Estágio de Mestrado 2009-2010

Resumo / Abstract
Uma nova via de sinalização possivelmente envolvida na retenção renal de sais e
hipertensão arterial
A hipertensão arterial afecta quase um terço da população adulta dos países ocidentais e
representa um factor de alto risco para a ocorrência de doença cardiovascular ou de
acidente vascular cerebral. Doenças hereditárias raras revelaram que a retenção
aumentada de sais nos rins pode determinar a hipertensão. Um exemplo destas doenças
é o pseudo-hipoaldosteronismo tipo II (PHA2), também conhecida como hipertensão
hipercalémica familiar, ou ainda síndrome de Gordon, e que é caracterizada por
hipertensão acompanhada por hipercalemia (elevados níveis séricos de potássio). O
PHA2 é causado por mutações nos genes WNK1 e WNK4, dois membros da subfamília de proteínas cinases WNK (With-No-K =lysine), a qual o laboratório
proponente está a caracterizar. Os mecanismos celulares subjacentes a esta condição
envolvem a regulação pelas cinases WNK da homeostase renal de electrólitos através da
modulação de diversos canais iónicos, por exemplo do co-transportador de sódio e
cloreto NCC e do canal de potássio ROMK nos segmentos do nefrónio cruciais para a
homeostase de electrólitos, ou seja no tubo contornado distal (DCT) e no ducto colector
cortical (CCD). Sabe-se que o mecanismo de regulação do NCC envolve a activação
pelas cinases WNK de duas outras cinases, OSR1 ou SPAK que, por sua vez, fosforilam
directamente a proteína NCC e activam o transporte iónico. Entretanto, existem
evidências experimentais que a WNK4 regula também a quantidade do canal NCC
presente na membrana plasmática das células renais. Um estudo recente do laboratório
proponente identificou um novo mecanismo de actuação da WNK4. Foi demonstrado
que a proteína WNK4 interage com a tirosina cinase Syk que fosforila proteínas
contendo um motivo peptídico específico, o qual foi localizado em três canais iónicos
da membrana plasmática: o co-transportador renal de sódio, potássio e cloreto NKCC2,
o co-transportador renal de potássio e cloreto KCC3 e o canal de cloreto CFTR. De
seguida, foi demonstrado experimentalmente pelo laboratório proponente que o resíduo
de tirosina 512 (Tyr512) da CFTR é de facto fosforilado pela Syk, e que esta
fosforilação resulta na redução da expressão do canal CFTR na membrana plasmática.
Mais determinou-se que a presença da WNK4 impede esta fosforilação através da
interacção proteína-proteína com a Syk. Estes dados identificaram a fosforilação da
Tyr512 pela cinase Syk como um novo sinal regulador da prevalência da CFTR à
superfície das células e que a WNK4 desempenha um papel antagonista neste processo.
A presente candidatura propõe um estudo piloto para verificar se este novo mecanismo
opera também sobre os canais renais NKCC2 e KCC3. O primeiro facilita o influxo de
sódio e cloreto nas células renais que é compensado pelo segundo com o efluxo de
potássio e cloreto. Ambos são importantes para a homeostase electrolítica nos rins e
contêm a referida tirosina alvo nos seus domínios N-terminais citoplasmáticos. Estes
domínios serão produzidos como proteínas recombinantes em bactérias, para posterior
utilização como substratos da Syk em ensaios de cinase in vitro. Será depois confirmado
o efeito inibitório da presença da cinase WNK4 sobre a actividade de Syk. A validação
deste mecanismo in vivo irá envolver a transfecção de células renais com Syk ou
WNK4, seguida pela análise das quantidades dos dois canais inseridas na membrana
plasmática, utilizando para este fim metodologias já implementadas de microscopia
confocal de imunofluorescência e de marcação extracelular de proteínas membranares
com biotina. Os dados obtidos irão validar a hipótese que a via WNK4/Syk regula
também os referidos canais iónicos, representando mais um modo de actuação de
WNK4 sobre a homeostase electrolítica nos rins. Com base nos dados validados nesta
proposta, prevê-se um estudo mais alargado no futuro que visa caracterizar a
contribuição desta via para a hipertensão e se poderá servir como alvo terapêutico no
seu tratamento.