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Universidade Federal de Sergipe
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Núcleo de Pós-Graduação em Química
Curso de Pós-Graduação em Química
GILDERMAN SILVA LÁZARO
ESTUDO ESPECTROSCÓPICO DA INTERAÇÃO DE
PIRIMETAMINA E SULFADIAZINA COM SISTEMAS
MODELOS DE MEMBRANAS BIOLÓGICAS
São Cristóvão
Sergipe – Brasil
2006
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
ESTUDO ESPECTROSCÓPICO DA INTERAÇÃO DE
PIRIMETAMINA E SULFADIAZINA COM SISTEMAS
MODELOS DE MEMBRANAS BIOLÓGICAS
GILDERMAN SILVA LÁZARO
Dissertação apresentada ao Núcleo de PósGraduação em Química da Universidade Federal
de Sergipe, para a obtenção do Título de Mestre
em Química.
Orientador: Prof. Dr. Luis Eduardo Almeida
Co-orientador: Profa. Drª. Ledjane Silva Barreto
São Cristóvão - SE
2006
Dedico este trabalho a minha família, por ser a base sólida de
total integridade e harmonia, que sempre contribuiu para o
fortalecimento dos pilares, que dão sustento as minhas
conquistas profissionais e pessoais.
ii
AGRADECIMENTOS
Transcrever os sentimentos de agradecimentos a todos que contribuíram para
a realização deste trabalho foi uma das etapas mais difícil durante processo de
elaboração do mesmo. No entanto, na impossibilidade de evitar paradoxo, gostaria
de agradecer:
• Ao Profº Dr. Luis Eduardo Almeida, por me aceitar como orientando, pela total
disposição nos momentos solicitados, pela confiança depositada durante o
desenvolvimento das atividades e pela total integridade na condução da
realização deste trabalho. Professor, você é o máximo!!!
• A Profª Dra. Ledjane Silva, por contribuir na escolha do meu orientador e por se
fazer presente em todos os momentos seja como co-orientadora ou conselheira.
Você é um grande exemplo de profissional.
• Ao Profº Dr. Nivan Bezerra, pela grande contribuição prestada a este trabalho
através da realização de cálculos teóricos computacionais.
• A Profª Dra. Marina Menezes, por contribuir com o meu interesse por pesquisa
através do incentivo e confiança depositada em me durante a graduação.
Obrigado professora!
• As professoras Dras Luciene e Iara, pelas mudanças sugeridas durante o meu
exame de qualificação.
• A Profª Dra Eunice e ao Profº Dr. Reinaldo, pela contribuição dada com testes
calorimétricos.
• Aos técnicos dos laboratórios, que sempre contribuíram para um bom andamento
das minhas atividades, através do fornecimento de materiais.
• A todos do departamento de química que contribuíram para que este trabalho
fosse realizado.
• Aos estudantes de iniciação científica: Alisson, Adelmo e Osmi, pela
cooperatividade durante a convivência no laboratório. Sem vocês este trabalho se
tornaria mais exaustivo.
• As minhas amigas da pós-graduação: Alane, Edjane, Elane e Tatiane, pelo
carinho durante todo o processo da pós, por me erguer nos momentos mais
iii
críticos, pelos bons momentos que passamos durante alguns fins de semana e
por ser minhas amigas. Gosto muito de vocês.
• A minha amiga Ana Paula (Paulinha), pela grande ajuda na confecção desta
dissertação. Obrigado, tenho muita admiração e carinho por você.
• As minhas amigas: Andréa, Glyêise, Adelaide, Paloma, Vágna, Oara, e Marilia,
pela presença e apoio nos momentos da minha vida.
• Aos meus grandes amigos: José Antonio, Givaldo e Renilson, pela grande
amizade, carinho, incentivo e apoio. Sem vocês não me sentiria tão forte para
chegar aonde cheguei.
• Aos meus irmãos: Ana, Janete, Julita, Antonio, José, Jaime e Gilmar, pelo amor,
respeito e admiração. Vocês são a base que rege minha integridade moral.e
emocional. Amo vocês.
• Aos meus Pais Jaime e Eliza, em especial a minha mãe, que sem ela jamais teria
chegado aonde chegue. Obrigado, vocês são a razão da minha vida.
• A todos que contribuíram para que este trabalho pudesse acontecer.
• Ao FINEP e CNPq pelo apoio financeiro.
iv
Curriculum Vitae
Março/2006
Dados Pessoais
Nome
Gilderman Silva Lázaro
Filiação
Jaime Lázaro Santos e Eliza Silva Lázaro
Nascimento 12/03/1967 - Ilha das Flores/SE - Brasil
Formação Acadêmica/Titulação
Conclusão
2002
Graduação em Química Licenciatura.
Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristóvão, Brasil
Em andamento Mestrado em Química.
Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristóvão, Brasil
Atuação Profissional
1.
Centro Federal de Educação Tecnológica de Sergipe - CEFET-SE
Vínculo
institucional
1995 -
Vínculo: Efetivo, Enquadramento funcional: Técnico em
Química.
Função: Coordenador
v
2.
Governo do Estado de Sergipe - GOVERNO/SE
Vínculo
institucional
Colégio Estadual Professor José Barreto Fontes (DRE’8).
2004-
Professor de Química.
Trabalhos resumidos publicados em anais de evento
1.
LÁZARO, G. S., JESUS, S. C. de, CARVALHO, J. de, SANTOS FILHA, M. M.
Peroxidase da Cajarana (Spondias dulcis, A.): Extração, Purificação e Propriedades
Bioquímicas. In: 12o ENQA, São Luis – MA .12o Encontro Nacional de Química
Analítica, 2003. p.OT003.
2.
LÁZARO, G. S., JESUS, S. C. de, CARVALHO, J. de, SANTOS FILHA, M. M.;
Purificação e Caracterização Bioquímica da Peroxidase em Frutos da Família
Anonácea - Pinha (Anoma Squamosa L.) In: SBQ 26 Anos, 2003, Poços de Caldas.
26a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. , 2003. p.TC044.
3.
LÁZARO, G. S., SILVA, I. S. M. da, ANDRADE, D., LIMA, P. S. de, ALMEIDA, L. E.;
O Ciclo de Krebs: Reeducação Alimentar e o Estudo Termoquímico In: Xi Encontro
Nacional de Ensino de Química, 2002, Recife. XI ENEQ- Ciência, Tecnoliogia,
Ambiente e Sociedade na Educação Química: O Desafio da Interação. , 2002.
v.Único. p.130 – 130.
vi
4.
LÁZARO, G. S., JESUS, S. C. de, CARVALHO, J. de, SANTOS FILHA, M.
M..Otimização da Extração da peroxidase da Pinha (Anoma Squamosa L.) Via
Metodologia de Superfície de Resposta In: SBQ 25 Anos: Passado Presente e
Futuro, 2002, Poços de Caldas. Livro de Resumos da Sociedade Brasileira de
Química. , 2002. v.Único. p.TC009 - TC009.
5.
LÁZARO, G. S., SANTOS FILHA, M. M., JESUS, S. C. de, VIEIRA, I. C.,
CARVALHO, J. ; Estudo Termocinético da Enzima Polifenol Oxidase Como uma
Alternativa as Constantes Km e Vmax In: A Química na América Latina/ Integração e
Desenvolvimento Sustentável., 2001, Poços de Caldas. Anual da Sociedade
Brasileira de Química, 2001. v.Único. p.QA126 - QA126
6.
SANTOS FILHA, M. M., LÁZARO, G. S., CABRAL, A. C., CARVALHO, J.;
Parâmetros Cinéticos Km e Vmax da Polifenol Oxidase da Jaca In: XL Congresso
Brasileiro de Química, 2000, Recife. Química: Ontem, Hoje e Amanhã. , 2000.
v.Único. p.18 - 18
Atividades Desenvolvidas Durante o Curso de Mestrado
Publicação em anais de evento
1.
ALMEIDA, L. E., LÁZARO, G. S., MENEZES Jr., A.L., MACEDO, O. F. L., SANDOS
dos, A. G., COSTA Jr., N. B. E BARRETO, L.S.. Estudo da Interação da
Pirimetamina com Micelas (SDS, CTAC, HPS E Brij-35) Via Fluorescência.
In: 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2006. Águas de Lindóia.
Livro de Resumos da 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química.
2006.
vii
2.
ALMEIDA, L. E., LÁZARO, G. S., MENEZES Jr., A.L., MACEDO, O. F. L., SANTOS
dos, A. G., COSTA Jr., N. B. E BARRETO, L.S.. Estudo de Absorção Óptica de Duas
Drogas Antitoxoplasmose: Pirimetamina e Sulfadiazina In:28ª Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas. Livro de Resumos da
28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. 2005.
Cursos
1.
Mecanismo de Tansdução Celular. II Workshop de Química e Biotecnologia. 28 a
30 de setembro de 2005.
2.
Integração Universidade-Empresa: Os Caminhos da Pós-Graduação em
Química. IV Workshop de Pós-Graduação em Química. 25 a 26 de novembro de
2004.
Artigo Submetido
1.
LÁZARO, G. S, MENEZES Jr., A.L., MACEDO, O. F. L., SANTOS dos, A. G.,
COSTA Jr., N. B. E BARRETO, L. S, ALMEIDA, L. E.Spectroscopy Studies of the
Interaction of Pyrimethamine and Sulfadiazine with Micelles. Biochimica et.
Biophysica Acta, 2006. (em preparação)
viii
2.
VIEIRA, E. F. S., CESTARI, A. R., LOPES, E. C. N., BARRETO, L.S., LÁZARO,
G.S., ALMEIRA, L.E.; Determination of Kinetc Parameters From Isothermal
Calorimetry for Interaction Processes of Pyrimethamine With Chitosan Derivatives.
Journal of Colloid and Interface Science, 2006.
ix
ÍNDICE
Índice de tabelas..........................................................................................
xii
Índice de figuras...........................................................................................
xiii
Lista de símbolos e abreviações..................................................................
xvi
Resumo.......................................................................................................... xviii
Abstract.......................................................................................................... xix
Capítulo 1 – Introdução.................................................................................
1
1.1 Toxoplasmose..........................................................................
1
1.2 A Membrana biológica............................................................
5
1.3 Interação fármaco receptor....................................................... 11
1.4 Absorção UV-Vis......................................................................
13
1.5 Fluorescência...........................................................................
17
Capítulo 2 – Objetivos...................................................................................
22
2.1 Geral.........................................................................................
22
2.2 Específico.................................................................................
22
x
Capítulo 3 – Seção Experimental..................................................................
23
3.1 Determinação da solubilidade da pirimetamina (PIR) e
sulfadiazina (SDZ)........................................................................
23
3.2 Determinação dos parâmetros espectroscópicos (ε e λmáx) da
pirimetamina (PIR) e sulfadiazina (SDZ).............................
23
3.2 Determinação teórica da transição eletrônica da pirimetamina
(PIR) e sulfadiazina (SDZ)....................................
24
3.3 Determinação dos valores de pKa............................................
24
3.4 Determinação das constantes de associação (Kb) da PIR e
SDZ em micelas...........................................................................
Capítulo 4 – Resultados e Discussões.........................................................
4.1
Determinação
dos
parâmetros
espectroscópicos
25
28
da
pirimetamina...............................................................................
28
4.2 Determinação do pKa pirimetamina...........................................
33
4.3 Determinação da constante de associação da pirimetamina
às micelas.....................................................................................
4.4
Determinação
dos
parâmetros
espectroscópicos
41
da
sulfadiazina..................................................................................
4.5 Determinação do pKa sulfadiazina............................................
48
53
4.6 Determinação da constante de associação da sulfadiazina às
micelas.....................................................................................
xi
58
Capítulo 5 – Conclusões...............................................................................
61
Capítulo 6 – Perspectivas Futuras................................................................
62
Capítulo 7 – Bibliografia...............................................................................
63
xii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Coeficiente de absortividade molar das soluções de PIR nos pH
4,0, 7,0 e 9,0................................................................................. 32
Tabela 2. Energia de interação entre um próton (H+) e um nitrogênio da
Pirimetamina................................................................................. 34
Tabela 3. Valores de pKa para PIR 8,85 x 10-5 mol.L-1 em tampão triplo 20
mmol.L-1 obtidos da titulação espectrofotométrica na presença
e ausência de micelas..................................................................
38
Tabela 4. Comprimentos de onda de máxima emissão para a PIR na
presença e ausência de surfactante nos pH 4,0, 7,0 e 9,0..........
42
Tabela 5. Constantes de associação para a PIR (1 x 10-5 mol.L-1) em
surfactantes aniônicos (SDS), catiônicos (CTAC), zwiteriônico
(HPS) e neutro (Brij-35®)..............................................................
