UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA COMPORTAMENTO IN VITRO E PATOGENICIDADE DE ISOLADOS DE Fusarium gutiforme EM ABACAXIZEIRO, ORIUNDOS DOS ESTADOS DA PARAÍBA, PERNAMBUCO E RIO GRANDE DO NORTE OZIMAR DE LIMA COUTINHO AREIA – PB 2010 ii OZIMAR DE LIMA COUTINHO COMPORTAMENTO IN VITRO E PATOGENICIDADE DE ISOLADOS DE Fusarium gutiforme EM ABACAXIZEIRO, ORIUNDOS DOS ESTADOS DA PARAÍBA, PERNAMBUCO E RIO GRANDE DO NORTE Tese apresentada à Universidade Federal da Paraíba, pelo Doutorando Ozimar de Lima Coutinho, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia do Centro de Ciências Agrárias, para a obtenção do título de Doutor em Agronomia. Orientadora: Profª Drª Luciana Cordeiro do Nascimento AREIA-PB 2010 Ficha Catalográfica Elaborada na Seção de Processos Técnicos da Biblioteca Setorial do CCA, UFPB, Campus II, Areia – PB. C871c Coutinho, Ozimar de Lima. Comportamento in vitro de isolados de Fusarium gutiforme em abacaxizeiro, oriundos dos estados da Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte. / Ozimar de Lima Coutinho. - Areia: UFPB/CCA, 2010. 51f. : il. Tese (Doutorado em Agronomia) - Centro de Ciências Agrárias. Universidade Federal da Paraíba, Areia, 2010. Bibliografia. Orientadora: Luciana Cordeiro de Nascimento. 1. Fungos – Doenças de plantas 2.Fungos – crescimento micelial 3. Fungos – esporulação 5. Fungos – patogenicidade 5. Ananas comosus L. I. Nascimento, Luciana Cordeiro (Orientadora) II.Título. iv À DEUS, Minha única fonte inesgotável de sabedoria e amor, sempre fiel aos meus anseios, apesar das minhas negligências. Aos meus pais, Odílio Coutinho da Silva e Maria Clese de Lima Coutinho “in memoriam” pela incansável luta que travaram para me educar, abrindo mão em muitas ocasiões de seus sonhos para a realização do meu sonho. A vocês, mesmo ausentes da vida terrena, minha eterna gratidão. À minha esposa, Sônia Maria Venâncio Coutinho, companheira fiel em todos os momentos e incentivadora de minha jornada de estudo. As minhas filhas, Rebeca Venâncio Coutinho e Raíssa Clese Venâncio Coutinho, presentes de DEUS e motivos do meu orgulho. DEDICO v AGRADECIMENTOS À DEUS, Presença viva em todos os momentos de minha vida. Sempre fiel. Às PIBs-RR/PB (Primeira Igreja Batista de Roraima/Paraíba) Pelas orações destinadas ao sucesso deste trabalho e ao meu crescimento espiritual. Minhas casas e refúgios de orações. À minha Orientadora, Profª Drª Luciana Cordeiro do Nascimento, pelo papel fundamental no desenvolvimento do meu trabalho de Tese. À UNIVERSIDADE FEDERAL DE RORAIMA E AO CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS, minha instituição e ambiente de trabalho, por tudo que conquistei profissionalmente. AO CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA, por me proporcionar e possibilitar cursar o Doutorado em Agronomia com área de concentração em Agricultura Tropical. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Agronomia: Dr. Ademar Pereira de Oliveira; Dr. Alberício Pereira de Andrade; Dr. Egberto Araújo; Dr. Ítalo Moreira Aquino; Dr. Jacinto de Luna Batista; Dr. Jacob Silva Souto; Drª Luciana Cordeiro do Nascimento; Dr. Napoleão Esberard Beltrão; Dr. Ricardo Elesbão Alves; Dr. Levi Moura Barros; Dr. Francisco Xavier de Souza; Drª Silvanda de Melo Silva; Drª Rizelane de Alcantara Bruno; Dr. Walter Esfrain Pereira, pelos ensinamentos, experiências e acima de tudo responsabilidade na transferência de conhecimentos. Ao senhor José Pedro Alves da Silva, proprietário do Sítio Jacoca em ItapororocaPB, pela doação de mudas, folhas e frutos de abacaxi utilizadas neste trabalho. Aos amigos João Belo Soares e Fernando Antonio Tomaz de Oliveira, proprietários da Fabrica de Bebidas Avaí em Alagoinha-PB, que além da amizade de muitos anos, forneceram os tubetes para armazenamento dos fungos deste trabalho de Tese. Aos funcionários, José Tomáz de Aquino (Tomáz), Cosmo Ribeiro Dantas (Cosminho), Severino João Numeriano de Souza (Nino), Francisco Soares de Brito (Chico Flor), Cícera Eliane de Araújo (Eliane), Jacob Soares Dias (Jacozão), Inaldo Gomes de Oliveira (Naum) e José Ribeiro Dantas Filho (Zezinho), amigos sem limites para ajudar o próximo. Aos meus colegas de turma do Doutorado em Agronomia, pelos bons momentos juntos (Os maus momentos já ficaram no esquecimento). vi Aos meus amigos particulares, Leandro Silva do Vale, Luciano Façanha Marques, Catarina de Medeiros Bandeira, Ivanildo Cavalcante de Albuquerque, Maria Izabel Costa da Silva, Maria do Socorro Evangelista Coelho, Anne Evelyne Franco de Souza, Hemmannuella dos Santos Costa, Pedro Aguiar Neto, Antonia Barbosa de Lima, pela amizade sincera no transcorrer de toda jornada de estudo. À Pedro Luciano Ferreira da Silva (Mais que cunhado, amigo) e Terezinha de Lisieux Coutinho Ferreira (Mais que irmã, amiga). À CAPES/PRODOUTORAL. Pela bolsa de estudo durante o curso de doutorado, primordial para o bom andamento dos trabalhos. Agradecimentos especiais. (Anjos existem). Alexandra Estrela, por tudo que representou nesta jornada de trabalho, mesclando competência, seriedade, eficiência e acima de tudo amizade sincera. Pr. José Venâncio Filho e Maria Isaura Venâncio (Sogros), pelos joelhos dobrados em orações por nossa família. Aos amigos Eginaldes de Andrade Filho e Amarildo de Paula Coutinho. À minha cidade Alagoinha. Berço e inicio de tudo que conseguí em minha vida. À todos, (Amigos para sempre) que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. vii MENSAGEM Há cinco requisitos indispensáveis para o crescimento do homem: 1- ALIMENTO. O alimento espiritual é a Palavra de DEUS (Bíblia). Você deve ler, estudar, memorizar, pôr em prática e ouvir o ensino e a pregação da Palavra. 2- RESPIRAÇÃO. A respiração espiritual é a oração. Dedique tempo cada dia falando com DEUS sobre tudo que você faz; fale sobre suas necessidades e seus problemas, sobre sua família e seus amigos, e diga-LHE o quanto O ama e quão agradecido está. 3- EXERCÍCIO. O exercício espiritual é ajudar a outros, testificar, dar tempo e energia à obra de DEUS e ser um testemunho vivo ao mundo. 4- DESCANSO. O descanso espiritual é a adoração, tanto pública como privada. Descansar é esperar em DEUS e ter renovação física e espiritual. 5- HUMILDADE. Sejais sempre humilde e manso de coração, porque tão glorioso quanta a espada, é o arado humilde que rasga a terra. “DEUS, FONTE INESGOTÁVEL DE SABEDORIA E AMOR” viii SUMÁRIO Resumo Geral................................................................................................................... x General Abstract............................................................................................................ .xii Lista de Tabelas............................................................................................................. xiii Capitulo I - COMPORTAMENTO IN VITRO E PATOGENICIDADE DE ISOLADOS DE Fusarium gutiforme, EM ABACAXIZEIRO, ORIUNDOS DOS ESTADOS DA PARAÍBA, PERNAMBUCO E RIO GRANDE DO NORTE.......... 1 1. INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................. 2 2. Revisão de Literatura.................................................................................................... 5 2.1 Aspectos Gerais e Importância da Cultura................................................................ 5 2.1.1 O abacaxizeiro (Ananas comosus (L. Merril))........................................................ 5 2.1.2 Fusariose do abacaxizeiro, causada por Fusarium gutiforme ................................. 6 3. Referencias................................................................................................................... 8 Capítulo II- COMPORTAMENTO IN VITRO DE Fusarium gutiforme EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO..................................................... 14 Resumo........................................................................................................................... 15 Abstract .......................................................................................................................... 16 1. Introdução................................................................................................................... 17 2. Material e Métodos..................................................................................................... 19 2.1. Localização dos experimentos.................................................................................19 2.2. Crescimento micelial de Fusarium gutiforme in vitro............................................. 20 2.3. Esporulação de Fusarium gutiforme in vitro....................................................... 21 3. Resultados e Discussão................................................................................................... 22 ix 3.1. Crescimento micelial dos isolados de Fusarium gutiforme..................................... 22 3.2. Esporulação dos isolados de Fusarium gutiforme................................................... 25 4. Conclusões.................................................................................................................. 28 5. Referências................................................................................................................. 29 Capítulo III- AVALIAÇÃO DE SINTOMAS CAUSADOS POR Fusarium gutiforme EM FOLHAS “D” E RAÍZES DE ABACAXIZEIROS PÉROLA............................33 Resumo........................................................................................................................... 34 Abstract....................................................................................................................... 35 1. Introdução................................................................................................................... 36 2. Material e Métodos.................................................................................................. 38 2.1. Inoculação de F. gutiforme em folhas “D” de abacaxizeiro aderidas a planta mãe..38 2.2. Inoculação de Fusarium gutiforme em folhas “D” destacadas de plantas de abacaxizeiro cv. Pérola................................................................................................. 