Estudo da aderência localizada de uma amostra de Escherichia coli
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RODRIGO TAVANELLI HERNANDES Estudo da aderência localizada de uma amostra de Escherichia coli enteropatogênica atípica Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para a obtenção do Título de Doutor em Ciências. São Paulo 2006 RODRIGO TAVANELLI HERNANDES Estudo da aderência localizada de uma amostra de Escherichia coli enteropatogênica atípica Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para a obtenção do Título de Doutor em Ciências pelo Programa de Pós-graduação em Microbiologia e Imunologia. Orientadora: Profª. Drª. Tânia A. T. Gomes do Amaral São Paulo 2006 Hernandes, Rodrigo Tavanelli Estudo da aderência localizada de uma amostra de Escherichia coli enteropatogênica atípica./Rodrigo Tavanelli Hernandes. –São Paulo, 2006. xxii, 109f. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia. Título em Inglês: Studies on the localized adherence of an atypical enteropathogenic Escherichia coli strain. 1. Escherichia coli. 2. Aderência. 3. Intimina 4. Patogenicidade Este trabalho foi desenvolvido na Disciplina de Microbiologia do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM), com o auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Aos meus pais Antonio e Maria Minha Tia Doracy Minha querida avó Emília Minha Grande amiga Teresinha Pelo Amor sempre presente: Dedico Agradecimentos À minha orientadora Profª Drª Tânia Aparecida Tardelli Gomes do Amaral pela oportunidade de trabalhar sob sua orientação, pela confiança, ajuda e toda preocupação: À você, toda a minha admiração e gratidão.......... Muito Obrigado! À Profª Drª Mônica Aparecida Midolli Vieira pelos incentivos, ensinamentos e principalmente pela amizade. Sua colaboração foi fundamental para a realização desse trabalho. À Profª Drª Sylvia Mendes Carneiro pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório, pelos ensinamentos em Microscopia Eletrônica e principalmente pela amizade. À Profª Drª Rosa Maria Silva pelo incentivo e pela importante presença em diversos momentos deste trabalho. Ao Prof. Dr. Waldir Pereira Elias Junior pelo constante apoio científico e valiosa colaboração durante a realização deste trabalho. Ao Prof. Dr. Marcelo Ribeiro da Silva Briones pelo auxílio nos experimentos de seqüenciamento. Às Profªs Drªs Beatriz Ernestina Cabilio Guth, Roxane Maria Fontes Piazza, Isabel Cristina Affonso Scaletsky e Sylvia Cardoso Leão pelo apoio no desenvolvimento deste trabalho. Aos docentes do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia que de várias formas contribuíram para minha formação. À Evanilde e Sandra Fabbricotti por toda ajuda técnica dada durante a realização deste trabalho. À Cristina, Paloma, Darcy, Vitória e Zoraide por toda cooperação que foram essenciais para o desenvolvimento deste trabalho. Á Magda Nisti e Paola Rossi pela colaboração durante todos estes anos. Às queridas e eternas amigas Denise Yamamoto, Fábia Salvador, Fabiana Moreira e Flávia Bastos pelo agradável convívio durante esses anos, pelos momentos de descontração, incentivo e por tudo que passaram a representar para mim. Aos amigos Cristiano, Samar e Eliane por toda amizade, apoio e torcida em todas as fases da minha vida. Aos amigos do Departamento de Microbiologia: Maria Cecília, Luís Fernando, Suely Sampaio, Lucília Nishimura, Cecília Abe, Michele Rabelo, Kátia Aranda e Bianca Bragato pela amizade e colaboração durante estes anos de convívio. Às amigas Andreza Zamboni e Michelle Dulguer não só pelo apoio científico, mas também pela grande amizade. À Ana Carolina e Analy pela colaboração e conhecimentos trocados durante os experimentos de seqüenciamento. Á Cristina Viana pelo apoio no desenvolvimento deste trabalho e também pela amizade. Ao meu Tio Adaucto e família pelo constante incentivo, apoio e carinho sempre presentes: Muito Obrigado! À Tia Joaninha, Tia Rosa e demais familiares: Obrigado por todo apoio e por todos os momentos que compartilhamos juntos. Súmario Página Lista de Figuras Lista de Tabelas Lista de Abreviaturas e Siglas Resumo Abstract Introdução......................................................................................................... 1 Objetivo............................................................................................................. 15 Material e Métodos.......................................................................................... 16 1. Amostras bacterianas..................................................................................... 16 2. Teste de adesão.............................................................................................. 18 3. Teste de FAS.................................................................................................. 19 4. Immunobloting............................................................................................... 19 5. Imunomarcação com soro anti-BFP............................................................... 20 6. Microscopia eletrônica de transmissão.......................................................... 21 7. Técnicas de manipulação e de análise de DNA…………………………..... 22 7.1 Extração de DNA plasmidial em pequena escala.................................... 22 7.2 Extração de DNA plasmidial em larga escala......................................... 22 7.3 Eluição dos fragmentos do DNA do gel de agarose................................ 22 7.4 Reações de digestão de DNA.................................................................. 23 7.5 Reação de precipitação do DNA............................................................. 23 7.6 Extração de DNA genômico.................................................................... 23 7.7 Eletroporação........................................................................................... 24 7.8. Reação de polimerização em cadeia (PCR)........................................... 24 7.9 Perfil plasmidial (Birnboim & Doly)..................................................... 28 7.10 Construção do mutante em eae por nocaute não polar........................ 29 7.11 Mutagênese por Mini-Tn 10................................................................ 30 7.12 Pesquisa de Determinantes Genéticos de Virulência pelo ensaio de Hibridação de Colônias (Colony blot)......................................................... 31 7.13 Southern blotting.................................................................................. 33 8. Produção de anti-soro em coelho................................................................... 34 9. Curva de crescimento..................................................................................... 34 10. Absorção do anti-soro utilizando-se o mutante não aderente...................... 35 11. Seqüenciamento do DNA............................................................................. 35 Resultados......................................................................................................... 37 1. Seleção da amostra......................................................................................... 37 2. Caracterização da amostra 1551-2................................................................. 43 3. Cinética de Adesão......................................................................................... 47 4. Obtenção da amostra mutada 1551-2:eae-..................................................... 49 5. Southern-blot realizado para confirmar a mutação no gene eae da amostra 1551-2................................................................................................................ 52 6. Microscopia eletrônica de transmissão.......................................................... 55 7. Complementação da amostra 1551-2:eae- com o plasmídio pCVD438........ 57 8. Construção de uma biblioteca de mutantes.................................................... 59 9. Soro produzido com a amostra 1551-2:eae- e absorvido com o mutante não aderente 143: caracterização e inibição de adesão............................................. 61 10. Clonagem do gene eae no vetor pMOS para seqüenciamento..................... 63 11. Seqüenciamento e Análise do gene eae da amostra 1551-2........................ 65 Discussão........................................................................................................... 67 Conclusões......................................................................................................... 74 Referências Bibliográficas............................................................................... 75 Anexos............................................................................................................... 95 Lista de Figuras Página Figura 1 Representação esquemática dos genes que compõem a região LEE............................................................................................... Figura 2 5 Representação esquemática do translocon formado pelo sistema de secreção tipo III e pelas proteínas secretadas........................... 7 Figura 3 Padrão de adesão localizada apresentado pela amostra E. coli 1551-2. Ensaio realizado em células HeLa, utilizando 6 horas de contato........................................................................................... Figura 4 41 Gel de agarose a 0,7% com perfis de bandas de DNA plasmidial de 9 amostras de aEPEC de sorogrupos não EPEC e de E. coli R 861, contendo bandas de pesos moleculares conhecidos como padrão............................................................................................ 41 Figura 5 Microscopia Eletrônica de Transmissão da amostra 1551-2......... 42 Figura 6 Ensaio de Imunoblot de proteínas totais das amostras E2348/69 e 1551-2, utilizando o soro anti-BFP............................................ Figura 7 43 Gel de agarose com o produto de amplificação do gene bfpL das amostras: E2348/69, 1551-2 e E. coli HB101............................... 44 Figura 8 Gel de agarose com o produto de amplificação do gene fimH das amostras: E2348/69, 1551-2, e HB101................................... 45 Figura 9 Imunomarcação com o soro policlonal anti-BFP das amostras: E2348/69 (A) e 1551-2 (B)........................................................... Figura 10 46 Cinética de adesão das amostras de aEPEC 1551-2 e protótipo de tEPEC E2348/69...................................................................... 48 Figura 11 Mapa do vetor suicida pJP5603 indicando o sítio de EcoRI onde o fragmento de 924 pb do gene eae foi clonado para a obtenção do plasmídio recombinante pRT2................................................. Figura 12 50 Teste de adesão em células HeLa da amostra 1551-2 e derivada mutante em intimina...................................................................... 