43
Tabela 6. Coeficiente de absortividade molar das soluções de SDZ nos
pH’s 4,0, 7,0 e 9,0........................................................................
52
+
Tabela 7. Energia de interação entre um próton (H ) e um nitrogênio da
Sulfadiazina..................................................................................
53
-5
Tabela 8. Valores de pKa para SDZ 7,50 x 10 mol/L em tampão triplo
20mmol/L obtidos da titulação espectrofotométrica na presença
e ausência de micelas..................................................................
56
Tabela 9. Constantes de associação para a SDZ (1 x 10-4 mol.L-1) em
surfactantes aniônicos (SDS), catiônicos (CTAC) e zwiteriônico
(HPS)...........................................................................................
xiii
59
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo do Toxoplasma gondii e as fontes de infecção…..............
3
Figura 2. Representação da membrana biológica segundo o Modelo do
Mosaico Fluido.............................................................................
6
Figura 3. Estrutura esquemática do surfactante........................................
7
Figura 4. Representação esquemática micelar……………………………..
7
Figura 5. Representação esquemática das micelas inversas (reversas)
(a) e micelas diretas (b)................................................................
8
Figura 6. Exemplos de surfactante aniônico (SDS), catiônico (CTAC),
zwiteriônico (HPS) e neutro (TRINTON X-100® e Brij-35®)..........
9
Figura 7. Níveis de energia eletrônica molecular.......................................
15
Figura 8. Multiplicidades de spin eletrônico ………………………………..
17
Figura 9. Estruturas de sondas fluorescentes............................................
19
Figura 10. Diagrama parcial de energia de um sistema fotoluminescente... 19
Figura 11. Espectros de excitação e emissão de fluorescência................... 21
Figura 12. Estrutura da Pirimetamina………………………………………..
28
Figura 13. Espectros de Absorção Óptica da PIR em Solução Aquosa e
calculado teoricamente.............................................................
Figura 14. Espectros de Absorção Óptica da PIR em Solventes Orgânicos
29
30
Figura15. Curvas de calibração da PIR obtidas através da espectroscopia
de absorção. (●) pH 4,0, λ = 272 nm e R = 0,9994; (■) pH 7,0, λ
= 274 nm e R = 0,9999 e (▲) pH 9,0, λ = 284 nm e R = 0,9998
Figura 16. Sítios nitrogenados da PIR.......................................................... 34
Figura 17. Dependência da absorção em 272 nm da PIR (8,85 x 10-5
mol.L-1) em função do pH..........................................................
35
Figura 18. Dependência da absorção em 272 nm da PIR (8,85 x 10-5
mol.L-1)
em função do pH em presença de CTAC 40 35
-1
mmol.L ...................................................................................
Figura 19. Dependência da absorção em 272 nm da PIR (8,85 x 10-5
mol.L-1) em função do pH em presença de SDS 120 36
mmol.L-1.................................................................................
xiv
Figura 20. Dependência da absorção em 272 nm da PIR (8,85 x 10-5
mol.L-1) em função do pH em presença de Brij-35® 36
40mmol/L...................................................................................
Figura 21. Espectro da titulação fluorimétrica, da PIR em pH 9,0, na
presença de HPS com concentração na faixa (0,0 a 7 x 103
)mol.L-1. A amostra foi excitada em 286 nm e varredura
efetuada de 300nm a 550nm.....................................................
41
Figura 22. Titulação fotométrica da PIR 1,0 x 10-5 mol.L-1 , em 376 nm,
com CTAC em pH 7,0 e excitação em 274nm.........................
44
Figura 23. Titulação fotométrica da PIR 1,0 x 10-5 mol.L-1 , em 377 nm,
com SDS em pH 4,0 e excitação em 273nm............................
-5
44
-1
Figura 24. Titulação fotométrica da PIR 1,0 x 10 mol.L , em 380 nm,
com HPS em pH 9,0 e excitação em 286nm............................
45
Figura 25. Titulação fotométrica da PIR 1,0 x 10-5 mol.L-1 , 378 nm, com
HPS em pH 9,0 e excitação em 286nm...................................
45
Figura 26. Duplo recíproco obtido da equação 7, para titulação da PIR (1
x 10-5 mol.L-1) em pH 9,0 na presença de Brij-35......................
Figura 27. Estrutura da sulfadiazina………………………………….……..
47
48
Figura 28. Espectros de absorção óptica da SDZ em meio aquoso e
calculado teoricamente..............................................................
49
Figura 29. Espectros de absorção óptica da SDZ em Solventes
Orgânicos..................................................................................
Figura 30. Curvas de calibração
da
SDZ
obtidas
através
50
da
espectroscopia de absorção. (●) pH 4,0, λ = 265 nm e R =
0,9995; (■) pH 7,0, λ = 258 nm e R = 0,9996 e (▲) pH 9,0, λ
= 241 nm e R = 0,9995..............................................................
51
Figura 31. Sítios nitrogenados da SDZ........................................................
53
Figura 32. Dependência da absorção em 241 nm da SDZ em função do
pH..............................................................................................
54
Figura 33. Dependência da absorção em 241 nm em função do pH da
SDZ na presença CTAC 40 mmol.L-1........................................
55
Figura 34. Dependência da absorção em 241 nm em função do pH da
SDZ na presença SDS 120 mmol.L-1................................
xv
55
Figura 35. Dependência da absorção em 241 nm em função do pH da
SDZ na presença SDS 120 mmol.L-1........................................
56
Figura 36. Titulação fotométrica da SDZ 1,0 x 10-4 mol.L-1 , em 265 nm,
com CTAC em pH 7,0............................................................... 58
Figura 37. Titulação fotométrica da SDZ 1,0 x 10-4 mol.L-1 , em 266 nm,
com CTAC em pH 7,0............................................................... 59
xvi
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES
• φ - rendimento quântico de fluorescência
• λ – Comprimento de onda
• A – Absorbância
• AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
• AM1 – Austin model 1
• b – Caminho óptico
• Brij-35® – Polioxietileno-dodecil-éter
• c – velocidade da luz no vácuo
• cmc – Concentração Micelar Crítica
• CTAC – cloreto de cetiltrimetilamônio
• DMSO – Dimetilsulfóxido
• E – energia
• eψ
ψ – equivalente de energia
• eq. – equação
• F – Intensidade de Fluorescência
• h – constante de Planck
• HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
• HPS – N-hexadecil-N, N-dimetil-3-amônio-1-propanossulfonato
• INDO – Intermediate Neglect of Differential Overlap
• K – Constante de Boltzman
• Ka – Constante de equilíbrio de protonação
• Kb – Constante de associação
• kce – Conversão externa
• kci – Conversão interna
• Kd– Constante de dissociação
• kf – Competição de fluorescência
• ki – Conversão intersistema
xvii
• ks – Supressão de vários tipos
• máx – Máximo
• P – Intensidade da luz transmitida
• P0 – Intensidade da luz incidente
• pH – Potencial hidrogenônico
• PIR – Pirimetamina
• S0 – Estado fundamental da molécula
• S1 – Estado eletrônico excitado
• S-CI – Interaction of Configuration Singlet
• SDS – dodecilsulfato de sódio
• SDZ – Sulfadiazina
• T – transmitância
• TRITON X-100® – T-octilfenoxipolietoxietanol
• UV Vis – Ultravioleta – Visível
• ε – Coeficiente de absortividade molar
xviii
RESUMO
O objetivo desse trabalho é o estudo espectroscópico da interação da
pirimetamina (PIR) e da sulfadiazina (SDZ) com sistemas modelos de membranas
biológicas. Esses fármacos são utilizados no tratamento da toxoplasmose, doença
causada pelo protozoário Toxoplasma gondii. Como modelos de membranas,
utilizamos diversos surfactantes: que são SDS, CTAC, Brij-35®, TRITON X-100® e o
HPS. O estudo da interação “fármaco-receptor” tem se intensificado com o
desenvolvimento de carreadores específicos para fármaco de alta toxicidade. A
espectrofotometria de absorção óptica e fluorescência, dentre outras, são as
técnicas mais adequados para o estudo dessas interações. Nesse trabalho,
determinamos os parâmetros espectroscópicos (λmáx e ε) e a solubilidade da PIR e
SDZ em diversos meios, bem como a influência do pH e da presença de
surfactantes nestes parâmetros, como também as constantes de associação (Kb)
foram determinadas. A solubilidade da PIR é máxima em meio ácido (pH = 4,0)
tendo um valor de 160 mg.L-1, enquanto que a SDZ é mais solúvel em meio básico
(pH = 9,0) com solubilidade igual a 186 mg.L-1. A pirimetamina apresenta banda de
absorção bem definida decorrente de transições do tipo π→π*, em torno de 272 nm
(pH = 4,0), 274 nm (pH = 7,0) e em 284 nm (pH = 9,0); e a sulfadiazina apresenta
uma banda bem definida com dois máximos centrados em 241 e 258 nm (em pH 7,0
e 9,0) e em pH = 4,0, há a presença de apenas uma banda centrada em 265 nm. Os
valores teóricos da energia na protonação dos fármacos evidenciam que as mesmas
possuem apenas um valor de pKa. O pKa da pirimetamina e da sulfadiazina é 7,26 ±
0,07 e 6,38 ± 0,02, respectivamente.
As constantes de associação da PIR às micelas evidenciam uma forte
dependência do pH do meio e da carga micelar. Os maiores valores foram
encontrados para o CTAC e o HPS em pH 9,0 (da ordem de 1500 e 1000 M-1,
respectivamente). Já a SDZ apresenta constantes em torno de 2 a 3 ordens de
grandeza menores (Kb em torno de 5 a 70 mM-1) e as interações parecem ser
predominantemente hidrofóbicas e sofrem pouca influência da carga micelar.
Palavra Chave: Interação de fármacos, Toxoplasmose, Espectroscopia UV-Vis,
Fluorescência.
xix
ABSTRACT
Spectroscopic studies of the interaction between pyrimethamine (PIR) and
sulfadiazine (SDZ) with biological membranes models systems were presented in this
work. These drugs are used in toxoplasmosis treatment. The toxoplasmosis is a
disease caused by the protozoan toxoplasma gondii. We used the following
surfactantes: SDS, CTAC, Brij-35®, TRITON X-100® and HPS as model of
membranes. Recently studies of drug-receptor interaction have been intensified with
the development of specific carriers to highly toxic drugs. Optical absorption and
fluorescence spectrophotometry, among other, are the most adequate techniques for
the study of these interactions. In this work, spectroscopic parameters (λmáx e ε),
solubility in various media, pH and surfactant influence were determined for PIR and
SDZ. The binding constants (Kb) were also determined. The solubility of PIR is
maximum in acid medium (pH = 4.0), 160 mg.L-1. On the other hand, SDZ is more
soluble in alkaline environment (pH = 9.0), 186 mg.L-1. PIR presents a well defined
absorption band due to π→π* transitions, near 272 nm (pH = 4.0), 274 nm (pH =7.0)
and 284 nm (pH = 9.0). SDZ presents a well defined band with two maxima centered
at 241 and 258 nm (pH 7.0 and 9.0) and at pH = 4.0 there is only one band centered
at 265 nm. Theoretical calculations of energy values of protonated and unprotonated
drugs evidence only one pKa value as confirmed experimentally (pKa = 7.26 and 6.38
for PIR and SDZ respectively).
PIR binding constants to micelles evidence a strong dependence with the pH
and the micelle charge. The highest values were found to CTAC and HPS at pH 9.0
(1500 e 1000 M-1, respectively). The SDZ binding constants are lower than those for
PIR (5 – 70 mM-1) and the interactions seem to be predominantly hydrophobic and
the micelar charge has a low influence.
Key words: drugs interaction; toxoplasmosis; UV-VIS spectroscopy;
fluorescence.
xx
1
1
1.1
INTRODUÇÃO
TOXOPLASMOSE
A toxoplasmose é uma doença geralmente assintomática que atinge grande
parte dos mamíferos e aves no âmbito nacional. Causada pelo protozoário
intracelular, Toxoplasma gondii, pode atingir todos os tipos de células, tendo maior
afinidade pelas células nervosas e ósseas acometendo principalmente cérebro,
pulmões, olhos e a medula em aproximadamente 20% da população mundial [1].
Esse parasita possui como principal hospedeiro os felinos onde age no trato
intestinal produzindo a forma infectante mais resistente e, principalmente, o homem
como hospedeiro intermediário [2]. Em pacientes com sistema imunológico normal, o
parasita pode ficar inativo por tempo indeterminado. No entanto, quando essa
pessoa tornar-se imunodeprimida (com as defesas imunológicas diminuídas) por
qualquer razão (HIV, pacientes que recebem órgãos por transplantes ou são
tratados através de quimioterapias diversas ou mesmo após uma doença muito
debilitante) os sintomas e a doença toxoplasmose podem se manifestar[3].
