nestin, 52% das células Coup-TFII-positivas seriam precursores
neuroectodérmicos. Se subtrairmos os 52% de células Nestin-positivas dos 73% de células
Coup-TFII-positivas que não são precursores mesodérmicos (100% - 27% Brachyury-T
positivas), restariam 21% de células Coup-TFII-positivas que não seriam precursores
mesodérmicos ou neuroectodérmicos.
Esta porcentagem de células Coup-TFII-positivas não-mesodérmicas e nãoneuroectodérmicas também é observada se invertermos a comparação, subtraindo os 27%
de células Brachyury-T-positivas dos 48% de células Coup-TFII-positivas que não são
precursores neuroectodérmicos (100% - 52% Nestin positivas). Diante destes resultados,
realizamos a citometria de fluxo simples para Foxa2 no D4 e identificamos que cerca de
25% das células do CE expressam Foxa2 (dados não mostrados). Como não podemos
comparar as populações Coup-TFII-positivas com as Foxa2-positivas (anticorpo de CoupTFII e Foxa2 feitos em coelho) no momento, a identidade das cerca de 20% Coup-TFIIpositivas mais Brachyury e Nestin-negativas, assim como a dos 35% de células Coup-TFIInegativas nos CE, permanece desconhecida.
Como uma observação adicional, vale ressaltar que em CE D4, observamos cerca de
56% das células positivas para Nestin. Considerando o estádio inicial de diferenciação
destas células, consideramos esta uma porcentagem alta para representar precursores
58
neuroectodérmicos. Apesar de ser comumente utilizado como um marcador de
neuroectoderme, há relatos de que Nestin não seria um marcador exclusivo de progenitores
neurais (Kaeagushi et al., 2001). Trabalhos relatam sua expressão em populações de células
não neurais, como progenitores de ilhota pancreáticas (Zulewski et al., 2001), músculo
esquelético (Sejersen e Lendahl, 1993) e de células endoteliais (Lardon et al., 2002). Esta
característica poderia justificar a relativamente alta porcentagem de células Nestin-positivas
observadas neste trabalho. Entretanto, a dinâmica da expressão de Nestin observada aqui
reproduz a relatada pela literatura, sendo inicialmente expresso por volta do 3° dia de
diferenciação em células progenitoras neurais, decaindo durante a progressão da
diferenciação, à medida que as células adquirem destinos neuronais ou gliais (Kaeagushi et
al., 2001; Lumelsky et al., 2001; Wisie et al., 2004).
A participação de Coup-TFII na aquisição de destinos neurais já foi relatada em CE
originados de CTE humanas, onde nos dias iniciais da diferenciação, Coup-TFII está
localizado ao redor de estruturas conhecidas como rosetas neurais, caracterizadas pela colocalização com o marcador neural Pax6. Interessantemente, o nocaute de Coup-TFII
nessas células reduz a expressão de Pax6, no entanto a expressão de Brachyury-T e Sox1,
expresso em estádios mais tardios da diferenciação neural de CTE humanas, não foram
afetadas (Rosa e Brivanlou, 2011).
O próximo passo foi confirmar as co-localizações reveladas por citometria de fluxo
no CE como uma estrutura tridimensional, através de IF. Marcações simples para
Brachyury-T, Nestin e Foxa2 (Fig.17) revelaram padrões de expressões distintas. Enquanto
que células Brachyury-T positivas encontram-se mais distribuídas pelas extremidades e, em
alguns casos, localizadas somente em um hemisfério dos CE, células Foxa2-positivas
formam nítidos aglomerados celulares isolados (Fig. 17 A e B). Apesar de não ter sido
59
possível realizar dupla marcações com Coup-TFII, os domínios de expressão de BrachyuryT e Foxa2 aparentam estar seguindo a subdivisão de populações visualizada para CoupTFII.
