ministério da educação universidade federal rural da amazônia
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA CAMPUS PARAGOMINAS ARGEMIRO PEREIRA MARTINS FILHO ODYONE NASCIMENTO DA SILVA Atividade de enzimas antioxidantes no controle de danos celulares provocados por alagamento em plantas jovens de Euterpe oleracea (Mart.) PARAGOMINAS 2015 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA CAMPUS PARAGOMINAS ARGEMIRO PEREIRA MARTINS FILHO ODYONE NASCIMENTO DA SILVA Atividade de enzimas antioxidantes no controle de danos celulares provocados por alagamento em plantas jovens de Euterpe oleracea (Mart.) Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Engenharia Agronômica da Universidade Federal Rural da Amazônia como requisito para obtenção do grau de Bacharel em Engenharia Agronômica. Área de Concentração: Fisiologia vegetal. Orientador: Drº Allan Klynger da Silva Lobato PARAGOMINAS 2015 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal Rural da Amazônia ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Martins Filho, Argemiro Pereira; Silva, Odyone Nascimento da Atividade de enzimas antioxidantes no controle de danos celulares provocados por alagamento em plantas jovens de Euterpe oleracea (Mart.) /Argemiro Pereira Martins Filho; Odyone Nascimento da Silva. – Paragominas, 2015. 30f. Orientador: Profª DSc. Allan Klynger da Silva Lobato Trabalho de Conclusão de Curso (Eng. Agronômica) – Universidade Federal Rural da Amazônia - UFRA, Paragominas - PA, 2015. 1. Catalase 2. Glutationa 3. Peróxido de hidrogênio I. Martins Filho, Argemiro Pereira II. Silva, Odyone Nascimento da III. Lobato, Allan Klynger da Silva, Orient. IV. Título. CDD 23. ed. 634,6 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- À DEUS, Aos nossos PAIS, Aos nossos FAMILIARES e AMIGOS AGRADECIMENTOS À DEUS que em sua infinita grandeza nos concedeu sabedoria e discernimento para a confecção deste trabalho. À nossas FAMÍLIAS pelo apoio inesgotável. À Universidade Federal Rural da Amazônia – UFRA pela oportunidade de ingressarmos no curso de graduação em Engenharia Agronômica. Ao nosso ORIENTADOR, Allan Lobato, pelo incentivo e ensinamentos transmitidos que contribuíram para a concretização deste trabalho. A diretora do campus Izabelle Pereira Andrade, pelo apoio dado desde o início do curso. Aos nossos COLEGAS de curso. A minha irmã Paula Francyneth Nascimento da Silva pela imensa colaboração. Ao meu noivo e amigo Renato da Silva Bandeira pela ajuda e compreensão durante a confecção deste trabalho. “Há tempo de plantar, e tempo de arrancar o que se plantou.”. (Eclesiastes 3.2 b) RESUMO O objetivo deste estudo foi investigar a atividade enzimática relacionada com o sistema antioxidante na espécie Euterpe oleracea (Mart.). O açaizeiro é uma palmeira amazônica, de importância econômica devido à produção de bebidas energéticas. Plantas expostas ao alagamento podem ser danificadas ao nível celular e causar disfunções metabólicas irreversíveis que conduzem à morte celular. O delineamento experimental foi em esquema fatorial inteiramente casualizado, com duas condições de água (alagamento e controle) e cinco épocas de avaliação (0, 6, 12, 18, e 24 dias). Os parâmetros medidos foram peróxido de hidrogênio, malondialdeído e glutationa, e as atividades enzimáticas de catalase, ascorbato peroxidase e guaiacol peroxidase, sendo todos avaliados em tecidos de folhas e raízes. O alagamento não promoveu modificações significativas no MDA e H2O2 em ambos os tecidos avaliados. A menor alteração na GSH ocorreu apenas na raiz. Em relação à CAT foram obtidos picos significativos para folhas e raízes. Na GPX e APX as interferências iniciais e significativas foram na folha e raiz, respectivamente. O alagamento não promoveu aumentos e reduções significativas nos compostos oxidantes avaliados, exceto a glutationa, sendo um indicativo de tolerância para a Euterpe oleracea. No entanto, para as enzimas antioxidantes alguns resultados foram significativos, sugerindo maior eficiência no controle de danos celulares desencadeados durante o alagamento nesta espécie. Palavras-chave: Catalase, glutationa, peróxido de hidrogênio. ABSTRACT The aim of this study was to investigate the enzyme activities related to the antioxidant system in this specie Euterpe oleracea (Mart.). The açai tree is an Amazonian palm, of economic importance due to the production of energy drinks. Plants exposed to waterlogging may be damaged