Identificação da mutação A1762T/G1764A do vírus da
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE – UFCSPA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEPATOLOGIA Adaliany Cecilia da Silva Souza Identificação da mutação A1762T/G1764A do vírus da hepatite B em pacientes de Porto Alegre Porto Alegre 2015 Adaliany Cecília da Silva Souza Identificação da mutação A1762T/G1764A do vírus da hepatite B em pacientes de Porto Alegre Dissertação submetida ao Programa de PósGraduação em Hepatologia da Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito para a obtenção do grau de Mestre. Orientadora: Profa. Drª Ana Beatriz Gorini da Veiga Co-orientador: Dr. Nélson Alexandre Kretzmann Filho Porto Alegre 2015 Catalogação na Publicação da Silva Souza, Adaliany Cecília Identificação da mutação A1762T/G1764A do vírus da hepatite B em pacientes de Porto Alegre / Adaliany Cecília da Silva Souza. -- 2015. 44 p. : tab. ; 30 cm. Dissertação (mestrado) -- Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Programa de Pós-Graduação em Medicina: Hepatologia, 2015. Orientador(a): Ana Beatriz Gorini da Veiga ; coorientador(a): Nélson Alexandre Kretzmann Filho . 1. Hepatite B. 2. Mutação A1762T/G1764A do VHB. I. Título. Sistema de Geração de Ficha Catalográfica da UFCSPA com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Adaliany Cecília da Silva Souza Identificação da mutação A1762T/G1764A do vírus da hepatite B em pacientes de Porto Alegre Dissertação de Mestrado submetida à Comissão Julgadora do Programa de Pós-Graduação em Hepatologia da Fundação Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre em Medicina: Hepatologia. Banca Examinadora: _________________________________________________________ _________________________________________________________ __________________________________________________________ Data de Aprovação ____/____/______ Porto Alegre 2015 Dedico ao meu esposo, Antonio David, ao meu querido e lindo filho, Artur David, por toda parceria e dedicação na conquista do meu sonho. Em especial ao meu amado esposo principalmente por compreender minha ausência, por sempre ofertar apoio, me confortar com palavras amorosas, com muito carinho, bem como por dedicar a mim motivação e incentivos constantes ao longo de muitos anos. AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Eliane e Adailton, pela base familiar que me foi oferecida. Aos meus amados irmãos, Lidiane e Eli, por todo amor, carinho e compreensão, aos meus cunhados e cunhadas. Aos meus amados sobrinhos: Renan, Felipe, João, Luiza, Julia e Gustavo, por todo carinho e compreensão de minha ausência. À minha orientadora, Dra Ana Beatriz Gorini da Veiga, por todo carinho, compreensão, ensinamentos e esforço para conclusão deste meu sonho. Muito obrigada. Ao meu co-orientador, Dr. Nélson Alexandre Kretzmann Filho. À aluna de Iniciação Científica Lenise Oliveira e à Mestranda Giórgia Marasca por toda a ajuda. À Professora Dra Cristiane Valle Tovo e ao médico Dimas Alexandre Kliemann, pelo apoio e dedicação. A toda equipe do Setor de Infectologia do Hospital Conceição, por todo o carinho e acolhimento. A toda equipe do Laboratório de Biologia Molecular da UFCSPA, em especial a Magda e Grasiela pelo carinho e ajuda. À Dra Aline Gehlen Dall Bello e à Dra Tiane Martin de Moura por toda ajuda, carinho e ensinamentos. À secretária Luciani Spencer, por todo apoio. A todos meus amigos que, de alguma forma, ajudaram nessa conquista, em especial a minha amiga Keli Silveira, por toda amizade, carinho, companheirismo, lealdade e ensinamentos. RESUMO Introdução: A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um problema de saúde pública mundial, havendo cerca de 2 bilhões de pessoas infectadas no mundo. A infecção pelo VHB pode manifestar como hepatite aguda, hepatite fulminante e hepatite crônica, sendo que os pacientes com hepatite crônica podem desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular. Na hepatite B crônica ocorre uma intensa replicação viral, na qual observa-se a presença do antígeno e (HBeAg-positivo); a soroconversão, com surgimento do anti-HBe, está associada a um prognóstico favorável. Algumas mutações no genoma viral, como a dupla mutação A1762T/G1764A, estão associadas a um mau prognóstico da doença hepática, com maior risco de desenvolver carcinoma hepatocelular, mesmo quando ocorre soroconversão. Objetivo: Identificar a mutação A1762T/G1764A do VHB em pacientes infectados, por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase seguida pela análise de fragmentos de restrição (PCR-RFLP), e relacionar a presença ou não da mutação com o prognóstico da doença hepática. Metodologia: Foram selecionados 49 pacientes com hepatite B crônica com carga viral acima de 200 cópias, no período de novembro de 2012 a dezembro de 2013. A identificação da mutação A1762T/G1764A foi realizada por intermédio da técnica de PCRRFLP usando a enzima de restrição Sau3AI. Resultados: Dos 49 pacientes analisados, 21 eram do gênero feminino (42,85%) e 28 do gênero masculino (57,14%). A idade mínima foi de 19 anos e a idade máxima foi de 79 anos (média 50,48 e desvio padrão de 12,764). Todas as amostras apresentaram resultados positivos para VHB. A mutação A1762T/G1764A do VHB foi identificada em 4 amostras (8,16%). Na análise da carga viral do VHB não houve diferença significativa entre os grupos (p=0,43). Houve diferença significativa nos níveis de ALT (p=0,0028), mas não de AST (p=0,051). Observou-se 75% de soroconversão HBeAnegativo e anti-HBe-positivo nos portadores de VHB contendo a mutação A1762T/G1764A. Conclusão: A detecção da mutação A1762T/G1764A do VHB foi baixa devido ao baixo número de amostras. Valores alterados da variável ALT em conjunto com a presença da mutação A1762T/G1764A podem indicar um mau prognóstico da doença hepática. A soroconversão do HBeAg em anti- HBe em pacientes com carga viral alta pode está relacionada com a presença da mutação A1762T/G1764A do VHB. Palavras-chave: Hepatite B; Mutação A1762T/G1764A do VHB; Hepatites Virais. ABSTRACT Introduction: Hepatitis B is an infectious disease caused by the Hepatitis B Virus (HBV), which is a worldwide public health problem with around 2 billion people infected. The infection with HBV can manifest as acute hepatitis, fulminant hepatitis and chronic hepatitis. Patients with chronic hepatitis may develop cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In chronic hepatitis B there is an intense viral replication, in which the presence of the antigen (HBeAg positive) is observed; seroconversion, with the appearance of anti-HBe, is associate with a favorable disease prognosis. Viral mutations, such as the double mutation A1762T/G1764A, are associated with poor prognosis, with a greater risk of developing hepatocellular carcinoma, even when occurs seroconversion. Objective: Identify the mutation A1762T/G1764A of HBV in infected patients by polymerase chain reaction followed by restriction fragment analysis (PCR-RFLP), and correlate the presence or absence of the mutation with disease prognosis. Methodology: 49 patients with chronic hepatitis B and viral load above 200 copies were selected between November 2012 and December 2013. The identification of the A1762T/G1764A mutation was performed by PCR-RFLP using the restriction enzyme Sau3AI. Results: Among the 49 patients, 21 were female (42.85%) and 28 males (57.14%). The minimum age was 19 years old and the maximum age was 79 years old (mean 50.48 and standard deviation of 12.764). All samples were positive for the wild strain of HBV; 4 samples (8.16%) were positive for both the wild strain and the A1762T/G1764A mutants. No significant difference was found in viral loads between groups (p = 0.43). There was statistically significant difference in ALT levels (p = 0.0028), but not in AST levels (p = 0.051). 