Assim como para os anticorpos adquiridos para citometria de fluxo, não obtivemos
sucesso na realização de IF para alguns dos anticorpos, principalmente os anticorpos
produzidos em camundongo (Pax6, Sox1, AFP e Nestin). Intrigantemente, quando testamos
os anticorpos em cortes sagitais de embriões de camundongo conseguimos marcações
específicas para Nestin e AFP. Apesar de inúmeras etapas de otimização do protocolo
(Material e Métodos), esta limitação técnica nos impediu de realizar IF duplas para CoupTFII e marcadores dos folhetos germinativos de modo a mapear a distribuição
tridimensional destas populações celulares nos CE em formação.
Entretanto, os resultados obtidos através das IF simples e citometria de fluxo duplas
revelaram um padrão reprodutível da expressão de Coup-TFII em um dos hemisférios dos
CE, sendo esta população de células Coup-TFII compostas por células precursoras de
tecidos mesodérmicos e dos derivados do neuroectoderma. Interessantemente, a maioria
dos trabalhos na área relatam que células precursoras dos derivados dos folhetos
germinativos se formam com uma distribuição espacial aleatória nos CE (Pekkanen-Mattila
et al., 2010; Sajini et al., 2011).
Talvez o mais forte indício seja o trabalho de Sajini et al., (2011), que analisaram o
destino das células que deixavam de expressar Oct4 durante os primeiros 7 dias de
diferenciação, período que compreende a formação dos três folhetos germinativos e
formação do eixo anteroposterior. Embora constatassem que tanto a sequência de perda de
Oct4 como o início da expressão de marcadores de endoderme (Foxa-2 e AFP) e
mesoderme (Brachyury-T) correspondem temporalmente ao que ocorre em embriões, a
60
distribuição da localização destes marcadores não seguem nenhum padrão global, sendo
observados somente padrões locais de diferenciação.
A co-localização quase que total das células Brachyury-T-positivas e Nestinpositivas com Coup-TFII observada em nosso trabalho indica que ambas populações
celulares estariam restritas a apenas um hemisfério nos CE, nas condições de cultivos
conduzidas neste trabalho. Apesar desta hipótese ser refutada pela maioria dos trabalhos,
Ten Berge et al., (2008) e Marikawa et al., (2009) já demonstraram padrões de expressão
gênica polarizados em CE diferenciados espontaneamente a partir de CTE e células-tronco
de carcinoma embrionário, respectivamente.
Em especial, o trabalho de Ten Berge et al., (2008) traça um paralelo interessante
com os nossos resultados, uma vez que descreve, com relativa profundidade, um
mecanismo de padronização anteroposterior dos embriões com características muito
semelhantes ao observado no embrião. Neste trabalho, Brachyury-T e Foxa2 estão contidos
no domínio de expressão da via de sinalização Wnt, em um dos polos do CE no 4° dia de
diferenciação. No polo oposto, os autores relatam a marcação dos fatores de especificação
de neuroectoderma os marcadores Otx2, Pax6 e Sox1. Neste cenário, a via Wnt estaria
delimitando a região do CE onde os precursores mesodérmicos e endodérmicos estão se
formando.
Nossos resultados indicam que o domínio de expressão de Coup-TFII nos CE
estaria parcialmente sobreposto ao da via Wnt, onde na região de sobreposição Coup-TFIIWnt estariam os precursores mesodérmicos, e na região sem sobreposição entre estes dois
fatores estariam os precursores neuroectodérmicos, como ilustrado na Fig.18. Vale ressaltar
que Ten Berge et al., (2008) consideraram as expressões dos fatores e marcadores celulares
como domínios de expressão, sem a detecção destas expressões em nível celular e sem
61
quantificar de alguma forma a co-localização destes domínios de expressão, como foi feito
em nosso trabalho, através de IF e citometria de fluxo duplas, respectivamente.