at the cellular level and cause irreversible metabolic dysfunctions leading to cell death. The experimental design was completely randomized factorial scheme, with two water conditions (waterlogging and control) and five evaluation times (0, 6, 12, 18, and 24 days). The parameters measured hydrogen peroxide, malondialdehyde and glutathione, and enzymatic activities of catalase, ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase, being all evaluated in leaf and root tissues. The waterlogging did not promoted significant modifications in MDA and H2O2 in both tissues evaluated. The minor alteration in GSH occurred only in root. In relation to CAT were obtained significant peaks to leaf and root. In GPX and APX the early and significant interferences were only in leaf and root, respectively. The flooding did not cause increases and significant reductions in oxidizing compounds evaluated, except glutathione, being indicative of tolerance for Euterpe oleracea. However, for the antioxidant enzymes some results were significant, suggesting greater efficiency in the control of cellular damage triggered during the flooding in this species. Keywords: Catalase, glutathione, hydrogen peroxide. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Peróxido de hidrogênio em folhas e raízes (A - B) em plantas jovens de Euterpe oleracea sujeitos ao alagamento . Letras iguais não apresentam diferenças significativas no teste F (P <0,05). Os quadrados representam os valores médios de cinco repetições, e as barras representam os desvios padrão. ..................................................................................... 18 Figura 2 - MDA em folhas e raízes (A - B), e glutationa em folhas e raízes (C- D ) em plantas jovens de Euterpe oleracea sujeitos ao alagamento. Letras iguais não apresentam diferenças significativas no teste F (P <0,05). Os quadrados representam os valores médios de cinco repetições, e as barras representam os desvios padrão. ............................................................ 20 Figura 3 - Catalase em folhas e raízes (A - B), Atividades ascorbato peroxidase em folhas e raízes (C - D), e atividades guaiacol peroxidase em folhas e raízes (E - F) em plantas jovens de Euterpe oleracea sujeitos ao alagamento. Letras iguais não apresentam diferenças significativas no teste F (P <0,05). Os quadrados representam os valores médios de cinco repetições, e as barras representam os desvios padrão. ............................................................ 23 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 10 2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 11 2.1. Objetivo geral ........................................................................................................... 11 2.2. Objetivos específicos ................................................................................................ 11 3. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 11 3.1. Descrição e importância socioeconômica do açaizeiro ......................................... 11 3.2. O alagamento e sua influência no desenvolvimento da planta ............................ 13 3.3. Atuação das enzimas antioxidativas durante o alagamento ................................ 14 4. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 15 4.1. Condições experimentais............................................................................................. 15 4.2. Delineamento experimental .................................................................................... 15 4.3. Instalação e condução do experimento .................................................................. 15 4.4. Análises fisiológicas.................................................................................................. 16 4.4.1. Peróxido de hidrogênio (H2O2), Malondialdeído (MDA) e Glutationa (GSH) .. 16 4.4.2. Enzimas antioxidantes catalase (CAT), Ascorbato peroxidase (APX) e Guaiacol peroxidase (GPX) .............................................................................................................. 17 5. 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 18 5.1. Peróxido de hidrogênio (H2O2) ............................................................................... 18 5.2. Malondialdeído (MDA) ........................................................................................... 19 5.3. Glutationa (GSH) ..................................................................................................... 