75% of HBeAgA-negative to anti-HBe-positive seroconversion was observed in patients with the A1762T/G1764A HBV mutants. Conclusion: Detection of the A1762T/G1764A HBV mutation was low due to the low number of samples. The change in ALT levels along with the presence of A1762T/G1764A HBV mutants may be related to poor prognosis of liver disease. The HBeAg seroconversion to anti-HBe in patients with high viral load is related to the presence of A1762T/G1764A HBV. Keywords: Hepatitis B; A1762T / G1764A HBV Mutation; Viral Hepatitis. LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1 (Revisão da Literatura) - Prevalência da Hepatite B no mundo.................................11 Figura 2 (Revisão da Literatura) - Marcadores sorológicos na hepatite B aguda.....................14 Figura 3 (Revisão da Literatura) - Marcadores sorológicos na hepatite B crônica...................14 Figura 4 (Revisão da Literatura) - Genoma do VHB................................................................16 Figura 5 (Revisão da Literatura) - Partícula Dane VHB...........................................................17 Tabela 1 (Artigo) – Principais parâmetros sorológicos para VHB...........................................35 Tabela 2 (Artigo) - Principais parâmetros bioquímico para VHB ...........................................35 Figura 1 (Artigo) - Eletroforese em gel de agarose da RFLP...................................................36 Tabela 3 (Artigo) - Carga Viral das amostras sem a mutação e com a mutação......................37 Tabela 4 (Artigo) - Relação de AST das amostras sem a mutação e com a mutação...............38 Tabela 5 (Artigo) - Relação de ALT das amostras sem a mutação e com a mutação...............38 Tabela 6 (Artigo) - Comparação HBeAg e Anti-HBe e a Mutação A1762T/G1764A.............39 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ALT Alanina Aminotransferase Anti-HBc Anticorpo anti-HBc Anti-Hbe Anticorpo anti-HBe AST Aspartato Aminotransferase BD Bilirrubina Direta BI Bilirrubina Indireta BT Bilirrubina Total CREAT Creatinina CHC Carcinoma Hepatocelular DNA Ácido Desoxirribonucléico G Força Gravitacional GGT Gama Glutamiltransferase HB Hepatite B HBcAg Antígeno Core do Vírus da Hepatite B HBeAg Antígeno e do Vírus da Hepatite B HBsAg Antígeno de Superfície do Vírus da Hepatite B HBxAg Antígeno x do Vírus da Hepatite B HIV Vírus da Imunodeficiência Humana IFN Interferon IFNα Interferon Alfa IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M µL Microlitro µM Micromolar Nm Nanômetro ORF Janela Aberta de Leitura Pb Pares de Base PCR Reação em Cadeia da Polimerase PCB Promotor Core Basal qPCR Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real RFLP Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição VHB Vírus da Hepatite B SUMÁRIO 1. REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................................11 1.1 Infecção pelo VHB.............................................................................................................11 1.2 Trajetória da Infecção pelo VHB.......................................................................................12 1.3 Transmissão........................................................................................................................13 1.4 Vacinação...........................................................................................................................13 1.5 Diagnóstico.........................................................................................................................13 1.6 Tratamento..........................................................................................................................15 1.6.1 Drogas..............................................................................................................................15 1.7 O Vírus da Hepatite B.........................................................................................................16 1.8 Antígenos Virais.................................................................................................................17 1.9 Genótipos do VHB.............................................................................................................18 1.10 Mutação Virais..................................................................................................................19 1.11 HBeAg e a dupla Mutação A1762T/G1764A ..................................................................20 1.12 Identificação da dupla Mutação A1762T/G1764A Através da Técnica de PCR-RFLP...20 2. JUSTIFICATIVA..................................................................................................................21 3. OBJETIVOS.........................................................................................................................22 3.1 Objetivo Primário................................................................................................................22 3.2 Objetivos Secundários.........................................................................................................22 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................23 5. ARTIGO................................................................................................................................29 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................................43 11 1. REVISÃO DA LITERATURA 1.1 Infecção pelo VHB A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um problema de saúde pública mundial. Mesmo sendo uma doença com prevenção a partir de vacinação, estima-se que 2 bilhões de pessoas estejam infectadas pelo VHB no mundo, dessas, cerca de 350 milhões apresentam marcadores sorológicos de infecção ativa. A cirrose hepática e o carcinoma hepatocelular (CHC) são desfechos comuns da hepatite B, sendo previstas mais de 1 milhão de mortes anualmente no mundo (1). As regiões com alta prevalência de casos de VHB (>8%) estão concentradas no Sudeste Asiático, China, Filipinas, África, Bacia Amazônica e Oriente Médio, as regiões com prevalência intermediária (2-7%) inclui países do Leste Europeu, Ásia Central, Japão, Israel e Rússia, as regiões com baixa prevalência (<2%) são Europa Ocidental, Austrália, Nova Zelândia, América do Norte e América do Sul (Figura 1) (2-3). A América do Sul apresenta baixa prevalência de VHB. Entretanto, na região Amazônica brasileira a prevalência é considerada alta, comparável à da Ásia (1-2) . A distribuição do VHB é bastante heterogênea no Brasil, destacando uma faixa que abrange os estados do Acre, Rondônia e Roraima (4-5) . A incidência no Brasil, no período de 1999 a 2011, foram notificados 120.343 casos confirmados de hepatite B. Na região sul do Brasil, no período de 1999 a 2011 foram notificados 38.007, só em 2010 foram notificados 3.906 casos sendo, 1.167,89 (29,9%) dos casos no Rio Grande do Sul. Em Porto Alegre no período de 1999 a 2011 foram notificados 1693 casos de hepatite B (6). Figura 1. Prevalência da Hepatite B no mundo. Fonte: CDC, 2012 (7). 