39 2.3. Inoculação de Fusarium gutiforme em raízes de mudas de abacaxizeiro ’Pérola’ em casa de vegetação.........................................................................................................................40 3. Resultados e Discussão............................................................................................. 42 4. Conclusões................................................................................................................. 48 5. Referências................................................................................................................ 49 x COUTINHO, O. L. Comportamento in vitro e patogenicidade de isolados de Fusarium gutiforme em abacaxizeiro, oriundos dos Estados da Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte. Areia 2010. 51 f. Tese (Doutorado em Agronomia) Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Paraíba. RESUMO GERAL O presente trabalho objetivou testar a patogenicidade de Fusarium gutiforme utilizando diferentes isolados e métodos de inoculação em plantas de abacaxizeiro ‘Pérola’ (Ananas comosus L.). Foram utilizados 20 isolados coletados de plantas de abacaxizeiro com sintomas típicos da fusariose em áreas produtoras nos estados da Paraíba, Rio Grande do Norte e Pernambuco. O material foi isolado em meio de cultura batatadextrose-ágar (BDA) e incubado a temperatura de 25±2°C e fotoperíodo de 12 horas durante sete dias. Para as avaliações in vitro do crescimento micelial e esporulação de F. gutiforme, os isolados foram plaqueados em meios: BDA, ADA (Aveia-dextroseágar), CDA (Cenoura-dextrose-ágar) e AbDA (Abacaxi-dextrose-ágar) em três regimes de luminosidade (Claro contínuo, Escuro contínuo, Alternância luminosa). O crescimento micelial foi avaliado durante sete dias através da medição das colônias em dois sentidos diametralmente opostos com auxílio de uma régua milimetrada. A contagem dos esporos foi feita através da adição de 20 mL de água destilada esterilizada (ADE) na placa contendo o fungo, seguida de raspagem com escova de cerdas macias e filtragem em dupla camada de gaze estéril. A contagem de esporos foi realizada em hemacitômetro. O delineamento experimental utilizado foi o DIC com arranjo fatorial de 4X3, sendo quatro meios de cultura e três regimes de luminosidade, aplicados a 20 tratamentos, com quatro repetições. Os testes de patogenicidade, em plantas de abacaxizeiro ‘Pérola’ foram realizados em casa de vegetação através de inoculação em folhas D, aderidas e destacadas da planta mãe e em raízes. Para inoculação em folhas D aderida a planta mãe, com auxílio de agulha estéril, foi realizada duas perfurações nas partes medianas e basais aclorofiladas com posterior pincelamento da suspensão de conídios (107 conídios/mL) dos isolados de F. gutiforme. No método de inoculação pelo sistema radicular, foram realizados ferimentos com bisturi seguida da imersão das raízes na suspensão de esporos. Esse procedimento foi realizado após retirada das plantas de seus respectivos vasos, sendo replantadas após a inoculação. Para controle, utilizaramse plantas não inoculadas. No método de inoculação em folhas D destacadas, as folhas foram retiradas das plantas, sendo desinfestadas e o procedimento de inoculação xi semelhante ao de folhas aderidas à planta mãe. As folhas foram acondicionadas em bandejas, em condições de câmara úmida, fechadas com filme plástico, mantidas a temperatura de 25 ± 2 oC e fotoperiodo de 12 horas. Os dados médios foram submetidos a análise estatística pelo Programa Computacional SISVAR e adequados a escala de notas que variou de zero a cinco. Os resultados demonstraram que, independente do meio de cultura, regime de luminosidade e método de inoculação, os isolados de F. gutiforme testados demonstraram patogenicidade às plantas de abacaxizeiro cv. Pérola, podendo ser utilizados em testes experimentais de avaliação de severidade. Palavras chave: patogenicidade. Ananas comosus. L., crescimento micelial, esporulação, xii COUTINHO, O. L. Behavior in vitro and isolated Pathogenicity of Fusarium gutiforme in pineapple plants, originating from Paraíba, Pernambuco and Rio Grande do Norte, Brazil. Areia, 2010. 51 f. Thesis (Doctorate in Agronomy) Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Paraíba. GENERAL ABSTRACT The present work had as objective to test Fusarium gutiforme pathogenicity using different isolates and inoculation methods in pineapple plants cultivar Pérola (Ananas comosus L.). It was used 20 isolates collected from pineapple plants with disease typical symptoms from production fields in Paraíba, Rio Grande do Norte and Pernambuco, Brazil. The material was incubating in PDA medium at 25±2°C and photoperiod of 12 hours during seven days. For in vitro evaluations of mycelia growth and sporulation of F. guttiforme, isolates were incubated on media PDA, ODA (Oat-dextrose-agar), CDA (Carrot-dextrose-agar) e AbDA (Pineapple-dextrose-agar) in three light regimes (continuous light, continuous dark and alternance light). The mycelia growth was evaluated during seven days by colony growth measured with millimeter rule. The spores counting was done by addition of 20 mL of sterilized distilled water on Petri dish with fungus, and rasped with soft brush plus filtrate in double gauze layer. The spores counting were done with hemacytometer. The experimental design was completely randomized with factorial arrangement 4x3, with four culture media ant three light regimes, on 20 treatments with four replications. Pathogenicity tests were realized in greenroom by inoculation in D leafs, attached and separated to mother plant and in roots. For inoculation in leafs attached to mother plant was used needle sterilized, and was done two perfurations on media and basal clorofiled parts with posterior painting of conidia suspension (107 conidia/mL) of F. gutiforme isolates. In inoculation method on roots were realized wounds with needle and immersion in conidia suspension. This procedure was done after remove plants from vases, being replanted after inoculation. For control treatment it was used non inoculated plants. In inoculation of leafs detached of mother plant, leafs were disinfested and inoculation method was similar leafs attached mother plant. Leafs were incubated in trays, in humid chamber conditions, closed with plastic film, and maintained at 25 ± 2 oC and photoperiod of 12 hours. The data were analysed by Compute Program SISVAR and measured by severity índex disease, varying in 0 to 5. The results demonstrated that, independent of culture media, light regime and inoculation method, all isolates of F. gutiforme showed mycelia growth, sporulation and pathogenicity on tested conditions in pineapple plants cultivar Pérola, being recommended for experimental tests for severity evaluations. xiii Key words: Ananas comosus L., mycelia growth, sporulation, pathogenicity. LISTA DE TABELAS CAPÍTULO II TABELA 1. Origem dos isolados de Fusarium gutiforme obtidos de plantas de abacaxizeiro, cv. Pérola com seus respectivos pontos de coletas....................................19 TABELA 2. Médias referentes a interação Isolados, Meios de culturas, Regimes de luminosidade para crescimento micelial de Fusarium gutiforme....................................23 TABELA 3. Médias, referentes a interação Isolados, Meios de cultura, Regimes de luminosidade para esporulação de Fusarium gutiforme..................................................26 CAPÍTULO III TABELA 01. Origem dos isolados de Fusarium gutiforme com suas respectivas localidades e pontos de coletas........................................................................................38 TABELA 02. Patogenicidade de Fusarium gutiforme inoculadas em folhas D de abacaxizeiro cv. Pérola, aderidas a planta mãe...............................................................43 TABELA 03. Patogenicidade de Fusarium gutiforme inoculadas em folhas D destacadas de abacaxizeiro cv. Pérola.............................................................................44 TABELA 04. Patogenicidade de Fusarium. gutiforme inoculadas por imersão via radicular de mudas de abacaxizeiro cv. Pérola................................................................46 1 COMPORTAMENTO IN VITRO E PATOGENICIDADE DE ISOLADOS DE Fusarium gutiforme EM ABACAXIZEIRO, ORIUNDOS DOS ESTADOS DA PARAÍBA, PERNAMBUCO E RIO GRANDE DO NORTE CAPÍTULO 1 2 1. INTRODUÇÃO GERAL Originário da América Latina, mais precisamente Brasil e Paraguai, o abacaxizeiro (Ananas comosus (L.) Merril) pertencente à família das Bromeliáceas, destaca-se economicamente por ser o mais importante representante do gênero Ananas. É classificado botanicamente como uma infrutescência, da classe das monocotiledôneas (MARIN et al., 2008). Estudos de distribuição do gênero indicam que o seu centro de origem é a região Amazônica compreendida entre 10ºN e 10ºS de latitude e entre 55ºL e 75ºW de longitude, por se encontrar o maior número de espécies reconhecidas até o momento. Assim, a região Norte do Brasil pode ser considerada um segundo centro de diversificação desse gênero (SOUZA, et al., 2002). No Brasil, a cultura do abacaxizeiro tem desempenhado importante papel econômico e social como geradora de emprego e renda, além de contribuir para a manutenção do homem no campo, evitando assim, o êxodo rural para os grandes centros urbanos (MATOS e REINHARDT, 2007). Esta frutífera encontra condições ecológicas favoráveis à sua exploração na maior parte do território nacional, desde a região Norte, Nordeste até a porção setentrional da região Sul, incluindo áreas de Santa Catarina, Paraná e Rio Grande do Sul não sujeitas a geadas (LIMA et al, 2001). A FAO (2005) apontava o Brasil como terceiro maior produtor mundial de frutas, com uma produção estimada de 43 milhões de toneladas, correspondendo a uma participação de 7,9% do total produzido no cenário mundial. Cunha et al., (2007) relataram o Brasil como maior produtor mundial de abacaxi, com 61.790 ha plantados, uma produção de mais de dois milhões de toneladas de frutos e produtividade de 27.329 