Paralelamente, o Toxoplasma gondii adquire cada vez mais importância como
patógeno
oportunista,
acometendo
dessa
maneira,
número
crescente
de
imunodeprimidos. Além disso, a partir da década de 80, passou a determinar em
infecções pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) graves distúrbios cerebrais
[4].
O parasita apresenta três formas infectantes que se proliferam em diferentes
velocidades, denominadas de taquizoítos, bradizoítos e oocisto.
Os Taquizoítos são de proliferação rápida presentes em grande número nas
infecções agudas. Devido ao tamanho (2–8 µm) neste estágio, a penetração em
células torna-se mais fácil, pois a disseminação dessa forma em líquidos biológicos
é muito elevada. A atividade do taquizoíto no meio ambiente ou na carcaça do
hospedeiro leva algumas horas, porque é incapaz de proliferar sem penetrar em
uma nova célula [2, 5].
2
Os Bradizoítos são uma forma de proliferação extremamente lenta, presente
nas infecções congênitas e crônicas. Devido a sua longevidade, organizam-se aos
milhares em cistos teciduais como músculo, miocárdio e sistema nervoso em
tamanho variando de 10 a 100 µm de diâmetro. Neste estágio podem sobreviver nos
tecidos, por alguns dias, mas são mortos se congelados a -20ºC, aquecidos a 65ºC
ou submetidos à radiação ionizante [2, 5].
Oocistos é a forma infectante produzida no trato gastrointestinal do felino,
resultante do ciclo sexuado do parasita. Os oocistos são eliminados nas fezes, ainda
não esporulados, necessitando de 1 a 5 dias para esporulação e se tornar
infectante. Após sua maturação, tornam-se viáveis no meio-ambiente por muitos
meses e até anos, dependendo das condições ambientais, sendo extremamente
resistentes a esterilizantes químicos, temperaturas extremas (20ºC até 37,5ºC) e
processo de secagem, mas destruídos pelo aquecimento a 70ºC por dez minutos [2,
3, 5, 6].
Na Figura 1 pode ser observado o ciclo do parasita e as fontes de infecção.
Onde o gato (1), através das fezes, libera bilhões de oocistos (2) por dia, que
permanecem viáveis no mínimo por 1 ano e resistem a extremos da temperatura
ambiental. Dessa forma é possível a infecção de animais herbívoros (3) e do homem
(4) pela ingestão do oocisto.
O homem é atingido pelo protozoário no contato com o solo, como por
exemplo, através dos tanques de areia, onde os gatos costumam defecar, pelo
hábito de ingestão de carne crua ou mal cozida, migração transplacentária, inalação
de oocistos espolurados, transfusão de sangue e transplante de órgãos, sendo que
a última infecção é rara, porém, pode ocorrer.
Revelada por anticorpos séricos, a prevalência é crescente em grupos etários,
atingindo valores variáveis para diferentes populações, de 30, 50 ou mesmo 90 %
em indivíduos adultos. Em nosso país, no mínimo seis mil bebês nascem por ano
com infecção congênita, que seria evitável se houvesse orientação sanitária e
acompanhamento sorológico nas populações desinformadas [1, 2, 7].
A infecção congênita e em pacientes imunodeprimidos, como os portadores
do HIV, é muito preocupante, uma vez que, o tratamento dessa doença é dificultado
e pode levar à morte do indivíduo, devido aos efeitos colaterais dos fármacos
existentes. No caso de mulheres grávidas, o feto acometido pode nascer com
3
seqüelas caso venha a sobreviver; e em pacientes com AIDS pode ocorre uma
reinfecção com potencial mais elevado ocasionando o óbito [2, 8-10].
Pesquisas
recentes
buscam
o
desenvolvimento
de
uma
vacina
antitoxoplasmose, obtendo-se bons resultados para uso veterinário [11]. No caso da
toxoplasmose humana, vem sendo evidenciado o fortalecimento do patógeno com
essas vacinas experimentais, não sendo aprovado para uso humano. A busca de
medicamentos antitoxoplasmose com uma maior eficácia e menores efeitos
colaterais é um grande desafio, pois por ser uma doença de maior incidência na
classe mais pobre os investimentos não são expressivos.
Figura 1 – Ciclo do Toxoplasma gondii e as fontes de infecção [12].
4
O
tratamento
da
Toxoplasmose
conta
ainda
com
uma
gama
de
medicamentos disponíveis com ação eficaz antiparasitária e com uma intensa
possibilidade de reações adversas, inibindo o tratamento da doença.
Atualmente as alternativas de medicamentos que são mais aceitas, por ordem
de preferência, são a pirimetamina (PIR), sulfadiazina (SDZ), azitromicina,
clindamicina, sulfametoxazol e trimetoprim, espiramicina e atovaque. A PIR é o
fármaco que mostra maior eficácia com ação antiparasitária, como demonstrado por
estudos feitos por Holland e colaboradores [13] e Bosch-Driessen e colaboradores
[14]. O mecanismo de ação do fármaco está relacionado à utilização do ácido fólico
pelo parasita e ocorre através da inibição da enzima dihidrofolato redutase,
responsável pela conversão do ácido fólico em ácido folínico, interferindo assim na
síntese dos ácidos nucléicos, levando a erros de divisão nuclear, durante o processo
de replicação do parasita. Contudo, o seu efeito colateral leva a depressão medular
e descontinuidade do tratamento em aproximadamente 25% dos pacientes [13].
Medidas
simples
são
recomendadas
no
tratamento
profilático
da
Toxoplasmose e, geralmente, estão associadas a hábitos alimentares e contato com
excreção e secreção de animais [2]. Ou seja, a cocção adequada dos alimentos,
lavagem de frutas e verduras, assepsia das superfícies utilizadas na preparação dos
alimentos e remoção de fezes dos felinos, diariamente, são medidas importantes a
fim de precaver a proliferação do protozoário.
5
1.2
A MEMBRANA BIOLÓGICA
As pesquisas com as membranas e sistemas modelos de membranas vêm se
intensificando nos últimos tempos. O dinamismo associado às membranas
biológicas confere um papel importante à superfície celular e envolve uma área de
investigação muito importante da bioquímica e biofísica. Do ponto de vista físico, as
membranas desempenham um papel crucial nas células, uma vez que definem os
seus limites entre o exterior e interior, controlando tudo que é transportado através
das membranas. As membranas, além da função de barreira que separa dois tipos
de meio, são sistemas funcionais onde ocorrem processos celulares fundamentais, e
conhecendo a composição fisiológica da membrana, pode-se compreender como as
células se relacionam com o meio, como elas se comunicam, se diferenciam, e até
como células doentes são originadas e recuperadas[15,16].
As membranas biológicas, de maneira geral, são constituídas essencialmente
por diversos tipos de fosfolipídios, proteínas e esteróis, como por exemplo, o
colesterol; e se mantêm juntas principalmente por interações hidrofóbicas, formando
uma bicamada lipídica fina, resistente e flexível em volta da célula. Muitas das
proteínas e dos lipídios presentes, na membrana celular, apresentam-se como
conjugados
de
carboidratos,
denominando-se
glicoproteínas
e
glicolipídios,
respectivamente. Conforme o Modelo de Singer e Nicolson, a matriz da membrana
biológica é uma bicamada constituída de fosfolipídios e glicolipídios na qual estão
incorporadas as proteínas [16-18] (Figura 2).
Devido à complexidade da biomembrana, as investigações relativas à
estrutura e propriedades da bicamada lipídica têm sido sintetizadas em modelos
mais simples, possibilitando explicar várias propriedades das membranas biológicas
[16]. Neste sentido, tem sido freqüente o uso de micelas, bicamadas planas,
vesículas, lipossomos e monocamadas, a fim de simplificar o problema e entender o
comportamento físico-químico, que ocorrem nas membranas [19-23].
Os fosfolipídios, componentes predominantes das membranas, são anfifílicos,
isto é, possuem uma parte da molécula que é hidrofílica (com afinidade pela água) e
outra hidrofóbica (sem afinidade pela água). Quando em contato com a água, esses
fosfolipídios tendem a formar bicamadas concêntricas, semelhantes à membrana
plasmática, conforme pode-se verificar na Figura 2. Nestas bicamadas, as moléculas
6
de lipídios se arranjam de tal forma que as partes hidrofílicas ficam em contato com
a água (tanto na monocamada externa quanto na interna), e as hidrofóbicas ficam
em contato entre si [24]. Vale ressaltar também que os surfactantes são anfifílicos
porque na sua constituição há uma parte apolar ou hidrofóbica e uma polar ou
hidrofílica (Figura 3). Diferentemente dos fosfolipídios, em meio aquoso, os
surfactantes tendem a formar micelas (Figura 4) e não bicamadas [25]. O tamanho e
a forma micelar dependem de vários fatores, entre eles: da natureza e comprimento
da cadeia apolar, do grupo polar, da concentração do anfifílico, da temperatura, da
natureza do solvente e do método de preparação de suas soluções. Sendo assim,
as micelas podem ser classificadas como inversas ou diretas (Figura 5a e 5b,
respectivamente) [16, 18, 26].
Glicoproteína
Proteína
Receptora
Carboidrato
Colesterol
Proteína
Glicolipideo
Fosfolipídio
Proteína Transportadora
Figura 2 – Representação da membrana biológica segundo o Modelo do Mosaico
Fluido. Extraído e adaptado de [27].
7
Figura 3 – Estrutura esquemática do surfactante [28]
Figura 4 – Representação esquemática micelar [29].
8
a
b
Figura 5 – Representação esquemática das micelas inversas (reversas) (a) e
micelas diretas (b).
As micelas são estruturas com elevado grau de organização, e sua
estabilidade é adquirida através do efeito entrópico do sistema. A formação micelar
ocorre através de agregações monoméricas (Figura 3) dos anfifílicos em função do
solvente e da estrutura do anfifílico, a partir de uma determinada concentração,
denominada concentração micelar crítica (cmc), para a qual metade do anfifílico se
encontra na forma agregada. No entanto, quanto mais longa a cadeia carbônica do
monômero, maior a tendência do surfactante possuir uma cmc baixa, ou seja, menor
ou igual a 10-3 mol.L-1. Dependendo da estrutura química, os anfifílicos podem ser
neutros, catiônicos, aniônicos ou zwiteriônicos (Figura 6).
Um exemplo bem prático de formação de micelas é a adição de um pouco
de óleo em água onde a região hidrofílica polar tende a interagir positivamente com
as moléculas de água, que tende a dissolver estes compostos. A região hidrofóbica
não-polar, entretanto, tende a evitar o contato com a água, fazendo com que essas
regiões não-polares se agrupem. Assim, as regiões apolares adquirem uma menor
9
área hidrofóbica ao solvente, enquanto as estruturas polares são arranjadas para
maximizar sua interação com este [30].
OO S O
O
O- Na+
CH3ClH3 C N+
O S O
O
H3C N+ CH3
CH2
(CH2)11
CH2
(CH2)14
CH3
(CH2)14
CH3
CH3
CTAC
SDS
CH3
H 3C
CH3
C
CH2
CH3
HPS
CH3
C
CH3
O
CH2
CH2
T R IT O N X -100 ®
H 3C
(CH 2) 12
(O CH 2 CH 2 ) 23
OH
OH
n
Brij-35®
Figura 6 – Exemplos de surfactante aniônico (SDS), catiônico (CTAC), zwiteriônico
(HPS) e neutro (TRINTON X-100® e Brij-35®).
A formação de micelas é acompanhada por mudanças distintas em várias
propriedades físicas, tais como: espalhamento de luz, viscosidade, condutividade
elétrica, tensão superficial, pressão osmótica e a capacidade de solubilização de
10
solutos [31]. Sendo que, do ponto de vista analítico, uma das mais importantes
propriedades dessas estruturas organizadas é a sua capacidade de solubilizar
solutos de diferentes características.
11
1.3
INTERAÇÃO FÁRMACO RECEPTOR
A partir da 2ª Guerra Mundial, a indústria de antibióticos foi impulsionada,
dando origem a um novo campo de atividades em diferentes áreas de
conhecimento, dentre as quais, a Biotecnologia. Graças a esse avanço científico, foi
possível a descoberta de vários fármacos, permitindo vencer doenças consideradas
fatais.