51 Figura 13 Ensaio de Immunoblot com soro anti-intimina de proteínas totais das amostras 1551-2 e mutante em eae............................... Figura 14 52 Representação esquemática dos fragmentos HindIII observados na amostra selvagem 1551-2, e na amostra mutada em intimina 1551-2:eae-.................................................................................... 53 Figura 15 Southern blot para comprovar a inserção do vetor suicida pJP5603 em eae. Em A, observa-se um gel de agarose a 1% com DNA das amostras 1551-2, 1551-2:eae- e do vetor pRT2, pJP5603 + fragmento de ~924 pb de eae clonado, digerido com HindIII........................................................................................... 54 Figura 16 Microscopia eletrônica de transmissão da interação das amostras 1551-2 (A e B) e 1551-2:eae- (C e D) com células HeLa.............................................................................................. 56 Figura 17 Ensaio de Immunoblot com soro anti-intimina de proteínas totais da amostra 1551-2:eae- complementada com o plasmídio recombinate pCVD438 bem como dos controles 1551-2:eae(controle negativo) e 1551-2 (controle positivo).......................... Figura 18 57 Teste de FAS das amostras 1551-2 (A) e 1551-2:eae- (B) complementada com o gene eae da amostra E2348/69, protótipo de tEPEC....................................................................................... 58 Figura 19 Análise do mutante não aderente da amostra 1551-2:eae-. A: Curva de crescimento das amostras 1551-2, 1551-2:eae- e do mutante não aderente (143). B e C: Padrão de adesão da amostra 1551-2:eae- (B) e do seu mutante não aderente-143 (C) às células HeLa............................................................................. Figura 20 Teste de adesão em células HeLa das amostras 1551-2 (A) e 1551-2:eae- (B) na temperatura de 18ºC (6h)............................... Figura 21 60 62 Immunoblot de extrato de proteínas totais das amostras: 1551-2, 1551-2:eae-, mutante não aderente, 1551-2 cultivada à 37ºC e 1551-2 cultivada à 18ºC, utilizando o soro produzido com a amostra 1551-2:eae- e absorvido com o mutante não aderente..... 62 Figura 22 Ensaio de inibição de adesão da amostra 1551-2:eae- com soro absorvido com o mutante 143, realizado em células HeLa durante 6 horas.............................................................................. Figura 23 63 Gel de agarose com o produto de amplificação do gene eae das amostras 1551-2 e derivadas: 2) pISEQ (pMOS + fragmento de 3,1 kb clonado); 3) 1551-2; 4) pISEQ digerido com HindIII e 5) pMOS............................................................................................ Figura 24 64 BLASTN da seqüência de 1077 nucleotídeos, obtida a partir do sequenciamento dos clones pISEQ1, 2 e 3................................... 66 Lista de Tabelas Página Tabela 1 Características e origem das amostras de E. coli e plasmídios utilizados neste estudo..................................................................... 17 Tabela 2 Primers e condições utilizadas para os ensaios de PCR.................. 26/27 Tabela 3 Seqüência dos primers utilizados nos experimentos de seqüenciamento………………………………………………….... Tabela 4 36 Características clínicas, fenotípicas e genotípicas de 9 amostras de EPEC atípicas não pertencentes a sorogrupos de EPEC que expressam adesão localizada em 6 horas (AL6) na ausência de Bundle forming pilus........................................................................ 40 Lista de Abreviaturas e Siglas AA Aderência agregativa AAF/I Aggregative Adherence Fimbria I AAF/II Aggregative Adherence Fimbria II AAF/III Aggregative Adherence Fimbria III AD Aderência difusa A/E Attaching and effacing AL Aderência localizada ATV Solução de associação Tripsina-Versene BFP Bundle forming pilus BSA Soroalbumina bovina CNF Fator Necrotizante Citotóxico DAEC Escherichia coli difusamente aderente DMEM Meio mínimo essencial de Eagle modificado por Dulbecco DNA Ácido desoxirribonucléico dATP 2'- Desoxiadenosina 5'- Trifosfato dCTP 2'- Desoxicitidina 5'- Trifosfato dGTP 2'- Desoxiguanosina 5'- Trifosfato dTTP 2'- Desoxitimidina 5'- Trifosfato dNTPs Desoxinucleotídeos Trifosfatos EAEC Escherichia coli enteroagregativa EAF EAST EPEC Adherence Factor Enteroaggregative Stable Toxin EDTA Ácido etilenodiaminotetracético EHEC Escherichia coli enterohemorrágica EIEC Escherichia coli enteroinvasora EPEC Escherichia coli enteropatogênica ETEC Escherichia coli enterotoxigênica ExPEC Escherichia coli extra-intestinal LB (caldo ou ágar) Luria Bertani LEE locus of enterocyte effacement LT Toxina termo-lábil MEM Meio mínimo essencial de Eagle MSHA Hemaglutinação manose-sensível ORF Open reading frame PBS Solução tampão salina fosfato PCR Reação de polimerização em cadeia q.s.p. quantidade suficiente para SDS Dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS SFB Soro fetal bovino SSC Solução tampão cloreto de sódio/citrato de sódio ST STEC Toxina termo-estável Escherichia coli produtora de toxina Shiga Stx Shiga toxin TE Solução tampão Tris-EDTA TEB TEMED Solução tampão Tris-EDTA- borato N,N, N', N'- Tetrametil-etilenodiamino TSB Tryptic Soy Broth UV Ultra-violeta UPEC α 32P- dCTP Escherichia coli Uropatogênica Citosina trifosfato marcado com fósforo 32 radioativo Unidades % Porcentagem G Grama Kb Kilobase kDa Kilodalton kV Kilovolt M Molar mA Miliampere Mda Megadalton Mg Miligrama mL Mililitro mM Milimolar Mm Milímetro N Normal (normalidade) ºC Grau centigrade Pb Pares de base Rpm Rotação por minuto U Unidade V Volt v/v Volume/volume X Vezes μg Micrograma μL Microlitro μm Micrômetro Resumo Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) compreende uma das seis categorias diarreiogênicas da espécie. Atualmente, ela é dividida em duas subcategorias, EPEC típica (tEPEC) e EPEC atípica (aEPEC), tendo por base a presença do plasmídio EAF (EPEC adherence factor), que só ocorre entre as tEPEC. As EPEC promovem, no epitélio intestinal, a lesão attaching and effacing (A/E), cujos determinantes genéticos estão localizados em uma ilha de patogenicidade denominada região LEE (locus of enterocyte effacement). Um dos genes presentes nessa região, o gene eae, codifica uma proteína de membrana externa (intimina) responsável pela aderência íntima às células intestinais, observada na lesão A/E. Uma característica fenotípica marcante das tEPEC é a produção do padrão de adesão localizada (AL), no qual são observadas microcolônias bacterianas compactas sobre células HeLa e HEp-2, após 3 horas de contato. O padrão AL está associado com a expressão da fímbria denominada bundle-forming pilus (BFP), que é codificada pelo plasmídio EAF e promove agregação bactéria-bactéria, dentro das microcolônias, bem como a interação inicial, que precede a aderência íntima mediada por intimina. Por outro lado, a maioria das aEPEC promove a formação de microcolônias mais frouxas, após ensaios mais prolongados (ensaios de 6 horas), o que caracteriza a chamada adesão semelhante à AL (AL-like). Durante um estudo anterior, sobre o potencial de virulência de 59 amostras de aEPEC, foi observado que 9 delas produziam AL típica (em 6 horas), mesmo na ausência de BFP. Após um amplo estudo das suas características fenotipicas e genotipicas, uma amostra (1551-2) foi selecionada para a identificação da estrutura responsável pela formação de microcolônias compactas. Ensaios de microscopia eletrônica revelaram que o padrão AL da amostra 1551-2 refletia bactérias internalizadas e que um mutante não-polar em eae (1551-2:eae-), perdia essa propriedade, embora continuasse aderindo de forma difusa (AD). O seqüenciamento da região variável do gene eae revelou que a intimina da amostra 1551-2 pertence ao subtipo omicron (ο). Para caracterizar a adesina responsável pela AD no mutante 1551-2:eae-, foram obtidos mutantes não aderentes utilizando-se o transposon Mini-Tn10. Um desses mutantes foi empregado para a absorção de um soro produzido com a amostra 15512:eae- Esse soro foi capaz de inibir a adesão da amostra 1551-2:eae- a células HeLa e, em ensaios de immunoblot, revelou uma banda de aproximadamente 25 kDa. Podemos concluir que o padrão AL da amostra 1551-2 reflete um processo de internalização provavelmente mediado por intimina, e que novos fatores de virulência, possivelmente uma proteína de ~25 kDa, poderiam desempenhar importante papel na interação de amostras de aEPEC in vitro. Abstract Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) comprise one of the 6 diarrheagenic categories of the species. Presently, it is sub-grouped into two sub-categories, typical EPEC (tEPEC) and atypical EPEC (aEPEC), based on the presence of the EAF (EPEC adherence factor) plasmid, which occurs only in tEPEC. EPEC promote, in the intestinal epithelium, an attaching and effacing lesion (A/E) whose genetic determinants are located in a pathogenicity island named LEE (locus of enterocyte effacement). One of the LEE genes, the eae gene, encodes an outer membrane protein (intimin), which is responsible for the intimate adherence to the intestinal cells, observed in the A/E lesions. A marked phenotypic characteristic of tEPEC is the production of the localized pattern of adherence (LA), where compact bacterial microcolonies are detected on HeLa and HEp-2 cells, after 3 hours of contact. The LA pattern is associated with the expression of the bundle-forming pilus (BFP), which is encoded on the EAF plasmid and promotes bacterium-bacterium aggregation within the microcolonies as well as the initial interaction that precedes the intimate adherence by intimin. On the other hand, most aEPEC form microcolonies looser than those seen in LA, after more prolonged assays (6 h assays), a phenotype that characterizes the so called LA-like pattern of adherence. During a previous study on the virulence potential of 59 strains of aEPEC, it was observed that 9 of them produced typical LA, even in the absence of BFP. After an ample analysis of their phenotypic and genotypic characteristics, one strain (1551-2) was selected for the identification of the structure responsible for compact microcolony formation in this strain. Electron microscopy assays have revealed that the LA pattern of strain 1551-2 reflected, in fact, internalized bacteria, and that a non-polar mutant in eae (1551-2:eae-), had lost this property but maintained a strong diffuse adherence. Sequencing experiments of the variable region of the 1551-2 intimin molecule revealed that it corresponds to intimin subtype omicron (ο). To further characterize the adhesin responsible for the diffuse adherence phenotype in strain 1551-2:eae-, non-adherent mutants were obtained by