kg/ha. O Brasil participa timidamente do comércio internacional, apesar de ser o terceiro produtor mundial de frutas frescas (EMBRAPA , 2007). Em 2007 a abacaxicultura paraibana destacava-se no cenário nacional não só por tratar de um fruto com grandes qualidades nutricionais e organolépticas, mas também por sua rentabilidade e produtividade. Apresentava uma área plantada de 11.466 hectares com produção de 514.936 toneladas de frutos, sendo o segundo maior produtor de abacaxi no Brasil, perdendo apenas para o estado do Pará (CUNHA et al., 2007). Oficialmente o município maior produtor de abacaxizeiro da Paraíba é Santa Rita com 3 mais de três mil hectares de plantio, e uma produção esperada de cerca de 90 milhões de frutos. (GOVERNO DA PARAÍBA, 2008). Segundo o IBGE (2008) o Brasil produziu 1.712.365 frutos de abacaxi em 2008. Deste total, 787.966 foram produzidos no Nordeste, participando o estado da Paraíba com 45% desta produção, em seguida os estados da Bahia e do Ceará, com 22,3% e 13,2%, respectivamente. O Brasil, com uma produção superior a 1.700.000 toneladas destacou-se como o maior produtor de abacaxi da América do Sul. A produção está distribuída principalmente nas regiões Nordeste (40,2%) e Sudeste (28,92%). A cultivar Pérola é a mais plantada comercialmente no Brasil. Sendo este um fruto largamente produzido no estado da Paraíba e considerado de alta qualidade pelos mercados do Sul e Sudeste do Brasil, mostrando-se também, com potencial de exportação para países da América Latina. Por encontrar excelentes condições para seu desenvolvimento e produção, vem sendo cultivada em quase todos os estados brasileiros (MARTINS et al., 2007). Para a Embrapa/Centro Nacional de Pesquisa de Mandioca e Fruticultura (1991) na Paraíba o clima é fator favorável a produção de abacaxi de ótima qualidade, devido a fatores como temperatura (22 a 32ºC) durante todo o ano, insolação (2.500 a 3.000 horas/ano), e umidade relativa do ar, com média anual, acima de 70%, com reduzidas oscilações. A colheita do abacaxi paraibano concentra-se ao longo de todo o ano, entretanto de Janeiro a Junho, a Paraíba colhe apenas 24,66% da sua produção, ficando os 75,34% restantes de sua colheita para os meses subseqüentes (CARVALHO et al., 2007). Dentre os principais problemas fitossanitários que acometem a cultura do abacaxizeiro, a fusariose é a doença que causa maiores prejuízos econômicos aos produtores, uma vez que as perdas podem atingir até 100% da produção. Os sintomas mais característicos da doença são alterações morfológicas, bem como exsudação de goma ou resina, daí a doença ser conhecida, inicialmente, por gomose (PISSARRA et al., 1979). O agente etiológico é o fungo Fusarium gutiforme Nirenberg & O'Donnell que apresenta especificidade para o abacaxizeiro (VENTURA et al., 1993a,b; VENTURA et al., 1994; VENTURA, 1996; LIMA et al, 2001; MATOS e REINHARDT, 2007; OLIVEIRA e NASCIMENTO, 2009). A fusariose foi relatada pela primeira vez por Kimati e Tokeshi (1964) no estado de São Paulo em frutos da cultivar ‘Smooth Cayenne’, disseminando-se por todo o país e em alguns países da América Latina. No Brasil, as duas cultivares mais plantadas, 4 Pérola e Smooth Cayenne são suscetíveis à doença, constituindo-se de uma base genética bastante estreita, dificultando os programas de melhoramento (SANTOS, 2000). Para efetivo controle deve-se eliminar os restos culturais da safra anterior (incorporação no solo ou queima); utilizar mudas sadias; durante o cultivo, identificar plantas doentes, eliminá-las e pulverizar as inflorescências desde o seu aparecimento no olho da planta até o fechamento das últimas flores com fungicida à base de benzimidazol (VENTURA e COSTA, 2006). Na fusariose, a identificação e determinação das respostas de defesa contra o F. gutiforme, é uma prática comum para entender a relação existente entre planta e o patógeno, viabilizando o estabelecimento de estratégias de controle, prevenindo assim perdas econômicas posteriores (ZORZAL, 2008). As mudas são infectadas, geralmente na fase inicial de desenvolvimento, quando ainda estão aderidas à planta-mãe que apresenta frutos doentes. É pouco perceptível nos estádios iniciais da doença, porém, como o fungo sobrevive em mudas e plantas, o conhecimento dos sintomas nas mesmas possibilita a eliminação de importantes fontes de inóculo (VENTURA e ZAMBOLIM, 2002; VENTURA e COSTA, 2006). Face ao exposto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o comportamento in vitro e a patogenicidade de 20 isolados de F. gutiforme em abacaxizeiro cv. Pérola, obtidos de materiais coletados em municípios dos estados da Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte. 5 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Aspectos gerais e importância da cultura 2.1.1. O abacaxizeiro (Ananas comosus (L.) Merril) O gênero Ananas é amplamente distribuído em regiões tropicais principalmente a espécie Ananas comosus (L.) Merril, que abrange todas as cultivares plantadas de abacaxizeiro, constituindo-se em uma das fruteiras tropicais mais cultivadas no país. É uma planta terrestre, perene, monocotiledônea onde o processo de florescimento é desuniforme, comprometendo a regularidade da produção e podendo resultar em frutos não enquadrados no padrão comercial (VAILLANT et al., 2001). O abacaxizeiro é uma planta que apresenta folhas dispostas em espiral em torno de uma haste central, internamente apresentam a forma de calha, que propiciam a condução de água para a base, com ângulos que definem o tipo da folha, como por exemplo, 45 graus, que determina as folhas “D”. As folhas são revestidas por uma camada de cutícula e tricomas, os estômatos encontram-se na parte inferior, esses tem a função de absolver água e nutrientes, refletir luz e proteger as folhas contra a desidratação causada pelas altas temperaturas. Na disposição foliar do abacaxizeiro destaca-se a folha D, por ser a principal folha desta planta, com disposição em um ângulo de 45º do eixo central da planta (PY et al., 1984). O caule é matéria prima para a indústria de alimentos e para a obtenção de álcool etílico e gomas, além de propagarem vegetativamente mudas. O restante do abacaxizeiro pode ser usado na alimentação animal, como material fresco ou ensilado. (MEDINA et al., 1987). Sua haste quando de uma planta adulta pesa de 400 a 500 gramas. O caule armazena os produtos elaborados pelas folhas, que podem ser utilizadas a qualquer tempo, esta é dividida em internódios, com gemas localizadas nas cicatrizes deixadas pelas folhas no seu ponto de inserção. Das gemas nascem os rebentos que garantem a perpetuação da espécie. As raízes são profundas, porém de pequena dimensão e pouco resistentes, encontrando-se a maioria na faixa de 15cm de profundidade (SIMÃO, 1998). O fruto é normalmente cilíndrico ou ligeiramente cônico, constituído por 100 a 200 pequenas bagas ou frutilhos fundidos entre si sobre o eixo central ou coração que é 6 a continuação do pedúnculo fibroso (VILAR, 2000). A polpa do fruto apresenta as cores branca, amarela ou laranja-avermelhada, sendo o peso médio dos frutos de um quilo, dos quais 25% são representados pela coroa. Este é consumido ao natural, ou na forma de sorvetes, doces, picolés, refrescos e sucos caseiros (GRANADA et al., 2004). As variedades de abacaxi mais conhecidas foram classificadas em cinco grupos distintos: Cayenne, Spanish, Queen, Pérola e Perolera, de acordo com um conjunto de caracteres comuns, relativos ao porte da planta, forma do fruto e características morfológicas das folhas (EPSTEIN, 1999). Estima-se que cerca de 70% da produção mundial de abacaxi provém de Smooth Cayenne. No Brasil e em outros países da América Latina, ocorrem diversas variedades locais e populações silvestres de abacaxi pertencentes ao gênero Ananas e alguns desses materiais podem ser recomendados diretamente como variedades ou utilizados em programas de melhoramento genético, uma vez caracterizados e avaliados adequadamente (CABRAL et al., 2008). . 2.1.2. Fusariose do Abacaxizeiro, causada por Fusarium gutiforme O abacaxizeiro tem sido infectado por vários patógenos que apresentam influência negativa na produtividade e na qualidade dos frutos (SOUZA et al., 2002). A fusariose é o principal problema da cultura, infectando mudas, durante o crescimento, período de florescência, e até mesmo, durante o ciclo produtivo. As perdas são estimadas em 30 a 40% nos frutos e em até 20% nas mudas (CUNHA, 2007), podendo atingir até 100% da produção (VENTURA e ZAMBOLIM, 2002; VENTURA et al., 2007). O gênero Fusarium é bem heterogêneo, e apresenta uma ampla distribuição geográfica incluindo, assim, muitas espécies identificadas pelas características morfológicas. F. gutiforme, antes denominado de F. moniliforme Sheldon var. subglutinans, foi estabelecido como uma espécie independente por apresentar características morfológicas estáveis e suficientes para tanto (MORAIS et al., 2003). Em meio batata-dextrose-ágar, F. gutiforme apresenta inicialmente um micélio branco, que passa a róseo alaranjado, alcançando, algumas vezes, a coloração violeta. Dois tipos de esporos são produzidos: os microconídios e os macroconídios, entretanto as características principais deste patógeno são a produção de microconídios em polifiálides, sempre em falsas cabeças e ausência de clamidósporos (MELLO, 2001). 