A diagnose e a cura de doenças fatais, produção de novos medicamentos,
produção de carreadores diversos para fármacos de alta toxicidade, ou a cujo alvo
seja dificultado, se administrado in natura, são alguns exemplos do potencial
biotecnológico já alcançado nos dias de hoje.
A Quimioterapia é o tratamento que utiliza medicamentos com o objetivo de
destruir, controlar ou inibir o crescimento das células infectadas. Pode ser associada
a outros tipos de tratamentos, como a cirurgia e a radioterapia. Por ser um
tratamento agressivo tanto para as células infectadas como para as sadias, e os
medicamentos devam ser administrados em quantidades elevadas próximas às
doses tóxicas para que sejam efetivos, os efeitos colaterais são inevitáveis, entre
eles os mais comuns são: queda de cabelo, ferimentos na mucosa bucal,
dificuldades na deglutição, náuseas, vômitos, constipação, diarréia, infecções,
anemia e aparecimento de sangramentos. Para evitar estes efeitos, os fármacos
deveriam ser administrados em quantidades mínimas, mas o tratamento tornaria
ineficaz devido às perdas relacionadas a sua absorção pelos tecidos, diluição nos
fluidos corporais ou excreção [32, 33].
A eficácia do medicamento pode ser aumentada através do encapsulamento
do fármaco em carreadores que o levará ao local onde é necessário, evitando a sua
perda através de interações e efeitos colaterais. Desta forma, torna-se indispensável
que se tenha um bom conhecimento sobre a interação de fármacos usuais, para um
determinado tipo de tratamento, com biomateriais naturais (ossos, dentes e tecidos
em geral) e artificiais (implantes dentais e ósseos). A emissão ou a absorção de
energias envolvidas nessas interações é utilizada para se estabelecer parâmetros
físico-químicos desejáveis à avaliação dos mecanismos envolvidos na formação das
ligações
químicas
que
ocorrem
nas
fármaco/carreador e ármaco/sistema modelo.
interfaces
fármaco/biomaterial,
12
Do ponto de vista qualitativo, o grau de afinidade e a especificidade da
ligação fármaco/receptor são determinados por ligação covalente e interações
intermoleculares, que compreendem as forças eletrostáticas, a de dispersão, as
hidrofóbicas, e a ligação de hidrogênio [34].
As forças eletrostáticas de cuja magnitude depende diretamente da constante
dielétrica do meio e da distância entre as cargas são resultantes da interação entre
dipolos e/ou íons de cargas opostas.
As forças de dispersão, em geral, são de baixa energia (0,5-1,0 Kcal.mol-1).
No entanto, são de extrema importância para o processo de reconhecimento
molecular,
uma
vez
que
o
somatório
acarreta
contribuições
energéticas
significativas.
As interações hidrofóbicas são individualmente fracas e ocorrem em função
da interação em cadeias ou subunidades apolares. O ganho entrópico, associado à
desorganização do sistema, promove a interação ligante-receptor. Devido à
estrutura do peptídeo e fármaco, essa interação torna-se muito importante, pois
favorece o reconhecimento da macromolécula presente na biomacromolécula.
As ligações de hidrogênio são consideradas as mais importantes, dentre as
interações não-covalentes, em sistemas biológicos, sendo responsáveis pela
manutenção das conformações bioativas de macromoléculas e interações purinaspirimidinas dos ácidos nucléicos.
Já as ligações covalentes, responsáveis pelas interações intramoleculares,
provocam a inibição enzimática irreversível ou a inativação do sitio receptor, devido
à elevada energia (77-88 Kcal.mol-1) em relação às ligações mais fortes presentes
nos sistemas biológicos (10 Kcal.mol-1).
Daí faz-se necessário o estudo da interação de fármacos com possíveis
carreadores, por ser uma das maneiras de obter informações sobre mudanças
conformacionais e até estruturais, quando os fármacos são colocados na presença
de modelos biofísicos simplificados [34].
13
1.4
ABSORÇÃO UV-Vis
A absorção da radiação eletromagnética é uma propriedade universal da
matéria. A região do ultravioleta e visível do espectro eletromagnético compreende a
faixa de 180 – 800 nm.
As espécies químicas: átomos, íons ou moléculas podem existir somente em
certos estados quantizados de energia. Quando uma espécie altera seu estado
energético, absorve ou emite uma quantidade de energia exatamente igual à
diferença de energia entre os estados [35]. Essa é uma condição necessária para
que a absorção da luz esteja relacionada com o comprimento de onda ( λ ) através
da equação (1).
E = E1 − E 0 =
hc
eq. ( 1 )
λ
Onde E1 é a energia do estado mais elevado e E 0 é a energia do estado mais baixo.
Os termos c = 2,998 x 108 m.s-1 e h = 6,626 x 10-34 J.s são a velocidade da luz no
vácuo e a constante de Planck, respectivamente. Além de apresentarem estados
eletrônicos, as moléculas também apresentam estados vibracionais quantizados que
estão associados à energia das vibrações interatômicas e estados rotacionais
quantizados.
A espectroscopia de absorção molecular está baseada na medida da
transmitância T ou absorbância A da luz incidente em soluções de analito (equação
2a e 2b respectivamente).
T =
Psolução
Psolvente
=
P
P0
eq. ( 2a )
14
A = log
Psolvente
P
≅ log 0
Psolução
P
eq. ( 2b )
A relação quantitativa entre a intensidade da luz absorvida e a concentração é
dada pela lei de Lambert-Beer (equação 2), onde P0 e P são as intensidades de luz
incidente e transmitida, respectivamente, por uma a mostra; ε é o coeficiente de
absortividade molar (L.mol-1.cm-1) característico de cada espécie num determinado
comprimento de onda; c a concentração (mol.L-1) do analito, e b é o caminho óptico
(cm) da luz incidente [16, 35].
A = log
P0
= ε bc
P
eq. ( 2 )
Esta relação é bem sucedida ao descrever o comportamento da absorção de
meios, contendo concentrações de analito relativamente baixa (usualmente < 0,01
mol.L-1), ou seja, essa é uma lei limite.
A absorção de radiações ultravioleta e visível geralmente resulta da excitação
de elétrons de ligação; como conseqüência, os comprimentos de onda dos picos de
absorção podem ser correlacionados com tipos de ligações nas espécies em estudo.
A espectroscopia de absorção molecular é, portanto, valiosa para identificar grupos
funcionais em uma molécula através das transições eletrônicas que envolvem o
processo de absorção.
Em compostos orgânicos, as transições eletrônicas possíveis são n → σ ∗ ,
σ → σ ∗ , π → π ∗ e n → π ∗ . Conforme observado na Figura 7, as energias dos
vários tipos de orbitais moleculares diferem significativamente, possibilitando
transições muito distintas para os diversos tipos transições eletrônicas. As razões
para estas diferenças podem ser relacionadas em termos da mecânica quântica, e
determinam a magnitude dos coeficientes de absorção molar. Através destas
distinções são estabelecidas transições “proibidas” ou “permitidas”.
15
σ*
Antiligante
*
n → π*
n → σ*
n
Antiligante
π → π*
σ → σ*
Energia
π
Não-ligante
π
Ligante
σ
Ligante
Figura 7 – Níveis de energia eletrônica molecular [35].
Nas transições σ → σ ∗ , a energia necessária para o elétron migrar do orbital
no estado fundamental para o orbital, no estado excitado, é elevada, e os máximos
de absorção nunca são observados na região ultravioleta acessível, em solução. Já
as transições n → σ ∗ necessitam de menos energia e podem ser produzidas por
radiação na região entre 150 e 250 nm. As absortividades molares associadas a
esse tipo de absorção são pequenas, de magnitude intermediária e normalmente
estão em torno de 10-3 L.cm-1.mol-1, e os máximos de absorção são influenciados
pela polaridade do solvente. No entanto, o número de grupos funcionais orgânicos
com picos n → σ ∗ é relativamente pequeno [35].
Para transições π → π ∗ e n → π ∗ , as energias necessárias situam-se em
uma região espectral na faixa de 200 a 700 nm.
As absortividades molares para picos associados à transição n → π ∗ variam
na faixa de 10 a 100 L.cm-1.mol-1, e os valores para transições π → π ∗ encontramse na região entre 1.000 e 10.000 L.cm-1.mol-1. Ambas as transições sofrem efeitos
16
de deslocamentos em presença de solventes com
deferentes polaridades
denominada de hipsocrômico (deslocamento para o azul, λ maiores) e batocrômico
(deslocamento para o vermelho, λ menores).
O número de máximos e mínimos de absorção são relativamente
pequenos e a identificação não-ambígua, no analito em estudo, é frequentemente
impossível. Sendo assim, a espectroscopia no UV-Vis tem aplicação um tanto
limitada em análise qualitativa.
17
1.5
FLUORESCÊNCIA
A fluorescência molecular e fosforescência são métodos ópticos importante
em que moléculas, átomos ou íons são excitados por absorção de uma radiação
eletromagnética. Quando as espécies excitadas relaxam para o estado fundamental,
liberam a energia recebida na forma de luz. A fluorescência difere da fosforescência
pelo fato de que as transições eletrônicas responsáveis pela fluorescência não
envolvem uma mudança de spin eletrônico. Ou seja, a multiplicidade de spin do
estado excitado origina os estados singlete e triplete (Figura 8)[18, 35].
Figura 8 – Multiplicidades de spin eletrônico [35].
No estado excitado singlete, o spin do elétron promovido ainda está
emparelhado com o elétron no estado fundamental. No entanto, os spins no estado
triplete estão desemparelhados.
O tempo de vida médio de um estado excitado triplete pode variar de 10-4 a
vários segundos; já o estado excitado singlete possui um tempo de vida médio de
10-5 a 10-8 segundos. As relaxações que ocorrem em tempos inferiores a 10-5
18
segundos, chamam-se fluorescência, enquanto que em tempos superiores,
fosforescência, chegando de minutos ou até horas.
A espectroscopia de fluorescência tem sido amplamente utilizada como
ferramenta nas pesquisas químicas, bioquímicas, biofísicas e médicas. Este uso tem
sido ampliado devido ao desenvolvimento de novas tecnologias na produção e
detecção da luz.
Diversas vantagens têm contribuído para a ampla utilização desta técnica,
entre as quais a possibilidade de se trabalhar com soluções extremamente diluídas
(10-6 mol.L-1 para proteínas ou 10-7 – 10-5 mol.L-1 para outros grupos fluorescente).
Outra
vantagem
é
a
sensibilidade
intrínseca
com
limites
de
detecção
frequentemente de uma a três ordens de grandeza (na faixa de partes por bilhão)
menores que os encontrados em espectroscopia de absorção. Essa elevada
sensibilidade é uma conseqüência do tempo relativamente longo (10-9 – 10-5 s) que a
molécula permanece no estado excitado, se comparado com a velocidade com a
qual um fóton é absorvido (10-14 a 10-15 s). Devido ao tempo de vida no estado
excitado ser elevado vários processos podem acontecer tais como: reações de
protonação
e
desprotonação,
mudanças
conformacionais
em
proteínas
e
reorientação do cromóforo [18].
A fluorescência é observada com maior freqüência em espécies aromáticas.
Muitas proteínas de membrana contêm resíduos de aminoácidos fluorescentes
(tripitofano, tirosina e fenilalanina), podendo ser estudada com esta técnica. As
proteínas que não possuem cromóforos fluorescentes, isto é, que não contém
aminoácidos aromáticos, podem acoplar covalentemente ou não, marcadores
extrínsecos. Os marcadores covalentes são, principalmente, aqueles que possuem
grupos reativos que modificam seletivamente tióis e aminas de proteínas. Na Figura
9 estão alguns exemplos de estruturas de sondas fluorescentes [18, 35].
Os princípios básicos da fluorescência são representados através do
diagrama de Jablonski, figura 10, (onde as linhas horizontais mais espessas estão
representando o estado fundamental da molécula (S0), e o estado eletrônico e
vibracional excitado (S1) na posição inferior e superior, respectivamente).
A velocidade da absorção de um fóton impossibilita rearranjo significativo do
núcleo da molécula. Ocorre então, um relaxamento para nível vibracional
fundamental do estado excitado através da conversão interna (processo não
radioativo), e o retorno para o estado eletrônico fundamental com emissão da luz.
19
No entanto, vários outros processos contribuem para o estado excitado perder
energia através da competição com a fluorescência.
CH 3
N
NH
SO3H
O
CH
9-Vinil antraceno
CH 3
CH 2
S
O
Cl
ácido 1-anilino
cloreto de densila
8-naftaleno sulfônico
Figura 9 – Estruturas de sondas fluorescentes [36].
Figura 10 – Diagrama parcial de energia de um sistema fotoluminescente [35].