Com isso, não é possível concluir por este trabalho, por exemplo, se as células
Brachyury-T-positivas ou Foxa2-positivas seriam também positivas para a sinalização Wnt,
ou se estariam somente localizadas no mesmo polo das células Wnt-positivas. Apesar dos
autores provarem um efeito da modulação da via Wnt nos domínios de expressão de
Brachyury-T e Foxa2, esta relação não necessariamente seria célula-autônomo, uma vez
que a sinalização Wnt ocorre através da secreção do fator para o ambiente extracelular.
Entretanto, Van den Brink et al., (2014) mostraram que Brachyury-T está expresso em
células onde a via de sinalização Wnt está ativa. Portanto, é possível que os precursores
mesodérmicos, marcados pela expressão de Brachyury-T, seriam formados a partir da
ativação da via Wnt e da expressão de Coup-TFII.
62
Figura 18: Esquema dos possíveis domínios de localização de Coup-TFII, via de sinalização Wnt e
folhetos germinativos em CE. O domínio de expressão de Coup-TFII estaria parcialmente sobreposto ao da
via Wnt, onde na região de sobreposição Coup-TFII-Wnt estariam os precursores mesodérmicos, BrachyuryT, e no domínio de expressão de Coup-TFII sem sobreposição com a via Wnt estariam os precursores
neuroectodérmicos, Nestin. Na região composta somente pela via Wnt estariam os precursores endodérmicos,
representado por Foxa-2.
Uma limitação importante do nosso trabalho, no estado em que ele se encontra, é a
falta da dupla detecção de Foxa2 e Coup-TFII por citometria de fluxo, resultado que será
obtido com a aquisição de anticorpos adicionais, produzidos em animais que não
camundongo ou coelho.
Outra evidência da existência de um padrão espacial de expressão gênica foi
relatada por Marikawa et al., (2009), onde os autores demonstraram que a expressão de
Brachyury-T encontra-se restrita a uma região de morfologia alongada nos CE com 6 dias
de diferenciação, originados de células-tronco de carcinoma embrionário P19. Além disso,
os autores mostram que ambas características, a morfologia
alongada e a expressão
63
localizada de Brachyury-T, são dependentes da sinalização Wnt/β-catenina, similar ao que
ocorre no embrião durante a formação do eixo anteroposterior.
Recentemente, o grupo do Dr. Alfonso Martinez-Aries, da Universidade de
Cambridge no Reino Unido, baseando-se no trabalho de Marikawa et al., (2009),
manipulou diversas condições de cultivo e vias de sinalização e demonstrou que CE
derivados a partir de CTE podem reproduzir, em grande detalhe, os processos observados
durante a gastrulação (Van den Brink et al., 2014). Em condições específicas de cultivo,
estes CE, denominados pelos autores como gastrulóides, apresentam morfologia alongada e
expressão polarizada de marcadores mesoendodérmicos (Brachyury-T, Tbx6 e Sox17) e
neuroectoderme (Sox1). Quando expostos a indutores ou inibidores de vias de sinalização,
os CE passam a apresentar características morfogenéticas observadas no embrião, como a
modulação da proteína de adesão epitelial E-caderina, o que altera o comportamento das
células dos CE em padrões muito semelhantes às transições epitélio-mesênquima (TEM)
observadas durante a gastrulação.
Somados, estes trabalhos fortalecem o uso de CE como uma entidade biológica
valiosa para o estudo do desenvolvimento embrionário, revelando uma capacidade
intrínseca das células embrionárias de assumirem destinos, comportamento e relações
teciduais de forma muito semelhante ao embrião. Os resultados obtidos neste trabalho não
somente corroboram com estes estudos, mas sugerem um componente completamente novo
neste mecanismo.
Como pode ser visto nas citações acima, todos os demais trabalhos usando CE como
sistema modelo para o estudo do desenvolvimento embrionário exploraram somente
conhecimentos que já haviam sido descobertos no embrião, pois o objetivo foi traçar
paralelos entre o sistema modelo e o sistema biológico. Em nosso trabalho, identificamos a
64
formação de duas populações celulares discretas logo no início da diferenciação (CoupTFII-positivas e Coup-TFII-negativas), sobre as quais aparentam estar segregados os
precursores dos folhetos germinativos embrionários.