19 5.4. Catalase (CAT) ......................................................................................................... 21 5.5. Ascorbato peroxidase (APX) ................................................................................... 21 5.6. Guaiacol peroxidase (GPX)..................................................................................... 22 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 24 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 25 10 1. INTRODUÇÃO Euterpe oleracea (Mart.) é uma espécie de palmeira de grande importância econômica devido a sua utilização na produção de bebidas energéticas e alimentos, que são produzidos a partir de seus frutos e caule, respectivamente (ROGEZ, 2000; BOBBIO et al., 2002). Os frutos contêm grandes quantidades de lipídeos e minerais, tais como K, Ca e Mg (MENEZES et al., 2008; YUYAMA et al., 2011). Além disso, um estudo realizado por Bobbio et al. (2000) revelou que a fruta é uma importante fonte de antocianinas, que são pigmentos hidrossolúveis, responsáveis pela cor vermelha de flores, frutos. O Brasil é o principal produtor dessa espécie, e é também um importante consumidor e exportador de produtos derivados desta palmeira (ROGEZ, 2000). Assim, o açaí (fruto ou bebida) possui um mercado regional muito forte, sobretudo, pelos seus altos valores nutricionais e de unânime preferência popular por oferecer um singular paladar. Devido a sua importância cultural, o açaí transformou-se, através de lei (Lei /PA, Nº 6413), na bebida e fruto símbolo do estado do Pará e, agora passa a ser priorizado, cada vez mais, como produto econômico capaz de gerar renda para a população local. Nas últimas três décadas, o açaizeiro vem se destacando por seu impacto positivo na economia paraense. A produção de frutos, que provinha quase que exclusivamente do extrativismo, a partir da década de 1990, passou a ser obtida também de açaizais nativos manejados e de cultivos implantados, principalmente nas áreas de várzea. Ou seja, seu padrão produtivo está sendo alterado, (de extrativista, para manejo cultivado e/ou direcionado), em função da crescente procura no comércio externo à região (PINHEIRO, 2010). Alagamentos promovem alterações típicas na bioquímica, fisiologia, anatomia e morfologia das plantas (FANTE et al., 2010; HENRIQUEL et al., 2010; CORTEZI; COLLI 2011; ALVES et al., 2012). O principal problema do alagamento é a disponibilidade limitante de oxigênio no solo para o sistema radicular. A saturação de água no solo elimina os espaços anteriormente ocupados pelo ar, o que limita a respiração das raízes (DREW, 1997; BAILEYSERRES; VOESENEK, 2008). Outros efeitos sobre o sistema radicular incluem o aumento da porosidade (PRZYWARA; STEPNIEWSKI, 1999) e perda de biomassa (MIELKE et al., 2003). Plantas expostas ao alagamento podem ser danificadas ao nível celular, principalmente quando há aumento na produção de espécies reativas ao oxigénio (EROs). EROs em altas concentrações podem modificar as estruturas e as funções de organelas como os cloroplastos, 11 e causar disfunções metabólicas irreversíveis que conduzem à morte celular (PEREIRA et al., 2010). O sistema antioxidante das plantas inclui enzimas e compostos não-enzimáticos, tais como a glutationa, que podem contribuir para a eliminação das EROs. Em virtude da importância econômica dessa fruteira, produtores do Pará e de vários estados brasileiros passaram a realizar plantios comerciais. Em razão dessa perspectiva, tornase necessário o conhecimento de estudos básicos que possam ser úteis na orientação de uma maior potencialização de exploração comercial e racional dessa palmeira (OLIVEIRA et al., 2000). 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral Investigar a atividade enzimática relacionada com o sistema antioxidante na espécie Euterpe oleracea (Mart.) submetida ao alagamento. 2.2. Objetivos específicos Mensurar a atividade das enzimas antioxidantes Catalase, Ascorbato peroxidase e Guaiacol peroxidase. Quantificar os compostos antioxidantes Peróxido de hidrogênio, Malondialdeído e Glutationa. Observar a influência do alagamento nesses parâmetros. 