20
A competição com a fluorescência ( k f ) ocorre com os seguintes processos:
cruzamento intersistema ( k i ), conversão externa ( k ce ), conversão interna ( k ci ) e
supressão de vários tipos ( k s ): equação (3) [18].
Como conseqüência desses caminhos para a dissipação do excesso de
energia, o rendimento quântico pode ser muito sensível ao meio e aos grupos
estruturais que cercam o cromóforo. Sendo assim, devido à existência destes vários
outros processos que competem com a emissão de fluorescência, o rendimento
quântico é sempre menor que 1 ( φ < 1).
φ=
kf
k f + k i + k ce + k ci + k s
eq. ( 3 )
Devido ao processo de relaxação ocorrer de forma mais acelerada em relação
à emissão de fluorescência, esta se dá a partir do estado S1. Duas conseqüências
deste fenômeno são: 1- a independência da forma do espectro de emissão
relativamente ao comprimento de onda da radiação de excitação, 2- o deslocamento
deste espectro de absorção. Ver Figura 11 (deslocamento de Stokes) [35].
A estrutura molecular, do mesmo modo como o ambiente químico, influencia
a ocorrência ou não da luminescência de uma molécula, entre os quais se
destacam: tipo de transições, rigidez, solvente, temperatura, pH, entre outros.
Para a maior parte dos compostos fluorescentes, a radiação é produzida por
uma transição π ← π ∗ ou n ← π ∗ , visto que transições de energia mais elevadas
tornam-se proibidas, porque tal radiação é suficientemente energética para causar
desativação dos estados excitados por pré-dissociação ou dissociação. No entanto,
quanto menor a possibilidade de conformações rotacionais, maior a eficiência
quântica.
21
Figura 11 – Espectros de excitação e emissão de fluorescência [35].
Já na maioria das moléculas, a intensidade de fluorescência decresce com o
aumento da temperatura por causa do aumento das colisões e pela presença de
átomos pesados em suas estruturas. É observada, também, uma variação da
intensidade de fluorescência para as formas ionizadas e não-ionizadas de um
composto.
Finalmente, os espectros de emissão representam as intensidades da
fluorescência, em função do comprimento de onda de emissão e a transição do nível
vibracional mais baixo do primeiro estado excitado S1 para o estado fundamental S0.
Devido à sensibilidade às reações químicas ou às perturbações de solventes
durante o tempo de vida do estado de excitação, têm-se um interesse particular
nesses espectros de emissão.
22
2
2.1
OBJETIVOS
GERAL
Estudar a interação da PIR e SDZ com diversos sistemas modelos de
membranas biológicas, visando o encapsulamento desses fármacos em um
carreador eficiente que de diminua seus efeitos colaterais aumentando a eficácia no
tratamento da toxoplasmose.
2.2
ESPECÍFICO
Estabelecer parâmetros físico-químicos da interação da PIR e SDZ com
micelas de dodecilsulfato de sódio (SDS), cloreto de cetiltrimetilamônio
(CTAC), N-hexadecil-N, N-dimetil-2amônio-1-propanossulfonato (HPS), Toctilfenoxipolietoxietanol (TRITON X-100®) e polioxietileno-dodecil-éter (Brij35®).
Medir a constante de associação da PIR e SDZ com as micelas, através da
fluorescência e absorção UV-Vis.
23
3
3.1
PARTE EXPERIMENTAL
DETERMINAÇÃO DA SOLUBILIDADE DA PIR E SDZ.
Utilizando massas conhecida de PIR e SDZ, foi determinado a solubilidade
destes fármacos em meio aquoso, e nos solventes orgânicos acetonitrila,
dimetilsulfóxido, metanol, etanol e éter etílico. Para cada solvente, foram efetuadas
sucessivas adições de volumes fixos, até a não visualização de partículas de
fármaco. Em seguida, os espectros de varredura de absorção foram obtidos na
faixa de 200 a 400 nm. Após obtenção do espectro, diluía-se a solução com o
solvente em estudo; em seguida, nova varredura foi efetuada. O processo de
diluição se repetia, até que a diminuição da absorbância, em relação à
concentração, estivesse de acordo com a lei de Lambert-Beer (equação 2),
evidenciando que todo fármaco foi solubilizado.
3.2
DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS ESPECTROSCÓPICOS (ε E λmáx) DA
PIR E SDZ.
Foram preparadas soluções aquosas dos fármacos PIR e SDZ em meio
micelar (SDS [80 mmol.L-1], CTAC [20 mmol.L-1], HPS [40 mmol.L-1], Brij-35® [40
mmol.L-1] e TRITON X-100® [0,22 mmol.L-1]) e nos pH 4,0, 7,0, 9,0, a fim de se
determinar os comprimentos máximos de absorção e emissão. As varreduras foram
efetuadas na faixa de 200–400 nm para absorção e 300 a 550 nm para emissão,
utilizando um espectrofotômetro UV-Vis e um espectrofluorímetro Perkin Elmer
Lambda 45, ambos acoplados a um computador.
Para a determinação do ε, no comprimento de onda de máxima absorção,
foram preparadas soluções de concentrações distintas de PIR em tampão fosfato
(2,0 x 10-5 – 1,1 x 10-4) mol.L-1, borato (1,2 x 10-5 – 8,5 x 10-5) mol.L-1 e acetato (2,5
24
x 10-5 – 1,4 x 10-4) mol.L-1 e de SDZ em tampões fosfato (1,1 x 10-5 – 6,8 x 10-5)
mol.L-1, borato (4,4 x 10-6 – 4,4 x 10-5) mol.L-1 e acetato (8,0 x 10-6 – 6,4 x 10-5)
mol.L-1. Os valores de absorbância no comprimento de onda máximo de absorção
nos respectivos tampões foram medidos. O ε foi obtido utilizando a Lei de LambertBeer.
3.3
DETERMINAÇÃO TEÓRICA DA TRANSIÇÃO ELETRÔNICA DA PIR E SDZ.
Inicialmente, calculou-se a geometria de menor energia, utilizando a
metodologia AM1[37] implementada no programa MOPAC [38]. A geometria de
saída do AM1 foi utilizada no método INDO/S-CI o qual foi usado para calcular as
forças dos osciladores e as energias de transições implementado no programa
ZINDO [39]. O espaço de configuração CI foi gradualmente acrescido até que
nenhuma mudança significativa nas energias de transições fosse notada. Para tanto,
foi feito um ajuste por Lorenzianas [40] a fim de traçar o perfil dos espectros teóricos,
usando as energias de transições singleto com as respectivas intensidades relativas
obtidas da força dos osciladores, fixando a meia largura de todas as bandas em 35
nm. Os perfis encontrados foram comparados com os espectros experimentais.
3.4
DETERMINAÇÃO DOS VALORES DE PKa
Os valores de pKa da PIR e SDZ, na ausência e na presença de cada
surfactante SDS (120 mmol.L-1), CTAC (40 mmol.L-1), Brij-35® (40 mmol.L-1), HPS
(40 mmol.L-1) e TRITON X-100® (0,486 mmol.L-1) foram determinados através do
ajuste da curva experimental obtida através da medida de absorbância em diferentes
valores de pH. A PIR e SDZ foram preparadas em tampão triplo: fosfato, borato e
acetato (concentração total dos sais 30 mmol.L-1), nas concentrações 8,85 x 10-5
mol.L-1 e 7,5 x 10-5 mol.L-1, respectivamente. Em seguida foram feitas titulações
espectrofotométricas destas soluções, variando-se o pH na faixa de 2,0 a 12,0. Para
25
a PIR, o tampão foi previamente ajustado para pH = 12,0, e para a SDZ pH = 2,0,
uma vez que a PIR é mais solúvel em meio ácido e a SDZ em meio básico. No
sentido de evitar o efeito de diluição dos fármacos, as concentrações dos titulantes
(HCl e NaOH) foram elevadas. Os valores de pKa foram obtidos através de uma
curva que melhor se ajustasse aos dados experimentais, utilizando o gráfico da
absorbância versus pH, através da equação (4) [41].
A + 10 pK a + A 0 10 pH
A=
10 pK a + 10 pH
eq. (4)
Sendo:
3.5
A
Leitura de absorbância
A0
Absorbância do fármaco desprotonada
A+
Absorbância do fármaco protonada
pK a
Constante de equilíbrio de protonação
pH
Potencial hidrogeniônico
DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES DE ASSOCIAÇÃO (Kb) DA PIR E
SDZ EM MICELAS
A constante de associação da PIR foi determinada através da titulação
fluorimétrica do fármaco com surfactantes em diferentes concentrações. Os
experimentos foram realizados em pH 4,0, 7,0 e 9,0, excitando as moléculas da
droga no comprimento de onda de máxima absorção, utilizando uma concentração
1,0 x 10-5 mol.L-1 nos diferentes pH. Em todos os pH a titulação foi efetuada com
26
sucessivas adições de uma solução estoque de CTAC, HPS, SDS e Brij-35. A
constante de dissociação (Kd) foi determinada através da curva obtida do melhor
ajuste dos dados experimentais do gráfico da concentração de surfactante versus
variação de fluorescência, utilizando a equação (5) e através do inverso de Kd
equação (6) foi determinado o valor da constante de associação (Kb) [26, 42, 43].
∆F =
∆Fmáx .[Surfac tan te]
K d + [Surfac tan te]
Kb =
1
Kd
eq. ( 5 )
eq. ( 6 )
Sendo:
∆F
Variação de Intensidade de fluorescência
∆Fmáx
Fluorescência máxima
[Surfactante] Concentração de surfactante
Kd
Constante de dissociação
Kb
Constante de associação
O valor de Kb para a PIR, também, foi determinado através da melhor curva
que se ajustasse aos dados experimentais utilizando o duplo recíproco descrito pela
equação 7 [18].
1
1
1
1
1
. .
=
+
∆F ∆Fmáx ∆Fmáx K b [Surfac tan te]
eq. ( 7 )
A constante de associação da SDZ foi determinada através da titulação
espectrofotométrica do fármaco com surfactantes em diferentes concentrações. Os
27
experimentos foram realizados em pH 4,0, 7,0 e 9,0 no comprimento de onda de
máxima absorção. A concentração de SDZ foi 3,5 x 10-5 mol.L-1. Em todos os pH a
titulação foi efetuada com sucessivas adições de uma solução estoque do
surfactante em estudo. A constante de associação (Kb) foi determinada através da
curva obtida do melhor ajuste dos dados experimentais da absorbância versus
concentração de surfactante utilizando a equação (8) [41].
0
0
0
N
A = ADrog
+ ( ADrog
. Surfac − ADrog ) /(1 / K b {[ Surfac ] 0 − cmc} ) + 1
eq. ( 8 )
Sendo:
A
Leitura de absorbância
0
ADrog
Absorbância da droga na ausência de surfactante
o
ADrog
. Surafc
Absorbância da droga na presença de surfactante
Kb
Constante de associação
cmc
Concentração micelar crítica
N
Número de surfactante/ número de moléculas da droga
[ Surfac ]
Concentração do surfactante
28
4
4.1
RESULTADOS E DISCUSSÕES
DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS ESPECTROSCÓPICOS DA PIR
A PIR (Figura 12), é um derivado de uma classe de fármacos chamados de
diaminopirimidinas. Atua inibindo a enzima dihidrofolato redutase, responsável pela
conversão do ácido fólico em ácido folínico, interferindo assim na síntese dos ácidos
nucléicos. A ação quimioterápica da PIR está relacionada à sua afinidade seletiva,
maior em relação à enzima redutase dos microorganismos e muito menor em
relação às enzimas correspondentes dos mamíferos.
A PIR é muito pouco solúvel em água. A solubilidade utilizando o método
proposto por Meylan e colaboradores [44] é de 121 mg.L-1. Determinou-se através
do método da dissolução direta, uma solubilidade de 160 mg.L-1 para a PIR em
solução tamponada pH = 4,0, de 40 mg.L-1 em pH = 7,0 e de 30 mg.L-1 em pH = 9,0.
Estes dados diferem dos calculados pelo método de Meylan; além deste método ser
uma aproximação que considera classes de compostos em geral, ele não prevê o
efeito de protonação destes fármacos.
A PIR é praticamente insolúvel em solventes orgânicos apolares e tem uma
solubilidade relativamente alta em solventes orgânicos polares, em especial, em
DMSO (dimetilsulfóxido) que chega a 1,6 g.L-1.
CH 3 CH 2
N
NH 2
N
Cl
NH 2
Figura 12 - Estrutura molecular plana da PIR
29
Os espectros de absorção óptica em soluções aquosas tamponadas (pH =
4,0, 7,0 e 9,0) bem como os espectros calculados teoricamente são mostrados na
Figura 13.
