Emprego de Isótopos Estáveis para o Estudo do Carbono e do

Manejo de Sistemas Agrícolas para Seqüestro de Carbono no Solo
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Capítulo 13
Emprego de Isótopos Estáveis
para o Estudo do Carbono e do
Nitrogênio no Sistema Solo-Planta
Bruno José Rodrigues Alves
Lincoln Zotarelli
Cláudia Pozzi Jantalia
Robert Michael Boddey
Segundo Urquiaga
Introdução
Para o sucesso da agricultura, é importante conhecer como as
práticas voltadas para o manejo dos componentes dos sistemas de
produção interferem nos processos de formação da matéria orgânica
no solo e na disponibilidade de nutrientes para as culturas. As avaliações
quantitativas (estoques e fluxos) são importantes para dimensionar o
resultado dos fatores envolvidos em um determinado sistema de produção.
Por sua vez, o entendimento do papel desses fatores pode ser conhecido,
de forma acurada e precisa, por meio do emprego de isótopos.
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Capítulo 13
Os isótopos 13C e 15N têm tido ampla aplicação na pesquisa
científica, não somente por serem estáveis e, por isso, não oferecerem
riscos no manuseio, mas porque são isótopos de dois elementos de grande
importância para o crescimento vegetal e que possuem os ciclos mais
complexos nos sistemas agrícolas.
Estudo da dinâmica de carbono
A matéria orgânica tem grande influência sobre as propriedades
químicas e físicas dos solos tropicais e por isso é considerada componentechave para a sustentabilidade dos sistemas agrícolas. A decomposição
de resíduos de vegetais e animais que chegam ao solo, que podem
contribuir para o acúmulo de matéria orgânica no solo, reúne processos
biológicos que são componentes essenciais do ciclo do C. Durante o
processo de decomposição dos resíduos orgânicos, alguns compostos
escapam da ação biológica por intermédio da interação com colóides
minerais do solo, ou pelas próprias características estruturais que lhes
confere recalcitrância, e passam a formar o húmus ou a matéria orgânica
coloidal do solo. Assim, a qualidade e a quantidade do resíduo orgânico
implicará maior ou menor acumulação de matéria orgânica no solo
(URQUIAGA et al., neste Livro).
As convenções sobre clima, realizadas na última década, trouxeram
à tona a discussão sobre estratégias para o aumento nos estoques de
matéria orgânica no solo, pois, além de proporcionar uma condição
mais favorável para a fertilidade do solo, representa uma forma de mitigar
o aquecimento do planeta pela diminuição da concentração de CO2 na
atmosfera (LAL; KIMBLE, 2000). Pela importância que representa a matéria
orgânica no solo, é importante conhecer a influência dos sistemas florestais,
agrícolas e pastoris sobre o seu efeito no acúmulo ou preservação desse
componente do solo.
A abundância natural do
13
C
Na natureza, existem dois isótopos do C que são estáveis e se
encontram na natureza em suas devidas proporções. O 12C é o mais
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leve e apresenta a maior proporção em relação ao total de C na
natureza (98,89%), e o 13C conta com apenas 1,11% do total. Essas
proporções se mantêm relativamente estáveis em qualquer resíduo
orgânico. No entanto, com o advento de espectrômetros de massas
mais sensíveis, encontrou-se que, quando o C passa de um estado
físico-químico para outro, ocorre uma discriminação entre os dois
isótopos, ou seja, um isótopo muda de estado preferencialmente, ou
mais rapidamente, em relação ao outro. Isso faz com que ocorra uma
variação na casa dos milhares na proporção 13C/12C. As análises da
composição isotópica de C são feitas medindo-se a relação de 13C/12C
das amostras em relação a um padrão internacional, e o resultado é
expresso em termos de diferença de δ13C em relação ao padrão.
O padrão internacional para o carbono é uma rocha calcária encontrada
em uma formação geológica denominada Pee Dee, na Carolina do
Norte, EUA, cuja abreviação é PDB (Pee Dee Belemnite), e tem uma
relação molar de 13C/12C (R) de 0,01124. Os desvios em relação ao
padrão são conhecidos como unidades δ (letra grega delta minúscula),
e como são valores muito pequenos convencionou-se expressá-los em
partes por mil (‰).
A composição isotópica das plantas em relação ao padrão PDB é
determinada pela equação:
Em que
R é a relação molar 13C/12C.
Como a relação molar 13C/12C das plantas é inferior à do PDB, o
δ13CPDB das plantas é negativo.
Usando-se essa terminologia, os valores de δ 13C do CO2 atmosférico
situam-se em torno de -7 ‰ δPDB13C, e as plantas têm valores variando
de -11 a -35 ‰ δPDB13C (FARQUHAR et al., 1989). Daqui por diante, se
utilizará o termo 1 delta como equivalente a 1 ‰ δPDB13C.