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1. Descrição e importância socioeconômica do açaizeiro O açaizeiro (Euterpe oleracea), também chamado de açaí-branco, coqueiro-açaí, juçara, palmiteiro, entre outros, é uma palmeira perene de cujos frutos processados obtêm-se a bebida denominada “açaí”. É uma planta monocotiledônea nativa da várzea da região amazônica, especificamente dos seguintes países: Venezuela, Colômbia, Equador, Guianas, e 12 Brasil (estados do Amazonas, Amapá, Pará, Maranhão, Rondônia, Acre e Tocantins), assim como em Trinidad e Tobago e nas bacias do Pacífico na Colômbia e no Equador (NASCIMENTO, 2008). O açaizeiro é uma palmeira que fornece dois produtos alimentares essenciais: o palmito e os frutos, a partir dos quais a bebida açaí é elaborada. Essa bebida se destina principalmente a um mercado local e totalmente informal e constitui a base da renda de dezenas de milhares de famílias, sendo sua entrada maciça e brutal sobre o mercado externo, no início dos anos 1990, prefigurando o desenvolvimento de uma nova produção de renda (ROGEZ, 2000). O açaizeiro se destaca, entre os diversos recursos vegetais, pela sua abundância e por produzir, importante alimento para as populações locais, além de ser a principal fonte de matéria-prima para a agroindústria de palmito no Brasil. As maiores concentrações ocorrem em solos de várzeas e igapós, compondo ecossistemas de floresta natural ou em forma de maciços conhecidos como açaizais, com área estimada em 1 milhão de hectares. Também ocorre em áreas de terra firme, principalmente quando localizadas próximas às várzeas e igapós (EMBRAPA, 2008). A dinâmica produtiva do açaí constata-se a partir da presença de empresas envolvidas em sua comercialização. Entre os terceirizados aparecem diversos agentes locais, dentre estes algumas pessoas que por conhecerem bem geograficamente a região mantém contato direto com os produtores, sendo responsáveis pela negociação do preço e por todo o processo de colheita do açaí nas áreas de coleta do fruto. Outros agentes indispensáveis nesse processo são: os proprietários de embarcações, que alugam as mesmas para o transporte até a cidade, as pessoas responsáveis pelo embarque e desembarque do açaí, além do “peconheiro” – pessoa responsável pela retirada do açaí do açaizeiro – que podem ser o próprio dono do açaizal, com auxílio de seus filhos e netos e outros agentes da família, ou um terceiro, neste caso, contratado pelo próprio produtor (PINHEIRO; FERREIRA, 2010). Nesse contexto, as possibilidades de geração de renda através da cadeia produtiva do açaí são inúmeras, sobretudo no período de safras, de julho a dezembro, quando a extração diminui em virtude da chegada do período da entressafra. Assim, a produção tem abrangido novas áreas, incluindo subsídios financeiros para o preparo de grandes extensões de terras visando maximizar o cultivo do açaí com implantação de sistemas direcionados ou racionais prioritariamente para esse fim em retorno à grande procura e aceitação deste produto, tanto a nível de mercado interno, quanto destinado ao mercado nacional e até internacional (PINHEIRO; FERREIRA, 2010). 13 3.2. O alagamento e sua influência no desenvolvimento da planta O alagamento é um estresse hídrico que pode limitar o desenvolvimento de diversas espécies em diferentes regiões e, a adaptação às condições de estresse resulta em eventos integrados que ocorrem em vários níveis, envolvendo alterações morfológicas, anatômicas, celulares, bioquímicas e moleculares (NOGUEIRA et al., 2005). Essas alterações variam com a espécie e o estádio de desenvolvimento da planta, assim como o tipo de estresse, a duração e a intensidade do mesmo (LARCHER, 2000). O alagamento promove a saturação hídrica do solo, onde os espaços que antes eram ocupados por ar agora são ocupados pela água, à diminuição da disponibilidade de oxigênio para as raízes cria um ambiente hipóxico (com baixa concentração de oxigênio) ou anóxico (sem oxigênio), que, dependendo da espécie e do tempo de inundação, pode limitar o seu crescimento e desenvolvimento (BAILEY- SERRES; VOESENECK, 2008). A falta de oxigênio disponível altera o metabolismo celular, afetando não só a respiração das raízes como também as características físico-químicas e biológicas do solo, desencadeando alterações na fisiologia, na morfologia e na anatomia das plantas (PAROLIN, 2001). A tolerância das diferentes espécies vegetais ao estresse por alagamento serve para distinguir plantas tolerantes de plantas suscetíveis a baixas concentrações de O2 disponível no solo (ARMSTRONG et al., 1994). Evidências sugerem que a restrição hídrica provoca estresse oxidativo em várias plantas, por