3,0
Calculado (vácuo)
pH 4,0
pH 7,0
pH 9,0
Calculado (protonado)
Absorbância
2,5
2,0
1,5
272 nm
274 nm
274 nm
280 nm
284 nm
1,0
0,5
0,0
220
240
260
280
300
320
340
360
Comprimento de onda, nm
Figura 13 - Espectros de absorção óptica da PIR em solução aquosa
e calculado teoricamente.
O Espectro da PIR, em solução aquosa, apresenta uma banda de absorção
bem definida ecentrada em torno de 272 nm (pH = 4,0), em 274 nm (pH = 7,0) e em
284 nm (pH = 9,0). A existência de um ombro em torno de 220 nm, é observada para
todos os meios tamponados em estudo (figura 13). O espectro da PIR protonada,
obtido através de cálculos teóricos, evidencia essa banda, sugerindo que a mesma
se encontra deslocada para a faixa de 238 nm. .
30
O espectro calculado teoricamente não leva em conta o efeito do solvente, ou
seja, é calculado considerando o vácuo como meio. Devido a isso, é possível
observar diferenças entre o obtido experimentalmente em pH 7,0 e o calculado,
quanto ao comprimento de onda máximo de absorção (Figura 13).
As características observadas nos espectros de absorção das soluções
aquosas são, também, identificadas nas soluções orgânicas. A banda bem definida
que aparece em solução aquosa, também, está presente nos solventes orgânicos
polares, sendo que o máximo de absorção está próximo do encontrado para a
solução em pH 9,0 (284nm), destacando-se o DMSO de cujo máximo está em torno
de 291 nm (figura 14).
2,5
Acetonitrila
Dimetilsulfóxido
Etanol
Éter etílico
Metanol
2,0
Absorbância
284 nm
1,5
1,0
291 nm
0,5
0,0
200
250
300
350
400
Comprimento de onda, nm
Figura 14 - Espectros de absorção óptica da PIR em
solventes orgânicos.
31
O deslocamento de aproximadamente 12 nm no máximo de absorção da PIR,
quando se passa de um meio ácido para um básico, sugere que a banda em 272 nm
(pH=4,0) se deve a transições do tipo π→π*. Os espectros de absorção obtido
através de cálculos teóricos utilizando o ZINDO_S/ci, também apontam na mesma
direção (Figura 13). Outra evidência que corrobora para esta afirmativa é o ε
encontrado para estes máximos de absorção em soluções são valores típicos de
coeficientes de absortividade molar para transições do tipo π→π* [33] ver tabela 1.
Para as radiações monocromáticas, a absorbância ( A ) é diretamente
proporcional ao comprimento do caminho óptico ( b ), a concentração das espécies
absorventes ( c ) e a constante de proporcionalidade ( ε ) denominada de
absortividade (ver equação 9), Lei de Lambert-Beer [35].
A = ε .b . c
eq. (9)
Utilizando este princípio, determinou-se o coeficiente de absortividade no
comprimento de onda de máxima absorção correspondente ao meio ácido, neutro e
básico (Figura 15).
Tabela 1
Coeficiente de absortividade molar das soluções de
PIR nos pH 4,0, 7,0 e 9,0.
λ
ε
pH
nm
L.mol-1.cm-1
4,0
272
6.744 ± 130
7,0
274
6.828 ± 45
9,0
284
8.374 ± 75
32
0,8
1,0
0,7
Absorbância
0,8
0,5
0,4
0,6
0,4
0,3
0,2
0,2
0,1
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
0,2
12,0
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
5
-1
10 x [ PI R], mol.L
5
-1
10 x [ PI R], mol.L
0,8
0,7
0,6
0,5
Absorbância
Absorbância
0,6
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
5
-1
10 x [ PI R], mol.L
Figura 15 - Curvas de calibração da PIR obtidas através da espectroscopia de
absorção. (●) pH 4,0, λ = 272 nm e R = 0,9994; (■) pH 7,0, λ = 274 nm e R = 0,9999
e (▲) pH 9,0, λ = 284 nm e R = 0,9998.
33
4.2
DETERMINAÇÃO DO pKa DA PIR
A estrutura química de muitos fármacos envolve a participação de anéis
aromáticos, responsáveis pelas propriedades de absorção óptica e fluorescência na
região do UV-Vis, as quais variam com o estado de protonação do fármaco e o meio
na qual se encontra [45]. A determinação do pKa é de fundamental importância, pois
a constante de ionização de um fármaco é capaz de expressar, dependendo da sua
natureza química e do pH do meio, a contribuição percentual relativa das espécies
ionizadas e não-ionizadas e o comportamento farmacocinético das substâncias nos
principais compartimentos biológicos com pH definidos (por exemplo, mucosa
gástrica, pH ≅ 1; mucosa intestinal, pH ≅ 5 e plasma, pH ≅ 7,4) pode ser avaliado
antes da administração do fármaco [34].
A solubilidade da PIR em água é sensivelmente aumentada em meio ácido,
visto que apresenta muitos sítios disponíveis para a protonação, dentre os quais,
destacam-se os quatros grupos aminas existentes na estrutura (ver Figura 16). Estes
sítios evidenciam que a PIR pode possuir mais de um valor de pKa. No entanto,
cálculos teóricos utilizando o ZINDO_S/ci mostram que o valor energético para todas
as possibilidades na interação do próton (H+) com os grupos aminas é relativamente
igual (Tabela 2). Sendo assim, somente um valor de pKa é observado para a PIR.
Tomando por base o fato de que a absorbância da PIR se altera após sua
protonação, a dependência do valor da absorbância, em dado comprimento de onda,
em função do pH, foi utilizada para a determinação do pKa. A Figura 17 apresenta a
variação da absorbância em função do pH para a PIR na ausência de micelas, e as
Figuras 18 a 20 para a PIR em presença de micelas catiônica, aniônica e neutra,
respectivamente. Titulações efetuadas em 272 nm.
34
Átomo de Cloro
Átomo de Nitrogênio
Átomo de Carbono
Átomo de Hidrogênio
06
16
02
15
Figura 16 – Sítios nitrogenados da PIR.
Tabela 2 – Energia de interação entre um próton (H+)
e um nitrogênio da PIR.
Nitrogênio do grupo amina
Energia kcal mol-1
2
196,24
6
189,87
15
212,14
16
210,59
35
1,00
0,80
0,70
0,60
0,50
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
Figura 17 - Dependência da absorção em 272 nm da
PIR (8,85 x 10-5 mol.L-1) em função do pH.
0,55
0,50
Absorbância
Absorbância
0,90
0,45
0,40
0,35
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
Figura 18 - Dependência da absorção em 272 nm da PIR
(8,85 x 10-5 mol.L-1) em função do pH em presença de
CTAC 40 mmol.L-1.
36
0,55
0,45
0,40
0,35
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
Figura 19 - Dependência da absorção em 272 nm da PIR
(8,85 x 10-5 mol.L-1) em função do pH em presença de
SDS 120 mmol.L-1.
0,70
0,60
Absorbância
Absorbância
0,50
0,50
0,40
0,30
0,20
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
Figura 20 - Dependência da absorção em 272 nm da PIR
(8,85 x 10-5 mol.L-1) em função do pH em presença de Brij-35
40 mmol.L-1.
37
Os dados experimentais foram tratados de acordo com a equação de
Henderson-Hasselbach [34,35] para determinar o pKa. Considerando-se a
expressão:
pH = pKa + log (α / 1-α )
eq. (a)
Sendo α e (1-α) as frações molares da droga nas formas neutra e carregada,
respectivamente, a absorbância total em um dado comprimento de onda da droga
submetida ao equilíbrio ácido-base, pode ser considerado como sendo a soma das
intensidades das espécies protonadas (A+) e neutra (Ao):
A = α Ao + (1-α) A+
eq. (b)
Substituindo a equação b em a:
 A − A+ 

pH = pK a + log 0
−
A
A


eq. (c)
Esta equação pode ser submetida a um rearranjo e fornecer a expressão
abaixo, a qual pode ser utilizada para obter a melhor curva que se ajuste aos valores
experimentais:
A=
A + 10 pK a + A 0 10 pH
10 pK a + 10 pH
eq. (d)
38
Desta maneira os valores de pKa encontrados para a PIR são apresentados
na Tabela 3.
Tabela 3
Valores de pKa para PIR 8,85 x 10-5 mol.L-1 em tampão triplo 20 mmol.L-1 obtidos da
titulação espectrofotométrica na presença e ausência de micelas.
[Micela]
mmol/L
pKa
∆pKa
∆pKa-meio
∆pKa-el
0
7,26 ± 0,07
-
-
-
SDS
120
9,07 ± 0,03
1,81
-1,31
3,12
-107(-184)
CTAC
40
6,33 ± 0,03
-0,93
-1,31
0,38
55(-22)
BRIJ-35®
40
5,95 ± 0,07
-1,31
-1,31
0,00
77 (0)
HPS
40
5,80 ± 0,02
-1,46
-1,31
-0,15
86(9)
Triton X-100®
0,5
7,48 ± 0,04
0,22
-1,31
1,53
-13(-90)
Sistema
Tampão
e.Ψ
(meV)
O deslocamento do valor de pKa da PIR, observado na Tabela 3 para micelas
catiônica, aniônica e zwiteriônica, evidencia que a interação da droga com tais
micelas sofre influência da carga micelar. No caso do SDS, surfactante aniônico, o
pKa é deslocado para duas unidades acima do valor encontrado em solução aquosa.
Já para as micelas de CTAC, catiônicas e HPS, zwiteriônica o deslocamento é de
aproximadamente uma unidade para baixo.
Para o TRITON X-100®, não há praticamente mudança no pKa da droga.
Devido o TRITON X-100® absorver na região em que a PIR absorve, não foi
possível trabalhar com concentração elevada deste surfactante, como nos demais,
39
que permitisse uma concentração elevada de micelas. Este fato explica o porquê de
não observamos variação significativa no pKa da PIR neste sistema.
Já para o Brij-35®, também um surfactante neutro, onde a concentração
utilizada está bem acima da cmc, observa-se uma variação de pKa da PIR de mais
de uma unidade. Por se tratar de micelas neutras, as interações que regem a
associação entre a PIR e o Brij-35® são predominantemente de natureza
hidrofóbicas, e o abaixamento do pKa da PIR reflete a mudança de localização do
fármaco de um meio aquoso (polar) para um meio hidrofóbico micelar (apolar).
Na tabela 3, ∆pKa é a variação entre o pKa medido experimentalmente na
presença de micela e o valor de pKa no tampão. ∆pKa-meio é o deslocamento do valor
obtido da micela aniônica Brij-35® e esta variação está relacionada somente com a
mudança de meio do fármaco sem efeito de carga micelar. O ∆pKa-el é o efeito
eletrostático obtido da diferença entre ∆pKa
e ∆pKa-meio. Por fim, a energia
equivalente eΨ é obtida através da equação (2,3*kT* ∆pKa ) [41, 42]. Onde k é a
constante de Boltzman e T é a temperatura absoluta.
A relação entre o pKa aparente e a equação de Boltzman é dada por [46]:
∆pKa =
∆pKi − eψ 0
2,3kT
Os valores de pKa e da contribuição energética eΨ são afetados por
mudanças intrínsecas do potencial Ψ0 . Sendo assim, o efeito do potencial elétrico,
que afeta os nitrogênios do anel pirimidina, pode ser estimado através dessas
mudanças [41].
Na última coluna, entre parênteses, da tabela 3 pode ser observado os
valores dos potenciais para a PIR em presença de surfactante. Os dados obtidos
para o SDS e CTAC foram: -184 meV e -22 meV, respectivamente. No entanto, os
valores de 155 meV para o CTAC e -125 meV para o SDS estão predito na literatura
[44]. Para a micela catiônica CTAC, a diferença entre o valor experimental e o
estabelecido na literatura é muito elevada, sugerindo que o fármaco pode estar
localizada no centro (meio hidrofóbico) ou na extremidade (fase aquosa) da micela.
40
Já para a micela aniônica SDS, por apresentar uma diferença menor entre os
valores obtidos, sugere a possibilidade de uma localização superficial da PIR, ou
seja, na região do grupo polar da micela.
O ∆pKa-el representa a contribuição eletrostática, no pKa do fármaco, devido a
transferência de cargas entre as micelas CTAC, HPS e SDS com o fármaco [41]. Por
ser um surfactante neutro, a contribuição eletrostática do Brij-35®, é nula (ver tabela
3). Os valores obtidos experimentalmente, da contribuição eletrostática para o
CTAC, SDS e HPS de 0,38, 3,12 e -0,15, respectivamente, sugerem que a interação
fármaco-micela é, consideravelmente, forte.