12 1.2 Trajetórias da Infecção pelo VHB A hepatite B pode se manifestar de maneiras diferentes, conforme a atividade viral, podendo ser classificada em hepatite aguda, hepatite fulminante ou hepatite crônica (2). Quando o VHB infecta um indivíduo, ocorre um período de incubação que pode levar de 45 a 180 dias. Após esse período, os indivíduos desenvolvem quadros de hepatite aguda, na maioria das vezes subclínica e anictérica. Apenas 20% dos pacientes desenvolvem icterícia e cerca de 0,1 a 0,5 % dos pacientes evoluem para um caráter fulminante, com taxa de letalidade de 70% (2,7). A infecção aguda pelo VHB evolui para cura em 90-95% dos casos e, em 5-10% dos casos, leva à hepatite B crônica (2, 8-9). Metade desses portadores de hepatite B crônica não apresentam doença hepática, mas a outra metade mostra sinais de atividade inflamatória no fígado por muitos anos, podendo desenvolver, nas fases mais tardias da doença, cirrose hepática e/ou CHC (2,10-12) . Estima-se que 15 a 20% dos pacientes com hepatite B crônica desenvolvem cirrose dentro de cinco anos (1, 12 ). A hepatite B crônica é caracterizada pela intensa replicação viral, nessa fase, encontrase positivo o antígeno e do VHB (HBeAg-positivo), que é um marcador de replicação viral. Quando o hospedeiro tem uma boa resposta imunologia, a hepatite B evolui para melhora no quadro clínico, apresentando anticorpo contra o antígeno HBe (anti-HBe) por um processo de soroconversão. Na soroconversão apresenta o seguinte perfil sorológico: HBeAg-negativo e o anti-HBe-positivo. A soroconversão indica uma redução na replicação viral e, consequentemente, a regressão na reação inflamatória no fígado; nessa fase, há uma diminuição no risco de desenvolver cirrose e/ou CHC. O processo de soroconversão é precedido por uma elevação abrupta das aminotransferases e exacerbação da inflamação hepática, a qual requer atenção a um pequeno grupo de pacientes que podem desenvolver hepatite fulminante (1,2 13-15). Alguns pacientes, mesmo soroconvertidos apresentam um prognóstico desfavorável para a hepatite B. Estudos têm demonstrado haver associação entre mutações virais e a progressão da hepatite B em pacientes soroconvertidos. Pacientes portadores de cepas virais que apresentam determinadas mutações na região Pre-Core ou na região Promotor Basal do Core (PBC) apresentam um pior prognóstico da doença. Neste contexto, a dupla mutação A1762T/G1764A merece destaque, uma vez que pacientes infectados por cepas mutantes desenvolvem rapidamente cirrose hepática, a qual se instala progressivamente, muitas vezes de forma assintomática, podendo evoluir para CHC (16-20). 13 1.3 Transmissão Os principais mecanismos envolvidos na transmissão do VHB estão relacionados à exposição percutânea do sangue e seus derivados. A transmissão do VHB se faz por meio de vias como a perinatal, sexual, transfusão de sangue e seus componentes ou produtos derivados do plasma, compartilhamento ou reutilização de agulhas e há, ainda, evidências que sugerem a transmissão por compartilhamento de instrumentos de manicure e lâminas de barbear (4, 8, 9, 21) . 1.4 Vacinação A infecção pelo VHB pode ser prevenida a partir da vacinação, a qual está disponível no Brasil e é distribuída pela rede pública de saúde. As vacinas são produzidas por meio de engenharia genética por intermédio da inserção de um plasmídeo contendo o antígeno de superfície do VHB (HBsAg) em leveduras. A resposta imunológica à vacina é bastante alta; após três doses intramusculares, mais de 90% dos adultos jovens e mais de 95% das crianças e adolescentes desenvolvem respostas adequadas de anticorpo. Essas doses são preconizadas no calendário de vacinação infantil, onde a primeira dose é ao nascimento ainda na maternidade, seguida de mais 3 doses com intervalo de 60 dias para cada dose. O mesmo padrão de vacinação deve ser seguido para pessoas não vacinadas de outras faixas etárias. Mesmo com as campanhas de vacinação, existem alguns estados brasileiros, como o Acre, Roraima, Rondônia e Amazonas, que ainda apresentam alta prevalência de infecção pelo VHB (4,22). 1.5 Diagnóstico O diagnóstico da hepatite B é realizado primeiramente por técnicas sorológicas, as quais são fundamentais não apenas para o diagnóstico, mas também no monitoramento da infecção viral, na avaliação do estado clínico do paciente e no monitoramento da terapia adotada (8). A infecção pelo VHB é, em primeiro instante, detectada pelo antígeno HBsAg, sendo este o primeiro marcador sorológico encontrado no sangue após um período de incubação. Em seguida, encontra-se o anticorpo anti-HBc, contra o antígeno do core do VHB (HBcAg), e as imunoglobulinas IgG e IgM (Figura 2). Neste momento, observa-se, também, uma alta 14 viremia do VHB (níveis séricos que podem variar de 109 a 1010 cópias por mililitro). No primeiro momento da infecção aguda pelo VHB, estima-se que 75% a 100% dos hepatócitos estejam infectados (1,16). Figura 2 . Marcadores sorológicos na hepatite B aguda. Fonte: Dény & Zoulim,2010 (22) (adaptado para português) A persistência do HBsAg no soro por mais de seis meses indica uma infecção crônica pelo VHB, junto com a presença do HBeAg, o qual indica uma alta replicação viral. No processo de soroconversão, passa a ser detectado no soro o anti-HBe, o que ocorre junto com a queda dos níveis de ácido desoxirribonucleico (DNA) do VHB (Figura 3) (23-25). Figura 3. Marcadores sorológicos na hepatite B crônica. Fonte: Dény & Zoulim, 2010 (22) (Adaptado para português). Para avaliar a severidade da doença no fígado, são usados exames laboratoriais, como as aminotransferases, ou transaminases: aspartato aminotrasferase (AST) e alanina 15 aminotransferase (ALT). Usualmente, os níveis de ALT são mais altos do que os de AST. Outros marcadores bioquímicos são importantes para auxiliar na avaliação de prognóstico, como gama glutamiltransferase, fosfatase alcalina, tempo de protrombina e albumina do soro (26) . O diagnóstico do VHB é focado nos marcadores sorológicos das proteínas virais específicas e seus respectivos anticorpos. Entretanto, com os avanços da biologia molecular, tornou-se possível avaliar fatores genéticos que possam levar a um mau prognótico da doença hepática (27). 1.6 Tratamento O objetivo no tratamento dos pacientes com HBeAg-positivo é prevenir o desenvolvimento da cirrose hepática e/ou CHC, por meio da antecipação da soroconversão do HBeAg-positivo em anti-HBe (24). Pacientes com hepatite B crônica, HBeAg-positivo e níveis de aminotransferases menor que duas vezes o valor normal não devem receber tratamento em função da baixa resposta terapêutica (<10%). Entretanto, devem ser monitorados os níveis de aminotransferases desses pacientes a cada três meses (23-24). Pacientes com hepatite B crônica, HBeAg-positivo e níveis de aminotransferases maior ou igual a duas vezes o valor normal, devem receber tratamento. No caso desses pacientes, a escolha adequada para o tratamento são os seguintes fármacos: interferon alfa (IFNα), lamivudina, adefovir, entecavir, telbivudina e tenofovir (24, 28-29). 