transposon mutagenesis with Mini-Tn10. One of these non-adherent mutants was then used to absorb an antiserum produced against strain 1551-2:eae-. This absorbed antiserum inhibited the diffuse adherence of strain 1551-2:eae- to HeLa cells and, in immunoblot experiments, it has revealed a protein band of approximately 25kDa. From the data presented in this study, it is possible to conclude that the LA phenotype of aEPEC strain 1551-2 comprises, rather, an internalization process probably mediated by intimin, and that novel virulence factors, possibly a ~25 kDa protein, could play an important role in the interaction of aEPEC strains in vitro. Introdução 1. Escherichia coli diarreiogênica A diarréia infecciosa tem sido considerada uma das principais causas de mortalidade infantil nos países em desenvolvimento, onde é considerada endêmica (Hanson et al., 1993). Suas manifestações clínicas são variáveis em característica e severidade, relacionando-se tanto com o estado imunológico do indivíduo, como com a natureza dos agentes etiológicos, destacando-se bactérias, vírus e protozoários (Thea & Keusch, 1993). As amostras de Escherichia coli associadas a infecções intestinais, denominadas E. coli diarreiogênicas, estão classificadas em seis categorias tomando-se por base os mecanismos de virulência específicos, as síndromes clínicas decorrentes, os sorotipos (combinação de antígenos somáticos O e flagelares H), os aspectos epidemiológicos e os tipos de interação com linhagens celulares cultivadas in vitro (Nataro & Kaper, 1998). As seis categorias de E. coli diarreiogênicas são: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora de toxina Shiga (STEC) – EHEC (E. coli enterohemorrágica; subgrupo de STEC capaz de causar lesão attaching and effacing), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli difusamente aderente (DAEC). As bactérias pertencentes a cada uma dessas categorias causam diarréia por mecanismos distintos, afetam diferentes grupos populacionais e expressam diferentes fatores de virulência (Levine, 1987; Nataro & Kaper, 1998). As principais características que definem as categorias de E. coli diarreiogênicas estão apresentadas no Quadro 1. 1 Quadro 1. Principais características das categorias diarreiogênicas de Escherichia coli. Categoria de E. coli diarreiogênica Principais características a EPEC Gene eae, plasmídio EAF (pEAF) ETEC Produção de toxinas termolábil (LT) e/ou termoestável (ST) EIEC Invasão de células em cultura de tecidos e produção de cerato-conjuntivite em cobaia. a, STEC (EHEC) Stx1 e/ou Stx2 (gene eae) EAEC Adesão agregativa (AA) DAEC Adesão difusa (AD) Adaptado de Nataro & Kaper (1998). 2. Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) O termo “E. coli enteropatogênica-EPEC” foi criado por Neter et al. (1955) para designar determinados sorogrupos de E. coli associados à diarréia, distinguindo-os assim dos sorogrupos de E. coli encontrados em indivíduos normais ou pacientes com processo de infecção extra-intestinal. A classificação em sorogrupos baseia-se no tipo de antígeno O (antígeno somático correspondente à parte polissacarídica da molécula de lipopolissacarídeo da membrana externa). Com base nesse antígeno, as linhagens de E. coli categorizadas como EPEC compreendem doze diferentes sorogrupos: O26, O55, O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128, O142 e O158 (W.H.O., 1987). A infecção por EPEC ocorre principalmente em crianças menores de um ano (Nataro & Kaper, 1998). O principal sintoma clínico das infecções por EPEC é a 2 diarréia aguda, embora alguns casos de diarréia persistente também tenham sido relatados (Levine & Edelman, 1984; Donnenberg, 1995; Fagundes-Neto, 1996). A categoria das EPEC pode ser dividida em duas subcategorias, EPEC típica (tEPEC) e EPEC atípica (aEPEC), tendo por base a presença de um plasmídio de alto peso molecular denominado plasmídeo EAF – EPEC adherence factor (pEAF) (Kaper, 1996; Trabulsi et al., 2002). O mecanismo central de patogenicidade das EPEC compreende a promoção de uma lesão característica no epitélio intestinal denominada attaching and effacing (A/E) (Moon et al., 1983). Essa lesão caracteriza-se pela adesão íntima da bactéria ao epitélio intestinal e destruição localizada das microvilosidades intestinais, levando ao surgimento de uma estrutura em forma de pedestal na superfície da célula hospedeira, formada pelo acúmulo de actina polimerizada e outros elementos do citoesqueleto (Rothbaum et al., 1982; Knutton et al., 1987; Silva et al., 1989; Finlay et al., 1992). Diversas amostras da categoria STEC também produzem a lesão A/E, embora sua propriedade de virulência principal consista na produção de uma ou mais toxinas Shiga, que são codificadas por genes fágicos (stx) (Nataro & Kaper, 1998). Na lesão A/E, ocorre concentração de actina polimerizada (F-actina), o que levou ao desenvolvimento de um teste específico para identificar E. coli com atividade A/E, denominado teste de FAS (Fluorescent-actin staining) (Knutton et al., 1989). Nesse teste, a faloidina marcada com isotiocionato de fluresceína liga-se especificamente à actina filamentosa, em cultura de células epiteliais, abaixo de cada bactéria aderida. O teste de FAS representa um importante recurso no diagnóstico de EPEC e também de outros microrganismos capazes de produzir esta lesão histopatológica peculiar. Vários fatores estão envolvidos na formação da lesão A/E, dentre os quais uma adesina de membrana externa de 94 kDa, a intimina, que é codificada pelo gene eae. A 3 intimina liga-se ao seu receptor translocado Tir (Translocated intimin receptor) para produzir uma adesão íntima e irreversível à célula epitelial, levando a crer que a essência da infecção por EPEC deve-se a uma interação entre a região carboxi-terminal da intimina e Tir, translocada na superfície da célula eucariótica (Frankel et al., 1998). Estudos conduzidos por Kelly et al. (1998) demonstraram que a porção da intimina que se liga ao receptor na célula hospedeira está localizada nos 280 resíduos de aminoácidos da porção carboxi-terminal da molécula. Essa região da molécula de intimina que se liga ao receptor foi denominada Int280 (Frankel et al., 1995) A alta variabilidade da região carboxi-terminal da intimina originou uma classificação desta proteína em pelo menos 20 sub-tipos distintos de intimina. (Adu-Bobie et al., 1998; Zhang et al., 2002; Garrido et al., 2006; Blanco et al., 2006). Esta variabilidade no C-terminal de intimina pode estar relacionada com recombinação gênica, como forma de escape da resposta imune do hospedeiro, ou a uma adaptação a novos nichos ecológicos, uma vez que alguns dos diferentes sub-tipos de intimina parecem ter tropismo por diferentes segmentos intestinais. Além da intimina, uma série de outras proteínas, que são secretadas pela bactéria através de um sistema de secreção tipo III (SSTT), está envolvida na formação da lesão A/E. Essas proteínas são denominadas EPEC-secreted proteins (Esp), sendo as mais conhecidas EspA, EspB e EspD. Os genes que codificam a lesão A/E estão localizados dentro de uma ilha de patogenicidade denominada locus of enterocyte effacement (região LEE – representada na figura 1), a qual na amostra protótipo de EPEC E2348/69, apresenta ~35 kb (McDaniel et al., 1995). A região LEE está organizada em cinco regiões de funções conhecidas: LEE1, LEE2, LEE3, LEE5, e LEE4. Nas regiões LEE1, LEE2 e LEE3, encontram-se os genes que codificam o SSTT. Na região LEE4, encontram-se os genes 4 que codificam as Esps e em LEE5, localizam-se os genes eae (que codifica intimina), tir (que codifica Tir) e cesT (que codifica um chaperone essencial para a secreção e translocação do receptor Tir). Além desses elementos, LEE codifica proteínas efetoras (Map, EspF, EspG, EspH, EspZ), chaperones (CesAB, CesD, CesD2, e CesF) e proteínas reguladoras (Ler, GrlA, GrlR) (Dean et al., 2005; Deng et al., 2004). A ativação da região LEE1 por uma proteína heterodimérica que se liga ao DNA (IHF – Integration host factor) resulta na expressão de ler, o primeiro gene do operon LEE1. Ler é um regulador positivo de outros genes da região LEE (Mellies et al., 1999). Figura 1: Representação esquemática dos genes que compõe a região LEE. Adaptado de Dean, Maresca & Kenny (2005). No modelo proposto da patogênese de EPEC, as bactérias apresentariam uma aderência inicial às células do hospedeiro, possivelmente mediada por uma fímbria do tipo IV, denominada Bundle-forming pilus (BFP) e/ou pelo flagelo (Girón et al.,1991; Girón et al., 2002). Esse contato com a célula hospedeira ativaria genes do SSTT (escN, escV, escF, entre outros), para a formação de um complexo semelhante a uma seringa, onde filamentos de EspA, ligados ao SSTT por EscF, formariam uma organela na 5 superfície bacteriana que atuaria como um translocon por onde seriam injetadas nas células hospedeiras diversas proteínas efetoras e/ou receptoras, além das proteínas que formariam poros na membrana da célula hospedeira (EspB e EspD) (Chen e Frankel, 2005) Em EPEC, quando Tir é translocada, o domínio extracelular passa a atuar como receptor da intimina, enquanto que as porções amino- e carboxi-terminal ficam expostas no citosol. Na porção carboxi, um resíduo de tirosina é fosforilado e atua como mobilizador de proteínas do citoesqueleto: uma proteína adaptadora (Nck) recruta NWASP (Wiskott-Aldrich syndrom protein), que por sua vez ativa o complexo regulador de nucleação de actina Arp2/3 (Actin related protein 2/3), culminando com a formação do pedestal. Apesar de não influenciarem a formação da lesão A/E, foi demonstrado que algumas proteínas codificadas por LEE teriam alguma importância no desenvolvimento da diarréia. EspF atuaria nas tight junctions, levando à perda de resistência elétrica transepitelial e à indução de apoptose; EspH teria um papel na modulação da estrutura do citoesqueleto da célula hospedeira; Map (Mitochondrial-associated protein) interferiria na função mitocondrial e também na formação de filopódio e EspG, que apresenta seqüência semelhante à de genes de virulência em Shigella flexneri, seria responsável pela desestabilização da rede de microtúbulos da célula hospedeira. Recentemente, EspZ foi descrita como uma nova proteína secretada pelo SSTT, mas sua função permanece desconhecida (Kristen et al., 2005). Além das proteínas codificadas por LEE, 3 proteínas descritas recentemente, que não são codificadas por LEE, mas utilizam o SSTT para serem translocadas, podem alterar processos celulares quando da interação com as células hospedeiras: Cif (Cycleinhibiting factor), responsável pela interrupção da divisão celular (Marchès et al., 6 2003), EspI, também denominada NleA (non-LEE encoded factor) (Mundy. et al., 2004, Gruenheid, et al., 2001), essencial para