estabelecimento da tecnologia de genética reversa para a produçao
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ESTABELECIMENTO DA TECNOLOGIA DE GENÉTICA REVERSA PARA A PRODUÇAO DE VACINAS CONTRA VIRUS INFLUENZA PANDÊMICOS CORDENADOR_ Alexandre de Magalhães Vieira Machado VÍRUS INFLUENZA E O SEU POTENCIAL PANDÊMICO • Vírus envelopado de forma esférica ou filamentosa. • Duas glicoproteínas estão presentes na superfície da partícula viral: a hemaglutinina e a neuraminidase. • A HA e a NA são os principais determinantes antigênicos e os principais alvos dos anticorpos neutralizantes. • Os vírus influenza do tipo A se dividem em diferentes subtipos. • O genoma viral é constituído de 7 ou 8 segmentos de RNA fita simples e polaridade negativa (ARNv). CRONOMETRANDO A CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS DE TRANSFERÊNCIA Amostras: H1N1 – clone 160/2 H3N2 - clone 427 Clonagem via Topo: ineficaz Clonagem direta pHW2000: Construídas em 3 dias HA 160/2 NA 160/2 NA 427 Problemas na construção HA 427 GENÉTICA REVERSA PARA O DESENVOLVIMENTO DE VACINA CONTRA A GRIPE PANDÊMICA GENÉTICA REVERSA 293T + MDCK IP VERO + MDCK IP VERO PR8 293T + MDCK IP VERO + MDCK IP FLU SUÍNO (H1N1) 293T + MDCK IP VERO + MDCK IP gn828 IOC A/Bahia/231/2010 WT 828 PR8 GENÉTICA REVERSA PARA O DESENVOLVIMENTO DE VACINA CONTRA A GRIPE PANDÊMICA HEMAGLUTININA NEURAMINIDASE 828 828 828 A/BAHIA/231/2010 828 A/BAHIA/1601/2010 828 PR8 ADAPTAÇÃO EM CAMUNDONGOS • Amostra 828: • Amostra IOC: • 2ª passagem: sem mortes • 2ª passagem: 60% de óbitos • Poucas alterações macroscópicas • Alterações macroscópicas significativas ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM • Presença de homologia suficiente nas extremidades (15-50 pb) •Múltiplos fragmentos de DNA podem ser corretamente recombinados numa única molécula BIOLOGIA SINTÉTICA PARA A CONSTRUÇÃO DE VÍRUS INFLUENZA RECOMBINANTES PLASMÍDEO HA NA NA-RFP CN ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM PRODUTO DE PCR • Esta estratégia permite a construção de um vírus influenza recombinante em menos de 48 após a recepção da amostra víral. • Estratégia para rápida introdução de mutações no genoma viral. • Parceria com pesquisadores em Bioinformática para desenhar iniciadores capazes de amplificar diferentes HA e NA HA (H3N2) CN HEMAGLUTININA NEURAMINIDASE PR8 PCR PCR PR8 PCR PLASMÍDEO PR8 PLASMÍDEO PCR 828 PLASMÍDEO PCR PR8/DRFP PCR PCR PR8/DRFP PLASMÍDEO PCR 231 427 WM 828 p/VERO