1.6.1 Drogas Os fármacos disponíveis para o tratamento da hepatite B crônica são os interferons (IFN) e análogos de nucleotídeos. O IFNα foi a primeira droga aprovada para o tratamento da infecção da hepatite B crônica; possui atividade antiviral e imunomoduladora, sendo ambas as ações importantes no tratamento do VHB (28). A terapia com o IFNα deve ser adotada com portadores de hepatite B crônicos com: HBeAg-positivo, atividade inflamatória hepática, alterações nos níveis normais das aminotransferases e atividade necroinflamatória confirmada por biópsia do fígado (30-32) . As principais vantagens com o tratamento do IFN são: uso do fármaco por tempo limitado, reposta terapêutica que se mantém após o término do tratamento e ausência de resistências. Por outro lado, há desvantagens como os efeitos colaterais severos e o alto custo deste 16 tratamento. Aproximadamente um em cada três pacientes tratados com IFN precisa reduzir a dose em 5% devido aos efeitos adversos (24). Os análogos de nucleotídeos ou nucleosídeos são administrados por via oral; sua ação é bloquear a replicação viral, através da inibição da síntese da transcriptase reversa e da atividade da polimerase do VHB (33-34) . As principais vantagens com o tratamento baseado nesses análogos são a fácil administração via oral e os poucos efeitos colaterais. Dentre as desvantagens, destaca-se a alta taxa de recidiva quando se interrompe a medicação. Com isso, há necessidade de um tratamento prolongado, muitas vezes sem opção de interrupção ou término. Além disso, pacientes com tratamento prolongado podem vir a desenvolver resistência aos antivirais. Essas resistências ocorrem em função da presença de mutações localizadas em regiões estratégicas do genoma viral, as quais proporcionam a replicação do vírus mesmo em condições adversas (35-37). 1.7 O Vírus da Hepatite B O vírus da hepatite B pertence à família Hepadnaviridae, é um vírus envelopado que possui tropismo pelas células hepáticas e seu principal hospedeiro é o ser humano. O genoma do VHB é constituído por DNA contendo aproximadamente 3.200 nucleotídeos (1). O genoma do VHB é formado por quatro fragmentos sobrepostos de janela aberta de leitura (open reading frame – ORF). As ORF são regiões do genoma compostas pelos seguintes genes: gene S, formado pelas regiões Pré-S1, Pré-S2 e S, que codificam três glicoproteínas de superfície – S (small), L (large) e M (middle) – e o HBsAg; gene C, formado pelas regiões Pré-Core e Core, responsáveis pela síntese do HBcAg e do HBeAg; gene P, que codifica a DNA-polimerase; e gene X, que codifica o antígeno x do VHB (HBxAg) (Figura 4) (38-40). Figura 4. Genoma do VHB. Fonte: Zhang Q (40). 17 A partícula infecciosa do VHB é denominada de partícula Dane (Figura 5), com diâmetro de aproximadamente 42 nm, a qual possui estrutura complexa com envoltório externo e interno. O envoltório externo é formado pelo HBsAg e o envoltório interno é formado pelos antígenos HBcAg e HBeAg, pela DNA-polimerase e pelo DNA (40) . Existem outras partículas subvirais menores de 20 nm, as quais possuem formas filamentosas ou esféricas, presentes apenas na corrente sanguínea dos indivíduos infectados pelo VHB. Tais partículas são formadas exclusivamente pelo HBsAg (41). Figura 5. Partícula Dane VHB. Fonte: © James A. Perkins. 1.8 Antígenos Virais Os antígenos do VHB são importantes no diagnóstico da hepatite B e na identificação da real situação do desenvolvimento da doença em seu hospedeiro. Como já mencionado, os antígenos do VHB são: HBsAg, HBcAg, HBxAg e HBeAg. O HBsAg é formado principalmente pela proteína S, localizada junto à membrana do retículo endoplasmático. A presença do anticorpo contra o antígeno HBs do VHB (anti-HBs) na corrente sanguínea ocorre logo após o desaparecimento do HBsAg, isto é, cerca de dois meses após a normalização dos níveis das aminotransferases, consequentemente, sua presença está associada com o término da infecção pelo VHB. Destaca-se que o anticorpo anti-HBs pode estar presente na resposta de imunização da vacina contra o VHB (16,42). O HBcAg é expresso somente nos hepatócitos, assim não pode ser detectado na corrente sanguínea, tendo como forma secretora o HBeAg. O HBcAg não tem importância 18 direta no diagnóstico da infecção pelo VHB, porém é importante para avaliar a replicação viral em amostras de biópsia hepática (29,43-44). O HBxAg é uma pequena proteína reguladora, a qual é produzida em baixos níveis na hepatite B aguda ou crônica. A presença do HBxAg na corrente sanguínea induz uma resposta imunocelular. Assim, acredita-se que possa contribui para a estabilização do vírus e na manutenção da replicação viral em portadores de hepatite B crônica (40,44-47). O HBeAg está associado com alta viremia do VHB, Portanto, sua presença na corrente sanguínea está relacionada com a alta replicação viral. Os portadores do VHB, ao longo da infecção, tornam-se HBeAg-negativos por meio da soroconversão. Nessa fase, estará presente o anticorpo anti-HBe (43,48). 1.9 Genótipos do VHB O VHB possui uma diversidade viral complexa, apresentando oito genótipos (A, B, C, D, E, F, G e H). Além dos oitos genótipos, existem quatro principais subtipos e nove subtipos secundários sorológicos do VHB: adw, ayw, adr e ayr, sendo nove subtipos secundários (adw: adw2, adw4; ayw: aywl, ayw2, ayw3, ayw4; adr: adrq+, adrq-; e ayr. Os genótipos do VHB são distintos entre si, devido às alterações em suas sequências de nucleotídeos, as quais estão diretamente relacionadas com a gravidade da doença e com a resposta ao tratamento (6,49-52). A epidemiologia e a heterogeneidade dos genótipos do VHB estão relacionadas com a evolução clínica da doença e com a resposta ao tratamento antiviral (4,53). Na Ásia, observa-se que portadores de hepatite B crônica com genótipo C apresentam doença mais grave no fígado se comparados com os portadores do genótipo B. Assim, sugere-se que o genótipo C é um fator de risco para o desenvolvimento da cirrose hepática e/ou CHC (4,27,53,54). Os genótipos do VHB apresentam uma distinta distribuição geográfica. Os genótipos A e D são prevalentes no Brasil, Europa, América do Norte, Índia e África. Os genótipos B e C são prevalentes no Sudoeste da Ásia, China e Japão. O genótipo E é limitado à África e o genótipo F é frequentemente encontrado nas populações nativas da América do Sul e da América Central. O genótipo G é prevalente na França, Estados Unidos, Geórgia, GrãBretanha, Itália, Alemanha e México e o genótipo H só foi encontrado na América Central (6, 49,52,53) . O Brasil é um país que apresenta alta miscigenação na população. Em função disso, observa-se uma distribuição genotípica do VHB distinta das encontrada nos demais países da América Latina (54-55). Os genótipos encontrados no Brasil são A, B, D e F. Recentemente, no 19 ano de 2003, houve um caso isolado do genótipo E de um cidadão angolano residente em São Paulo, que, com constância, percorria países da América Latina, África e Europa (4,54-56). No Brasil, o genótipo A é o mais prevalente, com média de 48,5% dos casos, seguido do genótipo D, com prevalência de 38,5% dos casos. Acredita-se que a alta prevalência dos genótipos A e D no Brasil deve-se à imigração italiana no final do século XIX. Por outro lado, na região Norte do Brasil e nas populações indígenas, o genótipo F apresenta uma prevalência acima de 75% dos casos já o genótipo B apresenta baixa prevalência (4,54-56). No Rio Grande do Sul existe a prevalência do genótipo D, com aproximadamente 63,0% dos casos, seguido do genótipo A com 32,0% dos casos e o genótipo F com 5% dos casos (57). 