As maiores diferenças na composição isotópica de C nos tecidos
vegetais são observadas entre espécies que têm ciclo de carboxilação
C3 e as que têm ciclo C4. As plantas do ciclo C3 (ou de Calvin) fixam o
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CO 2 atmosférico através da enzima Rubisco (Ribulose bifosfato
carboxilase/oxigenase), enquanto as C4 fixam CO2 através da enzima
PEP carboxilase (fosfoenolpiruvato carboxilase). A PEP carboxilase
apresenta alta afinidade (baixo Km) pelo CO2 (MAGALHÃES, 1985). Como
a Rubisco apresenta uma menor afinidade pelo CO2 esta enzima
discrimina o isótopo pesado de carbono, 13C, em relação ao isótopo
leve, 12C, muito mais do que a PEP, e assim, as plantas de ciclo C3
acumulam menos 13C. A discriminação envolvida nesse processo foi
relatada por Smith & Epstein (1971) para diversos grupos de plantas
(Fig. 1). Nesse estudo, observou-se que uma significativa discriminação
isotópica ocorria com intensidades diferentes entre plantas de ciclo
fotossintético C3 e C4, as quais foram separadas em diferentes grupos.
Plantas de ciclo C3, como as dicotiledôneas, discriminam mais
intensamente o 13C e por isso apresentam variações na abundância
isotópica de 13C que variam de -20 a -34 deltas (em média -27 deltas).
Exemplares desse grupo com maior abundância de 13C pertencem a
ambientes mais secos e, supostamente, devem apresentar alguma
evolução no sistema fotossintético, afetando o aproveitamento do CO2
atmosférico.
As plantas de ciclo C4, em sua maioria monocotiledôneas,
discriminam menos o 13C e apresentam valores que variam de -9 a
-17 deltas (em média -13 deltas). Em virtude da diferença média de 14
deltas, pode-se dizer que os ciclos fotossintéticos podem ser
identificados com base na análise da variação da abundância isotópica
de 13C.
Entretanto, adaptações que levam a maiores relações 13C/12C
parecem ser uma resposta da vida sob condições mais limitantes, como
sob os ambientes xéricos e aquáticos. As briófitas podem apresentar um
sinal isotópico semelhante a plantas C3 ou C4, dependendo das condições
de disponibilidade de água. As algas podem ter como fonte de C o
bicarbonato dissolvido na água, o que poderia explicar valores mais
altos de δ13C encontrados para alguns representantes dessa família
(Fig. 1). Em condições de estresse hídrico, plantas de ciclo C3 tendem a
discriminar menos o 13C, o que tem sido utilizado como uma ferramenta
para seleção de variedades mais adequadas para climas mais áridos
(PATE, 2001).
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Fig. 1. δ13C em diferentes grupos de plantas.
Fonte: Adaptada de Smith e Epstein (1971).
Dinâmica do C do solo
avaliada por meio do isótopo
13
C
O uso da abundância natural de 13C para estudo da origem do C
do solo pressupõe que a matéria orgânica do solo reflete o material
vegetal do qual se derivou (uma marcação in situ). Essa discriminação
isotópica do 13C durante a decomposição do resíduo altera levemente a
marcação isotópica da matéria orgânica do solo e o grau com que isso
ocorre está relacionado com a composição química dos resíduos.
Resíduos vegetais mais ricos em compostos, como proteínas, açúcares,
aminoácidos e ácidos orgânicos, têm valores similares de 13C dentro de
plantas com diferentes ciclos fotossintéticos (por exemplo – C4 e algodão
– C3), e são facilmente decomponíveis. Lipídeos e carotenóides, porém,
são empobrecidos em 13C nessas duas espécies e de decomposição mais
lenta (WHELAN et al., 1970). Celulose e hemicelulose compõem de
57% a 77% do tecido de plantas herbáceas, e são tipicamente
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Capítulo 13
enriquecidas em 13C de 1-2 deltas em relação ao material total da planta.
Plantas arbóreas possuem de 17% a 31% de lignina na sua biomassa do
tecido lenhoso, que possui maior teor de carbono (>50%) do que a
celulose, sendo por isso responsável por uma maior percentagem do C
total. A lignina é um composto de difícil decomposição e empobrecido
em 13C em relação à celulose (BENNER et al., 1987), o que é um outro
fator para determinar a marcação final da matéria orgânica do solo.
Não obstante, tem sido observado que, na maioria dos casos, a
discriminação isotópica pela decomposição é pequena e varia entre 1
e 2 deltas (BALESDENT; MARIOTTI, 1987; MARTIN et al., 1990).
A técnica de variação da abundância natural de 13C é empregada
com sucesso em vários estudos para estudar a dinâmica de carbono do
solo, em longo prazo, em que o padrão fotossintético da vegetação
original foi modificada (BALESDENT; MARIOTTI, 1987; MARTIN et al.,
1990; SKJEMSTAD et al., 1990; JASTROW et al., 1996).