conta da produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ERO), tais como o radical superóxido, radical hidroxila (OH-), peróxido de hidrogênio (H2O2) entre outros (JALEEL et al., 2007). A produção de ERO parece ser um evento dinâmico durante o desenvolvimento vegetal, bem como uma resposta da planta a estresses bióticos e abióticos (APEL; HIRT, 2004). Segundo Ito et al. (1999), dependendo da altura da lâmina de água, da concentração de O2, de CO2 e de etileno dissolvidos na água, do pH e da turbidez isolados ou combinados podem modificar o grau de injúria e a capacidade de sobrevivência das plantas ao alagamento. Pezeshki, (2001) afirma também que tais fatores interferem em processos metabólicos essenciais à sobrevivência das plantas. Na floresta amazônica, árvores e outras plantas são expostas a submersão parcial ou total por até sete meses de cada ano (JUNK, 1989). As espécies que são capazes para sobreviver a esse período possuem mecanismos de tolerância ao alagamento. Modificações no metabolismo anaeróbico, que sugere tolerância das plantas de Euterpe oleracea em ambiente 14 com ocorrência de alagamento foram relatadas por Menezes Neto, et al. (1995), mas o número de investigações sobre as respostas fisiológicas e da atuação do sistema antioxidante continua a ser limitado para essa espécie. 3.3. Atuação das enzimas antioxidativas durante o alagamento Nos últimos anos, tem-se dado especial atenção aos danos celulares oxidativos causados nas raízes pelo acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ERO), sob condições em que a fosforilação oxidativa é reduzida em razão da deficiência de O2. Em plantas, está bem caracterizado que, sob condições de hipoxia no solo, ocorre um aumento descontrolado de radicais livres nas células (BLOKHINA et al., 2003). Modificações na estrutura e nas funções das membranas, resultantes da peroxidação de lipídeos, são também bem caracterizadas (CAKMAK; HORST, 1991), e podem resultar em danos ao funcionamento e à estrutura celular (MITTLER et al., 2004). A morte celular programada, também chamada de apoptose, é um processo diretamente relacionado ao aumento nas espécies reativas de oxigênio, que sinalizam para a morte celular (KRISHNAMURTHY et al., 2000). A sinalização para o desenvolvimento de aerênquimas nas raízes está diretamente relacionada à produção de H2O2, e também a inibição da peroxidase do ascorbato (MÜHLENBOCK et al., 2007). Para eliminar essas espécies reativas, as plantas apresentam sistemas enzimáticos antioxidantes que constituem uma importante defesa primária contra os radicais livres gerados sob condições de estresse, como a superóxido dismutase (SOD) que catalisa a dismutação do radical superóxido em H2O2 e O2, a catalase (CAT) e a ascorbato peroxidase (APX) que podem quebrar o H2O2 em H2O e O2. Entretanto, esta regulação pode ser perdida se o estresse for mais severo, aumentando consideravelmente a produção de radicais livres que podem levar a uma cascata de eventos que inicia com a peroxidação de lipídeos, avançando para a degradação de membranas e morte celular (GREGGAINS et al., 2000). As enzimas do sistema antioxidante são ainda pouco estudadas sob condições de alagamento (SAIRAM et al., 2008). Em folhas de milho, o alagamento prolongado promoveu redução na atividade das enzimas redutase da glutationa, peroxidase do ascorbato, catalase e superóxido dismutase, enquanto um alagamento em período curto estimulou a atividade dessas enzimas (YAN et al., 1996). As enzimas catalase, peroxidase do ascorbato e peroxidase do guaiacol são especializadas na remoção de H2O2 (MOLLER et al., 2007). Este 15 oxidante é relativamente estável e, pela ausência de cargas, tem sua passagem facilitada pela bicamada lipídica da membrana celular. Além disso, a síntese dessa molécula é expressivamente ativada pelo alagamento (MOLLER et al., 2007), que também pode ser relacionado à diminuição da atividade das peroxidases e catalase (YAN et al., 1996). 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Condições experimentais O experimento foi realizado em casa de vegetação na Universidade Federal Rural da Amazônia, Campus Paragominas, Brasil (2º55'S e 47º34'W), no ano de 2011 a 2012, sem controle de meio ambiente. Os valores mínimos, máximo, e temperaturas médias foram de 22, 37ºC, respectivamente. 