Quantificação de Microorganismos da Água do Mar

Prática 9: Quantificação de Microrganismos da Água do Mar.
A quantificação do número de microrganismos constitui uma das análises
microbiológicas necessárias na microbiologia alimentar e microbiologia da água. Nas
análises de água, quer seja água para consumo ou água para banho, doce ou salgada,
para além da análise com meios selectivos para detecção e estimativa dos
microrganismos indicadores (Coliformes Fecais, Coliformes Totais, Enterococci), fazse também rotineiramente, a contagem do número de microrganismos presentes em
um dado volume de água (Seeley et al. 1991).
Uma vez que o número de bactérias de uma dada amostra é muito grande, torna-se
necessário diluir a amostra inicial e posteriormente semear um dado volume da
amostra diluída em meio de Agar Nutriente, ou outro meio de cultura geral à
escolha.
Podem utilizar-se duas técnicas de sementeira distintas, de modo a atingir o objectivo
de estimar o número de bactérias de uma amostra de água. Uma das técnicas
designa-se por Sementeira por Espalhamento (Spread Plate), em que um volume de
1ml ou 0.1ml da amostra de água é pipetado em cima de meio de cultura sólido e
espalhada com uma vareta de vidro por toda a superfície do agar. A segunda técnica,
designada por Sementeira por Incorporação (Pour Plate), consiste na mistura de 1 ou
0.1ml da amostra de água com o meio de cultura ainda no estado liquido. A amostra
de água terá que ser diluída antes de semeada, de modo a que se consigam obter
placas com um número de colónias não superior a 300. Idealmente, as placas após o
período de incubação, devem apresentar de 25 a 250-300 colónias, de modo a que
possam ser objectivo de contagem. A contagem expressa-se como CFUs (ColonyForming-Units) ou UFCs (Unidades Formadoras de Colónias), visto que na prática
estamos a contar o nº de colónias formadas e não o nº de bactérias, uma vez que as
bactérias muitas vezes formam arranjos complexos de células, como é o caso do
género Staphylococcus, cujo arranjo celular se apresenta em cacho de uva.
A quantificação do nº de bactérias da amostra em estudo será estimada através da
fórmula:
Número de CFUs por ml da amostra = número de colónias contadas/ factor de diluição x
volume inoculado
Material e Métodos
- tubos de ensaio com Agar Marinho no estado liquido, em banho-maria
- tubos de ensaio com solução salina esterilizada (solução diluente)
- caixas de petri esterilizadas
- caixas de petri com Agar Marinho sólido
- pipetas esterilizadas de 1 ml
- lamparinas
- álcool 70%
Metodologia a seguir para Sementeira por Incorporação:
Cada grupo tem à sua disposição, 4 tubos de ensaio com Agar Marinho, mantido no
estado liquido em banho-maria, e 4 tubos de ensaio com solução salina esterilizada
(diluente).
- Agite bem o frasco da amostra de água a analisar, de modo a misturar bem de
forma uniforme os possíveis microrganismos que aí se encontram.
- 1º tubo: Retire 1ml desta água com uma pipeta esterilizada e transfira para um tubo
de solução salina. Misture bem com a ajuda da própria pipeta. Este será o tubo de
diluição 1: 10. Escreva no tubo a sua diluição; Pipete deste tubo 1ml para uma caixa
de petri esterilizada (no centro da caixa). Escreva na caixa a diluição da amostra
inoculada.
- 2º tubo: Retire 1 ml do 1º tubo e transfira para novo tubo de solução salina,
utilizando outra pipeta. Misture bem e identifique o tubo com a diluição
correspondente 1:100. Pipete deste tubo 1ml para nova caixa de petri esterilizada e
escreva na caixa a diluição correspondente.
- 3º tubo: Retire 1ml do 2º tubo de diluição e transfira para novo tubo de diluição.
Proceda da mesma forma que anteriormente, identificando o tubo como de diluição
1:1000, e introduzindo 1ml de amostra deste tubo em nova caixa de petri esterilizada.
- 4º tubo: Utilize o mesmo procedimento transferindo 1ml do 3º tubo de diluição
para este novo tubo, de modo a obter uma diluição de 1:10000.
No final desta série de diluições terá 4 tubos com diferentes diluições e 4 caixas de
petri também com 4 diluições distintas da amostra inicial.
- Certifique-se que os 4 tubos de Agar Marinho do seu banho-maria estão líquidos, e
a uma temperatura que ronda os 45 0C.
Deite o agar em cada uma das caixas de petri onde inoculou previamente 1 ml da sua
amostra diluída, 1 tubo de agar para cada caixa de petri, e misture bem a amostra
com o agar, executando movimentos rotativos da caixa sobre a bancada.
Deixe o agar solidificar, inverta as caixas e incube a 30 0C.
O esquema exemplifica o processo de diluição da amostra de água:
Sementeira por Espalhamento:
Para esta metodologia necessita de 4 caixas de Agar Marinho sólido. Identifique as
caixas com as diluições 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000. Em cada uma delas vai inocular 1
ml de amostra de cada tubo de diluição correspondente (ex: na caixa de diluição 1:10
vai inocular 1ml do tubo de diluição 1:10).
Com auxílio de um espalhador (pipeta Pasteur cuja extremidade foi dobrada em
“L”), devidamente esterilizado à chama e arrefecido, espalhe a sua amostra por toda
a superfície do agar. Deixe secar bem, e incube as caixas invertidas a uma
temperatura de 30 oC.
Resultados e Discussão:
Na próxima aula irá contar o nº de colónias formadas, e estimar o nº de CFUs por ml,
tendo em conta a diluição. Como exemplo se contou 150 colónias na placa de diluição
1: 1000 (10-3) então 150/10-3 será 150 x 1000 bactérias por ml. Dado que efectuará a
contagem para diversas diluições, poderá calcular a média do nº de bactérias por ml
da sua amostra de água. Questões a considerar na discussão deste trabalho prático
serão:
- Comparar o nº de bactérias por ml obtido pelos 2 métodos utilizados,
nomeadamente com qual dos métodos obteve o maior nº de bactérias,
- as vantagens e desvantagens destes métodos.
Na discussão é preciso ter em conta a proveniência da amostra de água analisada,
uma vez que o nº de bactérias/ml varia consoante o tipo de ecossistema (marinho
costeiro; marinho oceânico; águas oligotróficas, águas eutróficas….).
Literatura de apoio:
- Austin, B. (1992). Marine Microbiology, Cambridge University Press, UK: Cap 3 & 4
- Rheinheimer, G., Gocke, K. (1994). The use of bacteriological variables for the
characterization of different water bodies. Int. Revue ges. Hydrobiol. 79: 605-619.