Um exemplo dessa relação foi mostrado no trabalho publicado
por Tarré et al. (2001), que estudou a variação na marcação isotópica
do C em uma pastagem de braquiária (plantas C4) estabelecida em uma
área anteriormente ocupada por uma floresta (ciclo C3). A matéria
orgânica do solo sob floresta que tinha uma composição isotópica inicial
em torno de -25 deltas, recebeu por um longo tempo carbono enriquecido
em 13 C da pastagem (aproximadamente -12 deltas) e teve sua
composição isotópica modificada até 30 cm de profundidade (Fig. 2).
Sabendo-se a composição isotópica inicial do solo sob a vegetação
nativa e sob a cultura, é possível calcular a quantidade de C derivado
das plantas C3 e C4, o que é interessante em estudos de ciclagem do
carbono no solo e decomposição da matéria orgânica (BALESDENT
et al., 1988; MARTIN et al., 1990; SISTI et al., 2003).
Para calcular a proporção da matéria orgânica de origem C3 nativa
que é substituída pela matéria orgânica derivada de espécies C4, ou
vice-versa, utiliza-se a seguinte relação:
%MOSA = 100 -%MOSf
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Fig. 2. Abundância de
humidicola.
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13
C no perfil de um solo sob pastagens de Brachiaria
Fonte: Tarré et al. (2001).
Em que
%MOSF é a proporção da matéria orgânica do solo derivada da
vegetação nativa (C3), que possui uma marcação natural δ13CF.
δ13CA é a marcação natural da vegetação C4.
δ13CB é a marcação natural do C do solo sob a nova vegetação.
É uma metodologia simples de ser empregada e sem riscos para o
operador, e demanda, principalmente, um espectrômetro de massas de
alta precisão para análise da composição isotópica das amostras.
Utilizando essa técnica na França, Balesdent & Mriotti (1987)
observaram que após 23 anos de cultivo onde as folhas e colmos do
milho eram incorporadas no solo, somente 19% do C-orgânico do solo,
nas frações de 0-50 µm, era proveniente do milho. Quando esses resíduos
foram deixados em superfície, a incorporação do C-milho no C-orgânico
do solo ficou em torno de 13%.
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Capítulo 13
Em sistemas consorciados, a matéria orgânica nativa do solo de
origem C3 (por exemplo, no caso de áreas cuja vegetação nativa era
uma floresta) é substituída por matéria orgânica derivada de culturas de
ciclos C3 e C4. Nesse caso, pode ser necessário estimar a contribuição da
cultura de ciclo C3 para o estoque de matéria orgânica do solo, ou mesmo
para melhor compreender a dinâmica da matéria orgânica do solo
(TARRÉ et al., 2001; SISTI et al., 2003). Uma forma de estimar a
contribuição dos resíduos da espécie C3 foi proposta por Cadisch & Giller
(1996), para avaliar o papel das leguminosas forrageiras em pastagens
de braquiária, e é expressa na equação que se segue:
Em que
%MOSl é a proporção da matéria orgânica do solo derivada da espécie
C3, que possui uma marcação natural δ13Cl.
δ13Cg é a marcação natural na espécie C4 e δ13C(g) a marcação do solo
sob esta espécie.
δ13C(gl) é a marcação natural do C do solo sob o consórcio.
C(g) e C(gl) são, respectivamente, o conteúdo de C do solo sob a espécie
C4 e sob o consórcio.
Fica claro que, para o emprego dessa técnica, é necessário ter
um sistema-controle em que somente espécies C4 sejam utilizadas. Essa
técnica também possui a premissa de que a quantidade de C nativo do
solo é semelhante na área consorciada e na área-controle.
Origem e destino do N em sistemas
agrícolas por meio do emprego de 15N
Os solos tropicais são caracteristicamente pobres em N disponível
para a maioria das culturas-planta, e a adição de adubos ricos nesse
elemento são fundamentais para garantir alta produtividade das mesmas.
No entanto, as quantidades a serem aplicadas, assim como a forma e
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localização, são variáveis importantes do manejo das culturas e são
determinantes para o nível de aproveitamento do N derivado dos adubos.
Do ponto de vista ambiental, é importante otimizar o uso dos fertilizantes
para reduzir os níveis de perda (ou risco de poluição), e, por serem
inevitáveis, conhecer a forma com que esse elemento está sendo perdido
para o meio ambiente. O N é, também, um dos elementos mais
importantes no processo de acumulação de matéria orgânica no solo
(URQUIAGA et al., 2002), e, dessa forma, espécies vegetais que possam
introduzir N no sistema por meio do processo de fixação biológica de
nitrogênio, como os adubos verdes, aumentam as possibilidades de
acumular matéria orgânica no solo, além de diminuírem a necessidade
de fertilização com N (ZOTARELLI et al., 2002). As técnicas baseadas
no uso de 15N possibilitam uma melhor compreensão da dinâmica desse
nutriente no sistema solo-planta-atmosfera.