4.2. Delineamento experimental O delineamento experimental foi inteiramente casualizado e fatorial, sendo duas condições distintas de água (controle e alagamento), cinco épocas de avaliação (0, 6, 12, 18 e 24 dias), e cinco repetições, totalizando 50 unidades experimentais. Os dias de avaliação foram 15,21e 27/06/ e 03, 09/07/2012. Os dados foram submetidos à análise de variância, e as diferenças significativa entre as médias foram determinadas utilizando o teste F a um nível de probabilidade de 5 % (STEEL et al., 2006). Os desvios padrões foram calculados para cada tratamento em todos os pontos de avaliação. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SAS. 4.3. Instalação e condução do experimento As sementes de Euterpe oleracea foram germinadas em vasos de 8 litros (0,25 m de altura, 0,20 m de diâmetro) com furos na base, para a drenagem da água. Os vasos foram preenchidos com substrato Plantmax®, e as plantas foram irrigadas diariamente com 1 litro de água destilada. Após 100 dias realizou-se uma seleção nas mudas, remanescendo as de aparência e tamanho similar. Subsequentemente, aos 120 dias de idade, as plantas receberam 16 0,2 litros de solução nutritiva completa de Hoagland; Arnon, (1950) aplicada em intervalos regulares (a cada 30 dias) até à idade de 12 meses quando foi implantado o experimento. Posteriormente, as plantas foram submersas em água por 24 dias consecutivos durante o alagamento. O nível da água foi mantida a 5 cm acima da raiz sendo ajustado conforme o necessário. Para implementar o alagamento, grandes vasos de 25 litros foram utilizados (0,30 m de altura e diâmetro) sem furos de drenagem. As plantas foram transplantadas para os vasos maiores e, em seguida, o alagamento foi iniciado. As plantas submetidas ao tratamento controle foram regadas diariamente com água destilada. Além disso, as folhas do meio da planta foram colhidas e congeladas, sendo armazenadas a - 20 C para as determinações bioquímicas subsequentes. 4.4. Análises fisiológicas 4.4.1. Peróxido de hidrogênio (H2O2), Malondialdeído (MDA) e Glutationa (GSH) Os compostos oxidantes H2O2, MDA e GSH foram extraídos a partir de tecidos das folhas e raízes, como descrito por Wu et al., (2006). A quantia de matéria fresca (congelada) retirada foi de 500 mg, macerada em nitrogênio líquido e homogeneizada em 5 mL de ácido tricloroacético a 5% (w/v), num intervalo de temperatura de 2– 4ºC. Em seguida, coletou-se 1800 µL do extrato e colocado em microtubos de 2000 µL, centrifugado a 10000 rpm por 5 minutos a 3° C, coletando-se o sobrenadante. Para a determinação do H2O2, misturou-se 200 µL de sobrenadante e 1800 µL do mix de reação (tampão de fosfato de potássio 0,5 M [pH 7,0] e iodeto de potássio 2,0 M), e a absorvância foi medida a 390 nm em um espectrofotômetro (VELIKOVA et al., 2000). A determinação do MDA foi a partir da junção de 500 µL de sobrenadante com 1000 µL do mix de reação, que continha 0,5% (w/v) de ácido tiobarbitúrico em ácido tricloroacético a 20%. O mix foi incubado em água fervente a 95°C durante 20 minutos, e a reação foi paralisada com choque térmico. As amostras foram centrifugadas a 10000 rpm durante 10 minutos, e a absorvância foi medida a 532 nm. A quantidade do complexo MDATBA (pigmento vermelho) foi calculado com base no método de Cakmak; Horst, (1991) com pequenas modificações, utilizando um coeficiente de extinção de 155 mM-1 cm-1. 17 Para a determinação de GSH, foi utilizado 200 µL de sobrenadante e 1800 µL de mix de reação (tampão fosfato 0,5M [pH 7,6] e 0,2M de ácido 2-nitrobenzóico) que foram combinados, e a absorbância foi medida a 412 nm. 4.4.2. Enzimas antioxidantes Catalase (CAT), Ascorbato peroxidase (APX) e Guaiacol peroxidase (GPX) As enzimas antioxidantes CAT, APX e GPX, foram extraídas a partir do tecido de folhas e raízes de acordo com o método de Badawi et al., (2004). Onde a extração foi realizada com 500 mg de matéria fresca macerada em nitrogênio líquido, e homogeneizada em um mix de extração (fosfato de potássio[0,5M] + [0,5M] EDTA +ácido ascórbico [0,5 M] + água), em um intervalo de temperatura entre 2 – 5ºC sendo coletado 1800 µL do extrato e colocado em microtubos de 2000 µL. os microtubos foram agitados e centrifugados a 10000 rpm por 4 minutos, sendo coletado 1000 µL do sobrenadante para as determinações enzimáticas. A quantificação de proteínas solúveis totais foi realizada utilizando o método descrito por Bradford, (1976). A absorvância foi medida a 595 nm. Para a determinação de CAT, utilizou-se 200 µL de sobrenadante e 1800 µL do mix de reação (contendo 50 