virulência in vivo e EspJ, que atua modulando a dinâmica da infecção (Dahan et al., 2005). A Figura 2 é uma representação esquemática do translocon formado pelo sistema de secreção tipo III e pelas Esps. Figura 2: Representação esquemática do translocon formado pelo sistema de secreção tipo III e pelas proteínas secretadas. Adaptado de Nas tEPEC, muitos genes da região LEE são regulados in trans por um ativador transcricional denominado Plasmid encoded regulator (Per), que é codificado por pEAF. O regulador Per foi descoberto primeiramente devido à sua capacidade de aumentar a expressão de eae (Gomez-Duarte & Kaper, 1995). Embora os detalhes ainda sejam desconhecidos, é provável que o produto do regulador per (perA, perB, e perC) forme um complexo regulador global afetando a transcrição de vários genes localizados tanto no cromossomo como no pEAF, permitindo dessa forma que as tEPEC respondam 7 a diferentes condições ambientais e a diferentes fases de crescimento (Finlay & Abe, 1998). Uma característica fenotípica marcante entre as tEPEC é a produção do padrão de adesão localizada (AL), caracterizado pela formação de microcolônias bacterianas compactas sobre a superfície de células HeLa e HEp-2, após 3 horas de contato bactérias-células (Scaletsky et al., 1984). Aparentemente, o padrão AL está associado com a produção de BFP, sendo que esta fimbria exerceria funções de agregação bactéria-bactéria dentro das microcolônias bem como promoveria a aderência que precede a aderência íntima mediada pela intimina (Girón et al., 1991). A biogênese de BFP é codificada por um operon formado por 14 genes, localizado no pEAF (Sohel et al., 1996; Stone et al., 1996), sendo que a regulação da sua expressão envolve tanto genes plasmidiais (Tobe et al., 1996) como cromossômicos (Zhang & Donnenberg, 1996), além de sinais ambientais característicos do intestino delgado (Puente et al., 1996; Ordoñez, 1998). Estudos realizados por Bieber et al. (1998) demonstraram que, além de promover a agregação bacteriana em microcolônias, BFP estaria envolvida com o evento de dispersão das bactérias dos mesmos agregados e que uma amostra mutante nessa capacidade de dispersão apresentava uma virulência 200 vezes inferior, quando comparada com a amostra selvagem. Esse fenômeno de agregação e dispersão foi também examinado por Knutton et al. (1999), sendo associado às alterações na conformação da estrutura quaternária de BFP, cujos feixes de filamentos ficariam progressivamente maiores e mais espessos. Com a dispersão, as bactérias poderiam infectar outros sítios promovendo uma colonização mais eficiente da mucosa do intestino delgado. Essas evidências, no entanto, levaram a hipóteses controversas sobre o papel de BFP na aderência inicial de tEPEC às células intestinais, uma vez que Hicks 8 et al. (1998) sugeriram que BFP não estaria envolvida no estágio inicial de aderência de tEPEC a tecidos intestinais humanos mantidos in vitro, mas apenas na formação do complexo tridimensional das microcolônias. As aEPEC, por sua vez, apresentam como principal característica a presença da região LEE e ausência de pEAF e dos genes stx. Embora pertençam aos mesmos sorogrupos das tEPEC, seus antígenos flagelares são distintos, conseqüentemente, amostras típicas e atípicas de EPEC pertencem a diferentes sorotipos (Trabulsi et al., 2002). Amostras de alguns sorotipos de aEPEC apresentam fatores de virulência adicionais como a expressão da toxina enteroaggregative E. coli heat-stable toxin (EAST-1) nos sorotipos O128:H2 e O119:H2 (Dias, 1998), enterohemolisinas no sorotipo O111:H9 (Campos et al., 1994), o padrão de adesão agregativa a células epiteliais no sorotipo O125:H6 (do Valle et al., 1997) e a adesina afimbrial AfaE-1 no sorotipo O55:H7 (Keller et al., 2002). A grande maioria das amostras de aEPEC não é capaz de produzir AL em ensaios de aderência de 3 horas; de modo geral, essas amostras apresentam a formação de microcolônias mais frouxas, visualizadas após ensaios mais prolongados (ensaios de 6 horas) promovendo a chamada adesão semelhante à AL (AL-like) (Rodrigues et al., 1996). As principais características que diferem as tEPEC das aEPEC encontram-se listadas no Quadro 2. 9 Quadro 2: Principais características entre EPEC típica (tEPEC) e EPEC atípica (aEPEC). tEPEC aEPEC Lesão A/E Presente Presente pEAFa Presente Ausente Genes stx Ausente Ausente Expressão de BFP Presente Ausente Padrão de adesão AL (3 horas) AL-like/AD/AL(6 horas) O55:H6, O86:H34, O111:H2, O26:H11, O55:H7, O55:H34, O114:H2, O119:H6, O127:H6, O86:H8, O111ac:H8, O111:H9, O142:H6, O142:H34 O111:H25, O119:H2b, O125ac:H6, Principais sorotipos O128:H2b a detectado por hibridação com uma seqüência críptica de pEAF (sonda EAF) b contêm o operon bfp incompleto (Bortolini et al., 1999) Pelo menos até meados da década de 90, tEPEC foi a causa principal de diarréia infantil no Brasil (Trabulsi et al., 1961; Toledo et al., 1983; Trabulsi et al., 1985; Gomes et al., 1991; Rosa et al., 1998; Scaletsky et al., 1999) e outros países em desenvolvimento, embora fosse rara em países desenvolvidos (Nataro & Kaper, 1998). Atualmente, aEPEC parece apresentar um maior significado em diarréia em países desenvolvidos e alguns estudos preliminares vêm sugerindo que esse grupo tem emergido como causa importante de diarréia também nos países em desenvolvimento (Trabulsi et al., 2002, Franzolin et al., 2005). 10 3. Adesinas em Escherichia coli diarreiogênicas A existência de fatores de aderência adicionais a intimina tem sido então sugerida, e diversos estudos utilizando modelos com linhagens celulares epiteliais e intestinais in vitro têm sido realizados, no sentido de investigar a existência e a natureza de novas adesinas tanto em amostras de STEC como em amostras de aEPEC. Tarr et al. (2000) identificaram, no DNA de uma amostra de E. coli O157:H7, um gene cromossômico associado com aderência, que codifica uma proteína similar à proteína IrgA de Vibrio cholera (Goldberg et al., 1992). Essa proteína de 67 kDa foi denominada adesina homóloga a IrgA (Iha). Estudo realizados por Nicholls et al. (2000), em amostras de STEC-LEE positivas, caracterizaram o locus gênico efa 1 (fator de aderência de EHEC), o qual foi responsável pela adesão de STEC O111:H- em culturas de células CHO. LifA (lymphostatin) é uma proteína de 365 kDa homóloga a Efa 1 encontrada em amostras de EPEC. Tatsuno et al. (2001) investigaram o papel do plasmídio pO157 na aderência de E. coli O157:H7 (cepa Sakai) e relataram a importância de um gene denominado toxB na aderência dessa amostra e na inibição de ativação de linfócitos gastrointestinais murinos e humanos. Torres et al. (2002) descreveram no cromossomo de EHEC O157:H7, cepa EDL933, um operon fimbrial com alta homologia ao operon da fímbria polar longa (LPF) de Salmonella enterica serovar Typhimurium. Esse estudo revelou que LPF participa no aumento da aderência de E. coli O157:H7 a células eucarióticas e tem importante papel na formação de microcolônias bacterianas. No mesmo ano, Doughty et 11 al. (2002) descreveram um operon fimbrial relacionado à LPF em amostras de STEC pertencentes ao sorotipo O113:H21 (lpfO113). Paton et al. (2001) ao estudar o megaplasmídeo de uma amostra de STEC O113:H21 (98NK2) identificou um gene denominado saa que codifica uma adesina autoaglutinante. Essa adesina autoaglutinante (Saa) foi a primeira a ser descrita em amostras de STEC LEE-negativas. Estudos recentes conduzidos por Scaletsky et al. (2005) identificaram a existência de uma nova adesina em uma amostra de aEPEC do sorotipo O26:H11. Um inserto de aproximadamente 15 kb da região genômica dessa amostra denominada locus for diffuse adherence (lda), confere aderência difusa em células HEp-2 quando expressa em E. coli K-12. Surpreendentemente, ensaios de mutagênese sítio dirigida no gene ldaG (subunidade estrutural) não mostrou nenhuma alteração no padrão de aderência da amostra original. Os genes envolvidos com a biogênese da fímbria tipo 1 estão organizados em um operon cromossômico, presente na maioria das amostras de E. coli independentemente de sua origem (Orndorff & Bloch, 1990). O produto do gene fimH (FimH) determina a ligação aos receptores celulares e também tem capacidade de ligarse à fibronectina (Krogfelt et al., 1990). 4. Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) em sorogrupos não EPEC Em estudos epidemiológicos conduzidos em São Paulo pelo laboratório da Dra. Tânia Gomes em colaboração com o Centers for Disease Control and Prevention de Atlanta, Ga., U.S.A., a região LEE (avaliada pela presença do gene eae) foi encontrada 12 em um grupo de amostras de E. coli não pertencentes aos sorogrupos de EPEC, as quais eram desprovidas de pEAF e dos genes stx (E. coli eae+ EAF- stx-) (Gomes et al., 1998). Com base nessas características genéticas tais amostras foram, posteriormente, classificadas como EPEC atípicas. Amostras de EPEC atípicas, não pertencentes a sorogrupos de EPEC, foram isoladas tanto de crianças diarréicas como de algumas crianças sem alterações gastrointestinais (Gomes et al., 1998). Com o intuito de caracterizar o potencial de virulência dessa coleção de amostras, Vieira et al. (2001) realizaram uma extensa análise genotípica e fenotípica dessas amostras. Essa análise revelou uma diversidade de combinações de genes de virulência das demais categorias patogênicas de E. coli. Entretanto, um sub-grupo, desprovido de quaisquer desses marcadores, apresentando apenas o gene eae, foi o único que mostrou associação epidemiológica com diarréia (Vieira et al., 2001). Portanto, no nosso entender, esse sub-grupo é de grande interesse, uma vez que, em diversos estudos epidemiológicos sobre a diarréia aguda, cerca de 20 a 30% dos casos ainda permanecem sem diagnóstico (Gomes et al., 1991; Rosa et al., 1998). Vieira et al. (2001) verificaram também que, com a exceção de uma única amostra, que causou destacamento celular, todas as demais amostras de sua coleção aderiam às células HeLa e Caco-2, a maioria exibindo o padrão AL-like ou variações do padrão AL. No entanto, um grupo de 9 amostras apresentou a formação de microcolônias compactas compatíveis com AL, embora apenas em ensaios de 6 horas (AL6). Foi investigada, nessas amostras, a presença do gene bfpA, que codifica a subunidade estrutural da fímbria BFP (Donnenberg et al., 1992; Sohel et al., 1993) e verificou-se que eram desprovidas do referido gene. Tal resultado levou-nos a um estudo preliminar onde investigamos, por meio de immunoblot, com soro policlonal anti-BFP, se algumas dessas amostras eram capazes de expressar BFP, e o observado foi 13 que nenhuma delas apresentou bandas compatíveis com a dessa fimbria. Esse resultado lêvantou uma importante questão: Que tipo de estrutura estaria mediando a interação bacteriana evidente no padrão AL? Essa estrutura teria papel na aderência a células cultivadas ou mantidas in vitro? 