7 O patógeno incita lesões nos tecidos afetados, com exsudação de uma substância gomosa (FISHER et al., 2006). Alves (2006) esclarece que F. gutiforme por não produzir clamidósporos, apresenta baixa capacidade competitiva, não sobrevivendo no solo por longos períodos. Mudas infectadas e enterradas perdem a capacidade de servir como fonte de inóculo, após quatro a seis semanas, contudo, o patógeno pode sobreviver, como epífita, em folhas de plantas invasoras. Para Weber et al, (2003) as mudas constituem a principal fonte de disseminação dessa doença. Segundo Geiser et al., (2004) inúmeros fatores, incluindo a perda da distinção das espécies através de características morfológicas, levam a conceitos que são amplos e justamente com a variação e mutação dentro da cultura, tem conspirado para criar um sistema taxonômico que não reflete a diversidade das espécies. Isto tem gerado resultados contraditórios na aplicação de nomes de espécies para isolados patogênicos e toxogênicos. Devido a plasticidade e variações de características fenotípicas encontradas nestes fungos, a taxonomia baseada somente em conceitos morfológicos não é confiável (SUMMERELL e LESLIE, 2003). Oliveira e Costa, (2004) destacam que o gênero ainda apresenta uma série de variações de características morfológicas e patogênicas, resultando em uma classificação complexa dividida em seções, forma specialis e raças. O conceito forma specialis (f. sp.), foi aplicado por Snyder e Hansen, (1953) para reconhecer isolados patogênicos que foram morfologicamente semelhantes à isolados saprofíticos da mesma espécie, mas que diferenciam em sua habilidade para parasitar hospedeiros específicos. 8 3. REFERÊNCIAS ALVES, G. A. R. Sobrevivência de Fusarium subglutinans f. sp. ananas em solos de diferentes procedências e incorporação de matéria orgânica. 2006. 58f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) - Universidade Federal Rural da Amazônia, Belém, PA 2006. CABRAL, J. R. S.; MATOS, A.P. de; LANGE, A. 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COMPORTAMENTO IN VITRO DE Fusarium gutiforme EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO RESUMO Para a abacaxicultura, algumas doenças fúngicas podem causar prejuízos de quase 100% da produção e a fusariose causada por Fusarium gutiforme destaca-se por sua agressividade e susceptibilidade nas variedades comerciais. Este trabalho objetivou avaliar in vitro o comportamento de 20 isolados de F. gutiforme mediante avaliação do crescimento micelial e esporulação em placas de Petri, usando quatro diferentes meios de cultura: BDA (Batata-Dextrose-Ágar), CDA (Cenoura-dextrose-ágar), AbDA (Abacaxi-dextrose-ágar) e ADA (Aveia-dextrose-ágar), sob três regimes de luminosidade (Claro contínuo, Escuro contínuo e Alternância luminosa). Em meio BDA, foi realizado o isolamento do fungo a partir de partes de plantas de abacaxizeiro com sintomatologia típica da fusariose. As placas foram mantidas durante sete dias a 25±2°C e luminosidade natural. A avaliação do crescimento micelial foi realizada com régua milimetrada em dois sentidos diametralmente opostos. O delineamento experimental utilizado foi o DIC com arranjo fatorial de 4X3, sendo quatro meios de cultura e três regimes de luminosidade, aplicados a 20 tratamentos, composto pelos isolados, com quatro repetições. Para avaliação de esporulação, após o sétimo dia de crescimento, as colônias fúngicas foram removidas com escova de cerdas macias, após o acréscimo de 20mL de ADE e filtradas em dupla camada de gaze esterilizada obtendo-se uma suspensão de conídios mensurada em hemacitômetro para 107 conídios/mL. Dos 20 isolados testados, pode-se afirmar que ocorreram diferenças significativas, em relação ao crescimento micelial, bem como, quanto à esporulação de F. gutiforme. Os isolados 1SO05, 1SO07, 1SO08, 1SO15, 1SO16, 1SO18 e 1SO20 apresentaram maior crescimento micelial na interação regime de luz e meio. Os 1SO12, 1SO14 e 1SO19 apresentaram menores crescimentos para a referida interação. Os isolados 1SO07 e 1SO15 obtiveram maior esporulação na interação regime de luz e meio, enquanto 1SO19 e 1SO20 apresentaram menores crescimentos para a referida interação. Palavras chave: Fusariose, crescimento micelial, esporulação 16 COUTINHO, O. L. In vitro Behavior of Fusarium gutiforme in different incubation conditions. Second chapter, Areia 2010. 51 f. Thesis (Doctorate in Agronomy) Centro de Ciências Agrárias. Universidade Federal da Paraíba. IN VITRO BEHAVIOR OF Fusarium. gutiforme UNDER DIFFERENT INCUBATION CONDITIONS ABSTRACT Some fungal diseases can cause near 100% loss on pineapple crop. Fusarium wilt caused by Fusarium gutiforme stands out for its aggressiveness and the susceptibility to this pathogen among commercial varieties. This study aimed to evaluate the in vitro behavior of 20 F. gutiforme isolates by measuring mycelial growth and sporulation in four different culture media: PDA (Potato Dextrose Agar), CDA (carrot-dextrose agar), ABDA (Pineapple-dextrose agar ), and ADA (Oats dextrose agar), under three light conditions (continuous light, continuous dark, and alternating light), using Petri dishes. Fungal isolation was carried out on PDA from pineapple plant parts with symptoms typical of the disease. The plates were kept for seven days at 25 ± 2 ° C under natural light. Evaluation of mycelial growth was performed with a ruler on two diametrically opposite directions. The experimental design was a completely randomized with factorial arrangement of 4X3, with four media and three light regimes, applied to 20 treatments, which consisted of fungal isolates and four replications. Fungal sporulation was accessed after the seventh day by removing the colonies with a soft brush. Twenty milliliters of ADE was added to the preparation and filtered through a double layer of sterile gauze. The obtained conidia suspension was adjusted to a concentration of 107 conidia/mL using a hemacytometer. Evaluation of the 20 isolates showed that there were significant differences in relation to mycelial growth, as well as on the sporulation of F. gutiforme. The isolates 1SO05, 1SO07, 1SO08, 1SO15, 1SO16, 1SO18, and 1SO20 exhibited higher mycelial growth associated to the interaction between light and medium. Isolates 1SO12, 1SO14, and 1SO19 exhibited lower mycelial growth for the same interaction. Isolates 1SO07 and 1SO15 exhibited higher sporulation under the interaction light and medium, while isolates 1SO19 and 1SO20 showed lower rates for the same interaction. Key words: Fusariosis, mycelia growth, sporulation 17 1. INTRODUÇÃO O fungo causador da fusariose ou gomose do abacaxizeiro, Fusarium gutiforme, é a principal limitação fitossanitária na produção de abacaxi no Brasil, pois causa perdas, antes da fase de frutificação, além de ser constatada em todos os Estados produtores de abacaxi do Brasil (RUGGIERO et al., 1994). A doença, relatada pela primeira vez por Kimati e Tokeshi (1964) no estado de São Paulo, em frutos da cultivar Smooth Cayenne, encontra-se disseminada por todo o país e em alguns países da América Latina (PISSARRA et al., 1979). Este fungo pertence à família Tuberculariaceae, capaz de sobreviver por longos períodos de tempo no solo, em restos culturais e se disseminar através de propágulos (macro e microconídios), de vetores físicos (vento e água de irrigação) e de vetores biológicos (homem, insetos e mudas contaminadas) (BERGAMIN FILHO et al., 1995). Essa doença causa prejuízos devido à infecção das mudas, morte do abacaxizeiro no campo, infecção das inflorescências e frutos, que perdem seu valor comercial, resultando perdas elevadas na produção. O principal sintoma da fusariose em plantas ou em mudas é a exsudação de goma a partir da região infectada, cuja lesão se localiza no caule, progredindo para a base da folha, ficando restrita à região aclorofilada da mesma (LIMA et al., 2001; SANTOS et al., 2002; FISHER et al., 2006). É importante enfatizar a importância de se verificar diferentes isolados e determinar suas diferenças de comportamento quando cultivados in vitro, visto que a atividade destes pode mostrar-se diferenciada devido à localização e influência ambiental, as quais as plantas coletadas estão submetidas, além de outros fatores como variação genética, utilização de diferentes métodos de inoculação e meios utilizados, pH e a temperatura, obviamente, o uso de diferentes concentrações pode interferir na variação de resultados obtidos em diferentes experimentos (RANGANATHAN e BALAJEE, 2000). O aumento ou diminuição no crescimento micelial in vitro de determinados fungos fitopatogênicos pode ser resultado de mecanismos diretos ou indiretos da ação destes, tais como produção e liberação de metabólitos secundários, agindo na disponibilidade e absorção ou na supressão de nutrientes (GOES e KIMATI, 1990; RUGIERO et al., 1994; JAGADEESH et al., 2006; EGAMBERDIEVA et al., 2008). Dessa forma, o objetivo geral do presente trabalho foi avaliar o comportamento in vitro para crescimento micelial e esporulação em diferentes condições de incubação, 18 de 20 isolados de F. gutiforme obtidos de abacaxizeiro, coletados em municípios dos estados da Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte. 19 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Localização dos experimentos Os isolados de F. gutiforme foram obtidos de materiais coletados em diferentes campos de produção comercial nos Estados da Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte (Tabela 01) a partir de plantas de abacaxizeiro com sintomas típicos da fusariose, caracterizados pela presença de áreas necrosadas e de resina em folhas, mudas e frutos. TABELA 01. Origem dos isolados de Fusarium gutiforme obtidos de plantas de abacaxizeiro, cv. Pérola, com seus respectivos pontos de coleta ISOLADOS 1SO01 1SO02 1SO03 1SO04 1SO05 ISO06 1SO07 1SO08 1SO09 1SO10 1SO11 1SO12 1SO13 1SO14 1SO15 1SO16 1SO17 1SO18 1SO19 1SO20 LOCAL Guarabira-PB I Guarabira-PB II Itapororoca-PB I Itapororoca-PB II Rio Tinto-PB I Rio Tinto-PB II Pedras Fogo-PB I Pedras Fogo-PB II Araçagí-PB Conde-PB Alhandra-PB Espirito Santo-PB Santa Rita-PB Mamanguape-PB Juripiranga-PB Itambé-PE Pombos-PE Touros-RN Sapé-PB Marí-PB PONTO DE COLETA Sitio Canafistula Sitio São Gonçalo Sitio Jacoca Sitio Refúgio Sitio Camparte Sitio Cacimbão Sitio Açude Novo Sitio Taquari Faz. Redenção Sitio Boa Água Sitio Oh! Glória Sitio Jurema Faz. Zé Queiroga Sitio Pitombeira Sitio Salgado Faz. Maringá Sitio Pombos Faz. Potiguara Sitio Meu Destino Faz. Unção O material coletado foi encaminhado ao Laboratório de Fitopatologia, do Centro de Ciências Agrárias, da Universidade Federal da Paraíba, Campus II, Areia-PB. Para realizar procedimentos de pré-lavagem e desinfestação, obedecendo aos padrões de assepsia. A identificação do fungo realizou-se com auxilio de microscópio óptico e estereoscópico, através das observações de estruturas macro e micromorfológicas como micélio, conídios e esporos, confrontando-as com as descrições da literatura micológica 20 e fitopatológica especializada (BISBY et al., 2006; LESLIE et al., 2006; LIMA et al., 2001). 