Com o emprego de análise de perda e ganho de função de Coup-TFII nas CTE
iremos encontrar os aspectos determinantes desta expressão hemisférica de Coup-TFII nos
CE sobre os folhetos germinativos. Com o estudo do transcriptoma diferencial destas duas
populações de células, Coup-TFII-positivas e Coup-TFII-negativas, iremos não somente
encontrar genes que estão potencialmente regulados por Coup-TFII, mas também genes
cuja expressão diferencial nestas duas populações de células estariam determinando a
expressão de Coup-TFII nos CE.
Por fim, a caracterização dos sítios de ligação de Coup-TFII pela técnica de ChIPseq nos CE irá revelar quais destas relações gênicas entre Coup-TFII e os genes
diferencialmente expressos nas duas populações seria consequência de ligações diretas ou
indiretas deste fator de transcrição nas regiões regulatórias de seus genes alvos. Todas estas
abordagens estão sendo conduzidas em laboratório.
5.2 – Aspectos específicos da expressão de Coup-TFII em CE
5.2.1 – Relação temporal com o desenvolvimento embrionário
A caracterização da expressão de Coup-TFII em CE derivados de CTE murinas
E14Tg2a revelaram que o início da expressão de Coup-TFII ocorre por volta do D4, com
um aumento progressivo da expressão até o pico de expressão por volta do D13 (Fig. 6).
Nossos resultados corroboram com os dados obtidos em CE diferenciados a partir de CTE
humanas (Rosa e Brivanlou, 2011), onde foi também observado um pico de expressão para
65
Coup-TFII por volta do D13. Além disso, o 4o dia de diferenciação corresponde,
aproximadamente, com os estádios E6.5 – E7.5 (Leahy et al., 1999), demonstrando que o
início da expressão de Coup-TFII no D4 em CE correlaciona com o momento em que este
gene começa a ser expresso no embrião de camundongo (Pereira et al., 1999).
Uma forma de explorar nossa pergunta científica mais a fundo foi traçar um paralelo
entre os padrões morfológicos estabelecidos nos CE em estádios mais avançados de
diferenciação com os tecidos embrionários em que Coup-TFII encontra-se expresso durante
o desenvolvimento. Em embriões E14.5, Coup-TFII está localizado majoritariamente no
núcleo de células mesenquimais, apresentando uma localização dispersa por toda a célula
em alguns tecidos epiteliais, enquanto completamente ausente em outros (Fig. 9a). Por
exemplo, Coup-TFII é fortemente detectado no núcleo de células mesenquimais presentes
no pulmão de embriões E14.5, enquanto completamente ausentes das células ductais deste
órgão.
Em CE D15 e D18, Coup-TFII apresenta um padrão de expressão muito similar ao
observado no embrião, estando intensamente localizado no núcleo de células com
característica mesenquimal (asteriscos em Fig. 9b e c), enquanto ausente ou fracamente
expresso em células que apresentam características epiteliais (setas em Fig. 9b e c). Esta
relação da expressão de Coup-TFII entre células epiteliais e mesenquimais sugere um papel
importante deste gene nos processos de TEM e transição mesequima-epitélio (TME)
durante o desenvolvimento embrionário (Tsai e Tsai, 1997). Entretanto, o único relato
descrito sobre a participação de Coup-TFII na TEM foi durante o desenvolvimento de
tumores, onde Coup-TFII possui um papel inibitório no processo de TEM, associada à
capacidade de metástases tumorais, induzido pela sinalização TGF-β (Zhang et al., 2014).