A técnica parte do princípio de que qualquer material existente
na natureza que possua nitrogênio em sua constituição apresentará
uma proporção de 0,366% de átomos de 15N em relação ao total de N,
que em sua maioria é composto do isótopo 14N. Assim, se uma planta
cresce utilizando N de duas fontes (ex. solo e fertilizante), e uma delas
for artificialmente enriquecida com 15N, é possível determinar a
contribuição de cada uma para a nutrição da planta. Estudos mais
detalhados de cada fonte também podem ser feitos, como avaliação
da eficiência de fertilização, perdas do sistema, etc., como será
mostrado mais adiante.
O enriquecimento das fontes de N se faz com a adição de fertilizantes enriquecidos com 15N, como sulfato de amônio, por exemplo.
Por meio de técnicas que empregam resinas de troca iônica, é possível
obter substâncias nitrogenadas com uma proporção de 15N maior do
que a encontrada na natureza (ex. com 1% de 15N em relação ao total).
De fato, a maioria das metodologias que empregam o isótopo 15N utiliza
substâncias enriquecidas em 15N. Quando se trabalha com substâncias
enriquecidas, é comum utilizar-se o resultado de enriquecimento em
excesso, ou seja, o valor de enriquecimento acima da abundância
natural. Em termos práticos, desconta-se o valor 0,366% do resultado
da análise da amostra.
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Capítulo 13
Uso de material enriquecido com
15
N
Uma possibilidade para o uso de 15N como traçador é o emprego
da marcação direta de resíduos orgânicos. Nesse caso, o resíduo de
interesse deve ser marcado pela adição de um fertilizante marcado
com 15N durante o crescimento da planta. No caso de adubos verdes,
por exemplo, é comum o interesse em medir a transferência do N
existente no adubo verde para a cultura sucessora. Nesse caso, podese crescer a espécie utilizada como adubo verde em recipientes sob
condição de irrigação controlada e fertilizá-los com 15N. A planta
crescerá em um meio onde a fonte de N está enriquecida com 15N e
conseqüentemente os tecidos dessa planta ficarão com alta marcação
de 15N. O adubo verde poderá ser utilizado em experimentos de vasos
ou diretamente no campo. No último caso, uma área é delimitada e o
material existente é substituído na mesma proporção pelo adubo verde
marcado. A proporção do N derivado do adubo verde (%Ndav) é
calculada como sendo:
No trabalho desenvolvido por Cueto-Wong et al. (2001), objetivou-se avaliar o papel da adubação verde na nutrição do sorgo. Foram
utilizadas como adubo verde ervilhaca-peluda (Vicia villosa) e alfafa
(Medicago sativa), enriquecidas com 4% a 6% de átomos de 15N, após
crescimento em meio enriquecido com 15N. O emprego dos adubos
verdes enriquecidos com 15N permitiu mostrar que a maior proporção
do N derivado dos adubos verdes ficou imobilizada na camada mais
superficial do solo, sendo o sorgo beneficiado apenas com menos de
20% do N adicionado por essa via (Tabela 1).
A técnica de marcação direta pode ser usada em outras situações,
como numa aplicação de um composto, excretas animais, etc. Essa
técnica foi usada por Ferreira (2002), por exemplo, para avaliar o destino
do N aplicado ao solo na forma de urina bovina. Nesse estudo, parte da
urina recolhida de vacas leiteiras foi substituída por um igual volume de
uma solução de uréia, na mesma concentração do encontrado na urina,
enriquecida com 15N. Um volume de 1,5 litro da urina foi aplicado ao
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Tabela 1. Recuperação de 15N pelo sorgo forrageiro e em duas profundidades do solo, após adubação verde com com duas quantidades
diferentes de alfafa e de ervilhaca-peluda, enriquecidas com 15N.
Legume
Quantidade
aplicada
(mg ha-1)
Alfafa (baixo)
Alfafa (alto)
Ervilhaca (baixo)
Ervilhaca (alto)
2,7
4,0
3,2
6,4
Partes do sorgo
Parte aérea Parte aérea
colheita 1
colheita 2
15
Profundidade
do solo (cm)
Raízes
0-30
30-60
N recuperado – Proporção do adicionado
13,2
10,0
13,6
13,1
2,9
3,4
3,2
3,3
2,4
1,5
2,3
1,6
64,2
70,8
20,8
45,2
4,2
2,6
2,5
1,9
Fonte: Modificada de Cueto-Wong et al. (2001).
solo numa área equivalente ao observado após a micção dos bovinos.
Posteriormente, foram feitas colheitas consecutivas do material em oferta
e, finalmente, de todo o material vegetal e liteira existente sobre o solo
da área de estudo. Graças ao uso da marcação com 15N, foi possível
mostrar que somente 18% do N proveniente da urina foram recuperados
no material vegetal. O restante se encontrava no solo ou foi perdido do
sistema por lixiviação, ou por meio de formas voláteis desse elemento.