14 Objetivo O presente estudo tem como objetivo principal identificar e caracterizar a estrutura relacionada à formação de microcolônias bacterianas compactas, características do padrão AL (6 h), em uma amostra de EPEC atípica, desprovida de BFP e não pertencente a sorogrupos de EPEC. 15 Material e Métodos 1. Amostras bacterianas As 9 amostras de aEPEC, produtoras de AL6, estudadas foram isoladas de 5 crianças (16 a 41 meses de idade) com diarréia e 4 crianças sem diarréia na cidade de São Paulo, São Paulo, Brasil (Vieira et al., 2001). Elas pertenciam a pelo menos 8 sorotipos distintos compreendendo, portanto, clones distintos (Vieira et al., 2001). Inicialmente, todas as amostras foram avaliadas quanto à pureza, por meio de testes bioquímicos convencionais, e quanto à manutenção das propriedades de virulência já estabelecidas, conforme Vieira et al. (2001). Nos diversos experimentos que compõem este estudo, foram utilizadas, como controles, as seguintes amostras: E. coli E2348/69 (amostra protótipo de tEPEC, sorotipo O127:H6, produtora de AL) e as amostras não patogênicas E. coli-K12 HB101 e DH5α. Na Tabela 1, encontram-se listadas todas as amostras bacterianas e plasmídios utilizados neste estudo bem como suas principais características. Os cultivos bacterianos foram realizados em caldo Luria Bertani (LB-anexo 1.1), ágar MacConkey (Difco Laboratories) e Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM), conforme as necessidades experimentais. Todas as amostras foram conservadas a -70ºC em caldo Luria-Bertani (LB), acrescido de 20% de glicerol (LB-glicerol). 16 Tabela 1: Características e origem das amostras de E. coli e plasmídios utilizados neste estudo Amostra ou plasmídio Características relevantes Referência ou origem 0471-1 0621-6 1331-2 1551-2 2041-1 Amostras de aEPEC, sorogrupo não EPEC, que expressam AL6 Vieira et al. (2001) 1112-6 2932-2 3522-6 4632-3 1551-2:eae- Amostra 1551-2 mutada no gene eae Este estudo E2348/69 Amostra protótipo de tEPEC do sorotipo O127:H6 Levine et al. (1985) CVD206 E2348/69 mutada em eae Donnenberg & Kaper 1991 HB101 E. coli híbrida B/K-12 (Sm) Boyer & Roulland-Dussoix, 1969 DH5α E. coli supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZ ΔM15) hsdR17 Sambrook et al., 1989 DH5αλpir DH5α lisogenizada com λpir (Nal) Elliott & Kaper, 1997 S17αλpir Pro, res-, mod+, RP4-2, Tc::UM-Km::Tn7 (SM) Simon et al., 1983 R861 Amostra de E. coli portadora de plasmídios de pesos moleculares conhecidos Central Public Health Laboratory, Londres, Reino Unido pJP5603 Plasmídio vetor suicida de baixo número de cópias contendo o replicon R6K; 3,1kb (Km) Penfold & Pemberton, 1992 pGEM-T Easy Vetor plasmidial utilizado para clonagem de produtos amplificados por PCR Promega pMOSBlue Vetor plasmidial utilizado para clonagem de produtos Blunt Amersham Biosciences pRT1 pGEM-T Easy contendo um fragmento de ~924pb amplificado com os primers AE11/AE12 Este estudo pRT2 pJP5603 contendo um fragmento EcoRI de ~924pb do gene eae extraído de pRT1 Este estudo pISEQ1, 2 e 3 pMOSBlue contendo um fragmento de ~3kb amplificado com os primers AE11/escD Este estudo pCVD438 pACY184 contendo o gene eae da amostra E2348/69 Donnenberg & Kaper 1991 17 2. Teste de Adesão O padrão de adesão das amostras empregadas neste estudo foi avaliado em testes em células HeLa, empregando-se a metodologia descrita por Cravioto et al (1979). Monocamadas celulares incompletas, dispostas em microplacas de 24 orifícios contendo lamínulas de vidro de 13 mm (preparadas no laboratório de cultivos celulares da Disciplina de Microbiologia), foram lavadas com PBS (anexo 2.1) esterilizado e 1 mL de Dulbecco Modified Essential Medium (DMEM) (anexo 2.2), acrescido de 2% de soro fetal bovino e 1% de D-manose (anexo 2.3), foi adicionado a cada orifício da placa. Em seguida, 20 uL de cultura bacteriana (cultivo em LB overnight) foram adicionados à preparação e, após 6 h de incubação a 37oC (com intervalo para lavagem e troca de meio após 3 horas), as preparações foram lavadas com PBS esterilizado, fixadas com metanol e coradas com solução de May Grünwald (anexo 2.5) por 5 minutos e com solução de Giemsa (anexo 2.6) por 20 min. As lamínulas foram observadas ao microscópio óptico em aumento de imersão. O ensaio de cinética de adesão, realizado para amostras selecionadas, foi conduzido conforme a metodologia descrita acima, porém com os seguintes períodos de incubação: 1 h, 2 h, 3 h, 4 h (3 h+1 h), 5 h (3 h+2 h) e 6 h (3 h+3 h). Após os diferentes períodos de incubação, as preparações foram lavadas, fixadas, coradas e examinadas como descrito acima. Para a pesquisa da termorregulação da aderência, os ensaios de adesão foram incubados à 18ºC por 3 horas. Após esse período, a monocamada foi lavada com PBS, um novo meio foi adicionado e a placa foi reincubada à 18ºC por mais 3 horas. Em seguida, as preparações foram lavadas, fixadas, coradas e examinadas como descrito acima. 18 3. Teste de FAS (Fluorescent actin-staining) A capacidade de causar acúmulo de actina em células HeLa foi avaliada pelo teste de FAS (Knutton et al., 1989). Para essa finalidade, foi realizado um teste de adesão, em cujo final, as células foram fixadas com solução de formaldeído a 3% (anexo 3.1), lavadas e permeabilizadas com Triton X-100 a 1% (anexo 3.2), durante 5 minutos. Após lavagens, as preparações foram tratadas com FITC-faloidina (solução de isotiocianato de faloidina marcada com fluoresceína) a 5 μg/mL (anexo 3.3) e lavadas novamente. Em seguida, as lamínulas foram montadas em lâmina de vidro com 10 μL de glicerol a 90% em PBS e analisadas por microscopia de fluorescência. 4. Immunoblotting As amostras foram pré-cultivadas em LB por 18 h a 37ºC. A seguir, foram inoculados 100 μL destas culturas em 10 mL de DMEM e esse volume foi incubado a 37ºC, sob agitação constante, por um período de aproximadamente 6 h. Em seguida, as culturas foram centrifugadas a 15.000 g por 15 minutos, os sedimentos foram ressuspensos em 150 μL de tampão de amostra (anexo 4.1) e posteriormente, as suspensões foram fervidas por 10 minutos, segundo a metodologia descrita por Laemmli (1970). As proteínas separadas através de SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio) a 12% (anexo 4.4) foram transferidas para membrana de nitrocelulose por eletroforese. As membranas foram bloqueadas por 2 h com soroalbumina bovina (BSA a 3% - anexo 5.2) em solução de Tris pH 7,3 contendo Tween 20 à 0,05% (anexo 5.3). Em seguida, foram tratadas por 1 hora com o soro policlonal diluído 500 vezes em Tampão Tris (anexo 5.3). Após as lavagens, foi adicionado o anticorpo secundário, anti-imunoglobulina de coelho, produzido em cabra 19 e conjugado com fosfatase alcalina (Sigma Chemical Co. – St. Louis, MO, USA) a uma diluição de 1:2000, durante 1 h. As membranas foram reveladas pela imersão em solução do substrato diaminobenzidina. O soro anti-BFP foi gentilmente cedido pelo Dr. Jorge Girón (University of Arizona, Tucson, AZ), o soro anti-intimina universal foi gentilmente cedido pelo Dr. Gad Frankel (Imperial College of Science, Technology and medicine, Londres, Reino Unido) e o soro produzido contra a amostra 1551-2:eae-, foi obtido neste estudo. 5. Imunomarcação com o soro anti-BFP As amostras foram primeiramente cultivadas em LB (anexo 1.1), por 18 h a 37ºC. Após o crescimento, foi realizada uma diluição 1:100 em DMEM (anexo 2.2) acrescido de 2% de soro fetal bovino, e incubadas por 3 h a 37ºC sem agitação. Após esse período de incubação, as amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 700g, o DMEM foi retirado e o sedimento, lavado com 1 mL de PBS esterilizado. Novamente as amostras foram centrifugadas nas mesmas condições e o sedimento foi ressuspenso em 100 μL de PBS esterilizado. De cada suspensão foram aplicados 10 μL em tela para microscopia eletrônica. Após 5 minutos, o excesso das suspensões foi retirado e 10 μL do soro anti-BFP, diluído 1:5 em PBS-BSA a 1%, pH 8,0, foram aplicados à preparação. Após 1 hora à temperatura ambiente, as telas foram submetidas a 5 lavagens consecutivas com PBS-BSA a 1%, pH 7,2, e então, adicionados 10 μL do conjugado proteína A-ouro coloidal, diluído 1:10 em PBS-BSA a 1%, pH 7,2. Após 1 hora, as preparações foram lavadas 5 vezes com PBS-BSA a 1%, pH 7,2 e 5 vezes com água bidestilada, e coradas com molibdato de amônio a 2% para posterior análise em 20 microscópio eletrônico de transmissão Leo 906E, no laboratório de Biologia Celular do Instituto Butantan, em colaboração com a Drª Sylvia Mendes Carneiro. 6. Microscopia eletrônica de transmissão Primeiramente, foi realizado um ensaio de interação de 6 horas com células HeLa cultivadas até a obtenção de monocamadas semi-confluentes, sobre lamínulas de vidro colocadas nos poços de microplacas de 24 orifícios. Após esse período de interação, as células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas em solução fixadora durante, no mínimo, 2 horas. Resumidamente, as células foram pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 1% (anexo 6.3) e desidratadas em gradiente de etanol (Merck). A embebição e inclusão do material foram feitas em resina Spurr (Spurr, 1969) da seguinte maneira: cápsulas de gelatina transparente foram preenchidas com a resina e emborcadas sobre as lamínulas, previamente recobertas por uma fina camada de resina, no local de maior densidade de material. As lamínulas com as cápsulas mantidas na vertical foram levadas para polimerizar em estufa a 70ºC durante 2 horas. Em seguida, as lamínulas foram retiradas com jato de N2 líquido e as cápsulas com material foram levadas ao ultramicrótomo MT6000 (Sorvall) para a confecção de cortes finos (60-70 nm). Os cortes foram coletados em grades de cobre e contrastados com acetato de uranila a 2% (anexo 6.4) e citrato de chumbo (anexo 6.5) (Reynolds, 1963). O exame do material e as micrografias eletrônicas foram feitos ao Microscópio Eletrônico de Transmissão Leo 906E, no laboratório de Biologia Celular do Instituto Butantan em colaboração com a Drª Sylvia Mendes Carneiro. 21 7. Técnicas de manipulação e de análise de DNA Exceto quando indicado, as técnicas de manipulação e de análise de DNA utilizadas estão descritas em Sambrook et al. (2001) e Ausubel et al. (1995). 7.1 Extração de DNA plasmidial em pequena escala A extração de DNA plasmidial em pequena escala foi realizada utilizando-se o kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, WI, USA), conforme recomendações do fabricante. 7.2 Extração de DNA plasmidial em larga escala O kit Qiagen – Plasmid Midi (Quiagen Inc., EUA) foi empregado para a extração de DNA em larga escala, segundo recomendações do fabricante. Os sedimentos de DNA foram ressuspensos em TE (anexo 7.5) e analisados quanto a sua pureza e concentração em gel de agarose. 