Métodos para detecção de alérgenos em alimentos
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Métodos para detecção de alérgenos em alimentos Gerlinde Teixeira Departamento de Imunobiologia Universidade Federal Fluminense Antigenos vs Alérgenos Antigeno – Imunógeno Qualquer substância capaz de estimular linfócitos – Proteinas, lipoproteinas, glicoproteinas, – Hapteno Qualquer substância capaz de estimular linfócitos desde que acoplado a uma proteina – Moléculas pequenas como os corantes Antigenos vs Alérgenos Alergeno – Qualquer substancia que leva a reações adversas sejam mediadas por Linfócitos B – produção de IgE ou IgG Linfócitos T – produção de citocinas de padrão – Th1 - Inf, Il-1, Il-2, TNF – Th2 - Il-4, Il-5, Il-6, Il-10, Resposta a antígenos alimentares Tolerância oral Proteína alimentar Co Via oral o isi f to x e nt o c i ló g Anticorpos sistêmicos Células B e T sistêmicas Resposta local – Th3 Co Imunização nte xto sistêmica infl am ató rio Anticorpos sistêmicos Células B e T sistêmicas Resposta local – Th1 / Th2 Classificação dos Alérgenos alimentares Crustáceos – – – Moluscos Peixes Clara de ovo Leite Sementes – – – – Lagosta Camarão Siri – Mexilhões – lulas Gergelim Girassol Sementes de algodão Mostarda Nozes Amendoim Morango Legumes Trigo Reações adversas a alimentos Os sinais e sintomas consequentes a uma variedade de reações fisiopatologicas que podem ser mediadas por mecanismos – Imunológicos – Não imunológicos Mecanismos envolvidos nas alergias alimentares Mediados por IgE – Reações anafiláticas leves ao choque Mediadas por IgG e seus subtipos – – – – Reações anafiláticas leves ao choque Diarreia Inflamação intestinal crônica Dermatite herpetiforme IgA – Insuficiência renal Estrutura da Imunoglobulina As cinco classes de Ig O que determna – a classe são as regiões FC – a especificidade a região Fab É possivel ter uma especificidade com as 5 classes As formas poliméricas IgA IgM Propriedades das Ig’s humanas Classe de cadeia H Subclasse de cadeia H IgG IgA IgM IgD IgE 1 a 4 1, 2 e e e Fixação do complemento + 0 ++++ 0 0 Meia vida sérica (dias) 23 6 5 3 2 Transferência Placentária + 0 0 0 0 Lise bacteriana + + +++ ? ? Atividade anti-viral + +++ + ? ? Tipo de cadeia L e e Propriedades das IgG’s humanas IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Abundancia (% de IgG total) Meia vida no soro 70 20 06 04 23 23 7 23 Passagem placentária +++ + +++ +++ Fixação de complemento + + +++ - Ligação a Receptores FC +++ - +++ + Idiotipo Hipersensibilidade Tipo I Hipersensibilidade imediata mediada por IgE e IgG1 Mecanismo de ação Estimulo antigênico com proteínas heterólogas Ativação de Linfócitos Th2 – produção de Il4, Il5, Il6 Mudança de isotipo para IgE – Ocupação dos rFc de alta afinidade dos mastócitos Ativação de Mastócitos Novo estimulo antigênico Ligação do antígeno à IgE Degranulação dos mastócitos Inflamação Patologia Humana, Robbins Hipersensibilidade Tipo III Hipersensibilidade mediata mediada por imunocomplexos de IgG Mecanismos de ação As lesões teciduais – IgG ativa inúmeros mediadores séricos, em especial o sistema complemento Os complexos se formam predominantemente na circulação Lesão – deposito nas paredes dos vasos sanguíneos da microcirculação principalmente em estruturas de filtragem, como o glomérulo renal, articulação, etc Formação do imunocomplexo Só se formam na presença de antígenos com múltiplos epitopos (>2) Quando moléculas de antígenos solúveis e anticorpos estão presentes numa relação molar apropriada, podem unir-se umas às outras formando uma rede multimolecular. Hipersensibilidade Tipo IV Hipersensibilidade tardia mediada por células Mecanismos de ação Mediada por células, – linfócitos T – macrófagos ativados – Citocinas Il 1, Il 2, TNF, INF Dietas de exclusão Um dos princiapis tratamentos para as alergias alimentares – Pode ter como consequencia as deficiencias alimentares Dificuldade para os cuidadores de pacientes alergicos Dificuldade de integração de algumas crianças às atividades sociais que envolvem a alimentação Alérgenos Como a reação a alergenos é potencialmente severa se faz necessário regulamentações de seu controle. – Rotulagem - alerta da presença dos principais alergenos principal meio de previnir como ocorre para o gluten Métodos para detecção de antígenos alimentares Através de anticorpos – Anticorpos de pacientes alergicos – Produção de anticorpos policlonais – Produção de anticorpos monoclonais Purificação de proteínas - Precipitação – Colunas de purificação Análise de alimentos baseado em IgE humana Por colunas de afinidade Testes de ELISA Radio imunoensaio Immunoblotting Reagentes utilizando anticorpos Monoespecificos Imunoblotting com antígenos Produção de anticorpos policlonais Obtida a fração antigenica imunizar o animal com >100 g de antígeno associado a um adjuvante Primária dia o Ag + adjuvante sangria 14 Secundária 21 Ag sangria 28 Produção de Ac monoclonais Esquema da técnica do ELISA Cobertura da placa com cada fração Incubação com soro imune Lavar a placa 2x Incubar com ptn não relacionada Lavar a placa 6x Incubação Ac marcado com enzima interromper com H2SO4 Incubação com substrato cromógeno Lavar a placa 2x Lavar a placa 6x Ler a 490nm Resultados Baixa reatividade no ELISA Razões para isto adesividade baixa das frações proteicas ao plástico baixa antigenicidade a diminuição de reação AgAC menos Ac marcado menor atividade ezimática menos cor ELISA DE CAPTURA Sensibilidade aumentada Permite a quantificação Ac anti X Ptn inespecífica + Ag a ser testado Finalização da reação com Ac marcado Ac anti X de outro animal Imunoblot – Preparar o extrato proteico – Correr um gel de poliacrilamida – Transferir para nitrocelulose – Reação imunologica semelhante ao ELISA – Leitura da absorbancia para determinação da intensidade de reação. Polymerase chain reaction (PCR) Vantagem – a alta afinidade Desvantagens – Preço – Determinação das sequencias de iniciação Antígenos sequenciados Mais de 600 Espécie Nome vulgar Allergeno Número de aminoácidos