2.2. Crescimento micelial de Fusarium gutiforme in vitro Em câmara de fluxo laminar, a partir de placas puras dos 20 isolados de F.gutiforme, foram retirados individualmente, discos com 5mm de diâmetro, para inoculação nos meios BDA (batata-dextrose-ágar); CDA (cenoura-dextrose-ágar), AbDA (folhas de abacaxi-dextrose-ágar), ADA (aveia-dextrose-ágar). Cada meio foi composto por 200g de cada espécie vegetal, 17g de ágar, 20g de dextrose e o volume completado para 1000 mL de água destilada esterilizada (ADE), com pH ajustado para 6,2 vertidos para placas de Petri, com diâmetro de 9cm, e incubados em três diferentes regimes de luminosidade: Claro contínuo, Escuro contínuo e Alternância luminosa. As placas contendo os discos permaneceram por oito dias em sala de incubação a 25±2°C e fotoperíodo de 12 horas, para avaliação do crescimento micelial. A avaliação foi realizada no oitavo dia, mediante o uso de uma régua milimetrada, com mensurações diametralmente opostas, sendo aferida a média, para determinação do crescimento. O delineamento estatístico utilizado foi DIC (Delineamento Inteiramente Casualisado) com 20 tratamentos e quatro repetições (placas contendo o fungo) em arranjo fatorial 20 X 4 X 3 (vinte isolados, quatro meios de cultura BDA, CDA, AbDA, ADA e três regimes de luminosidade: Luz continua, Escuro continuo, Alternância luminosa) totalizando 240 tratamentos. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott a 1% de probabilidade (FERREIRA, 2000; SISVAR 5.1 2007). 2.3. Esporulação de Fusarium gutiforme in vitro Para a quantificação do número de esporos produzidos pelos 20 isolados de F. gutiforme, foram utilizadas colônias puras do fungo em quatro diferentes meios de culturas e três regimes de luminosidade, à 25+ 2ºC. Aos oito dias da incubação foi avaliada a produção de conídios. A suspensão foi obtida pela adição de 20 mL de ADE às placas de petri e raspagem da colônia com 21 escova de cerdas macias. A filtragem da suspensão deu-se por intermédio de uma camada dupla de gaze estéril, sendo determinada a quantidade de esporos em hemacitômetro, executando-se uma média de cinco leituras para cada repetição dos tratamentos. O delineamento experimental utilizado foi o DIC em arranjo fatorial de 20 X 4 X 3, com 20 isolados, quatro meios de culturas e três regimes de luminosidade, com 4 repetições para cada isolado do patógeno, totalizando 240 tratamentos. As médias foram comparadas pelo teste de Scott-Knott a 1% de probabilidade (FERREIRA, 2000; SISVAR 5.1 2007). 22 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Crescimento micelial dos isolados Diante dos resultados obtidos neste trabalho e expressados na Tabela 02 pode-se afirmar que ocorreram variações significativas quanto a interação Isolados, Meios de cultura e Regimes de luminosidade para crescimento micelial de Fusarium gutiforme. Os isolados 1SO05, 1SO07, 1SO08, 1SO15, 1SO16, 1SO18 e 1SO20 obtiveram maior crescimento micelial na interação regime de luz e meio; Os 1SO12, 1SO14 e 1SO19 apresentaram menores crescimentos para a referida interação (Tabela 02). Observou-se o crescimento micelial semelhante nos meios de cultura de acordo com o regime de luz, sendo o regime claro contínuo e alternado no meio BDA que favoreceu maior diferenciação nos isolados. No meio CDA, maior variação ocorreu no regime de luz alternada, assim como no meio AbDA nos regimes de luz claro e alternado. Para meio ADA, a exceção do 1SO019, não houve diferença de crescimento micelial no regime de luz alternada (Tabela 02). No regime de luz claro contínuo não ocorreu interferência dos meios no crescimento dos isolados (1SO05, ISO6, 1SO07, 1SO08, 1SO15, 1SO16, 1SO18 e 1SO20). Para escuro contínuo não observou-se interferência dos meios nos isolados ISO02, 1SO05, 1SO07, 1SO08, 1SO10, 1SO15, 1SO16, 1SO17, 1SO18, 1SO19 e 1SO20 e sob regime de luz alternada nos isolados 1SO01, 1SO05, ISO6, 1SO07, 1SO08, 1SO11, 1SO15, 1SO16, 1SO17, 1SO18 e 1SO20 (Tabela 02). 23 Tabela 02. Médias referentes a regimes de luz/isolados/meios de culturas para o oitavo dia de crescimento micelial de Fusarium gutiforme in vitro Luz Iso\Meio* ISO01 ISO02 ISO03 ISO04 ISO05 ISO06 ISO07 ISO08 ISO09 ISO10 ISO11 ISO12 ISO13 ISO14 ISO15 ISO16 ISO17 ISO18 ISO19 ISO20 BDA 8,05Bbα 7,98Bbα 5,43Dcβ 8,18Bbβ 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 5,08Dcγ 8,28Bbβ 8,98Aaα 3,98Ecβ 7,80Bbα 6,20Ccα 9,00Aaα 9,00Aaα 7,73Bbβ 9,00Aaα 4,33Ebα 9,00Aaα Claro CDA 8,45Baα 9,00Aaα 7,29Cbβ 9,00Aaα 8,95Aaα 8,18Bbα 9,00Aaα 9,00Aaα 7,63Cbβ 8,88Aaα 9,00Aaα 6,60Dbα 9,00Aaα 8,20Bbα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 5,40Daα 8,88Aaα Escuro AbDA ADA BDA CDA 6,83Bcγ 8,63Aaα 8,14Bbα 8,88Aaα 5,68Ccγ 8,53Aaα 8,34Bbα 9,00Aaα 8,89Aaα 3,89Edβ 7,29Cbα 8,95Aaα 9,00Aaα 6,83Bcβ 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 8,95Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 7,95Bbβ 8,35Bbα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 8,95Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 4,98Ccβ 8,08Bbβ 8,95Aaα 9,00Aaα 8,90Aaα 8,95Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 6,68Bbβ 9,00Aaα 9,00Aaα 8,60Aaα 3,00Fdγ 4,85Fbα 6,98Caα 9,00Aaα 6,45Bcβ 5,68Ebβ 8,13Baβ 5,23Cdβ 8,80Aaα 6,65Dbα 7,13Cbγ 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 5,68Caα 4,38Dbβ 4,53Fbα 5,15Daα 8,95Aaα 9,00Aaα 8,75Aaα 8,75Aaα AbDA ADA BDA 8,05Bbβ 9,00Aaα 8,13Bbα 7,85Bcα 8,60Baα 8,48Bbα 6,53Dcγ 3,85Ddβ 4,28Dcγ 7,25Cbβ 8,88Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 8,65Aaα 9,00Aaα 8,95Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 8,78Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 5,90Ecγ 9,00Aaα 9,00Aaα 8,70Aaα 9,00Aaα 8,30Bbβ 8,13Bbβ 9,00Aaα 9,00Aaα 4,10Gcβ 4,00Dcβ 4,40Dcβ 5,15Fcβ 4,08Ddγ 3,68Ebγ 5,93Ecα 8,23Baβ 6,68Ccα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 4,03Gcα 4,95Caα 4,38Dbα 8,98Aaα 8,98Aaα 9,00Aaα Alternada CDA 8,36Bbα 8,41Bbβ 4,69Ecγ 7,25Cbβ 9,00Aaα 8,65Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 8,85Aaα 9,00Aaα 4,40Ecβ 8,88Aaα 7,65Cbβ 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 5,45Daα 8,90Aaα AbDA 8,95Aaα 7,03Dcβ 8,01Bbβ 8,55Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aa α 8,90Aaα 8,20Bbβ 9,00Aa α 9,00Aaα 7,60Cbβ 9,00Aaα 5,95Edα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 4,80Fbβ 8,58Aaα CV (%) = 4,2 Médias seguidas de mesma letra minúsculas na coluna em cada isolado, assim como seguidas de mesma letra maiúscula na linha em cada meio de cultura e gregas em cada regime de luz na linha não diferem a 5% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott. *BDA= batata-dextrose-ágar; ADA= aveia-dextrose-ágar; CDA= cenoura-dextrose-ágar; AbDA= abacaxi-dextrose-ágar. ADA 8,95Aaα 8,93Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 8,95Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 8,93Aaα 9,00Aaα 8,91Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 9,00Aaα 5,26Baα 9,00Aaα 24 Silva et al., (2009) avaliando crescimento micelial e esporulação de Myrothecium roridum testados em dez meios de cultura: BTDA (beterraba-dextrose-ágar); RDA (rama de melão-dextrose-ágar); PA10 (polpa de melão com °Brix=10 ágar); ETDA (extrato de tomate-dextrose-ágar); CMDA (casca de melão-dextrose-ágar); CA (cenoura-ágar); PA04 (polpa de melão com °Brix= 04 ágar); IDA (inhame-dextroseágar); FMDA (folha de melão-dextrose-ágar); e BDA (batata-dextrose-ágar) como testemunha, não observou diferenças significativas em nenhum dos meios testados quanto ao crescimento micelial, diferentemente dos resultados obtidos no presente trabalho onde os meios de culturas e regimes de luminosidade exerceram influência entre os isolados quanto a crescimento micelial e esporulação. Costa et al., (2009) estudando o crescimento micelial de F. gutiforme em diferentes temperaturas e fotoperiodo de 12 horas, constatou que à medida em que se aumentava a temperatura, diminuía o índice médio de crescimento deste fungo, sendo a temperatura de 25°C a ideal para seu desenvolvimento, a mesma temperatura estudada no presente trabalho. Paludo et al., (2009) constataram que Cercospora beticola e Mycosphaerella fragariae sob claro contínuo e escuro, em meio de cultura BDA, o crescimento micelial não apresentou diferenças significativas entre os tratamentos. Os resultados do presente trabalho mostraram-se diferentes uma vez que ocorreu formação de crescimento micelial semelhante nos meios de cultura de acordo com o regime de luz, sendo o regime claro contínuo e alternado no meio BDA que favoreceu maior diferenciação nos isolados. Moraes et al., (2003) verificando o efeito da luz sobre o crescimento micelial de F. moniliforme em meio de cultura contendo fungicidas, pode constatar que dos regimes de luminosidade avaliados: escuro contínuo, luz branca e luz próxima da ultra violeta (12h de luz/12 de escuro), o crescimento do fungo ficou em torno de 63% mostrando uma média eficiência deste fungo em relação aos regimes de luminosidade, quando trabalhado em regime de luz branca. Todos os substratos utilizados neste trabalho favoreceram o crescimento micelial de F. gutiforme constatando-se variações de coloração nas colônias (variando do branco, alaranjado, violeta e marrom) de acordo com o meio de cultura e regime de luminosidade. 25 Uma cultura de Fusarium pode mudar sua morfologia gradualmente ou ainda produzir repentinamente setores de crescimento radicalmente na aparência do parental. Essa variabilidade morfológica tem gerado controvérsias na taxonomia e classificação das espécies de Fusarium. (PUHALLA, 1981; OLIVEIRA e COSTA, 2002; GEISER, et al., 2004) Segundo Sanabria, et al., (2002); Geiser et al., (2004); Leslie, et al., (2006), inúmeros fatores incluindo a perda da clara distinção das espécies através de características morfológicas, levando a conceitos que são amplos e juntamente com a variação e mutação dentro de uma cultura não reflete a diversidade das espécies. Muitos isolados de Fusarium estudados por taxonomistas e fitopatologistas foram identificados incorretamente usando simplificados sistemas morfológicos. Espécies que a pouco tempo foram identificadas usando métodos filogenéticos, certamente não seriam se fossem utilizados os métodos convencionais de características morfológicas. (AOKI, et al., 2003) 3.2. Esporulação dos isolados de Fusarium gutiforme A influência dos meios de cultura e regimes de luminosidade, quanto à esporulação são observados na Tabela 03, onde é demonstrada a variabilidade do comportamento dos isolados de F. gutiforme nessa interação. 