7.3 Eluição dos fragmentos do DNA do gel de agarose Após separação e visualização dos fragmentos de DNA, estes foram eluídos do gel utilizando o kit: Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, USA), conforme recomendações do fabricante. 22 7.4 Reações de digestão de DNA As reações de digestão com as enzimas de restrição foram realizadas em um volume final de 20 μL. As reações foram realizadas empregando-se os tampões e as temperaturas apropriadas, de acordo com as recomendações do fabricante para cada enzima de restrição empregada neste estudo. 7.5 Reação de precipitação do DNA O DNA foi precipitado pela adição, a uma solução de 100 μL de DNA em tampão TE, de 10 μL de acetato de sódio 3 M (pH 4,8) e 300 μL de etanol (p.a.), a solução foi homogeneizada e incubada a -70ºC durante 1 hora. Após este período a solução foi centrifugada a 4ºC durtante 15 minutos a 16.000 g, o sobrenadante foi então descartado e 800 μL de etanol 80% foram acrescentados para lavagem do sedimento. A solução foi novamente centrifugada a 16.000 g por 5 minutos. Após essa centrifugação todo etanol foi removido e o sedimento foi seco à temperatura ambiente e então ressuspenso em água ou no tampão de interesse. 7.6 Extração de DNA genômico A extração de DNA genômico foi realizada utilizando-se o Easy-DNA™ Kit (For genomic DNA isolation – Protocol #3 – Invitrogen, USA), conforme recomendações do fabricante. 23 7.7 Eletroporação O DNA recombinante foi transformado em células bacterianas competentes através de eletroporação. As células competentes foram preparadas segundo metodologia descrita por Ausubel et al., (1995), aliquotadas em volumes de 40 μL e mantidas à -70ºC. Para a transformação, as células competentes foram descongeladas em gelo e 1 μL de DNA plasmidial foi adicionado à alíquota de células competentes. Essa msitura foi transferida para cubetas apropriadas de 0,2 cm (Biorad, EUA), previamente resfriadas. Para eletroporação foi utilizado um eletroporador GenePulse (Biorad, EUA), a 2,5 kV, 25 μF e controle de pulso de 200Ω. Após a eletroparação foi adicionado imediatamente 1 mL de mio SOC (anexo 10) à reação, e a mesma foi incubada à 37ºC durante 1 hora sob agitação a 250 r.p.m. Em seguida, os cultivos foram plaqueados em diferentes volumes em agar LB (anexo 1.1) contendo antibioóticos apropriados e as placas incubadas à 37ºC por 18 horas. 7.8. Reação de polimerização em cadeia (PCR) A técnica de PCR utilizou DNA molde obtido a partir de uma colônia bacteriana cultivada em meio sólido (16-18 horas a 37ºC), ressuspensa em 300 μl de água bidestilada esterilizada e submetida à fervura durante 10 minutos. As reações foram realizadas em banho de gelo, em tubos tipo Eppendorf de 0,2 ml, onde foram colocados o DNA molde (lisado bacteriano) e todos os reagentes (Invitrogen, USA) descritos a seguir: 24 Tampão PCR (10 x)..................................................................... 1x dNTPs (1 mM)............................................................................ 0,2 mM* MgCl2 (50 mM)........................................................................... 1,5 mM Primer F...................................................................................... 100 pmoles Primer R...................................................................................... 100 pmoles Taq DNA polimerase (5U/μl)...................................................... 2,5 U DNA molde................................................................................. 5,0 μl Água bidestilada esterilizada q.s.p. ............................................. 50,0 μl * Concentração final de cada nucleotídeo em uma reação. Em seguida, as preparações foram colocadas em um aparelho termociclador (GeneAMP PCR System 2400, Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) e submetidas a ciclos específicos de condições de desnaturação, anelamento e extensão. As seqüências nuleotídicas dos primers utilizados estão descritas na Tabela 2. 25 Tabela 2: Primers e condições utilizadas para os ensaios de PCR Marcadores saa Descrição Seqüências (5’ – 3’) desnaturação Anelamento extensão 94ºC 30 seg. 58ºC 1min. 72ºC 40 seg. 94ºC 45 seg. 55ºC 30 seg. 72ºC 90 seg. 94ºC 1min. 64ºC 1min. 72ºC 1min. 59ºC 1 min. Jenkins et al. 2003 760 pb Batisson et al. 2003 250 pb Badea et al. 2003 72ºC 1min. 925 pb Szalo et al. 2002 55ºC 1min. 72ºC 2min. 920 pb Scaletsky et al. 2005 94ºC 1min. 52ºC 50seg. 72ºC 1min. 573 pb Doughty et al. 2002 94ºC 1min. 65ºC 1min. 72ºC 1min. 391 pb Deng et al. 2001 94ºC 30seg. 52ºC 1min. 72ºC 2min. 30seg. 2.685 pb Zhang et al. 2002 CGT GAT GAA CAG GCT ATT GC porcine A/Eassociated gene CTC GAG AGT GCC TTT CCT GG Plasmidial locus found in EHEC O157:H7 implicated in adhesion TAA AGC AGA AAA ATG CGA CAG AAG AT IrgA homologous adhesion CAA ATG GCT CTC TTC CGT CAA TGC CAG GTC GGG GTT ACC AAG T 94ºC 1 min. ldaG Locus for diffuse adherence AAA GAT CTG TGA TGA GGT TCA GGT GAA G AAA TCT AGA TGC AGA CGC AAC TAC AGC CA 94ºC 1min. lpfAO113 long polar fimbria ATG AAG CGT AAT ATT ATA G paa toxB iha GGA TCC ATG AGG AAC ATA A TAG TAA GTA GAG TAG AAC TGG GGG ATG TTA TTT CTT ATA TTC GAC ler LEE-encoded regulator eae ι Intimina Iota CAT CCG TGA TGG TCT GCT GAC C ACA GCT GAC GGC CCA CCC AG TTT ATC CTG CTC CGT TTG CT CCC GAA TTC GGC ACA AGC ATA AGC Referências 119 pb STEC autoagglutinating adhesion ATG GAC ATG CCT GTG GCA AC Tamanho do fragmento Condições 26 Tabela 2 (continuação) - Primers e condições utilizadas para os ensaios de PCR. Marcadores eae ζ Descrição Intimina Zeta eae (AE11/AE12) Região conservada do gene eae cat Gene que confere resistência ao cloranfenicol encontrado no plasmidio pBSL181. bfpL Bundle-forming pillus Seqüências (5’ – 3’) Fímbria tipo I Anelamento extensão 53ºC 1min. 72ºC 2 min. 30seg. 2.430 pb CCC GAA TTC GGC ACA AGC ATA AGC 94ºC 30seg. CCC GGC ACA AGC ATA AGC TAA ATG ACT CAT GCC AGC CGC TCA 94ºC 1min. 68ºC 1min. 72ºC 1min. 924 pb GGG CAC CAA TAA CTG CCT TA 94ºC 1min. 60ºC 1min. 72ºC 1min. 1.000 pb Este estudo 94ºc 30seg. 58ºC 30seg. 72ºC 1min. ~500 pb Drª Rosa Maria Silva (comunicação pessoal) 94ºC 30seg. 63ºC 30seg. 72ºC 1min. ~508 pb Johnson & Stell 2000 94ºC 30seg. 57ºC 30seg. 68ºC 5min. ~3.100 pb* TAG TTG TAC TCC CCT TAT CC TGT GAC GGA AGA TCA CTT CG GAG TGG TGT CAC AGG GCT TCT GTT GAC GTC ACC TGC CCT CCG GTA TGC AGA ACG GAT AAG CCG TGG eae (AE11/escD) Intimina Referências desnaturação ACA GTT CTG GTG GTG CTA TCC CGT fimH Tamanho do fragmento Condições CCC GGC ACA AGC ATA AGC TAA CAG AAC ATT CAG CCG TAC Zhang et al. 2002 Gannon et al. 1993 Gannon et al., 1993; este estudo * Fragmento amplificado com Elongase® Amplification System (Invitrogem, USA) 27 7.9 Perfil plasmidial (Birnboim & Doly) A análise do perfil plasmidial foi realizada por meio da extração dos plasmídios por lise alcalina, segundo metodologia descrita por Birnboim & Doly (1979). As amostras em estudo foram semeadas em LB (anexo 1.1) e incubadas a 37ºC durante 12-18 horas, sob agitação. Após esse período, as culturas foram centrifugadas, o sobrenadante desprezado e o sedimento ressuspenso em 100μL de solução I (anexo 7.1). Depois de um período de 30 minutos em banho de gelo, foram adicionados 200 μL de solução II (anexo 7.2). Depois de homogeneizadas, as preparações foram adicionadas de 150 μL de solução III (anexo 7.3) e, após 15 minutos de centrifugação a 16.000g, 100 μL da solução de acetato de sódio (anexo 7.4) foram acrescentados juntamente com 250 μL de etanol a 80%, e as preparações foram incubadas por 30 minutos a -20ºC. Após este intervalo, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 16.000g, o sobrenadante aspirado e 2 volumes de etanol a 70% foram adicionados, deixando as amostras à temperatura ambiente por 2 minutos. As preparações foram novamente centrifugadas por 2 minutos e os sobrenadantes aspirados. Depois de secos em temperatura ambiente, os sedimentos foram suspensos em 20 μL de TE (anexo 7.5). Após a extração, o DNA plasmidial foi analisado através de eletroforese em gel de agarose (0,7%). As bandas de DNA plasmidial da amostra E. coli R861 foram utilizadas como marcadores de pesos moleculares conhecidos. 28 7.10 Construção do mutante em eae por nocaute não polar A estratégia de mutagênese não-polar foi empregada com a finalidade de se obter uma derivada da amostra 1551-2 que não expressasse intimina. Para atingir este objetivo, foi utilizado o vetor suicida pJP5603, clonado com parte do gene a ser nocauteado (Penfold & Pemberton, 1992). Inicialmente, um fragmento de 924 pb do gene eae foi amplificado, a partir da amostra selvagem 1551-2, e clonado no vetor pGEM – T Easy (Promega, Madison, WI, USA). Após ligação, células competentes de E. coli JM109 foram transformadas por eletroporação e plaqueadas em agar LB contendo ampicilina (100 μg/ml), IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosídio) (0,5 mN) e X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-βD-galactosídio) (80 μg/ml), conforme descrito pelo fabricante. As colônias brancas, resistentes a ampicilina, foram selecionadas para confirmação da presença do inserto por PCR e por reações de digestão com EcoRI. Após essa etapa de clonagem, o fragmento do gene eae clonado em pGEM – T Easy foi extraído do vetor com EcoRI, eluído do gel utilizando o kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, WI, USA), e ligado ao vetor pJP5603 (Km) no sítio de EcoRI. Após ligação, as células competentes de E. coli DH5αλpir foram transformadas também por eletroporação e plaqueadas em ágar LB contendo canamicina (50 μg/mL) e X-Gal (80 μg/ml). As colônias brancas, resistentes a canamicina, foram selecionadas e testadas para a presença do inserto por PCR. As colônias que apresentaram o inserto foram armazenadas a –70ºC em LB-glicerol contendo canamicina. Em seguida, o DNA recombinante foi extraído e transferido para E. coli S17-λpir por eletroporação. Para os experimentos de conjugação, foi utilizada como receptora a amostra selvagem 1551-2 que apresenta resistência ao ácido nalídixico (selecionada neste estudo). As amostras de E. coli S17-1λpir (KmR) (doadora) e 1551-2 (NalR) (receptora) 29 foram cultivadas por 16 a 18 h em 3 ml de caldo LB contendo os respectivos antibióticos. Em seguida, 1 ml da doadora e 100 μl da receptora foram centrifugados a 700g, por 15 minutos, e ressuspensos em 100 μl de LB. Os cultivos foram misturados sobre a superfície de membranas de filtração de poros de 0,45 μm (Millipore), dispostas sobre placas de Petri contendo ágar LB. Duas membranas foram colocadas em cada placa. Após incubação por 16 a 18 h, o crescimento de cada membrana foi suspenso novamente em 10 ml de PBS. A seguir, 50, 100 e 150 μl da suspensão (mistura de conjugação) foram semeados em ágar LB contendo canamicina e ácido nalidíxico. Os mutantes aqui selecionados foram avaliados quanto à perda da capacidade de expressar a adesina intimina por immunoblot, utilizando anti-soro específico contra intimina, gentilmente cedido pelo Dr. Gad Frankel do Imperial College of Science, Londres. 