1.10 Mutações Virais O genoma do VHB evolui rapidamente, com altas taxas de substituições de nucleotídeos ao longo do tempo, gerando mutações, tais como deleções e inserções. Esses eventos ocorrem durante a replicação do DNA do VHB (49-50). As mutações de maior relevância estão localizadas nas regiões Pre-Core e PBC, as quais estão relacionadas com os antígenos HBcAg e HBeAg; essas mutações geram uma seleção de cepas variantes que não produzem HBeAg (58-59). Cepas não mutantes nas regiões Pre-Core e PBC, ao longo da infecção, podem inibir a replicação viral, enquanto as cepas com mutações podem ter a replicação viral exacerbada, as quais estão relacionadas com um prognóstico desfavorável da infecção pelo VHB (60-61). Mutações na região PBC, frequentemente, são detectadas em pacientes HBeAgnegativos, porém alguns pacientes podem ter HBeAg-positivo (62) . A mutação mais importante na região PBC é a dupla mutação A1762T/G1764A, a qual está associada com o aumento no nível da replicação viral e com a diminuição ou ausência da síntese do HBeAg (6263) . Neste sentido, foi observado que os portadores desta mutação desenvolvem rapidamente cirrose hepática e/ou CHC (63-64). 1.11 HBeAg e a dupla Mutação A1762T/G1764A O HBeAg foi descoberto há mais de três décadas e tornou-se instrumento útil no diagnóstico do VHB (9) . O HBeAg é usado como indicativo de replicação viral e de atividade viral, o qual está associado com a progressão da doença hepática (1,46,64). 20 No passado, a ausência do HBeAg no soro estava associada a pacientes que não apresentavam mais a replicação do VHB. Já nos dias de hoje, pacientes portadores da hepatite B crônica com HBeAg negativo representam um grupo com alto potencial de desenvolver cirrose hepática e/ou CHC (29,65). A incidência anual de cirrose hepática varia de 2% a 6% para pacientes HBeAg-positivos e de 8% a 10% para pacientes HBeAg-negativos (16-17). Na década de 80, os primeiros pacientes com HBeAg negativo foram observados na região do Mediterrâneo, os quais apresentavam infecção ativa pelo VHB. Em 1989, as primeiras mutações na região Pre-Core e PBC no genoma do VHB foram identificadas, as quais estão relacionadas com HBeAg-negativos em pacientes com replicação viral ativa. As mutações localizadas nas regiões Pre-Core e PBC são as mais importantes, sendo a de maior significância a dupla mutação A1762T/G1764A (66,67). A mutação A1762T/G1764A é uma dupla mutação pontual que está localizada na região PBC com substituição de adenina (A) por timina (T) na posição 1762, e a substituição de guanina (G) por adenina (A) na posição 1764 (19, 68-69). Esta mutação está associada ao mau prognóstico da hepatite B, sendo sua presença relacionada com o desenvolvimento precoce de cirrose hepática e CHC (19, 70-71). 1.12 Identificação da Mutação A1762T/G1764A Através da Técnica de PCR-RFLP Dentre as diversas técnicas da Biologia Molecular, destaca- se a reação em cadeia da polimerase seguido da técnica polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição PCRRFLP, a qual é uma técnica bastante utilizada para o estudo de sequências específicas de genomas. Tem como objetivo amplificar um fragmento de interesse, clivar esse fragmento em uma região específica utilizando uma enzima de restrição e analisar os fragmentos gerados. A análise é feita por eletroforese em gel de agarose ou em gel de poliacrilamida. A visualização pode ser feita com corantes específicos que se intercalam com DNA e registradas com um fotodocumentador. Assim, a mutação A1762T/G1764A pode ser facilmente detectada pela técnica de PCR-RFLP, utilizando enzima de restrição que cliva especificamente o DNA na região contendo a mutação (72-73). 21 2. JUSTIFICATIVA A infecção pelo VHB é um problema de saúde pública mundial. Os portadores do VHB podem desenvolver cirrose e/ou carcinoma hepatocelular, que levam ao óbito. Os pacientes com hepatite B crônica apresentam o antígeno HBsAg por mais de 6 meses na corrente sanguínea, além do antígeno HBeAg, que é um marcador de replicação viral. Uma parte dos pacientes conseguem reverter essa situação e evoluem para uma melhora da doença hepática; nesses casos, ocorre o processo de soroconversão, com a ausência do antígeno HBeAg e a presença do anticorpo anti-HBe. Entretanto, existem pacientes que, mesmo soroconvertendo, apresentam doença hepática ativa, devido a mutações na região PCB do VHB, as quais estão diretamente relacionadas ao mau prognóstico da doença hepática. Dentre essas mutações, merece destaque a dupla mutação A1762T/G1764A, a qual pode estar relacionada ao aumento da replicação viral e alterações nos níveis normais das aminotrasferases, mesmo em pacientes soroconvertidos. Portadores do VHB com cepas com a dupla mutação A1762T/G1764A, têm maiores chances de apresentarem um mau prognóstico da doença hepática, como desenvolver cirrose hepática de forma assintomática, podendo evoluir para CHC. Assim, considerando a alta prevalência do VHB em todo o mundo e que a presença da dupla mutação A1762T/G1764A no VHB aumenta as chances do portador da hepatite B ter um mau prognóstico da doença hepática, é importante a identificação das cepas com a dupla mutação A1762T/G1764A. Neste trabalho, foram analisados pacientes portadores de VHB atendidos nos hospitais Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre e Hospital Nossa Senhora da Conceição de Porto Alegre, quanto à presença da dupla mutação A1762T/G1764A viral; outros aspectos clínicos e laboratoriais também foram analisados. A correlação da dupla mutação A1762T/G1764A com a carga viral, com os antígenos e anticorpos e com as aminotrasferases é importante para o melhor entendimento do papel dessa mutação na evolução da doença hepática nos pacientes de Porto Alegre. 22 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Primário O objetivo deste trabalho é identificar a mutação A1762T/G1764A do VHB em amostras de pacientes do Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre e do Hospital Conceição através da técnica de PCR-RFLP. 3.2 Objetivos Secundários Associar a mutação A1762T/G1764A com a carga viral. Relacionar os níveis de AST e ALT com os mutantes e os não mutantes Associar a mutação A1762T/G1764A com o antígeno HBeAg e anticorpo anti-HBe. 23 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Fonseca JCF. História natural da hepatite crônica B. SBMT. 2007; 40: 672-7. 2. Ferreira MS. Diagnóstico e tratamento da hepatite B. SBMT. 2000; 33(4): 389-400. 3. Kane M. Global program for control of hepatitis B infection. Vaccine. 1995; 13: 47-9. 4. Roncata M. Ballardin PAZ, Lunge VR. Influência dos genótipos no tratamento da hepatite B. Rev HCPA. 2008; 28(3): 188-93. 5. Brasil LM, Braga WSM, Fonseca JCF. Prevalence of hepatitis B virus (HBV) infection in children, Codajas, Amazon Basin, Brazil: a pre-study vaccination. Acta Hepatologica. 1991; 1(26). 6. Ministério da Saúde – Secretaria de Vigilância em Saúde – Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais. Boletim epidemiológico hepatites virais ano III n.01. 2012. 7. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Hepatitis B. 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ARTIGO (Elaborado segundo as normas de publicação da revista Journal of Gatrointestinal and Liver Diseases) Identificação da mutação A1762T/G1764A do vírus da hepatite B em pacientes de Porto Alegre Adaliany Cecília da Silva Souza1, Giórgia de Souza Marasca2, Nélson Alexandre Kretzmann Filho3, Aline Gehlen Dall Bello4, Tiane Martin de Moura5, Dimas Kliemann6, Ana Beatriz Gorini da Veiga7* 1 Bióloga, Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Medicina: Hepatologia da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA), BR. 2 Biomédica, Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Medicina: Hepatologia da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA). 