26 Tabela 03. Médias referentes a regimes de luz/Isolados/Meios de culturas para esporulação de F. gutiforme in vitro. Luz Claro Escuro Alternada Iso\Meio* BDA CDA AbDA ADA BDA CDA AbDA ADA BDA CDA 222Aaα 135Acβ 135Abβ 135Abβ 20Baαβ 14Bhβ 17Chβ 28Bfα 16Bfγ 19Beβγ ISO01 30Bkγ 40Aiβ 36Bfβγ 110Adα 20Baαβ 29Bfδ 71Acβ 51Bdγ 36Bdα 37ABcα ISO02 14Clγ 87Afα 37Afβ 84Afα 20Baβ 21Bgγ 33Afβ 89Aaα 28Beα 30Bdα ISO03 15Blβ 25Ajα 22Ahαβ 24Bjαβ 20Baαβ 21Agβ 25Agβ 17Bgβ 23Beβγ 19Aeγ ISO04 190Abβ 283Aaα 43Afγ 32Aiδ 20Baαβ 31Bfβ 20Chγ 27Afβγ 61Bcα 20Ceγ ISO05 24Ckδ 40Biγ 144Aaα 79Afβ 20Baβ 121Aaα 71Bcγ 79Abβγ 72Bbα 23Ceγ ISO06 3Amα 5Akα 7Aiα 4Alα 20Baα 5Ahα 5Aiα 6Ahα 6Agα 6Afα ISO07 4Amα 4Akα 6Biα 6Blα 20Baα 6Ahα 6Biα 7Bhα 6Agγ 6Afγ ISO08 42Ajα 10Akβ 12Biβ 20Ajβ 20Baαβ 7Ahβ 19AhBα 9Bhαβ 7Bgβ 9Afβ ISO09 22Bkα 20Ajα 11Biα 13kBα 20Baα 23Agβ 35Afα 23Afβ 12Cfαβ 16Aeα ISO10 4Amα 11Akα 5Biα 7Blα 20Baα 6Ahα 6Biα 6Bhα 5Agγ 5Afγ ISO11 152Adα 53Ahγ 29Cgδ 102Beβ 20Baα 57Adγ 89Bbβ 14Cgδ 12Cfδ 22Beγ ISO12 169Acγ 210Abα 115Acδ 197Aaβ 20Baα 36Cfβ 44Ceαβ 50Cdα 105Baβ 83Bbγ ISO13 134Aeα 113Adβ 62Aeγ 40Ahδ 20Baα 29Bfβγ 20Bhδ 34Afβ 19Ceα 14Ceαβ ISO14 4Amα 4Akα 4Aiα 3Alα 20Baα 7Ahα 5Aiα 6Ahα 6Agα 6Afα ISO15 5AmBα 9Bkα 5Biα 4Blα 20Baα 4Bhα 4Biα 6Bhα 13Afβ 15Aeβ ISO16 55Biβ 88Beα 58Ceβ 49Agβ 20Baβ 91Bbα 67Bcβ 67Bcβ 110Aaβ 115Aaβ ISO17 68Bhβ 74Bgβ 114Bcα 49Agγ 20Baγ 66Acβ 168Baα 40Beγ 39Adδ 123Caα ISO18 78Agα 49Ahβ 80Adα 53Gaβ 20Baβ 50Beα 45Beα 12Bgγ 21Beα 14Ceαβ ISO19 88Cfβ 23Bjγ 25Bhγ 118Aα 20Baβ 94Abα 58Adβ 51Bdβ 21Bcα 40Bcβ ISO20 AbDA 38Beα 23Ceβ 20Beαβ 30Aeβ 31Beβ 36Ceβ 6Afα 50Adα 27Aeα 5Bfβ 328Aaα 241Abα 100Bcβ 18Beα 7Afα 18Aeβ 105Acβ 95Acγ 5Bfβ 21Beγ ADA 28Beαβ 9Cfγ 11Bfβ 194Aaα 30Aeβ 5Bfδ 6Afα 35Aeβ 15AfBβ 3Cfβ 140Abβ 136Abβ 188Baα 5Bfβ 8Afα 56Adα 136Bbα 105Ccβ 7Bfβ 29Ceγ CV (%) = 11,9 * Médias seguidas de mesma letra minúsculas na coluna em cada isolado, assim como seguidas de mesma letra maiúscula na linha em cada meio de cultura e gregas em cada regime de luz não diferem a 5% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott. *BDA= batata-dextrose-ágar; ADA= aveia-dextrose-ágar; CDA= cenoura-dextrose-ágar; AbDA= abacaxi-dextrose-ágar. 27 Os isolados 1SO07 e 1SO15 obtiveram maior esporulação na interação regime de luz e meio, enquanto 1SO19 e 1SO20 apresentaram menores índices para a referida interação (Tabela 03). Observou-se a formação de esporulação semelhante nos meios de cultura de acordo com o regime de luz, sendo o regime claro contínuo, no meio BDA, que favoreceu maior diferenciação nos isolados. No meio CDA, maior variação ocorreu no regime de luz clara, assim como no meio AbDA nos regimes de luz claro e escuro. Para meio ADA, maior diferenciação ocorreu sob regime de luz claro (Tabela 03). No regime de luz claro continuo não ocorreu interferência dos meios na esporulação dos isolados 1SO07, 1SO08, 1SO10, 1SO11, 1SO15 e 1SO16. Para escuro contínuo não observou-se interferência dos meios nos isolados 1SO07, 1SO08, 1SO11, 1SO15 e 1SO16 e sob regime de luz alternada nos isolados 1SO07 e 1SO15 como descrito na Tabela 03. Coelho et. al. (1997) apresentaram resultados demonstrando que isolados de Phomopsis sp. e Phoma sp., quando foram cultivados em meio ADA, em regime de claro contínuo, produziram maior quantidade de esporos. No presente trabalho obtevese resultados semelhantes quando trabalhado em meio ADA sob regime de claro continuo, demonstrando uma maior diferenciação entre os isolados. Rosa e Menezes (2001) observaram que em BDA e MPA (Maltose-PeptonaAgar), a esporulação de Pseudocercospora musae foi bastante incrementada, indicando assim haver especificidade do meio com determinadas linhagens do fungo e o seu potencial de esporulação, devido às vezes a metabólitos liberados ao meio pelo fungo. Salvaia et al., (2009) observando o potencial de esporulação de três isolados de Corynespora cassiicola em regimes de luz contínua, escuro contínuo e fotoperíodo de 12 horas, e variação de temperaturas determinou que na esporulação do fungo, os mesmos diferiram entre si no requerimento de luz para esporularem. No presente trabalho o substrato que proporcionou maior crescimento micelial não necessariamente proporcionou maior esporulação, visto que a exceção dos isolados 1SO07 e 1SO015 que proporcionaram melhor crescimento micelial e maiores taxas de esporulação os demais isolados não tiveram esta correlação. 28 4. CONCLUSÕES 1. Os isolados 1SO05; 1SO07; 1SO08; 1SO15; 1SO16, 1SO18 e 1SO20 apresentaram maior crescimento micelial de F. gutiforme, na interação: Isolados X Meios de cultura X Regimes de luminosidade e os isolados 1SO12, 1SO14 e 1SO19 apresentaram menor crescimento micelial na interação Isolados X Meios de cultura X Regimes de luminosidade. 2. Os isolados 1SO07 e 1SO15 apresentaram maior esporulação de F. gutiforme, dentro da interação: Isolados X Meios de cultura X Regimes de luminosidade e os isolados 1SO19; 1SO20 apresentaram menor esporulação, dentro da interação Isolados X Meios de cultura X Regimes de luminosidade. 29 5. 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Objetivouse neste trabalho, avaliar in vivo a atividade de Fusarium gutiforme, através da inoculação de folhas e raízes de abacaxizeiro ‘Pérola’. Mudas e folhas “D” foram inoculadas em casa de vegetação com 20 isolados de F. gutiforme, de diferentes áreas produtoras da Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte visando avaliar a patogenicidade. De colônias puras do patógeno, foram obtidas suspensões através da adição de 20mL de água destilada esterilizada na placa de Petri com BDA, contendo o fungo, incubado por sete dias à 25+2ºC e fotoperíodo de 12 horas, raspagem com escova macia, seguida de filtragem em dupla camada de gaze estéril, obtendo-se uma suspensão na concentração de 107conidios/mL, mensurada em hemacitômetro. Foi realizada inoculação em folhas D aderidas e destacadas da planta mãe, pelo método com uso de agulha de seringa descartável contaminada com suspensão conidial, incrementada pelo pincelamento da suspensão. As mudas foram inoculadas através da imersão radicular na suspensão de conídios por 30 minutos. Foram avaliados a patogenicidade e severidade em raízes e folhas aderidas através de análise estatística, utilizando delineamento inteiramente casualizado e em folhas destacadas da planta mãe através de escala de notas. Todos os isolados testados foram patogênicos ao material inoculado de abacaxizeiro. Na inoculação por imersão radicular as plantas desenvolveram alta severidade com notas variando de zero a cinco, 90 dias após a inoculação. O isolado 1SO10, foi o mais agressivo, quando inoculado via radicular, o ISO02 foi mais agressivo quando inoculado na parte basal aclorofilada das folhas destacadas e os isolados ISO01, ISO05, 1SO12, 1SO13, 1SO18, 1SO20 expressaram maior agressividade quando inoculados em folhas aderidas a planta mãe. Foram observadas diferenças significativas de severidade entre os isolados de F. gutiforme inoculados em abacaxizeiro cv. Pérola. Palavras-chave: Ananas comosus L., fusariose, métodos de inoculação 35 COUTINHO, O. L. Evaluation of symptoms caused by Fusarium gutiforme in leaves D and roots of Pineapple plants Pérola. 3. chapter, Areia 2010. 51 f. Thesis (Doctorate in Agronomy) Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Paraíba EVALUATION OF SYMPTOMS CAUSED BY Fusarium gutiforme IN D LEAFS AND ROOTS OF PINEAPPLE PLANTS ‘PÉROLA’ ABSTRACT Fusariosis is one of the most important disease problems for pineapple culture. The objective of this work was to evaluate in vivo Fusarium gutiforme activity by inoculation in leaf and roots of pineapple plants cultivar Pérola. Plantlets and D leafs were inoculated in greenhouse with 20 isolates F. gutiforme, from different production areas in Paraíba, Pernambuco and Rio Grande do Norte, Brazil, for evaluation of pathogenicity. From pure fungus colonies it was obtained suspensions by addition of 20mL of distilled water on Petri dish with PDA and fungus incubated for seven days at 25+2ºC and photoperiod of 12 hours and rasped with soft brush plus filtrate in double gauze layer obtained suspension of 107conida/mL measured in hemacytometer. It was done inoculation in D leafs attached and detached from mother plant by inoculation with sterilized needle infested with conidia suspension and painting suspension. The plantlets were inoculated by roots immersion on conidia suspension for 30 minutes. It was evaluated pathogenicity and severity on roots and attached leafs by statistical analysis using experimental design completely randomized and in detached leafs it was used disease index. All isolates tested were pathogenic to pineapple plants inoculated. In roots immersion inoculation, plants developed higher severity after 90 days post inoculation. The isolate 1SO10 was the most aggressive when inoculated by root immersion, 1SO02 was most aggressive when inoculated in detached leafs and isolates 1SO01, 1SO05, 1SO12, 1SO13, 1SO18, 1SO20 showed higher aggressively when inoculated in attached leafs in mother plant. It was observed significative differences of severity between F. gutiforme isolates of pineapple plants cv. Pérola. Key words: Ananas comosus, fusariosis, inoculation methods 36 1. INTRODUÇÃO De acordo com Ventura e Zambolim (2002) dentre as 1300 espécies conhecidas da família Bromeliaceae, o abacaxizeiro (Ananas comosus L.) destaca-se em importância para a agricultura, pois se trata de frutífera originária do Brasil, que apresenta grande expansão em área cultivada e tecnologia empregada, elevando o país, ao posto de maior produtor mundial. Apesar disso, sua produção, destina-se basicamente, ao consumo interno (Cabral et al., 