66
Portanto, baseado na conservação do padrão específico de expressão de Coup-TFII
entre células epiteliais e mesenquimais em CE, nossos resultados sugerem que análises de
perda e ganho de função de Coup-TFII durante a diferenciação de CTE como CE pode ser
uma importante abordagem para o estudo das bases moleculares da TME durante o
desenvolvimento embrionário.
A localização das células com características epitelias na periferia dos CE formam
uma estrutura muito semelhante a endoderme primitiva observada em estágios iniciais do
desenvolvimento embrionário e que já foi descrita em CE com 3 a 5 dias de diferenciação
(Rula et al., 2007).
Entretando em nossos experimentos essa estrutura foi observada
somente em CE D15 e D18, porém para confirmar se essas células podem ser endoderma
primitiva, torna-se necessário a identificação com marcadores específicos, como Dab2 e
Gata 4 (Rula et al., 2007).
5.3 – Fatores que influenciam na organização celular/tecidual dos CE
5.3.1 – Expressão dos fatores de pluripotência das CTE
A pluripotência das CTE é demosntrada através da expressão de fatores de
transcrição tais como Oct4, Sox2, Nanog e Klf4 responsáveis por manterem essas células
no estado indiferenciado e com características pluripotentes. Entretanto o nível de
expressão desses fatores entre diferentes células pode variar de acordo com as substâncias
utilizadas para manter a pluripotência. CTE cultivadas em meio contendo LIF podem
apresentar expressão heterogênea, por exemplo, de Nanog como demonstramos na Fig. 5c.
67
Porém quando as CTE são cultivadas em meio básico contendo inibidores de GSK3
e ERK, conhecidos como 2i, as células apresentam um estado homogêneo de pluripotência,
no qual o nível de expressão de Nanog se torna homogêneo entre as CTE, o que não é
encontrado em condições de cultura na ausência desses inibidores (Ying et al., 2008; Wray
et al., 2010).
A importância de se buscar métodos para manter uma expressão homogênea dos
fatores de pluripotência em CTE se deve ao fato de que o conjunto de fatores que uma
célula indiferenciada expressa e a sequência com que a expressão desses genes diminui
diferem entre células que adquirem diferentes destinos celulares, influenciando na
diferenciação celular (Thomson et al., 2011; Trott e Martinez Arias, 2013).
5.3.2 – Composição do meio de cultura
Muitos trabalhos relatam que a ausência de um padrão organizacional nos CE pode
ser devido à dificuldade em se controlar as condições durante a cultura, como a composição
de fatores do meio utilizado, qualidade do soro fetal bovino (SFB) e o tamanho dos
agregados (Kibiak, 2012; Van den Brink et al., 2014). Neste trabalho, observamos uma
variação na expressão de Coup-TFII nos diferentes experimentos. Apesar da maioria dos
CE apresentarem a marcação hemisférica para Coup-TFII, notamos que, em alguns
experimentos, esta marcação não foi observada em nenhum CE. Notamos também que isso
ocorreu quando a cultura dos CE foi realizada com um SFB de lote diferente do que havia
sido utilizado nos experimentos iniciais. A simples troca do lote, na aquisição de uma nova
alíquota, foi suficiente para voltarmos a observar a marcação hemisférica de Coup-TFII. É
sabido que o SFB é composto por uma variedade de fatores de crescimento e inibidores que
68
podem influenciar a diferenciação celular, sendo que a composição pode variar entre
diferentes lotes e por isso apresentarem eficácias diferentes durante a diferenciação de CTE
(Abe et al., 1996; Kibiak, 2012).
A concentração de glicose no meio também pode influenciar na diferenciação de
CTE. CE cultivados em meio com alta glicose (25mM - high glucose; HG) originam
derivados dos três folhetos germinativos, enquanto que, baixas concentrações de glicose
(5.5mM - low glucose; LG) induz principalmente a diferenciação em células de linhagem
neural (Mochizuki et al., 2011; Kibiak, 2012). Isto nos levou a realizar a diferenciação de
CE em meio básico DMEM com alta porcentagem de glicose (high glucose).