3 Professor do Programa de Pós-Graduação em Medicina Animal da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) e professor do Curso de Medicina Veterinária do Centro Universitário Ritter dos Reis (UNIRITTER). 4 Pós-Doutoranda da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA) no Programa de Pós-Graduação em Patologia – Laboratório Microbiologia Molecular. 5 Pós-Doutoranda da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA) no Laboratório Microbiologia Molecular Laboratório Microbiologia Molecular. 6 Médico Infectologista Hospital Nossa Senhora da Conceição (HNSC). Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Medicina: Hepatologia, UFCSPA. 7 Professora Associada, Departamento de Ciências Básicas da Saúde. Laboratório de Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Medicina: Hepatologia, Programa de PósGraduação em Patologia. Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA). *Dados para correspondência: Ana Beatriz Gorini da Veiga Rua Sarmento Leite, 245 / sala 309 – UFCSPA. Porto Alegre, RS, Brasil - CEP 90050-170 Telefone: +55 (51) 3303-8763 Email: [email protected] 30 Resumo Introdução: A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um problema de saúde pública mundial, havendo cerca de 2 bilhões de pessoas infectadas no mundo. A infecção por esse vírus pode se manifestar como hepatite aguda, hepatite fulminante e hepatite crônica, sendo que os pacientes com hepatite crônica podem desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular. Na hepatite B crônica, ocorre uma intensa replicação viral, na qual observa-se a presença do antígeno e (HBeAg-positivo); a soroconversão, com surgimento do anti-HBe, está associada a um prognóstico favorável. Algumas mutações no genoma viral, como a dupla mutação A1762T/G1764A, estão associadas a um mau prognóstico da doença hepática, com maior risco de desenvolver carcinoma hepatocelular, mesmo quando ocorre soroconversão. Objetivo: Identificar a mutação A1762T/G1764A do VHB em pacientes infectados, através da técnica de reação em cadeia da polimerase seguida pela análise de fragmentos de restrição (PCR-RFLP), e relacionar a presença ou não da mutação com o prognóstico da doença hepática. Metodologia: Foram selecionados 49 pacientes com hepatite B crônica com carga viral acima de 200 cópias, no período de Novembro de 2012 a Dezembro de 2013. A identificação da mutação A1762T/G1764A foi realizada através da técnica de PCR-RFLP usando a enzima de restrição Sau3AI. Resultados: Dos 49 pacientes analisados, 21 eram do gênero feminino (42,85%) e 28 do gênero masculino (57,14%). A idade mínima foi de 19 anos e a idade máxima foi de 79 anos (média 50,48 e desvio padrão de 12,764). Todas as amostras apresentaram resultados positivos para VHB. A mutação A1762T/G1764A do VHB foi identificada em 4 amostras (8,16%). Na análise da carga viral do VHB não houve diferença significativa entre os grupos (p=0,43). Houve diferença significativa nos níveis de ALT (p=0,0028), mas não de AST (p=0,051). Observou-se 75% de soroconversão HBeAnegativo e anti-HBe-positivo nos portadores de VHB contendo a mutação A1762T/G1764A. Conclusão: A detecção da mutação A1762T/G1764A do VHB foi baixa devido ao baixo número de amostras. Valores alterados da variável ALT juntamente com a presença da mutação A1762T/G1764A podem indicar um mau prognóstico da doença hepática. A soroconversão do HBeAg em anti- HBe em pacientes com carga viral alta pode está relacionada com a presença da mutação A1762T/G1764A do VHB. Palavras-Chaves: Hepatite B; Mutação A1762T/G1764A do VHB; Hepatites Virais. 31 Introdução A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um problema de saúde pública mundial. Mesmo sendo uma doença para a qual existe vacina, estima-se que 2 bilhões pessoas estejam infectadas no mundo, com cerca de 350 milhões de pessoas com marcadores sorológicos de infecção ativa [1] . Os portadores do VHB podem desenvolver cirrose e/ou carcinoma hepatocelular (CHC), os quais são responsáveis por mais de 1 milhão de mortes, anualmente, no mundo [2] . As regiões com alta prevalência de casos do VHB (>8%) estão concentradas no Sudeste Asiático, China, Filipinas, África, Bacia Amazônica e Oriente Médio; as regiões com prevalência intermediária (2-7%) são regiões do Leste Europeu, Ásia Central, Japão, Israel e Rússia; e as regiões com baixa prevalência (<2%) são Europa Ocidental, Austrália, Nova Zelândia, América do Norte e América do Sul [3,4] . No Brasil, a distribuição do VHB é bastante heterogênea, sendo mais prevalente na região norte do país, que abrange os estados do Acre, Amazonas, Rondônia e Roraima, e menos prevalente na região sul. A incidência no Brasil, no período de 1999 a 2011, foram notificados 120.343 casos confirmados de hepatite B. Na região sul do Brasil, no período de 1999 a 2011 foram notificados 38.007, só em 2010 foram notificados 3.906 casos sendo, 1.167,89 (29,9%) dos casos no Rio Grande do Sul. Em Porto Alegre no período de 1999 a 2011 foram notificados 1693 casos de hepatite B [5-6] . O VHB apresenta oito genótipos (A, B, C, D, E, F, G e H), os quais são distintos entre si devido às alterações em suas sequências de nucleotídeos encontrados são A, B, D e F do genótipo D, com 38,5% [7-11] . No Brasil, os genótipos [12-13] [5,12,14] , sendo mais prevalentes o genótipo A com 48,5%, seguido . No Rio Grande do Sul, existe a prevalência do genótipo D, com aproximadamente 63,0% dos casos, seguido do genótipo A, com 32,0% dos casos; o genótipo F representa 5% dos casos (7,12). O VHB pertence à família Hepadnaviridae e seu genoma é constituído por ácido desoxirribonucleico (DNA) contendo aproximadamente 3.200 nucleotídeos (3.2 kb) organizados em genes sobrepostos [2,5] . O VHB é um vírus envelopado; dentro do envelope lipoproteico encontra-se o nucleocapsídeo, que abriga, no seu interior, o genoma constituído por DNA circular com fita dupla parcial. O envelope apresenta o antígeno de superfície S (HBsAg), enquanto o nucleocapsídeo contém o antígeno C (HBcAg) .[15-18] A infecção pelo VHB pode se manifestar clinicamente de formas diferentes, conforme a atividade viral, classificada como: hepatite aguda, hepatite fulminante ou hepatite crônica. A 32 hepatite crônica pode evoluir para cirrose hepática e/ou CHC [3]. Estima-se que 15 a 20% dos pacientes com hepatite B crônica desenvolvem cirrose dentro de cinco anos [2,19] A hepatite B crônica é caracterizada pela intensa replicação viral, nessa fase, encontrase positivo o antígeno e do VHB (HBeAg-positivo), que é um marcador de replicação viral. Quando o hospedeiro tem uma boa resposta imunologia, a hepatite B evolui para melhora no quadro clínico, apresentando anticorpo contra o antígeno HBe (anti-HBe) por um processo de soroconversão. Na soroconversão apresenta o seguinte perfil sorológico: HBeAg-negativo e o anti-HBe-positivo. A soroconversão indica uma redução na replicação viral e, consequentemente, a regressão na reação inflamatória no fígado; nessa fase, há uma diminuição no risco de desenvolver cirrose e/ou CHC. O processo de soroconversão é precedido por uma elevação abrupta das aminotransferases e exacerbação da inflamação hepática, a qual requer atenção a um pequeno grupo de pacientes que podem desenvolver hepatite fulminante (2, 3,20-21) . Porém alguns pacientes, mesmo sendo soroconvertidos apresentam um prognóstico desfavorável. Normalmente, esses pacientes são portadores de cepas virais que apresentam mutações nas regiões Pre-Core e Promotor Basal Core (PBC) [22] . As mutações são eventos biológicos normais, que ocorrem durante a replicação