2003). Segundo a FAO (2008) e o IBGE (2008) a abacaxicultura está difundida por quase todo o Brasil, e, dentre os principais estados produtores, destaca-se a Paraíba, primeiro lugar, em produção e área plantada. Para Carvalho et al. (2002) a baixa produtividade, deve-se a fatores como a não seleção de mudas, tratos culturais inadequados e em maior ênfase, a fusariose (perdas de 20 % na Paraíba; 40 % na Bahia; e até 80 % em Minas Gerais), causada pelo fungo Fusarium gutiforme. No Brasil, as cultivares ‘Pérola’ e ‘Smooth Cayenne’ suscetíveis à doença, proporcionam altos prejuízos na cultura (GIACOMELLI, 1982; PY et al., 1984). Para Kimati e Tokeshi (1964), a doença encontra-se disseminada em todas as regiões produtoras destas variedades no Brasil e América Latina. Os sintomas característicos da doença são alterações morfológicas das plantas, como exsudação de goma, daí as denominações de gomose e resinose (PISSARRA et al., 1979). A doença é constatada em todos os Estados produtores de abacaxi do Brasil, sendo a principal limitação da expansão da cultura (ZORZAL et al., 2008). Goes et al. (1983) afirmam que o patógeno é capaz de infectar toda a planta, colonizando desde a região das inserções foliares até os frutos e, principalmente, as mudas. Para Ventura et al. (1993), o sintoma mais evidente é exsudação de goma, manifestando-se em todos estádios de desenvolvimento, especialmente em frutos. Na planta, a infecção do fungo causa lesões no caule e base das folhas, facilmente observadas, na parte aclorofilada. Durante o ciclo da cultura, o período crítico para infecção ocorre após a indução floral até ao final da antese, tendo como principal sitio de infecção as flores (VENTURA e ZAMBOLIM, 2002). Os demais sintomas da doença são curvatura do caule, alteração na filotaxia e redução do tamanho das folhas, 37 abertura da roseta central e exsudação de resina a partir de frutilhos infectados (PISSARRA et al., 1979) . O primeiro relato de variação no comportamento de genótipos de abacaxi referente à incidência da fusariose baseou-se em observações em frutos, sob condições naturais de inoculação (GIACOMELLI et al. 1982). Apesar de eficiente, a avaliação em campo, pode ser influenciada pelas condições ambientais e pelo potencial de inóculo na área, além de demandar tempo, uma vez que a avaliação é realizada no momento da colheita. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a patogenicidade e sintomatologia causados por de 20 isolados de F. gutiforme inoculados em folhas D e raízes de abacaxizeiro cv. Pérola. 38 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Inoculação de F. gutiforme em folhas “D” de abacaxizeiro aderidas à planta mãe Mudas de abacaxizeiro cv. Pérola, do tipo filhote rebentão, foram selecionadas e padronizadas de acordo com idade (30 dias após colheita do fruto), e tamanho (40 ± 5cm), coletadas no Sítio Jacoca, município de Itapororoca-PB, (Latitude: 6:49:53.555102; Longitude: 35:15:04.154224 do meridiano de Grennwich), plantadas em vasos com capacidade para 10kg, contendo terra vegetal, sem adubação química, com irrigação controlada (150 mL H2O/48hs), e mantidas em casa de vegetação, do Departamento de Fitotecnia e Ciências Ambientais, do Centro de Ciências Agrárias, da Universidade Federal da Paraíba, Areia-PB. Os isolados de F. gutiforme, foram obtidos de plantas sintomáticas de abacaxizeiro, coletadas em diferentes localidades de três estados produtores da abacaxicultura nordestina (Tabela 01). TABELA 01. Origem dos isolados de Fusarium gutiforme com as respectivas localidades e pontos de coleta. ISOLADOS 1SO01 1SO02 1SO03 1SO04 1SO05 ISO06 1SO07 1SO08 1SO09 1SO10 1SO11 1SO12 1SO13 1SO14 1SO15 1SO16 1SO17 1SO18 1SO19 1SO20 LOCAL Guarabira I-PB Guarabira II-PB Itapororoca I-PB Itapororoca II-PB Rio Tinto I-PB Rio Tinto II-PB Pedras Fogo I-PB Pedras Fogo II-PB Araçagí-PB Conde-PB Alhandra-PB Espírito Santo-PB Santa Rita-PB Mamanguape-PB Juripiranga-PB Itambé-PE Pombos-PE Touros-RN Sapé-PB Marí-PB PONTO DE COLETA Sitio Canafistula Sitio São Gonçalo Sitio Jacoca Sitio Refúgio Sitio Camparte Sitio Cacimbão Sitio Açude Novo Sitio Taquari Fazenda Redenção Sitio Boa Água Sitio Oh! Glória Sítio Jurema Faz. Zé Queiroga Sitio Pitombeira Sitio Salgado Fazenda Maringá Sitio Pombos Faz. Potiguara Sitio Meu Destino Faz. Unção 39 Os isolados foram testados quanto à patogenicidade em “folhas D” cv. Pérola, aderidas à planta mãe, através de dois ferimentos, feitos com agulhas esterilizadas, dois nas partes basais aclorofiladas e, dois nas partes medianas clorofiladas das folhas. A inoculação foi realizada através ferimentos com agulhas de seringas descartáveis incrementadas pelo pincelamento de suspensão de conídios 7 (10 conídios/mL) da suspensão obtida pela adição de 20mL de água destilada esterilizada (ADE) em placas de Petri contendo colônias puras cultivadas do fungo em meio BDA e incubadas por sete dias à 25± 2ºC e fotoperíodo de 12 horas. Foi efetuada a raspagem da colônica fúngica, com auxílio de escova de cerdas macias, sendo efetuada a filtragem com dupla camada de gaze estéril. Após a inoculação, as plantas mantiveram-se em casa de vegetação, para as avaliações do aparecimento dos sintomas da doença. Os sintomas expressos nas folhas D foram avaliados aos 30 dias, através de medições dos tamanhos das lesões apresentadas, sendo aplicados valores de acordo com escala de notas proposta por Santos et al., (2002) adaptada, na qual as notas variaram de zero (0) a cinco (5), onde: 0= Sem sintomas; 1= Lesão com tamanho de 0,1 até 1cm, caracterizada como exsudação leve; 2= Lesão variando de 1,1 a 2cm, caracterizada como lesão moderada; 3= Lesão variando de 2,1 a 3cm, caracterizada como exsudação acentuada; 4= Lesão variando de 3,1 a 4cm, caracterizada como Folha D com necrose e exsudação acentuada e inicio de murcha; 5= Lesão acima de 4cm, caracterizada como folha D necrosada, exsudação e murcha acentuada. Foram inoculados 20 isolados de F. gutiforme em quatro repetições constituídas pelas folhas D de abacaxizeiro. A testemunha foi composta por folhas D de plantas não inoculadas. O Delineamento utilizado foi o DIC e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott a 1% de probabilidade, analisados pelo programa SAS (1992). 2.2. Inoculação de Fusarium gutiforme em folhas “D” destacadas de plantas de abacaxizeiro cv. Pérola Para inoculação de F. gutiforme em folhas D destacadas de mudas de abacaxizeiro ‘Pérola’, foi utilizada suspensão de conídios obtida conforme metodologia descrita no item 2.1. Das mudas de abacaxizeiro cv. Pérola previamente plantadas foram destacadas folhas D e submetidas à desinfestação em hipoclorito de sódio a 1,5% por 3 minutos, complementada por triplo enxágue em ADE. Posteriormente as folhas foram 40 acondicionadas em bandejas plásticas, sendo realizada a inoculação dos diferentes isolados, descritos na Tabela 01, mais a testemunha não inoculada. As folhas foram feridas mecanicamente através de agulha esterilizada (dois ferimentos, um na parte aclorofilada basal e outro ferimento na parte clorofilada mediana da folha), infectadas através da imersão da extremidade pontiaguda em suspensão conidial de F. gutiforme complementado pelo pincelamento da suspensão, sobre a superfície do ferimento. As bandejas contendo as folhas inoculadas foram mantidas em condições ambientais (25+ 2ºC e fotoperíodo de 12 horas), protegidas com papel filme transparente adicionadas de chumaços de algodão estéreis embebidos em ADE, caracterizando a formação de uma câmara úmida. As avaliações foram realizadas aos oito dias após a inoculação, sendo a severidade avaliada de acordo com escala de notas proposta por Santos et al., (2002) modificada, por um período de oito (8) dias, na qual as notas variaram de zero (0) a cinco (5), onde: 0= Sem sintomas; 1= Lesão com tamanho de 0,1 até 1cm, caracterizada como exsudação leve; 2= Lesão variando de 1,1 a 2cm, caracterizada como exsudação moderada; 3= Lesão variando de 2,1 a 3cm, caracterizada como exsudação acentuada; 4= Lesão variando de 3,1 a 4cm, caracterizada como Folha D com necrose e exsudação acentuada e inicio de murcha; 5= Lesão acima de 4cm, caracterizada como folha D necrosada, exsudação e murcha acentuada. O delineamento utilizado foi o DIC e as médias dos dados foram comparadas pelo teste de Scott-Knott a 1% de probabilidade. Os resultados foram analisados pelo programa SAS (1992), com 20 tratamentos e 4 repetições. 2.3. Inoculação de Fusarium gutiforme em raízes de mudas de abacaxizeiro ’Pérola’ em casa de vegetação. Para inoculação em raízes foram utilizadas mudas do tipo filhote rebentão de abacaxizeiro cv. Pérola, coletadas 30 dias após colheita do fruto, sendo previamente plantadas em baldes com capacidade para 10kg, contendo terra vegetal, sem adubação química, com irrigação controlada em (150mL H2O) a intervalos de 48 horas, por 45 dias. A inoculação das mudas foi realizada retirando-se cuidadosamente as mesmas dos seus respectivos vasos e proferindo ferimentos no colo e raízes com auxílio de instrumento pontiagudo estéril, sendo posteriormente imersas as raízes por 30 minutos 41 na suspensão conidial de F.gutiforme. A suspensão foi obtida através de colônias puras do fungo, cultivadas em placas de Petri contendo o meio BDA e incubadas por sete dias à 25+ 2ºC e fotoperíodo de 12 horas, pela adição de uma alíquota de 20 mL de ADE e raspagem com auxílio de escova de cerdas macias. O material suspenso foi devidamente filtrado em dupla camada de gaze estéril e ajustada a concentração em hemacitômetro para 107conídios /mL da suspensão. Para um maior contato da suspensão com as raízes na inoculação radicular, foram utilizados sacos plásticos com capacidade para 5 Litros como invólucro, facilitando o manuseio e distribuição da suspensão nas raízes (VENTURA et al., 1994). Para cada um dos 20 isolados foram utilizadas quatro mudas como e a testemunha foi composta por plantas não inoculadas. Após tal procedimento, as mudas foram replantadas em seus respectivos vasos e acondicionadas em casa de vegetação sendo avaliadas após 90 dias. Foram realizadas as avaliações dos sintomas típicos da fusariose considerando escala de notas proposta por Santos et al. (2002) adaptada, variando de 0 (zero) a 5 (cinco), onde: 0= Sem sintoma (S/S), 1= Início de exsudação (IE), 2= Exsudação leve (EL), 3= Exsudação acentuada (EA), 4= Folhas basais necrosadas com início de murcha (FM), 5= Murcha acentuada com morte da planta (MP). O Delineamento utilizado foi o DIC e as médias dos dados foram comparadas pelo teste de Scott-Knott a 1% de probabilidade. Os resultados obtidos foram analisados pelo programa SAS (1992). Foram utilizados 20 tratamentos com 4 repetições, totalizando 80 plantas. 