Uma informação importante é a de que o N da urina tornou-se mais
disponível para as plantas após 115 dias da aplicação da urina sobre o
solo (Fig. 3). Isso pode ser um indicativo de que os resíduos vegetais
existentes sobre o solo podem ter imobilizado o N da urina e mineralizado
posteriormente. Outra possibilidade seria a capacidade de absorver o
N disponível no solo pelas plantas, que poderia estar limitada no início
do experimento, em virtude da alta concentração salina da urina e baixa
umidade do solo, ou por efeito sazonal.
Métodos indiretos
A técnica indireta é usada para estudar a utilização pela planta
de determinada fonte de N não marcada. Tem sido empregada para o
estudo da contribuição da fixação biológica de nitrogênio para as plantas
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Capítulo 13
Fig. 3. Proporção do N na planta derivado da urina e percentagem do N da
urina recuperado em cada corte de Brachiaria humidicola (1,5 L com 0,5059%
N e 1,037% atm 15N excesso) em pastagem sobre um Argissolo, na região da
Mata Atlântica, localizado em Itabela, BA.
Fonte: Ferreira (2002).
(BODDEY, 1987) e também para avaliar a contribuição de diferentes
resíduos na nutrição nitrogenada das plantas (URQUIAGA; ZAPATA,
2000).
O isótopo 15N é adicionado ao solo de forma que se tenham
dois tratamentos. Em um deles, somente o 15N-fertilizante é adicionado
ao solo (tratamento-controle), e o outro receberá, também, a fonte de
N que se deseja estudar. É recomendável se utilizar pequenas doses
de N com alto enriquecimento de 15N para evitar que ocorram efeitos
de interação entre a fonte marcada e o solo (efeito INA – JENKINSON
et al., 1985; BODDEY et al., 1993). Para minimizar os problemas relacionados com a técnica, deve-se certificar que a área foi marcada
uniformemente.
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Diluição isotópica de 15N
O próprio nome dado à técnica resume o processo que ocorre
para quantificação da contribuição da fonte marcada para a nutrição
da planta. A planta que cresce na parcela-controle, que foi enriquecida,
mas não recebeu a fonte não marcada sob estudo, apresentará um
enriquecimento de 15N que reflete a marcação do N disponível para a
planta. Por sua vez, a planta que recebe N da fonte não marcada
apresentará uma diluição isotópica de 15N em relação à planta do
tratamento-controle. Quanto maior a diluição maior é a contribuição
da fonte não marcada.
Quando se deseja estudar uma fonte orgânica de N, como adubos
verdes, excretas de animais, compostos orgânicos, etc, a contribuição
das mesmas (%N de FO) para a nutrição da planta é calculada da
seguinte forma:
Essa equação também pode ser usada para avaliar a transferência
do N fixado por uma leguminosa para uma cultura em consórcio, ou
mesmo quando se faz uma adubação verde de pré-cultivo. Neste caso,
utiliza-se no numerador o enriquecimento de 15N da planta na parcela
que recebeu a adubação verde, e, no denominador, o enriquecimento
de 15N da mesma planta, porém na parcela que não recebeu adubação
verde.
A técnica de diluição isotópica de 15N também é utilizada para
quantificar a contribuição da fixação biológica de nitrogênio (FBN) para
as plantas. Nesse caso, o solo recebe uma quantidade de fertilizante
marcado com 15N suficiente para elevar o enriquecimento do solo, mas
com mínima interferência no processo de FBN. Normalmente, as doses
utilizadas ficam entre 10 kg N ha-1.
Para avaliar o enriquecimento de 15N no N disponível do solo,
uma planta não fixadora de N2 é utilizada como testemunha.
A estabilidade da marcação do solo com 15N é uma das condições
que permite o atendimento da premissa da técnica de diluição isotópica
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Capítulo 13
de 15N para quantificação da FBN: “A planta testemunha, ou controle, e
a planta fixadora de N2 devem absorver N do solo com o mesmo
enriquecimento de 15N” (BODDEY, 1987). Uma vez obedecida essa
condição, plantas que utilizem 100% do N do ar apresentarão em seus
tecidos 0% de 15N em excesso e, pelo oposto, plantas que não se
beneficiam da FBN apresentarão um enriquecimento de 15N igual ao
do N disponível do solo, ou, em outras palavras, igual ao da planta
testemunha.