do DNA do VHB [23-24]. A região PCB está localizada na sobreposição do Pré-Core com o gene X na janela aberta de leitura e é responsável em regular a expressão do HBeAg. Mutações nessa região frequentemente são detectadas em pacientes com HBeAg-negativo, sendo menos frequentes em pacientes HBeAg-positivos. Das mutações descritas na região PBC, merece destaque a dupla mutação A1762T/G1764A, a qual apresenta importância clínica significante, pois os pacientes portadores dessas cepas mutantes desenvolvem rapidamente cirrose hepática, a qual se instala progressivamente e, muitas vezes, de forma assintomática, podendo evoluir para CHC [25-28]. Estudos sugerem que a presença desta dupla mutação no VHB aumenta as chances do portador da hepatite B ter um mau prognóstico da doença hepática [30] , pois a mutação está associada com o aumento no nível da replicação viral e com a diminuição ou ausência da síntese do HBeAg [31-32]. O objetivo deste trabalho foi identificar a mutação A1762T/G1764A na PBC do vírus da hepatite B, por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase seguida por análise de fragmentos de restrição (PCR-RFLP) e avaliar se a presença da mutação está associada com mau prognóstico. 33 Métodos Este trabalho é um estudo transversal, o qual acompanhou pacientes portadores do VHB do ambulatório de Infectologia Adulto do Hospital Nossa Senhora da Conceição de Porto Alegre, Brasil, e do ambulatório de Gastroenterologia do Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre, Brasil, no período de novembro de 2012 a dezembro de 2013. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP), conforme parecer: 575.347. Foram selecionados 49 pacientes conforme: critérios exclusão, HBsAg negativo, carga viral abaixo de 200 cópias de DNA, pacientes que estavam incapacitados de ler e assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, critérios inclusão, HBsAg positivo por mais de 6 meses e carga viral acima de 200 cópias. Todos os pacientes concordaram em participar do estudo e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Para cada paciente foi criado um banco de dados clínicos, contendo dados de exames laboratoriais sorológicos e bioquímicos, exames hematológicos, dados de biópsia. Todos os 49 pacientes foram submetidos à coleta de sangue, a qual foi realizada através de punção venosa a vácuo em tubo contendo anticoagulante no volume de 4 ml de sangue. As 49 amostras foram transportadas para o Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal de Ciências da Saúde (UFCSPA), onde foram realizadas as análises moleculares. O sangue foi centrifugado a 500 g por 5 minutos em temperatura ambiente; o plasma foi separado em um tubo de volume de 1,5 ml. Todas as amostras de plasma seguiram uma sequência numérica e foram armazenadas em freezer a -80ºC até o momento da extração do DNA. A extração de DNA foi realizada com Kit PureLinkTM viral DNA/RNA da Invitrogen Life Technologies, conforme protocolo do fabricante. Os produtos da extração foram analisados no aparelho NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA), com o objetivo de analisar a quantidade e qualidade do produto de extração; as amostras de DNA viral foram armazenadas a -20ºC. O DNA viral foi utilizado em Reações em Cadeia da Polimerase (PCR) usando o primer forward P2-1(5´- CACAAGAGGACTCTTGGACT-3´) na posição 1653 – 1672, na concentração de 0,05 µM, e o primer reverse P2-2 (5´GGCAAAAAAGAGAGTAACTC-3´) na posição 1940 – 1959, na concentração de 0,05 µM. O volume final da PCR foi de 25 µl e a reação ocorreu nas seguintes condições: 95ºC por 5 minutos; 40 ciclos de 95ºC por 1 minuto, 55ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto; extensão final a 72ºC por 5 minutos. O produto da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1,5 % contendo brometo de etídeo (80 V por 1 hora). 34 O produto da PCR, com tamanho de 307 pb, foi submetido à técnica de RFLP usando a enzima Sau3AI; essa enzima reconhece a região que apresenta a dupla mutação e cliva o produto amplificado em dois fragmentos, de 110pb e de 197pb. Para a técnica de RFLP foram usados 10 µl do produto da PCR para 10 unidades de enzima Sau3AI, em volume final de 50 µl. A reação foi incubada a 37ºC por 100 minutos e inativada a 65ºC por 20 minutos. O produto da RFLP foi analisado por eletroforese em gel de agarose 2% contendo brometo de etídeo (80 V por 1 hora). As variáveis quantitativas foram analisadas estatisticamente por mínima, máxima, média, desvio padrão e Teste t Student. As variáveis qualitativas foram analisadas por comparação de duas proporções. O nível de significância adotado foi de 5,0%. Resultados Foram analisados 49 pacientes, sendo 21 do gênero feminino (42,85%) e 28 do gênero masculino (57,14%). A idade mínima foi de 19 anos e a idade máxima foi de 79 anos (média 50,48 e desvio padrão de 12,764). A análise do perfil dos principais antígenos e anticorpos marcadores da hepatite B nesses pacientes é apresentada na Tabela 1. Na Tabela 2 são apresentados os principais parâmetros bioquímicos. Tabela 1. Principais parâmetros sorológicos para VHB. HBeAg :antígeno e do vírus da hepatite B; HBeAg: antígeno e do vírus da hepatite B; anti-HBs: anticorpo anti –HBs; anti-HBe : anticorpo HBe Tabela 2. Principais parâmetros bioquímicos para VHB. AST: aspartato aminotrasferase; ALT: alanina aminotransferase; BT: bilirrubina total; BD: bilirrubina direta; BI: bilirrubina indireta; CREAT: creatinina. 35 Foi coletada uma amostra de sangue de cada paciente, da qual foi extraído DNA viral. Todas as extrações foram bem sucedidas e o DNA foi utilizado na PCR para amplificação da região do genoma do VHB compreendida entre os nucleotídeos 1652 e 1959, gerando um fragmento de 307pb. Para a técnica de RFLP, todos os produtos de amplificação foram submetidos à reação de clivagem com a enzima de restrição Sau3AI. Após, os fragmentos de restrição foram analisados por eletroforese em gel de agarose. A Figura 1 mostra um gel de agarose com os resultados de algumas das amostras analisadas. Todas as amostras apresentaram produtos de amplificação de 307pb, referente à região amplificada do VHB sem a mutação A1762T/G1764A. Já a presença de VHB contendo a mutação A1762T/G1764A foi detectada em um total de 4 amostras (8,16%). De acordo com os resultados das análises dessas 4 amostras, além do fragmento de 307pb referente ao VHB sem mutação, foram observados os dois fragmentos resultantes da clivagem com a enzima Sau3AI, de 110pb e 197pb, indicativos da presença da mutação. Ou seja, esses pacientes apresentaram infecção tanto pela cepa mutante como pela cepa de VHB sem a mutação. Figura 1. Eletroforese em gel de agarose da RFLP Amostras com cepa selvagem: 30, 31, 44 e 45. As amostras com cepa selvagem e cepa mutante: 25, 32, 42 e 47. Para a análise da carga viral do VHB, as amostras foram separadas em dois grupos: um grupo com a mutação A1762T/G1764A e outro grupo sem a mutação. O grupo das amostras positivas para a mutação A1762T/G1764A apresentaram carga viral com o valor mínimo de 83.000 cópias de vírus, e máximo de 9.480.000 cópias de vírus, média 3.478.000 e desvio padrão 5.212.795. O grupo das amostras sem a mutação 36 A1762T/G1764A apresentaram carga viral com o valor mínimo de 20 cópias de vírus, e máximo de 170.000.000 cópias de vírus, média 6.320.278 e desvio padrão 27.373.142. Não houve diferença significativa nessa associação (p=0,43) (Tabela 3). Tabela 3. Carga Viral das amostras sem a mutação A1762T/G1764A e com a mutação