mM de tampão de fosfato [pH 7,0] e peróxido de hidrogénio a 12,5 mM) foram combinadas, e a absorvância foi medida a 240 nm (HAVIR; MCHALE, 1987). Para a determinação de APX, foi utilizado 1800 µL do mix de reação (contendo 50 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) + ascorbato 0,5 mM, + EDTA 0,1 mM, e 1,0 mM de peróxido de hidrogênio) foi misturado com 200 µL de sobrenadante, e a absorvância foi medida a 290 nm (NAKANO; ASADA, 1981). Para a determinação de GPX, utilizou-se, 1780 µL do mix de reação (contendo 50 mM de tampão fosfato [pH 7,0] e 0,05% guaiacol) foi misturado com 200 µL de sobrenadante. Subsequentemente, foi adicionado 20 µL de 10 mM de peróxido de hidrogênio. A absorvância foi então medida a 470 nm (CAKMAK; MARSCHNER, 1992). 18 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Peróxido de hidrogênio (H2O2) A variação de H2O2 durante o alagamento não mostrou valores significativos nas folhas e raízes, (Figura 3 C e D), sendo que apresentaram um leve aumento nos 18º e 6º dia nas folhas e raízes, respectivamente, quando comparados com as plantas de controle. A manutenção do peróxido de hidrogénio nas folhas e raízes pode ser explicado pela tolerância da espécie ao alagamento (PEREIRA et al., 2014). A superprodução de H2O2 afeta negativamente o metabolismo da planta, além de causar danos celulares (ZHOU; OOSTERHUIS, 2012). Chugh et al. (2011) descreveram que, em condições de hipoxia ocorrem alterações no ciclo ascorbato-glutationa, interrompendo a decomposição de H2O2. Kumutha et al. (2009) avaliando genótipos de Cajanus cajan expostos ao alagamento obteve um aumento neste parâmetro. Figura 1 - Peróxido de hidrogênio em folhas e raízes (A - B) em plantas jovens de Euterpe oleracea sujeitas ao alagamento. Letras iguais não apresentam diferenças significativas no teste F (P <0,05). Os quadrados representam os valores médios de cinco repetições, e as barras representam os desvios padrão. Fonte: Elaboração própria (2014) 19 5.2. Malondialdeído (MDA) O alagamento não causou um aumento significativo na oscilação dos valores de MDA nas folhas e raízes, respectivamente (Figuras 2 A e B), sendo que o valor mais expressivo na folha foi encontrado no 24º dia (Figura 2 A), com aumento de aproximadamente 27%. Além disso, na raiz foi verificado um aumento de aproximadamente 14% no 12º dia, e diminuição de 32% no 24º dia (Figura 2 B), quando comparados às plantas controle. Os níveis de MDA foram ligeiramente aumentados na folha, enquanto que na raiz ocorreu oscilação, sugerindo que os efeitos intensos não foram verificados na peroxidação dos lipídios após o alagamento. Plantas sujeitas ao alagamento produzem radicais livres e espécies reativas de oxigênio, que, em reação com ácidos graxos insaturados, são componentes estruturais da membrana (LOPES et al., 2005), assim, o estresse hídrico provoca a desestruturação dessas membranas e como consequência o aumento na peroxidação lipídica (LIN et al., 2013). Resultados semelhantes foram apresentados por Pereira et al. (2014) analisando os efeitos no MDA induzidos por alagamento em plantas de Euterpe oleracea. 5.3. Glutationa (GSH) O alagamento produziu oscilação e aumento nos resultados encontrados para GSH em folhas e raízes, respectivamente (Figuras 2 C e D). Na folha não ocorreu aumento significativo no 6º e 12º dia, e a redução também não foi significativa nos 18º e 24º dia (Figura 2 C), quando comparados com as plantas controle. A raiz apresentou um aumento significativo apenas no 24º dia (Figura 2 D), sendo esta alteração de cerca de 59%, em relação ao controle. O níveis de GSH aumentaram na raiz e oscilou nas folha em condições alagamento, provavelmente está relacionado com uma resposta de defesa, a planta quando exposta ao estresse vai desenvolver mecanismo de proteção contra as espécies reativas de oxigênio. A manutenção dos níveis de GSH são fundamentais para evitar os danos oxidativos nas células durante o alagamento (HERSCHBACH et al., 2005). Hossain et al. (2009) avaliando Citrus paradisi e plantas Trifoliata poncirus em condições de alagamento também observou aumento de GSH, dado esse que corrobora com este estudo. 