A contribuição da FBN por meio da técnica de diluição isotópica
de 15N é feita calculada pela seguinte fórmula:
Em que
% Nda é a percentagem de N derivada da FBN
Na realidade, é muito difícil ter satisfeita a condição de
estabilidade no enriquecimento de 15N do solo, sendo portanto de
grande importância a seleção de uma planta-controle adequada. A
marcação do solo em termos de área não apresenta grandes
dificuldades. O maior problema é a marcação uniforme em 15N até a
profundidade onde as raízes extraem o N para sua nutrição, o que
diminuiria muito a influência das diferenças do padrão de distribuição
das raízes tanto entre as variedades testadas quanto entre estas e a
planta-controle (BODDEY et al., 1996). Ainda mais complicado é a
dificuldade de se ter uma marcação com 15N no N disponível do solo
estável com o tempo (WITTY, 1983). Se a amplitude e a freqüência de
variação do enriquecimento de 15N no solo são grandes, a única
alternativa para se ter êxito na quantificação da FBN é o uso de uma
planta-controle que apresente um padrão de absorção de N do solo
com o tempo muito semelhante ao da planta teste. Deve-se destacar
que é muito difícil determinar a curva de absorção de N do solo de
uma planta fixadora de N2; contudo, quanto mais lentas as mudanças
do enriquecimento de 15N no N disponível do solo com o tempo, menos
crítica é a seleção da planta-controle.
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Emprego de Isótopos Estáveis para o Estudo do Carbono e do Nitrogênio no Sistema Solo-Planta
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Uma planta-controle ideal seria aquela em que a única diferença
da planta teste fosse apenas a incapacidade de obter contribuições da
FBN. Muitos autores têm recomendado o uso, como planta-controle,
de um genótipo não nodulante das leguminosas teste em estudo.
Genótipos não nodulantes ou nodulantes, mas não fixadores, de muitas
leguminosas são agora disponíveis, mas, em virtude das muitas variações
no hábito de crescimento e enraizamento dentro de uma mesma espécie,
estas podem não ser apropriadas para todas as situações. No que se
refere às plantas-controle, quando não se tem certeza da uniformidade
de marcação do solo com 15N, recomenda-se o uso de pelo menos
três espécies que não fixem nitrogênio e que tenham comportamento
de crescimento e de enraizamento bem diferentes entre si (BODDEY
et al., 1995). Se, no momento da colheita, o enriquecimento de 15N
das plantas-controle forem similares, pode-se concluir que a marcação
do solo apresentava certa uniformidade e não haverá problema para
quantificação da FBN.
Para minimizar os problemas quanto à escolha da planta-controle,
uma estratégia é minimizar as variações na marcação de 15N
no N disponível com o tempo. Pela facilidade, o método mais usual
de enriquecimento do solo com 15N é por meio da aplicação de
solução de fertilizante marcado com 15N (ex. uréia, sulfato de amônio,
nitrato de potássio, etc.) na superfície do solo (HARDARSON; DANSO,
1993). O problema mais importante associado com o uso de
fertilizantes solúveis marcados com 15N deve-se ao fato de que,
imediatamente após a aplicação destes, ocorre uma rápida queda no
enriquecimento de 15N no N mineral do solo, em razão da contínua
mineralização do N não-marcado da matéria orgânica do solo que
continuamente vai diluindo o 15N do N mineral do solo, ou em virtude
das perdas por lixiviação e/ou volatilização do N mineral do solo
(WITTY, 1983).
Para diminuir as mudanças temporais de enriquecimento de
N no N mineral do solo, tem-se proposto a adição de pequenas
quantidades de N marcado solúvel em intervalos regulares (ex.
semanalmente) (OLIVEIRA et al., 1992). Essa técnica, contudo, está
sujeita a erros, se colheitas seqüenciais de plantas são feitas, e se a
disponibilidade de N do solo é alta. Neste caso, as plantas controle e
15
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Capítulo 13
teste podem remover diferentes quantidades de N do solo, deixando
quantidades diferentes de N mineral residual no solo para as subseqüentes colheitas. Além disso, a adição de N marcado ao solo resultará
em enriquecimento diferente do N mineral para as duas culturas, no
começo do período de crescimento seguinte.
Uma outra estratégia para diminuir as mudanças temporais e a
queda do enriquecimento de 15N do solo é a utilização de uma fonte de
liberação lenta de 15N. Nas diferentes formulações de liberação lenta
de N incluem-se a adição de matéria orgânica marcada com 15N e a
mistura de substratos carbonatados, como a sacarose e celulose, com
fertilizantes nitrogenados solúveis, que promoverão uma imobilização
e posteriormente uma liberação lenta do 15N adicionado (GILLER;
WITTY, 1987; BODDEY et al., 1995).
Estimativa do N disponível do solo (Valor A)
Descrita por Fried & Dean (1952), a técnica de valor A é uma
medida que estima a quantidade de N do solo que esteve disponível
para a planta durante o seu desenvolvimento. O valor é expresso em
termos do fertilizante aplicado marcado com 15N. A técnica é considerada indireta e é baseada no conceito de que, quando existem duas
ou mais fontes de nitrogênio (exemplo: N do solo e N do fertilizante), a
planta absorverá, de cada fonte, quantidades proporcionais às
respectivas quantidades disponíveis.