41
4.3
DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE ASSOCIAÇÃO DA PIR ÀS MICELAS
A interação de um fármaco com seu sítio ativo, no sistema biológico, define
sua fase farmacodinâmica de ação. Do ponto de vista qualitativo, o grau de afinidade
e a especificidade da ligação micromolécula-sítio receptor são determinados por
interações
intermoleculares,
as
quais
compreendem
forças
eletrostáticas,
hidrofóbicas, ligações de hidrogênio, entre outras [34]. Sendo assim, a análise de Kb
nos permitiu avaliar o grau de associação e tipo de força que permeia essa
associação.
A análise da interação da PIR com as micelas foi realizada a partir de
experimentos que envolvia titulações do fármaco com as soluções das micelas,
Figura 21.
Intensidade de Fluorescência (u.a.)
550
-1
0,0
mol.L
-3
-1
0,5 x 10 mol.L
-3
-1
1,0 x 10 mol.L
-3
-1
1,5 x 10 mol.L
-3
-1
2,0 x 10 mol.L
-3
-1
2,5 x 10 mol.L
-3
-1
3,5 x 10 mol.L
-3
-1
5,0 x 10 mol.L
-3
-1
7,0 x 10 mol.L
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
300
350
400
450
500
550
Comprimento de onda, nm
Figura 21 - Espectro da titulação fluorimétrica, da PIR em pH 9,0, na
presença de HPS com concentração na faixa (0,0 a 7 x 10-3) mol.L-1. A
amostra foi excitada em 286 nm e varredura efetuada de 300 nm a 550
nm.
42
O método empregado para tal fim, está baseado na mudança de intensidade de
fluorescência da molécula do fármaco, relacionada à solubilização da mesma no
meio organizado. Desta forma, o comprimento de onda de emissão máxima da PIR
foi monitorado quando se variava a concentração de micelas no meio.
Através da análise dos espectros de emissão da PIR, em presença e
ausência de surfactante, constatou-se que a carga micelar influencia no
comprimento de onda de emissão máxima (ver Tabela 4). Esta influência é mínima
em presença de micelas de SDS que pode estar associado à maior fluidez das
micelas de SDS, quando comparada às demais micelas. Para o CTAC e HPS
observou-se
um
deslocamento
de
aproximadamente
15
nm
e
25
nm,
respectivamente. Esse deslocamento é uma evidência de que as estruturas
carregadas positivamente influenciam na banda de emissão da PIR, uma vez que o
fármaco associado à essas micelas, deve ter menos liberdade de movimento. Com
relação ao Brij-35®, por se tratar de um surfactante neutro, não é observado
deslocamento significativo no λmáx de emissão.
Tabela 4
Comprimentos de onda de máxima emissão para a PIR
na presença e ausência de surfactante nos pH 4,0, 7,0 e
9,0.
pH 4,0
pH 7,0
pH 9,0
SISTEMA
λmáx nm
λmáx nm
λmáx nm
Tampão
377
379
378
CTAC
363
361
361
HPS
351
356
357
SDS
375
377
376
Brij-35
379
376
375
43
A determinação da constante de associação Kb foi calculada através da curva
que melhor se ajustasse aos dados experimentais da titulação da PIR em função da
concentração dos surfactantes. Na Tabela 5 são apresentados os valores de K b
encontrados através desse ajustes. As Figuras de 22 a 25 representam as titulações
fluorimétricas da PIR na presença de CTAC, SDS, HPS e Brij-35®, respectivamente.
Tabela 5
Constantes de associação para a PIR (1 x 10-5 mol.L-1) em surfactantes
aniônicos (SDS), catiônicos (CTAC), zwiteriônico (HPS) e neutro (Brij-35®).
SURFACTANTE
K b mol.L
-1
pH 4,0
pH 7,0
pH 9,0
595 ± 138
142 ± 26
95 ± 16
CTAC
2±1
351 ± 39
1.694 ± 315
HPS
18 ± 1
51 ± 2
1.064 ± 118
<1
5±1
518 ± 99
SDS
Brij-35®
44
140
120
100
∆F
80
60
40
20
0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2
-1
10 x [CTAC], mol.L
2,5
3,0
Figura 22 - Titulação fluorimétrica da PIR 1,0 x 10-5 mol.L-1 ,
em 376 nm, com CTAC em pH 7,0 e excitação em 274 nm.
200
∆F
150
100
50
0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
10 x [SDS], mol.L -1
2,5
3,0
2
Figura 23 - Titulação fluorimétrica da PIR 1,0 x 10-5 mol.L-1 , em
377 nm, com SDS em pH 4,0 e excitação em 273 nm.
45
250
200
∆F
150
100
50
0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
3
10 x [HPS], mol.L-1
5,0
6,0
Figura 24 - Titulação fluorimétrica da PIR 1,0 x 10-5 mol.L-1 , em
380 nm, com HPS em pH 9,0 e excitação em 286 nm.
100
80
∆F
60
40
20
0
0,0
0,5
1,0
3
1,5
2,0
10 x [Brij-35], mol.L
2,5
3,0
3,5
-1
Figura 25 - Titulação fluorimétrica da PIR 1,0 x 10-5 mol.L-1 ,
378 nm, com Brij-35® em pH 9,0 e excitação em 286 nm.
46
Os valores encontrados para as constantes de associação da PIR às micelas
de SDS, CTAC, HPS e Brij-35 confirmam a forte influência do estado de protonação
do fármaco.
Os valores elevados e aproximados, 1.700 e 1.000 M-1, respectivamente, de Kb,
em pH 9,0, para a PIR em CTAC e HPS sugerem que a interação da PIR com estas
micelas sofrem uma influência relativamente alta da estrutura micelar em relação às
interações hidrofóbicas, além das interações eletrostáticas. Tais micelas apresentam
uma estrutura hidrocarbônica maior que as micelas de SDS, e como no pH 9,0 o
fármaco encontra-se desprotonado (pKa = 6,33 em CTAC e 5,95 em HPS), tais
associações são regidas fortemente por interações hidrofóbicas. O baixo valor
encontrado para o SDS (95 M-1) no mesmo pH, corrobora com esta idéia, visto que a
estrutura do SDS, além de ser menor se comparada às micelas de CTAC e HPS,
tem estrutura mais flexível que estas últimas.
Quando se passa para pH 4,0, a PIR encontra-se protonada em todas as
micelas (vide Tabela 5); as interações eletrostáticas entre a carga micelar e o
fármaco protonado tornam-se mais importantes que as interações hidrofóbicas. Daí
obter-se uma constante extremamente baixa em micelas de CTAC (Kb ≅ 2 M-1) e
relativamente alta para micelas de SDS (Kb ≅ 600 M-1).
Para as micelas neutras de Brij-35, as associações são regidas por interações
hidrofóbicas. Por isso, em pH 9,0, quando o fármaco está desprotonado, a constante
obtida foi de aproximadamente 520 M-1 , diminuindo em pH 7,0 para 5,0 M-1, onde o
fármaco está parcialmente protonado;, até não ser possível determinar a constante
em pH 4,0 (Kb<1,0 M-1) quando o fármaco está protonado aumentando sua
solubilidade em água.
Os dados foram também analisados utilizando o gráfico do duplo recíproco
(equação 7) e os resultados obtidos são todos bem próximos dos encontrados pelo
inverso de Kd. A Figura 26 representa um exemplo típico dos gráficos do duplorecíproco encontrados.
47
0,035
0,030
1/∆F
0,025
0,020
0,015
0,010
250
500
750
1000
1250
1500
1750
1/[Brij-35], mol.L -1
Figura 26 – Duplo recíproco obtido da equação 7, para titulação
da PIR (1 x 10-5 mol.L-1) em pH 9,0 na presença de Brij-35®.
48
4.4
DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS ESPECTROSCÓPICOS DA SDZ
A SDZ (Figura 27) é um derivado sulfamídico de rápida absorção pelo trato
gastrintestinal e de rápida eliminação por via renal. Ela também atua, como a PIR,
inibindo a síntese de purinas no ciclo vital do parasita, no entanto a sua ação se
verifica através da inibição competitiva do PABA (ácido para-aminobenzóico),
inibindo a enzima diidropteroato sintetase, utilizada na síntese de ácido fólico.
N
N
NH
O S O
NH2
Figura 27 Estrutura molecular plana da SDZ
A SDZ, contrariamente à PIR, apresenta uma solubilidade relativamente alta.
Pelo método da dissolução direta, determinou-se uma solubilidade de 37,5 mg/L
para a SDZ em solução tamponada pH = 4,0, de 60,0 mg/L em pH = 7,0 e de 186
mg/ L em pH = 9,0.
Os espectros de absorção óptica da SDZ, em solução aquosa tamponada,
bem como em diversos solventes orgânicos, são mostrados nas figuras 28 e 29,
respectivamente.
49
pH 4,0
pH 7,0
pH 9,0
Calculado (protonado)
Calculado (vácuo)
0,6
241 nm
258 nm
0,5
258 nm
241 nm
265 nm
Absorbância
0,4
271 nm
0,3
0,2
0,1
0,0
200
220
240
260
280
300
320
340
360
Comprimento de onda, nm
Figura 28 - Espectros de absorção óptica da SDZ em meio aquoso e
calculado teoricamente.
Em solução aquosa, a SDZ apresenta uma banda bem definida com dois
máximos centrados em 241 e 258 nm (em pH 7,0 e 9,0). Em pH = 4,0, há a
presença de uma banda centrada em 265 nm e, além disso, há a presença de um
ombro em torno de 209 nm. Esse ombro deve estar deslocado para comprimento de
onda menor que 200nm nos meios ácidos e básicos.
Os espectros ópticos obtidos através de cálculos teóricos, utilizando o
ZINDO_S/ci,
evidenciam
as
formas
e
bandas
de
absorções
obtidas
experimentalmente para pH 7,0 e pH 4,0 através dos espectros calculado (vácuo) e
calculado (protonado) respectivamente (figura 28).
50
268 nm
1,2
DMSO
Acetonitrila
Éter
Metanol
1,0
Absorbância
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
200
250
300
350
400
Comprimento de Onda, nm
Figura 29 - Espectros de absorção óptica da SDZ em solventes
orgânicos.
Em
solventes
orgânicos,
a
SDZ
apresenta
uma
banda
centrada
aproximadamente em 270 nm, independente do solvente orgânico polar utilizado
(Figura 29).
Os máximos de absorção idênticos da SDZ para os espectros teóricos e
experimentais (pH 7,0 e 9,0) é uma evidência que a absorção do fármaco não sofre
influência do solvente utilizado (Figura 28).
Apesar do espectro protonado (pH = 4,0 obtido experimentalmente) e do
calculado apresentarem diferença no máximo de absorção de 6 nm, isso não é o
suficiente para afirmar categoricamente que a SDZ sofre influência significativa do
efeito de solvatação.
51
Da mesma forma que se determinou para a PIR o coeficiente de
absortividade molar, também foi determinado para a SDZ, o ε através da equação da
reta obtida da curva de calibração nos diferentes valores de pH e no comprimento de
onda de máxima absorção (Figura 30).
1,0
0,9
0,8
0,8
Absorbância
0,6
0,4
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,2
0,1
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
-5
5,0
6,0
1,0
7,0
2,0
3,0
4,0
-5
-1
5,0
6,0
7,0
-1
10 x [SDZ], mol.L
10 x [SDZ], mol.L
0,8
0,7
0,6
Absorbância
Absorbância
0,7
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0,0
1,0
2,0
-5
3,0
4,0
5,0
-1
10 x [SDZ], mol.L
Figura 30 - Curvas de calibração da SDZ obtidas através da espectroscopia
de absorção. (●) pH 4,0, λ = 265 nm e R = 0,9995; (■) pH 7,0, λ = 258 nm e R
= 0,9996 e (▲) pH 9,0, λ = 241nm e R = 0,9995.
52
Os coeficientes de absortividade molar da SDZ no comprimento de onda
máximo de absorção (265 nm em pH = 4,0, 258 nm em pH = 7,0 e 241 nm em pH
9,0) crescem à medida que se passa do meio ácido para o básico. A tabela 6 mostra
o ε para a SDZ em solução aquosa. Os valores dos coeficientes observados
sugerem que as transições são do tipo π→π* o que também é corroborado através
de cálculos teóricos, utilizando o ZINDO_S/ci.
Os dois máximos da banda de absorção observada para os pH 7,0 e 9,0 nos
comprimentos de onda 241 e 258 nm (Figura 28) devem-se ao fato de que as
transições eletrônicas, nestes meios, são predominantes: π→π* e transferências de
carga dos oxigênios para o enxofre e para o anel aromático.