42 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os 20 isolados de F.gutiforme testados mostraram-se patogênicos ao serem inoculados em plantas de abacaxizeiro ‘Pérola’. Os sintomas típicos da doença foram inicialmente observados 30 dias após a inoculação destacando-se exsudações de resina gomosa, amarelecimento, necrose e murcha de forma mais acentuada. Nas folhas D inoculadas com F. gutiforme, maior patogenicidade foi observada nos isolados 1SO20, 1SO18, 1SO12, 1SO01, 1SO13, 1SO05, 1SO14, 1SO19, 1SO17, 1SO08, 1SO09, 1SO02, 1SO07, ISO6 e 1SO10 respectivamente, não diferindo estatisticamente entre si e apresentando maior agressividade do fungo. Ao contrário dos isolados 1SO15, 1SO04, 1SO03, 1SO11 e 1SO16 que mostraram-se menos patogênicos e não diferiram estatisticamente da testemunha (Tabela 02). Pode-se observar na Tabela 02 os valores correspondentes a severidade da doença 30 dias após a inoculação de F. gutiforme em folhas D aderidas a planta mãe de abacaxizeiro cv. Pérola. 43 TABELA 02. Patogenicidade de Fusarium gutiforme inoculados em folhas D de abacaxizeiro cv. Pérola, aderidas à planta mãe. ISOLADOS 1SO20 MÉDIAS * 5,68 A 1SO18 4,88 AB 1SO12 4,70 AB 1SO01 4,50 AB 1SO13 4,40 ABC 1SO05 4,30 ABCD 1SO14 3,80 ABCDE 1SO19 3,60 ABCDE 1SO17 3,50 ABCDE 1SO08 3,50 ABCDE 1SO09 3,40 ABCDE 1SO02 3,40 ABCDE 1SO07 3,30 ABCDE ISO06 2,40 ABCDE 1SO10 2,20 ABCDE 1SO15 1,50 CDEF 1SO04 1,40 DEF 1SO03 1,40 DEF 1SO11 1,10 EF 1SO16 1,00 EF Testemunha 0,00 F *Médias com a mesma letra não diferem significativamente pelo teste Scott-Knott a 1% de probabilidade. *Médias baseadas em escala de notas proposta por Santos (2002) modificada, onde: 0= sem sintomas; 1= lesão com tamanho de 0,1 a 1,0 cm (Exsudação leve); 2= lesão com tamanho de 1,1 a 2,0 cm (Lesão moderada); 3= 2,1 a 3,0 cm (Exsudação acentuada); 4= lesão com tamanho de 3,1 a 4,0 cm (Necrose acentuada com inicio de murcha); 5= Acima de 4,0 cm (Folha D necrosada exsudação e murcha acentuada). Para avaliação da patogenicidade dos 20 isolados de F. gutiforme os resultados demonstraram que em folhas destacadas 15 isolados (1SO15, 1SO11, 1SO17, 1SO05, 1SO07, 1SO08, 1SO19, ISO06, 1SO13, 1SO03, 1SO10, 1SO04, 1SO20, 1SO09 e 1SO18) apresentaram sintomatologia branda. A testemunha não inoculada, não expressou sintomatologia típica da fusariose. Os resultados obtidos 44 evidenciaram eficiência a inoculação por ferimento com agulha esterilizada contaminada com suspensão do patógeno. Os isolados 1SO02, 1SO14, 1SO01, 1SO12 E 1SO16 apresentaram maior agressividade dos sintomas em folhas destacadas. Menor sintomatologia foi observada nos isolados 1SO03, 1SO10, 1SO04, 1SO20, 1SO09, 1SO18. Observa-se comportamento diferenciado de patogenicidade quando se utiliza folha destacada e folhas aderidas. TABELA 03. Patogenicidade de Fusarium gutiforme inoculados em folhas D destacadas de abacaxizeiro cv. Pérola ISOLADOS 1SO02 MÉDIAS * 4,75 A 1SO14 3,20 AB 1SO01 2,30 AB 1SO12 1,90 AB 1SO16 1,65 AB 1SO15 1,40 BC 1SO11 1,20 BC 1SO17 1,15 BC 1SO05 1,05 BC 1SO07 1,00 BC 1SO08 0,90 BC 1SO19 0,72 BC ISO06 0,67 BC 1SO13 0,60 BC 1SO03 0,45 C 1SO10 0,40 C 1SO04 0,37 C 1SO20 0,37 C 1SO09 0,37 C 1SO18 0,30 C 0,00 C Testemunha *Médias com a mesma letra não diferem significativamente pelo teste Scott-Knott a 1% de probabilidade. *Médias baseadas em escala de notas proposta por Santos (2002) modificada, onde: 0= Sem sintomas; 1= 0,1 a 1,0 cm (Exsudação leve); 2= 1,1 a 2,0 cm (Exsudaçào moderada); 3= 2,1 a 3,0 cm (Exsudaçào acentuada); 4= 3,1 a 4,0 cm (Folha D necrosada exsudação acentuada com inicio de murcha); 5= acima de 4,0 cm (Folha D necrosada exsudação e murcha acentuada) 45 Ventura et al., (1994) e Santos et al., (2001a), trabalhando com inoculação de F. gutiforme em folhas destacadas de abacaxizeiro cv. Pérola, afirmam que o método da adição de uma gota de suspensão de inóculo sobre um ferimento na parte aclorofilada da folha foi o mais evidente na expressão dos sintomas. Para Oliveira (2008) a introdução de um palito contaminado com F. gutiforme a 2 e 5,0 cm da base de folhas D, destacadas de abacaxizeiro, foi um método de inoculação eficiente, incitando o desenvolvimento de lesões e possibilitando a avaliação dos sintomas da doença 15 dias após a inoculação. No presente trabalho, pode-se constatar que ferimentos inoculados com pincelamento de suspensão de conídios de F. gutiforme, mostrou-se eficiente quando realizado na parte basal aclorofilada, apresentando sintomas característicos da fusariose. Santos et al. (2001a) verificaram efeitos significativos da inoculação em diferentes tipos e regiões da folha, estabelecendo áreas com maior e menor severidade do patógeno. Para Zorzal, et al. (2008) que estudaram a variedade Vitória, resistente a fusariose, pôde-se observar que quando inoculadas com uma suspensão de conídios de F. gutiforme, os danos observados diferiram, indicando resistência e observandose uma maior espessura dos tecidos foliares, dificultando a penetração do inóculo. Em relação às variedades Pérola e Smooth Cayene, susceptíveis a fusariose, essas se mostraram vulneráveis aos danos causados pelo patógeno inoculado. Resultados semelhantes foram observados por Ventura et al. (2006) e Vance et al. (1980). Conforme Rugiero et al. (1994) a severidade da doença pode variar de uma região para outra, em função do inóculo existente no campo e, segundo Giacomelli, (1984), em virtude da grande variabilidade patogênica existente em F. gutiforme. Na Tabela 04 pode-se observar a severidade de F. gutiforme Pérola após 60 dias inoculação em mudas de abacaxizeiro cv. Pérola, através do método da imersão do sistema radicular em suspensão conidial. 46 TABELA 04. Patogenicidade de Fusarium. gutiforme inoculados por imersão via radicular de mudas de abacaxizeiro cv. Pérola ISOLADOS 1SO10 MÉDIAS* 5,00A 1SO02 4,50AB 1SO07 4,50AB 1SO13 4,50AB 1SO08 4,50AB 1SO14 4,00 BC 1SO15 4,00 BC 1SO17 4,00 BC 1SO05 4,00 BC ISO06 4,00 BC 1SO12 3,80 B C 1SO04 3,50 C 1SO01 3,50 C 1SO18 3,50 C 1SO11 3,50 C 1SO16 3,30 CD 1SO09 3,30 CD 1SO03 3,00 D 1SO20 2,30 E 1SO19 2,30 E Testemunha 0,00 F *Médias com a mesma letra não diferem significativamente pelo teste Scott-Knott a 1% de probabilidade. *Médias baseadas em escala de notas proposta por Santos (2002) modificada, onde:0= sem sintoma (S/S); 1= incio de exsudação (IE); 2= Exsudação leve (EL); 3= Exsudação acentuada (EA); 4= Folhas basais necrosadas com inicio de murcha (FM); 5= Murcha acentuada com morte da planta (MP) Os isolados 1SO20 e 1SO19 apresentaram apenas exsudação leve, demonstrando menor patogenicidade às raízes inoculadas. A testemunha não apresentou sintomatologia típica da doença. Para os isolados inoculados por imersão radicular pode-se constatar que 47 1SO10, 1SO02, 1SO07, 1SO13 e 1SO08 apresentaram maior agressividade, condicionando uma maior severidade da doença, sem diferença significativa entre eles. Quanto aos sintomas apresentados, os isolados estudados apresentaram índices satisfatórios de infecção, variando quanto à agressividade e confirmando sua utilização em testes de patogenicidade. Santos et al. (2001b) estudando isolados de F. gutiforme em mudas e folhas destacadas de abacaxizeiros obteve resultados significativos, quanto aos danos causados. Castro et al., (2008) observando diferentes métodos de inoculação do F. oxysporum f.sp. cubense em helicônia, determinaram que o método de injeção radicular sobressaiu aos demais, demandando menos tempo para surgimento de sintomas. Diferentes de quando utilizaram “dipping” de raízes, que foi menos eficiente para testes de patogenicidade em outras espécies fúngicas. Goes e Kimati, (1990) afirmaram ser a variabilidade do patógeno, responsável pela variação na intensidade dos danos e consequentemente das perdas, tendo este fato a ser considerado, principalmente quando se visar à identificação de genótipos de abacaxizeiro resistentes à fusariose. Relacionando as diferentes formas de inoculação estudadas no presente trabalho, observa-se que não houve diferença em relação á patogenicidade, face o método de inoculação, ou seja, todos os isolados foram patogênicos às plantas de abacaxizeiro ‘Pérola’. Quanto às formas de inoculação, tanto em testes via foliar quanto em testes via radicular, observaram-se variações na severidade da doença com diferença no tamanho das lesões. Pode-se afirmar que os isolados de F.gutiforme estudados no presente trabalho possuem potenciais de patogenicidade quando inoculados via foliar, em folhas destacadas ou aderidas, ou através de inoculação via radicular. 48 4. CONCLUSÕES Os isolados 1SO20, 1SO18, 1SO12, 1SO01, 1SO13, 1SO05, 1SO14, 1SO19, 1SO17, 1SO08, 1SO09, 1SO02, 1SO07, ISO6 e 1SO10 apresentaram maior patogenicidade do fungo quando inoculados em folhas D aderidas; entretanto, os isolados 1SO015, 1SO04, 1SO03, 1SO11 e 1SO16 expressaram menor patogenicidade quando inoculados em folhas D aderidas. O teste de patogenicidade em folhas D destacadas da planta mãe de abacaxizeiro cv. Pérola, através de ferimentos com agulhas de seringas contaminadas em suspensões conidiais de F. gutiforme, mostrou-se um método eficiente de inoculação, onde, 1SO02, 1SO14, 1SO01, 1SO12 e 1SO16 apresentaram sintomatologia mais severa, enquanto menor severidade foi observada nos isolados 1SO03, 1SO10, 1SO04, 1SO20, 1SO09, 1SO18. As mudas de abacaxizeiro cv. Pérola inoculadas por imersão radicular em suspensões conidiais de F. gutiforme mostraram-se susceptíveis aos 20 isolados testados. 49 5. REFERÊNCIAS CABRAL, J. R. S.; MATOS, A. P. de; JUGHANS, D. T. 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