Conforme descrito em Alves et al. (1999), o valor A do solo é
calculado baseando-se na seguinte relação:
Em que
QNF é a quantidade de N na forma de fertilizante aplicada no solo
%Nddf é a percentagem de N derivada do fertilizante, calculada pela
expressão:
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sendo a percentagem de 15N em excesso, na planta ou do fertilizante,
calculada subtraindo-se 0,366 dos valores de abundância de 15N obtidos
da análise por espectrometria de massas (como é muito comum o termo
em excesso, normalmente os valores fornecidos pela análise já vêm
expressos em % átomos de 15N em excesso). A %Ndds é obtida
subtraindo-se a %Nddf de 100.
Senaratne & Hardarson (1988) propuseram o uso da técnica de
valor A para estimar a contribuição do N dos resíduos de colheita para
a cultura sucessora. Avaliou-se a contribuição dos resíduos de ervilha e
sorgo para a cultura de cevada. Os autores encontraram que o valor A
na rotação ervilha-sorgo foi 233 kg ha-1 de N, 74 kg ha-1 de N maior
que o valor A encontrado na rotação cevada-sorgo. O valor mais alto
na rotação ervilha-sorgo correspondeu a um adicional de 9 kg ha-1 de
N de contribuição dos resíduos de ervilha para o sorgo, derivados da
contribuição da FBN para a ervilha.
Por meio da técnica de valor A, também pode se estimar a contribuição do N das raízes das culturas para o incremento de N do solo.
Alves et al. (2002) aplicaram a técnica de valor A para estudar o
efeito dos resíduos da soja sobre a disponibilidade de N para a cultura
do trigo, plantado em secessão. O trigo foi plantado numa área anteriormente cultivada com soja e em uma área adjacente que ficou em pousio
no verão, com cobertura de aveia. Foram montadas duas microparcelas
de 2,0 x 1,0 m dentro da área com resíduos de soja. Na microparcela 1,
o resíduo foi mantido intacto, e, na micro-parcela 2, todo resíduo foi
removido. Na parcela adjacente, em pousio no verão, foram montadas
mais duas microparcelas. Uma dessas microparcelas foi mantida com
resíduo remanescente da cultura de aveia e a outra microparcela teve
todo resíduo de aveia removido. Todas as microparcelas receberam
sulfato de amônio marcado com 15N (11,6% 15N em excesso), na mesma
dose utilizada para o plantio do trigo.
Os resíduos da soja proporcionaram um aumento de cerca de
30 kg ha-1 na disponibilidade de N para a cultura do trigo (Tabela 2). A
técnica de valor A também permitiu mostrar que na microparcela em
que se removeram os resíduos da superfície do solo houve um incremento
na disponibilidade de N do solo de cerca de 24 kg N ha-1, o que poderia
ser atribuído ao sistema radicular da cultura.
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Capítulo 13
Tabela 2. Rendimento e disponibilidade de N do solo (Valor A) para o
trigo plantado, ou não, em área com resíduos de soja (Londrina, PR).
Local de plantio
do trigo
Área de soja
Com resíduos
Sem resíduos
Área de pousio
Com resíduos
Sem resíduos
Rendimento
Valor A Incremento de N do solo pelos resíduos*
(kg ha-1)
2.463,9
2.219,4
117,6a
111,4a
29,8a
23,5b
1.776,1
1.858,6
92,1b
87,9b
4,3c
–
* O incremento na disponibilidade de N do solo foi calculado pela diferença entre o Valor A
encontrado para cada tratamento e o controle (área de pousio sem resíduos).
Valores seguidos de letras diferentes na coluna diferem entre si pelo teste Tukey, a 5% de
probabilidade.
Fonte: Modificada de Alves et al. (2002).
Variação natural do 15N
A técnica de abundância natural de 15N baseia-se no fato de que,
geralmente, o N do solo é levemente enriquecido em 15N em comparação
ao N2 do ar (SHEARER et al., 1978). O N da atmosfera apresenta a
seguinte composição isotópica: 99,6337% de átomos de 14N e 0,3663%
de átomos de 15N (JUNK; SVEC, 1958). Em virtude da discriminação
isotópica que ocorre durante as transformações que o N sofre no sistema
solo-planta, como mineralização/imobilização e desnitrificação/
nitrificação, é possível se observarem pequenas variações na
composição isotópica (14N e 15N) no solo e nas plantas (MARIOTTI et
al., 1982). Normalmente essa discriminação resulta num pequeno
enriquecimento em 15N do N do solo e das plantas em relação ao ar
atmosférico (SHEARER et al., 1978; MARIOTTI et al., 1982). Essa
diferença é muito utilizada em estudos de quantificação da FBN
(DELWICHE; STEYN, 1970; RENNIE et al., 1976), e a interpretação
básica dos resultados será a mesma da técnica de diluição isotópica de
15
N: a planta não fixadora apresentará um enriquecimento de 15N muito
semelhante ao solo e maior do que o da planta fixadora.