Tabela 6
Coeficiente de absortividade molar das soluções de
SDZ nos pH’s 4,0, 7,0 e 9,0.
λ
ε
pH
nm
L mol-1 cm-1
4,0
265
14.509 ± 415
7,0
258
13.066 ± 211
9,0
241
17.957 ± 554
53
4.5
DETERMINAÇÃO DO PKa SDZ
A SDZ apresenta, em sua estrutura, átomos de nitrogênio suscetíveis a
protonação (figura 31) com possibilidade de obter mais de um valor de pKa. No
entanto, os valores de energia da protonação destes nitrogênios, obtidos através de
cálculos teóricos utilizando o ZINDO_S/cin, evidenciam que apenas um valor de pKa
pode ser observado. Isso se deve ao fato que os valores das energias de
protonação dos nitrogênios são relativamente iguais (Tabela 7) e a diferença entre
os prováveis valores de pKa não são observados experimentalmente.
Átomo de Enxofre
2
Átomo de Oxigênio
7
Átomo de Carbono
23
Átomo de Nitrogênio
Átomo de Hidrogênio
6
Figura 31 – Sítios nitrogenados da SDZ.
Tabela 7 – Energia de interação entre um próton (H+) e
um nitrogênio da SDZ.
Nitrogênio do grupo amina
Energia kcal mol-1
2
157,22
6
152,99
7
169,99
23
177,03
54
Semelhantemente a PIR, foi realizada titulação de solução aquosa
tamponada de SDZ onde se mediu a variação da absorbância em função do pH.
A figura 32 apresenta a variação da absorbância em função do pH para a
SDZ, na ausência de micelas, e as figuras de 33 a 35, para a SDZ em presença de
micelas CTAC, SDS e Brij-35, respectivamente.
1,30
1,20
Absorbância
1,10
1,00
0,90
0,80
0,70
0,60
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
pH
Figura 32 - Dependência da absorção em 241 nm da SDZ
(7,5 x 10-5 mol.L-1) em função do pH.
12,0
55
1,30
1,20
1,10
Absorbância
1,00
0,90
0,80
0,70
0,60
0,50
0,40
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
Figura 33 - Dependência da absorção em 241 nm em
função do pH da SDZ (7,5 x 10-5 mol.L-1) na presença
CTAC 40 mmol.L-1.
1,60
Absorbância
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
11,0
12,0
pH
Figura 34 - Dependência da absorção em 241 nm em função
do pH da SDZ (7,5 x 10-5 mol.L-1) na presença SDS 120
mmol.L-1.
56
0,9
0,8
Absorbância
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
Figura 35 - Dependência da absorção em 241 nm em função do
pH da SDZ (7,5 x 10-5 mol.L-1) na presença Brij-35® 40 mmol.L-1.
Na
Ttabela
8,
pode
ser
observado
os
valores
de
pKa
obtidos
experimentalmente.
Tabela 8
Valores de pKa para SDZ 7,50 x 10-5 mol.L-1 em tampão triplo 20 mmol.L-1 obtidos
da titulação espectrofotométrica na presença e ausência de micelas.
Sistema
Tampão
[Micela]
pKa
mmol.L-1
0
6,38 ± 0,02
∆pKa
∆pKa-meio
∆pKa-el
-
-
-
e.Ψ
( meV)
-
SDS
120
7,09 ± 0,02
0,71
0,05
0,66
-42(-39)
CTAC
40
6,31 ± 0,02
-0,07
0,05
-0,12
4(7)
Brij-35
40
6,43 ± 0,03
0,05
0,05
0,00
-3(0)
HPS
40
7,05 ± 0,08
0,67
0,05
0,62
-40(-37)
TRITON X-100
0,5
6,82 ± 0,03
0,44
0,05
0,39
-26(-23)
57
Exceto para TRITON X-100, que absorve na mesma região da SDZ, a
concentração dos surfactantes foi sempre acima da cmc (concentração micelar
crítica) para garantir uma concentração de micelas suficientemente alta [24].
Diferentemente da PIR, para a SDZ o deslocamento do valor de pKa
observado para as micelas (Tabela 8) são inferiores a uma unidade de pKa. Sendo
assim, a associação do fármaco às mesmas deverá ser regida por interações
predominantemente hidrofóbicas.
Os valores experimentais dos potenciais obtidos para a SDZ, em presença de
CTAC (7 meV) e SDS (-39 meV) são muito pequenos em comparação com os
valores extraídos da literatura [46]. Esta diferença sugere a confirmação das
interações hidrofóbicas entre a SDZ e as micelas em estudo, e também que o
fármaco deve estar localizado em uma região mais hidrofóbica da micela.
Para a SDZ, uma contribuição eletrostática de 0,66 e -0,12 foram observadas
para SDS e CTAC, respectivamente. Estes valores sugerem que a contribuição
eletrostática é de baixa intensidade, visto que as contribuições obtidas são menores
em relação as encontradas para a PIR (SDS = 3,12 e CTAC = 0,38).
58
4.6
DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE ASSOCIAÇÃO DA SDZ ÀS
MICELAS
A análise da interação da SDZ com as micelas foi realizada a partir de
experimentos que envolvem titulações fotométricas do fármaco com as soluções das
micelas. O método empregado para tal fim, está baseado na mudança da absorção
da luz da molécula do fármaco, relacionada à solubilização da mesma no meio
organizado. Dessa forma, o comprimento de onda de absorção máxima da SDZ foi
monitorado quando se variava a concentração de micelas no meio.
Os valores da constante de associação Kb da SDZ foram determinados através
da curva que melhor se ajustou aos dados experimentais da titulação da SDZ, em
função da concentração de micelas (equação 8) em pH 4,0, 7,0 e 9,0 (Figuras 36 e
37).
0,58
0,56
Absorbância
0,54
0,52
0,50
0,48
0,46
0
5
10
15
20
25
30
35
40
10 x [CTAC], mol.L-1
3
Figura 36 - Titulação fotométrica da SDZ 1,0 x 10-4 mol.L-1 , em
265 nm, com CTAC em pH 7,0.
59
0,32
0,30
Absorbância
0,28
0,26
0,24
0,22
0,20
0,18
0
10
20
[HPS], mol.L
30
-1
x 10
40
50
-3
Figura 37 - Titulação fotométrica da SDZ 1,0 x 10-4 mol.L-1 , em
266 nm, com HPS em pH 7,0.
Os valores das constantes de associação da SDZ às micelas podem ser
observados na tabela 9.
Tabela 9
Constantes de associação para a SDZ (1 x 10-4 mol.L-1) em surfactantes
aniônicos (SDS), catiônicos (CTAC) e zwiteriônico (HPS).
SURFACTANTE
K b , mmol.L
-1
pH 4,0
pH 7,0
pH 9,0
SDS
5,0 ± 4,0
11,0± 2,0
-
CTAC
11,0 ± 2,0
69,0 ± 1,0
17,0 ± 6,0
HPS
5,0 ± 0,5
-
-
60
As constantes de associação da SDZ às micelas, de forma geral, são em torno
de três ordens de grandeza ou mais, menores que as encontradas para a PIR.
Em
pH
4,0,
as
constantes
encontradas
são
estatisticamente
iguais,
considerando-se o erro da medida. Esse fato pode estar indicando que, assim como
foi percebido no estudo de pKa do fármaco, a carga da micela não influencia
decisivamente na sua associação. No entanto, o método utilizado para a
determinação de tais constantes, por ser baseado na mudança de absorção do
fármaco, quando particiona para o meio organizado micelar, é limitado quando esta
variação é pequena. Fato este que ocorre com a SDZ. Daí pode-se estar
subestimando os valores de tais constantes devido a baixa sensibilidade do método.
Em pH 7,0, quando o fármaco encontra-se parcialmente protonado, observa-se
uma diferença significativa entre a constante obtida para o SDS (Kb ≅ 11 mmol.L-1) e
CTAC (Kb ≅ 69 mmol.L-1). Isso pode estar refletindo a maior hidrofobicidade do
CTAC em relação ao SDS.
Em pH 9,0, o método não se mostrou sensível à determinação da constante de
associação a nenhuma micela, exceto para o CTAC onde foi obtido o valor de
aproximadamente 17 mmol.L-1. Dados preliminares de voltametria cíclica sugerem
que o fármaco deve hidrolisar neste pH, o que aumentaria a sua solubilidade em
água, reduzindo ainda mais a constante de associação às micelas.
O método utilizado não foi sensível para determinar a constante de associação
da SDZ às micelas de Brij-35.
61
5
CONCLUSÕES
O estudo minucioso da espectroscopia óptica dos fármacos antitoxoplasmose
mostrou de forma enriquecedora que a PIR apresenta uma baixa solubilidade em
água e um espectro de absorção óptica com uma banda centrada em torno de 270
nm (meio neutro e ácido), deslocada para 285 nm em meio básico. Os coeficientes
de absortividades molares estão centrados em valores típicos das transições de
baixa energia do tipo π→π*, e os cálculos teóricos apontam na mesma direção. Já a
SDZ tem banda com dois máximos centrados em 241 e 258 nm em meio neutro e
básico, e uma banda centrada em 264 nm em meio ácido. Em pH = 4,0, a SDZ ainda
apresenta uma banda de absorção centrada em aproximadamente 209 nm. As
transições, também, são de baixa energia, ou seja, π→π*.
Valores teóricos da energia de interação, para a protonação dos nitrogênios
existentes na estrutura da PIR e SDZ, evidenciam que estes fármacos possuem
apenas um valor de pKa;
e os valores: 7,26 ± 0,07 e 6,38 ± 0,02, obtidos
experimentalmente para a PIR e SDZ, respectivamente corroboram para tal
evidência. Contudo, em meio micelar, observou-se deslocamentos relativamente
altos nos valores de pKa da PIR, sugerindo uma maior influência da carga micelar na
interação
fármaco-micela.
Já
para
a
SDZ,
as
interações
devem
ser
predominantemente hidrofóbicas, pois o pKa não sofre muita influência da carga
micelar. Isto se deve as forças de atrações eletrostáticas fármaco-micela, mais
intensas para a PIR, enquanto que para a SDZ essas forças são de baixa
intensidade. Por sua vez, uma maior flexibilidade da estrutura micelar, além do
estado de protonação dos fármacos, também, influência estas interações e as
constantes de associações (Kb) são sempre maiores para micelas mais rígidas
(CTAC e HPS) do que para as mais flexíveis (SDS). A maior afinidade observada
com micelas catiônicas e zwiteriônicas para a PIR, em pH 9,0 (1.694 ± 315 M-1 para
CTAC e 1.064 ± 118 M-1 HPS) confirmam estas influencias.
Todas as constantes de associação encontradas para SDZ às micelas são
extremamente baixas, da ordem de milimolar, evidenciando um caráter pouco
lipossolúvel do fármaco. No entanto, o método utilizado não foi sensível para
determinar a constante de associação para a SDZ.
62
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
Estudos de supressão de fluorescência deverão ser pensados efetuados no
universo da química para que a partir deles possa determinar com maior precisão e
segurança a localização da PIR nos sistemas modelos estudados na pesquisa
realizada e registrada no trabalho que ora é apresentado.
Medidas de microcalorimetria diferencial poderão ser utilizadas para se
determinar as constantes de associação dos fármacos estudados, sobretudo da
SDZ, uma vez que a técnica baseada na mudança de absorbância se mostrou
pouco sensível para tal fim.
63
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. LEHMANN, T. et al. Tansmission dynamics of Toxoplasma gondii on a pig form.
Infection, Genetics and Evolution, U.S.A., v. 3, p. 135-141, mar. 2003.
2. NETO, V. A. et al.; Toxoplasmose; São Paulo, Sarvier, 1995. Cap. 1.
3. http://www.abcdasaude.com.br/artigo.php?417, acessado em 10 de novembro de
2005.
4. BRAZ, L.M.A. et al. Avaliação da eficácia da azitromicina e da pirimetamina,
usadas isolada ou associadamente, no tratamento de infecção experimental de
camundongos pelo Toxoplasma gondii. Revista da sociedade Brasileira de
Medicina Tropical. V. 32, p 401-403, jul-ago. 1999.
5. MONTOYA, J.C., LIESENFELD, O., Toxoplamosis, THE LANCET, USA, Vol 363,
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6. Cento de vigilância Epidemiologoica – CVE. MANUAL DAS DOENÇAS
TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS. Secretaria de Estado da Saúde de São
Paulo.
7. BHOPALE, G. M. Pathogenesis of toxoplasmosis. Comp. Immol/Lun. Microbiol.
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