7.11 Mutagênese por Mini-Tn 10 O Transposon Mini-Tn10 foi empregado para a construção de um banco de mutantes da amostra 1551-2:eae-, já mutada no gene eae, que codifica a adesina intimina. O Transposon Mini-Tn 10 (Alexeyev et al., 1995) foi introduzido na amostra 1551-2:eae- por conjugação entre a amostra doadora S17-λpir (que contém o plasmídio pBSL181, com o transposon Mini-Tn10) e amostra receptora, 1551-2:eae-. As amostras S17-λpir (pBSL181) doadora (CloR) e 1551-2:eae- receptora (NalR) foram cultivadas por 16 a 18 horas em 3 ml de caldo LB contendo os respectivos antibióticos. Em seguida, 1 ml da doadora e 100 μl da receptora foram centrifugados a 700g, por 15 minutos e ressuspensos em 100 μl de LB. 30 Os cultivos foram misturados sobre a superfície de membranas de filtração de poros de 0,45μm (Millipore), dispostas sobre placas de Petri contendo ágar LB. Após incubação por 18 horas, o crescimento de cada placa contendo as membranas foi suspenso em 10 ml de PBS. Foram realizados 10 eventos de conjugação. 7.12 Pesquisa de Determinantes Genéticos de Virulência pelo ensaio de Hibridação de Colônias (Colony blot) As amostras de aEPEC foram semeadas em 3 mL de caldo LB (anexo 1.1) e incubadas por 16 horas em estufa a 37ºC. A seguir, foram semeadas em placas de agar MacConkey , por meio da técnica de placas mestre e incubadas por 16 horas à 37ºC. Em seguida, uma folha de papel de filtro Whatman nº. 541 (Whatman, New Jersey, EUA) de mesmo diâmetro da placa foi pressionada sobre as colônias bacterianas a fim de transferi-las para os filtros, procedendo-se à incubação dos mesmos por 1 hora à 37ºC. Os filtros assim obtidos foram tratados segundo metodologia descrita por Maas (1983), com solução desnaturante (anexo 8.1), expostos aos vapores de água fervente durante 3 minutos e novamente tratados com solução desnaturante por 1 minuto, à temperatura ambiente. Após esse período, os filtros foram imersos em solução neutralizante (anexo 8.2) durante 4 minutos e colocados para secar a 65ºC. Os fragmentos de DNA utilizados como sondas foram obtidos por PCR, marcados com 50 μCi de [α-32P] dCTP (Amesham Biosciences UK Limited), com atividade específica de 3.000 Ci/nmol utilizando-se o kit Ready-To-Go DNA labelling Beads (-dCTP) (Ameshan Biosciences UK Limited), segundo especificações do fabricante. Os fragmentos de DNA, num total de 100ng, em volume de 45μL de água, foram desnaturados por 5 minutos a 100ºC e, em seguida, mantidos em banho de gelo. 31 A solução foi transferida para os microtubos do kit contendo a mistura de marcação e delicadamente homogeneizada. Em seguida, 50 μCi de [α-32P] dCTP foram adicionados à mistura e o tubo foi incubado a 37ºC por 20 minutos. A purificação dos nucleotídeos marcados não incorporados foi realizada em microcolunas de Sephadex G50 ProbeQuant G50 microcolumns (Pharmacia-Biotech, New Jersey, EUA), segundo recomendações do fabricante. O fragmento sonda assim obtido foi mantido a -20ºC até o momento do uso. Os filtros foram incubados durante 1 hora à 65ºC, em solução de pré-hibridação (anexo 8.4) acrescida de 100μg/mL de DNA desnaturado de esperma de salmão (Eppendorf, USA), sob agitação lenta. Foi empregado o volume de 5mL de solução de hibridização por filtro. Em seguida, os filtros foram transferidos para sacos plásticos contendo nova solução de pré-hibridação (anexo 8.4) acrescida de aproximadamente 105 cpm/mL da sonda radioativa, previamente desnaturada à 100ºC por 5 minutos. Os sacos de hibridização foram selados e incubados por 18 horas à 65ºC sob agitação lenta. Após este período, os filtros foram transferidos para recipientes adequados para posterior lavagem. A seguir, a solução de hibridação contendo a sonda radioativa foi retirada, e os filtros foram lavados por duas vezes durante 15 minutos à 65ºC, sob agitação lenta, em solução de SSC a 0,1 x e SDS a 0,1% e duas vezes em solução de SSC a 0,1 x e SDS a 0,05%. Após este período, os filtros foram secos à temperatura ambiente e autoradiografados, pela exposição a filmes de raio X (X-Omat-R, Eastman Kodak – Rochester, NY, USA), em cassetes apropriados contendo tela intensificadora, por 18 horas à -70ºC. Em seguida, o filme foi revelado em revelador automático de filmes de raios X. 32 7.13 Southern blotting Após separação eletroforética e visualização do DNA genômico digerido, o gel de agarose foi submetido a dois banhos de aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente com solução desnaturante (anexo 9.1). Em seguida, o gel foi submetido a dois banhos de água para lavagem da solução desnaturante e transferido para dois banhos consecutivos de solução neutralizante (anexo 9.2) por 15 minutos à temperatura ambiente. O DNA genômico da amostra 1551-2 e do seu mutante em intimina (extraído com o kit DNA Easy – Invitrogen), digeridos com HindIII, foi tranferido do gel de agarose para a membrana de nylon positivamente carregada, utilizando-se o aparato de transferência Vaccugene XL – Vaccum Blotting System (Pharmacia, EUA), durante 1 hora sob vácuo a baixa pressão (50 mbar), segundo recomendação do fabricante. Após transferência, a membrana de nylon contendo o DNA cromossômico foi retirada do equipamento e submetida a um banho de 20 minutos à temperatura ambiente com solução SSC 2 x, e seca ao ar. A seguir a membrana foi colocada em um recipiente, que continha solução de pré-hibridação por 1 hora à 37ºC. As membranas foram então submetidas à hibridação com sonda marcada radioativamente para sequências gênicas de nosso interesse, sendo processadas e reveladas como descrito para o Colony-blot. 33 8. Produção de anti-soro em coelho A amostra 1551-2:eae- foi cultivada em DMEM a 37ºC por 18 h sem agitação. Em seguida, as células bacterianas foram coletadas e ressuspensas em 2 ml de PBS com 0,5% de formaldeído, procedimento realizado em esterilidade e mantidas a 4ºC. Para as imunizações, o inóculo foi ajustado para uma concentração bacteriana equivalente ao tubo 1 da escala de MacFarland (3x108 UFC/ml) em solução salina. Essa suspensão foi inoculada por via endovenosa em coelhos albinos jovens (raça New Zealand), com aproximadamente 60 dias de idade. O esquema de imunização foi realizado de acordo com o descrito por Ewing (1986) e incluiu inoculações em volumes crescentes de 0,5 a 4,0 ml com intervalos de 3 dias entre as mesmas. A sangria branca foi realizada após uma semana da última dose reforço. O sangue coletado foi mantido por 2 horas a 37ºC e, então, centrifugado (700 g durante 10 min) para separação do soro. O soro coletado foi inativado por incubação à 56ºC por 1 hora. 9. Curva de crescimento Para a realização da curva de crescimento, a amostra 1551-2:eae- e a amostra mutada não aderente 143 foram cultivadas durante 18h à 37ºC. Após esse período cada cultura foi diluída na razão 1:50, utilizando-se erlenmeyer de 250 mL contendo 20 mL de caldo LB pré-aquecido à 37ºC. Essa suspensão foi incubada, com agitação, a 37ºC por 30 minutos e só após esse período foi retirado 1 mL para a realização da primeira leitura da DO600. As leituras foram realizadas em intervalos de 20 minutos até que o teste tivesse completado 3 horas de duração, gerando assim 10 pontos de comparação. 34 10. Absorção do anti-soro utilizando-se o mutante não aderente Foi realizada utilizando-se o mutante não aderente obtido neste estudo o qual foi cultivado em 100 mL de caldo LB durante 18 horas à 37ºC. Após esse período, o cultivo bacteriano foi dividido em 4 tubos plásticos de centrífuga e centrifugado a 5.200g por 5 minutos. Após essa centrifugação, 2 dos tubos de centrífuga foram armazenados em geladeira e aos outros 2 tubos foram adicionados 5 mL de PBS, sendo então submetidos à fervura por aproximadamente 1 hora. Em seguida, esses tubos foram novamente centrifugados à 5200g por 5 minutos, o sobrenadante foi desprezado e, ao sedimento, foi adicionado aproximadamente 1 mL de soro. Essa mistura foi mantida por 2 horas à 48ºC, e homogeneizada a cada 15 minutos. Após 2 horas de incubação, a mistura sedimento + soro foi centrifugada à 11600 g por 30 minutos, e o sobrenadante (soro) foi transferido para outro tubo. 11. Sequenciamento do DNA Com o objetivo de sequenciar a região C-terminal do gene eae da amostra 15512, um fragmento de aproximadamente 3,1 kb foi amlificado, através de reação de PCR com a enzima Elongase (Invitrogen, USA), utilizando-se os primers AE11/escD. Esse fragmento foi então clonado no vetor pMOSBlue Blunt Ended Cloning Kit (Amersham Biosciences), segundo recomendações do fabricante. Os plasmídios recombinantes obtidos foram denominados de pISEQ1, pISEQ2 e pISEQ3 Para o seqüenciamento do inserto dos 3 clones recombinantes, pISEQ1, 2 e 3 (pMOS + gene eae da amostra 1551-2), foram utilizados os oligonucleotídeos escD/SeqR2/SeqR3 descritos na Tabela 3, sendo os procedimentos realizados em seqüencidador automático ABI377/96 (Applied Biosystems), utilizando terminadores de cadeia dideoxinocleotídeos fluorescentes BigDye, com o seguinte programa: 96ºC 5 35 min.; 25 x [96ºC 20 seg., 50ºC 10 seg.; 60ºC 4 min.]