Para a estimativa da FBN por meio da abundância natural de 15N,
utiliza-se a seguinte expressão:
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Em que
P é a % de fixação biológica de N
δ15N solo é o valor de δ15N encontrado na planta testemunha coletada
em cada parcela experimental
B é o fator de correção do fracionamento isotópico ocorrido pelas plantas
de soja crescendo exclusivamente dependente da FBN.
O método da abundância natural de 15N para a quantificação da
FBN sofre os mesmos problemas dos outros métodos isotópicos, tal como
a técnica da diluição isotópica a partir do enriquecimento do solo, como
discutido anteriormente. A premissa básica é que as plantas fixadoras e
não-fixadoras absorvem N do solo com a mesma marcação de 15N
(SHEARER; KOHL, 1986; BODDEY, 1987). No caso do método da
abundância natural, existe uma dificuldade adicional: o fracionamento
isotópico que ocorre durante a assimilação de N pelas plantas. Essa
dificuldade é solucionada crescendo a planta fixadora hidroponicamente
em solução livre de N, pois, assim, o seu enriquecimento em 15N
representará o enriquecimento do N2 atmosférico e o fracionamento
isotópico associado com a fixação biológica de nitrogênio (SHEARER;
KOHL, 1986). Pela Fig. 4, observa-se que, variando-se o valor de B,
tanto em condições de alta FBN (testemunha com 10 deltas) quanto baixa
(testemunha com 5 deltas), o erro é elevado e não reduz sua importância
significativamente com o incremento da FBN. Ainda na Fig. 4,
assumindo-se uma variação de 1 delta para ambas as testemunhas (5 e
10 deltas – valores comuns para solos brasileiros), observa-se, em cada
valor de B, que a variabilidade das estimativas aumenta drasticamente
com a diminuição da FBN. A grande variabilidade é atribuída ao erro
de 1 delta na baixa marcação de 15N do solo (5 deltas), muito próxima
da marcação da planta fixadora (2 deltas). Embora seja apenas um
exemplo fictício, situações semelhantes são observadas freqüentemente
em estudos que utilizam a técnica, o que torna imprescindível aumentar
o número de pontos de amostragem e de espécies-testemunhas para
ganho de precisão e exatidão das estimativas de FBN.
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Capítulo 13
Fig. 4. Variação na estimativa da FBN para uma leguminosa que apresenta
2 deltas de abundância de 15N, em duas condições de marcação do solo, e para
diferentes valores de B. Considerou-se uma variação constante de 1 delta para
as testemunhas.
Shearer e Kohl (1986) destacam como vantagem desse método o
fato de não haver necessidade de adição de N marcado, evitando os
problemas de inibição da fixação de N e de estabilidade da marcação
ao longo do tempo. O uso dessa técnica, com os devidos cuidados descritos,
normalmente apresenta altas correlações com a técnica de diluição
isotópica de 15N com aplicação de 15N-fertilizante na marcação do solo.
Atualmente, é a técnica mais difundida e aceita para fins de quantificação
da contribuição da FBN para as plantas (PEOPLES et al., 1989).
A contribuição da FBN para a cultura da soja na região de
Dourados, MS, cultivada em diferentes sistemas de rotação, foi avaliada
por meio da técnica de abundância natural de 15N (Tabela 3). As testemunhas foram ervas que cresceram espontaneamente na área experimental.
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Tabela 3. Contribuição da FBN para a cultivar de soja BR 16, estimada
a partir da análise de δ15N das plantas de soja das diferentes rotações e
das espécies invasoras usadas como testemunha.
Espécie
Soja
Amaranthus spinosus L.
Leonotis nepetaefolia L.
Euphorbia heterophylla L.
Bidens pilosa L.
Solanum americanum MILL.
Média das testemunhas
δ15N
% FBN para soja
-0,13 ± 0,08
3,84 ± 0,24
3,31 ± 0,33
3,55 ± 0,22
4,76 ± 1,62
5,05
4,00 ± 0,33
–
82,0
79,8
80,9
84,9
85,6
82,5 ± 2,7
Os nomes científicos correspondem às espécies usadas como testemunha para a técnica
isotópica, as quais foram amostradas ao acaso nas parcelas experimentais.
Para apenas uma das testemunhas, Solanum americanum, somente se
conseguiu um exemplar em toda a área avaliada. Para as demais, foram
retirados diversos exemplares de forma aleatória, tal como feito para a
cultura da soja.
De modo geral, a contribuição da FBN foi alta para as plantas de
soja desse experimento (82,5%). Houve uma variabilidade não muito
elevada entre a maioria das testemunhas, o que permitiu deduzir que a
marcação natural com 15N do N disponível do solo não era muito
heterogênea na área experimental. No caso exclusivo das testemunhas
Solanum americanum e Bidens pilosa, a marcação apresentada era de
cerca de 70%-80% superior à da menor testemunha (Leonotis sp.).
Mesmo assim, a contribuição da FBN para a cultura da soja variou muito
pouco, considerando as testemunhas de forma individualizada, o que
confirma o mencionado anteriormente.
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