A1762T/G1764A. Sem Mutação A1762T/G1764A Mínima 20 83.000 Máxima 170.000.000 9.480.000 Média 6.320.278 3.478.000 Desvio Padrão 27.373.142 5.212.795 39 3 N° p=0,43 Teste-t: duas amostras presumindo variâncias equivalentes Os níveis das aminotransferases AST e ALT foram analisados nas amostras de 48 pacientes. Para a AST, 79,16% dos pacientes apresentaram níveis acima de 40 U/l, enquanto 20,83% apresentaram níveis abaixo de 40 U/l. Em relação à ALT, 73,46% dos pacientes apresentaram níveis acima de 40 U/l, e 26,53% dos pacientes apresentaram níveis abaixo de 40 U/l. Os níveis de AST e ALT foram analisados considerando-se dois grupos: sem a mutação e o com a mutação A1762T/G1764A. Como mostrado na Tabela 4, os níveis de AST foram, em média, mais altos nos pacientes portadores da cepa mutante VHB A1762T/G1764A do que nos pacientes que não apresentaram vírus com essa mutação, porém essa diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,051). Por outro lado, como mostrado na Tabela 5, os níveis de ALT foram significativamente mais elevados nos pacientes portadores do VHB mutante A1762T/G1764A do que nos pacientes que não apresentaram essa cepa viral (p=0,0028). 37 Tabela 4. Relação de AST das amostras sem a mutação e com a mutação. Sem Mutação A1762T/G1764A Mínima 16 32 Máxima 298 139 Média 37,70 79,25 Desvio Padrão 47,14 14,66 N° 44 4 p=0,051 Teste-t: duas amostras presumindo variâncias equivalentes Tabela 5. Relação de ALT das amostras sem a mutação e com a mutação. Sem Mutação A1762T/G1764A Mínima 11 30 Máxima 198 214 Média 36,53 101,50 Desvio Padrão 35,82 86,91 N° 45 4 p=0,0028 Teste-t: duas amostras presumindo variâncias equivalentes Os níveis do antígeno HBeAg, está associado à replicação viral, foram analisados nas amostras de 42 pacientes, sendo 4 dessas amostras positivas para a mutação A1762T/G1764A do VHB. Também foram analisados os níveis do anticorpo anti-HBeAg, indicativo de soroconversão e melhora do quadro clínico, nas amostras de 46 pacientes, sendo 4 dessas amostras positivas para a mutação A1762T/G1764A do VHB. De acordo com os resultados, apresentados na Tabela 6, o perfil sorológicos das amostras com a mutação A1762T/G1764A foi: 25% HBeAg-positivo, 75% HBeAg-negativo, 75% anti-HBe-positivo e 25% antiHBenegativo. Em relação às amostras sem a mutação, 26,31% foram HBeAg-positivo, 73,68% HBeAg-negativo, 71,42% anti-HBe-positivo e 28,57% antiHBe-negativo. Não houve diferença significativa nos valores encontrados para o HBeAg e para o antiHBe. 38 Tabela 6. Comparação HBeAg e Anti-HBe e a Mutação A1762T/G1764A. Sem Mutação A1762T/G1764A HBeAg-positivo 10 (26,31%) 1 (25%) HBeAg-negativo 28 (73,68) 3 (75%) Anti-HBe-positivo 30 (71,42%) 3 (75%) Anti-HBe-negativo 12 (28,57%) 1 (25%) Teste de comparação de duas proporções Discussão O VHB é um problema de saúde pública. Por isso, são necessários cada vez mais estudos para compreender melhor a doença e suas consequências. O estudo do vírus e o aperfeiçoamento das técnicas destinadas a identificar as mutações podem contribuir para uma melhora no prognóstico da doença. Alguns estudos sugerem que mutações na região na região PBC estão associadas ao aumento no risco de desenvolver cirrose e CHC. A dupla mutação A1762T/G1764A é um preditivo marcador para o desenvolvimento cirrose e CHC, a qual, está envolvida na soroconversão HBeAg em anti – HBe em pacientes com aumento a replicação viral [34-35]. Estudos sugerem que a técnica de PCR-RFLP está bem estabelecida para a identificação da mutação A1762T/G1764A do VHB, bem como o uso da enzima de restrição em estaque Sau3AI, com bons resultados na sensibilidade da técnica [32]. No presente estudo, foram encontradas 4 (8,16%) amostras positivas para a mutação A1762T/G1764A do VHB. Comparando com outro estudo com a mesma metodologia, o qual, apresentou uma frequência da dupla mutação A1762T/G1764A de 55% amostras positivas [32] . A frequência de amostras positivas nesse estudo foi baixa devido ao pouco número selecionado para estudo. As investigações sugerem que a presença da mutação A1762T/G1764A do VHB está relacionada com o aumento significativo da replicação viral e, com isso, o mau prognóstico da doença hepática [34-37]. No presente estudo, não foi encontrada diferença significativa (p=0,43) nos valores da carga viral comparando os dois grupos: o grupo de pacientes infectados por VHB sem a mutação A1762T/G1764A, e o grupo de pacientes infectados por VHB que apresenta a mutação A1762T/G1764A. As aminotransferases, AST e ALT, são importantes para o monitoramento do dano hepático. Estudos sugerem que valores acima dos normais podem estar relacionados com a 39 presença da mutação A1762T/G1764A do VHB [32,33]. Neste estudo, os níveis de AST e ALT foram analisados nos dois grupos de pacientes, com a presença da mutação A1762T/G1764A do VHB e sem a presença da mutação. Não foi encontrada diferença significativa nos níveis de AST entre os dois grupos (p=0,051), porém houve uma tendência para níveis mais elevados no grupo de pacientes que apresentaram o VHB com a mutação A1762T/G1764A. Em relação à ALT, os níveis foram significativamente mais elevados no grupo de pacientes portadores de VHB mutante (p=0,0028). Portadores da dupla mutação A1762T/G1764A do VHB apresentam o perfil sorológico para o HBeAg: HBeAg-negativo e anti-HBe-positivo na maioria dos casos [32,34]. Conforme estudo do Liao Yun, o qual relaciona a soroconversão do HBeAg em anti- HBe ao mau prognóstico dos pacientes com VHB. No entanto, quando presente a dupla mutação A1762T/G1764A do VHB a soroconversão é uma fator independente para o desenvolvimento de cirrose e/ou CHC [38]. Nesse estudo, à análise da soroconversão do HBeAg-negativo e anti-HBe-positivo apresentou 75% nos portadores da mutação A1762T/G1764A do VHB e 25% não apresentou a soroconversão. Neste contexto, concluímos que são necessárias técnicas mais sensíveis para identificar a dupla mutação A1762T/G1764A do VHB, levando em conta a importância do desenvolvimento de cirrose e/ou CHC e aumento do número de amostras para melhorar o estudo. Assim, poderá contribuir positivamente no entendimento da correlação da dupla mutação A1762T/G1764A do VHB com os estágios da doença hepática. 40 Referências Bibliográficas 1. Liu WC, Mizokami M, Buti M, et al. Simultaneous quantification and genotyping of hepatitis B virus for genotypes A to G by real- time PCR and two-step melting curve analysis. JCM.DEC. 2006; 44(12): 4491-97. 2. Fonsec JCF. História natural da hepatite crônica B. SBMT. nov-dez 2007;40: 672-7. 3. Ferreira MS. Diagnóstico e tratamento da hepatite B. SBMT. jul-ago 2000; 33(4): 389-400. 4. Kane M. Global program for control of hepatitis B infection. Vaccine. 1995; 13:547. 5. Ministério da Saúde – Secretaria de Vigilância em Saúde – Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais. Boletim epidemiológico hepatites virais ano III n°01. 2012. 6. Brasil LM, Braga WSM, Fonseca JCF. Prevalence of hepatitis B virus (HBV) Infection in children, Codajas, Amazon Basin, Brazil: a pre-study. Acta Hepatologica. 1991; 1(26). 7. 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Apesar da técnica de RFLP está bem estabelecida para a identificação da mutação A1762T/G1764A do VHB, seria vantajoso implementar técnicas mais avançadas como a qPCR, a qual aumenta a sensibilidade do teste e, ao mesmo tempo, podemos quantificar as cepas mutadas, considerando a comprovação de que em uma mesma amostra podemos encontrar cepas selvagem e cepas mutadas ao mesmo tempo.