20 Figura 2 - MDA em folhas e raízes (A - B), e GSH em folhas e raízes (C- D) em plantas jovens de Euterpe oleracea sujeitas ao alagamento. Letras iguais não apresentam diferenças significativas no teste F (P <0,05). Os quadrados representam os valores médios de cinco repetições, e as barras representam os desvios padrão. Fonte: Elaboração própria (2014) 21 5.4. Catalase (CAT) A atividade de CAT apresentou aumento nas folhas e raízes (Figuras 1 A e 1B). Nas folhas foram obtidos aumentos significativos durante o 6º e 12º dias (Figuras 1 A), e estes valores correspondentes a 140 e 187%, respectivamente, se comparado com as plantas controle. Para a raiz os aumentos foram significativos nos dias 12º e 18º (Figuras 1 B), sendo mais expressiva após 18º dia sob alagamento. O aumento das atividades de CAT nas folhas e raízes são associadas ao controle e desintoxicação provocada por H2O2, porque este composto tem sua síntese intensificada durante o alagamento. O pico observado na atividade de CAT, durante o período de condições de hipoxia, é uma resposta da planta para aumentar a tolerância ao alagamento (HERNANDEZ et al., 2010). A catalase é uma enzima especializada em remoção de H2O2, apresentando frequentemente um aumento em sua atividade com o objetivo de atenuar o estresse (MOLLER et al., 2007). Plantas com sistema antioxidante eficiente, com intensa participação CAT, são mais tolerantes aos danos oxidativos. Resultados semelhantes relacionados ao aumento da atividade de CAT foram descritos por Hossain et al. (2009) investigando três genótipos de citros. 5.5. Ascorbato peroxidase (APX) O alagamento promoveu aumento na concentração de APX nas folhas e raízes (Figuras 1 C e D). Na folha o aumento não foi significativo, sendo o valor mais expressivo de cerca de 30% encontrada no 18º dia (Figura 1 C). Com relação à raiz, o aumento significativo ocorreu apenas no sexto dia após a aplicação do alagamento (Figura 1 D), este aumento foi de 298%, quando comparado com os tratamentos controle. O aumento e estabilização da APX nos tecidos das folhas e raízes após o alagamento estão relacionados com a adequação do sistema de defesa antioxidante (ASHRAF, 2012), além de revelar que as plantas jovens de Euterpe oleracea apresentam tolerância ao alagamento. Chugh et al. (2012) observaram um aumento na atividade APX na raiz de Zea mays sob alagamento. 22 5.6. Guaiacol peroxidase (GPX) O alagamento aplicado induziu aumentos nas atividades GPX nas folhas e raízes (Figuras 1 E e F). Na folha aumentos significativos apareceram após 6º e o 12º dia (Figura 1 E), estes aumentos foram cerca de 81 e 76%, respectivamente, quando comparados com as plantas do controle. Na raiz não ocorreu um aumento significativo até o 18º dia após a aplicação do alagamento (Figura 1 F). O aumento da atividade de GPX é explicado pelo fato do alagamento gerar um estresse oxidativo (VERMA et al., 2014), na qual ocorre o excesso na produção de peróxido de hidrogênio e redução na produção de glutationa, que são substratos da GPX (GILL; TUTEJA, 2010). Portanto, esta enzima deve ser usada como indicador da tolerância ao alagamento nesta espécie. 23 Figura 3 - Catalase em folhas e raízes (A - B), Atividades ascorbato peroxidase em folhas e raízes (C - D), e atividades guaiacol peroxidase em folhas e raízes (E - F) em plantas jovens de Euterpe oleracea sujeitas ao alagamento. Letras iguais não apresentam diferenças significativas no teste F (P <0,05). Os quadrados representam os valores médios de cinco repetições, e as barras representam os desvios padrão. Fonte: Elaboração própria (2014) 24 6. CONCLUSÕES CAT, APX e GPX foram eficazes no controle de danos oxidativo em folha e raízes indicando que plantas jovens de açaí são tolerantes ao alagamento. O alagamento não interfere em compostos oxidantes como MDA e H2O2, mas promove alterações positivas nos níveis de GSH, sendo este um indicativo de que plantas jovens de Euterpe oleracea apresentam um sistema antioxidante enzimático eficaz quando submetidas ao alagamento. 25 REFERÊNCIAS ARMSTRONG, W.; BRÄNDLE, R.; JACKSON, M.B. Mechanisms of flood tolerance in plants. Acta Bot. Neerl, v.43,p.307-358. 1994. ALVES, G.A.R.; SANTOS FILHO, B.G.; LOBATO, A.K.S.; DANIEL, K.Y. T.; OLIVEIRA NETO, C.F.; COSTA, R.C.L.; ÁVILA, F.W.; MARQUES, D.J.; GALATE, R.S. Water relations, nitrogen compounds and enzyme activities in leaf and root of young Yellow Lapacho (Tabebuia serratifolia) plants subjected to flooding. Plant Omics J, v. 5, p. 216222, 2012. APEL, K.; HIRT, H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annual Review of Plant Biology, v.55, p.373-399, 2004. ASHRAF, M. A. Waterlogging stress in plants: A review. 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