5.3.3 - Número inicial de células compondo os CE
Variações no número de células também podem influenciar o curso da diferenciação
(Kubiak, 2012; Van den Brink et al., 2014; Bedzhov e Zernicka-Goetz et al., 2014). A
diferenciação de CE com baixo número inicial de células é mais amplamente utilizada por
apresentar um padrão de diferenciação semelhante a embriões, sendo que uma das
explicações é que baixas quantidades de células se aproximam da composição encontrada
no epiblasto no período de implantação, esperando-se portanto uma recapitulação dos
eventos morfogenéticos encontrados in vivo. No entanto, acredita-se que CE são geralmente
formados com quantidades bem mais elevadas, o que explicaria a diferenciação
desorganizada encontrada na maior parte dos artigos relatados (Sajini et al., 2012).
A relação entre a quantidade inicial de células compondo o CE e seu padrão de
diferenciação celular foi recentemente descrita por Van den Brink et al., (2014). CE com
aproximadamente 200-400 células exibiram uma morfologia alongada coincidente com a
69
expressão polarizada de marcadores de mesoendoderme, tais como Brachyury-T, Tbx6,
Sox17, similar ao que ocorre em embrião durante a padronização do eixo anteroposterior.
Por outro lado, CE formados com mais de 600 células se desenvolveram de uma forma
desorganizada, a qual é geralmente relatada em CE.
Entretanto, realizamos experimentos para testar esta relação em nosso trabalho e
não observamos variações evidentes na expressão polarizada de Coup-TFII. CE formados a
partir de 500, 1000 ou 2000 células apresentaram a expressão de Coup-TFII restrita a um
dos hemisférios, sendo observado diferença somente no tamanho médio dos CE observados
em cada experimento (Fig. 12 e 13).
No D7, foi possível observar CE apresentando morfologias alongadas, semelhantes
aos observados por Marikawa et al., (2009) e Van den Brink et al., (2014). Porém,
diferentemente dos resultados obtidos por Van den Brink et al., (2014), que obtiveram CE
com morfologia alongada quando estes eram formados com 200 – 400 células e com a
adição de um ativador da via de sinalização Wnt, nós encontramos essa morfologia em CE
formados com 1000 e 2000 células, onde coincidentemente a expressão de Coup-TFII se
localiza restrita a uma das extremidades do CE.
70
6.CONCLUSÕES
1)
A localização hemisférica da expressão de Coup-TFII, detectada nos estádios inicias
de diferenciação celular (D4 – D7), juntamente com o fato de cerca de 99% das células
expressando Brachyury-T, marcador mesodérmico, e 95% das células expressando Nestin,
marcador de neuroectoderme, co-expressarem Coup-TFII, corroboram com a existência de
um mecanismo de organização global intrínseca em CE, onde a população de células CoupTFII-positivas espacialmente localizada, pode estar atuando na segregação de folhetos
mesodérmicos e neuroectodérmicos.
2)
A caracterização da expressão de Coup-TFII durante a diferenciação de CTE em CE
demonstrou que o dia de diferenciação em que a expressão de Coup-TFII é primeiramente
observada, corresponde com o estádio em que a expressão de Coup-TFII é primeiramente
observada em embriões de camundongos. Além disso, a dinâmica de expressão de CoupTFII reportada aqui, com um aumento progressivo da expressão e um pico por volta do
D13, é muito semelhante à dinâmica deste gene em CE diferenciados a partir de CTE
humanas.
3)
A regulação da expressão de Coup-TFII em tecidos epiteliais e mesenquimais
demonstrou ser muito semelhante entre nossos resultados nos CE D15 e D18 com o estádio
embrionário correspondente E14,5, com a expressão de Coup-TFII sendo fortemente
marcada em células mesenquimais, enquanto praticamente ausente em células epiteliais.
71
72
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