. As seqüências resultantes (reads), em forma de cromatogramas, foram utilizadas para montar seqüências da região clonada – contigs – com o auxílio dos programas Phred, Phrap e Consed (Gordon et al., 1988). Tabela 3: Seqüência dos primers utilizados nos experimentos de seqüenciamento. Primers Seqüências escD CAG AAC ATT CAG CCG TAC SeqR2 CCT AGA GGG GTG GTT TGT GG SeqR3 GCT GAG TAC CAT GTA TAT TTC CCG 36 Resultados 1. Seleção da amostra Com o objetivo de eleger uma amostra para a caracterização da estrutura responsável pelo padrão AL (figura 3), em ensaios de 6h, uma coleção de 9 amostras, obtidas anteriormente em nosso laboratório, foi submetida a um ensaio de adesão para confirmar o padrão anteriormente descrito. A coleção de amostras também foi analisada quanto ao perfil de bandas de DNA plasmidial (figura 4), e a combinação de genes de virulência que apresentavam (tabela 4). Vieira et al. (2001) haviam demonstrado previamente que estas amostras eram potencialmente capazes de promover lesões A/E, em células HeLa e em células intestinais Caco-2, uma vez que foram positivas no teste de FAS. Neste estudo, esta propriedade foi confirmada em células HeLa, para uma amostra selecionada (1551-2), pela observação da formação de lesão A/E (formação de estruturas semelhantes a pedestais, sob as bactérias aderidas intimamente, por microscopia eletrônica de transmissão) (Figure 5). A ocorrência de plasmídios de alto peso molecular compatíveis com pEAF foi analisada em gel de agarose. Embora 8 das 9 amostras tenham apresentado uma ou duas bandas de alto peso molecular (entre 27 e 110 MDa), uma amostra (1551-2) foi desprovida de plasmídios (Figure 4; Tabela 4). Além disto, somente duas amostras (0471-1 e 2932-2) carrearam bandas de 60-65 MDa, as quais foram compatíveis com o tamanho de pEAF. 37 Os sub-tipos de intimina haviam sido previamente analisados por PCR para 5 (α, β, γ, δ, e ε) (Vieira et al., 2001) de pelo menos 16 subtipos conhecidos de intimina (Garrido et al. 2006). Neste estudo, esta analise foi estendida para outros dois subtipos (ι and ζ) (Zhang et al. 2002); observou-se que duas amostras carrearam intimina β, enquanto as 7 restantes foram não tipáveis, com os primers testados. O envolvimento de varias estruturas adesivas recém descritas em E. coli, isto é, Saa, Paa, ToxB, Iha, Lpf e Lda, nas propriedades de aderência das amostras foi avaliada por PCR. A presença de ler (LEE-encoded regulator) foi também avaliada. Os dados das seqüências de virulência encontradas foram combinados com dados reportados previamente para estas amostras (Vieira et al, 2001; Gomes et al., 2004) e estão apresentados na Tabela 3. É interessante ressaltar que 3 amostras foram desprovidas do gene regulatório ler, ou que as seqüências desse gene, nestas 3 amostras, diferiam nas regiões de anelamento dos primers. A caracterização dessa coleção de 9 amostras de aEPEC, sorogrupo não EPEC, que expressam AL na ausência de BFP, revelou uma grande diversidade genética e de sorotipos, porém nenhuma adesina comum, que pudesse estar envolvida com a formação de microcolônias bacterianas compactas, foi identificada. Apenas duas amostras foram positivas quando testadas com a sonda paa e lfpAO113 (0621-6 e 4632-3 respectivamente). Apesar de todas as 9 amostras terem sido positivas para a sonda eae, o subtipo de intimina não pode ser determinado para a maioria das amostras, sendo o subtipo β encontrado em apenas duas amostras (2932-2 e 4632-3). A amostra de aEPEC 1551-2, que havia sido isolada de uma criança com diarréia sem nenhum outro patógeno associado (Vieira et al., 2001), foi eleita para a identificação da estrutura responsável pela formação de microcolônias bacterianas compactas na ausência de BFP, por ser desprovida de bandas de DNA plasmidial, e de 38 fatores adicionais de virulência, até então descritos. A ausência de bandas de plasmídios nessa amostra demonstra que o fenótipo de interesse é codificado por genes localizados no cromossomo bacteriano. 39 Tabela 4. Características clínicas, fenotípicas e genotípicas de 9 amostras de EPEC atípicas não pertencentes a sorogrupos de EPEC que expressam adesão localizada em 6 horas (AL6) na ausência de Bundle forming pilus. Amostras Diarréia Idade do Sorotipoa Paciente Bandas de DNA Tipo de plasmidial b (MDa) Intimina Genes de Virulênciad (meses) 0471-1 Sim 24 ONT:H19 60,8; 39, 3 NT eae irp2 0621-6 Sim 16 O41:H- 110,0; 88,0 NT ler eae inv paa 1331-2 Sim 35 O70:H2 81,8 NT ler eae irp2 1551-2 Sim 23 ONT: H- - NT eae 2041-1 Sim 41 ONT: H2 36,4 NT ler eae 1112-6 Não 24 R:H11,21 75,9 NT ler eae irp2 astA pet hly 2932-2 Não 34 O153:H7 65,5 β ler eae 3522-6 Não 23 ONT:H11 75,9; 27,2 NT eae irp2 astA pet hly 4632-3 Não 16 ONT: H- 45,2 β ler eae irp2 astA lpfA a NT, não tipável com os anti-soros O1 to O173 e H1 to H56; H-, imóvel; R, rugosa (Vieira et al., 2001) Tamanho aproximado; somente bandas de alto peso molecular (> 15 MDa) c NT, não tipável com as seqüências testadas (α, β, γ, δ, ε, ι, ζ) (Vieira et al., 2001 e este estudo). d E. coli seqüências genéticas pesquisadas: bfpA, perA, EAF, E-hly, inv, EAEC, aggR, aggC, aafC, aspU, shf, irp2, pet, pic, astA, pap, afa, sfa , daaC, cdt, cnf, hly (Vieira et al., 2001; Gomes et al., 2004); e saa, paa, toxB, iha, ldaG, lpfA e ler (este estudo). b 40 Figura 3: Padrão de adesão localizada apresentado pela amostra E. coli 1551-2. Ensaio realizado em células HeLa, utilizando 6 horas de contato. Pode-se observar a presença de agregados compactos de bactérias aderidas em regiões localizadas das células. Figura 4: Gel de agarose a 0,7% com perfis de bandas de DNA plasmidial de 9 amostras de aEPEC de sorogrupos não EPEC e de E. coli R 861, contendo bandas de pesos moleculares conhecidos como padrão. Observa-se a ausência de bandas de DNA plasmidial na amostra 1551-2. 41 Figura 5: Microscopia Eletrônica de Transmissão da amostra 1551-2. Observa-se nessa figura a formação do pedestal característico detectado na lesão attaching and effacing (seta). 42 2. Caracterização da amostra 1551-2 Uma vez eleita uma amostra que mantivesse o padrão AL, fomos verificar se ela realmente não era capaz de expressar a fímbria BFP. Para isso, foi realizado um immunoblot com o soro policlonal anti-BFP, e observamos que a amostra 1551-2 não foi capaz de expressar a fímbria BFP, pois não apresentou uma banda de proteína compatível (~18 kDa) com a observada na amostra protótipo de EPEC E2348/69, utilizada como controle positivo (Figura 6). Figura 6: Ensaio de Imunoblot de proteínas totais das amostras E2348/69 e 1551-2, utilizando o soro anti-BFP. Observa-se que somente a amostra E2348/69 é capaz de produzir a proteína de 18 kDa (seta), correspondente à subunidade estrutural da fímbria BFP. Dados obtidos por Vieira et al. (2001) já indicavam que a amostra 1551-2 não reagia com a sonda bfpA, correspondente a sub-unidade estrutural da fímbria. Mesmo em posse dessa informação, fomos buscar, por PCR, se a amostra em questão poderia conter algum outro gene relacionado ao operon bfp, uma vez que dados obtidos por Bortolini et al. (1999) indicaram que algumas amostras de EPEC apresentavam uma deleção de aproximadamente 13 kb no operon bfp, o que resultava em uma ausência de expressão dessa fímbria. Para tanto, foram utilizados primers para o gene bfpL, sendo que as reações não geraram amplificação na amostra 1551-2 (figura 7). 43 Figura 7: Gel de agarose com o produto de amplificação do gene bfpL das amostras: E2348/69, 1551-2 e E. coli HB101. Podemos observar que a amplificação com a amostra 1551-2 não gerou um fragmento (~500 pb) correspondente ao observado na amostra E2348/69, utilizada como controle positivo do experimento. Também pesquisamos nessa amostra, usando PCR para o gene fimH, a presença do operon da fímbria tipo I, e verificamos que, nesse caso, também não ocorreu a amplificação de uma banda referente ao gene fimH (correspondente à proteína adesiva da fímbria), o que nos indica que essa amostra não expressa a fímbria tipo I (Figura 8). 44 Figura 8: Gel de agarose com o produto de amplificação do gene fimH das amostras: E2348/69, 1551-2, e HB101. Podemos observar ausência de amplificação de um fragmento de ~508 pb com a amostra 1551-2, ao contrário do observado na amostra E2348/69, utilizada como controle positivo do experimento. Finalizando esta fase de caracterização da amostra 1551-2, foi realizado um ensaio de imunomarcação com o soro policlonal anti-BFP dessa amostra e da amostra protótipo de EPEC E2348/69, utilizada neste caso como controle positivo para a presença da fímbria BFP. Este ensaio de imunomarcação confirmou que realmente a amostra 1551-2 não expressa a fímbria BFP (Figura 9). 45 A B Figura 9: Imunomarcação com o soro policlonal anti-BFP das amostras: E2348/69 (A) e 1551-2 (B). Observa-se que somente na amostra E2348/69 ocorre marcação da fímbria BFP. A ausência de marcação na amostra 1551-2 indica que essa amostra não é capaz de expressá-la. Magnitude: figura A: 12.930 x; figura B: 10.000 x. 46 3. Cinética de Adesão Com o objetivo de se conhecer a evolução do padrão AL da amostra 1551-2, foi realizada uma cinética de adesão dessa amostra, em paralelo com a da amostra E2348/69 (protótipo de tEPEC, portanto portadora de bfpA), onde foi possivel se observar comportamentos bastante distintos. Enquanto com a amostra protótipo E2348/69, em 2 horas de ensaio já se pode observar microcolônias pequenas e bem compactas, para a amostra 1551-2 a tendência a formar microcolônias compactas só começa a se pronunciar após 4 horas de incubação (3h + 1h). A presença de microcolônias compactas bem definidas na amostra E2348/69 já pode ser observada após 3 horas de ensaio, sendo que ao final de 6 horas (3 h + 3 h), ainda se observa a presença de microcolônias grandes e compactas. Para a amostra 1551-2, após 5 (3 h + 2 h) horas de ensaio podemos verificar o predomínio de microcolônias pequenas e compactas, enquanto que ao final das 6 horas de ensaio (3 h + 3 h) o que se observa é a presença de microcolônias bastante compactas e muito bem definidas (Figura 10). 47 1551-2 E2348/69 Figura 10: Cinética de adesão das amostras de aEPEC 1551-2 e protótipo de tEPEC E2348/69. Ensaio utilizando células HeLa e diferentes períodos de incubação. Aumento microscópico: 1000 x 48 4. Obtenção da amostra mutada 1551-2:eaePara verificar o envolvimento da intimina no estabelecimento do padrão AL compacto, decidiu-se realizar uma mutação no gene eae. Com esse objetivo, o sistema que utiliza o vetor suicida pJP5603 foi escolhido, pois contém a origem de replicação R6K ori, derivada de pUTKm, um fragmento de 1861 pb derivado de Tn5, conferindo resistência à canamicina, e um fragmento de 760 pb de pSUP202, carregando o sítio RP4 Mob para a mobilização do plasmídio (Penfold & Pemberton 1992). Este vetor é dependente, portanto, da complementação in trans dos genes que codificam a proteína Pir para que ocorra sua replicação estável na amostra hospedeira. Foi amplificado por PCR um fragmento interno ao gene eae de 924 pb a partir da amostra selvagem 1551-2 (utilizando os primers AE11/AE12). O fragmento amplificado foi clonado no vetor pGEM-T Easy (Promega), originando o clone pRT1. A seguir, o fragmento de eae foi extraído de pRT1, após digestão com a enzima EcoRI, e clonado no sítio de EcoRI do vetor pJP5603, originando o plasmídio denominado pRT2 (Figura 11). Este plasmídio foi utilizado para transformar a amostra de E. coli DH5α-λPir. Os clones assim obtidos foram avaliados por PCR, pRT2 foi extraído e transformado na amostra E. coli S17-λPir. Esta foi utilizada como doadora nos experimentos de conjugação com a amostra selvagem 1551-2. De 20 transconjugantes testados, um resistente à canamicina e que não expressava a adesina intimina foi selecionado para estudos posteriores. Esse transconjugante (mutante) foi denominado 1551-2:eae-. O mutante no gene eae foi construído, portanto, pela inserção do plasmídeo pRT2 no cromossomo da amostra selvagem por meio de recombinação homóloga. Esse processo altera a seqüência de DNA da ORF de eae de maneira que uma proteína truncada, resultante da fusão do gene lacZ’ de pRT2 com o gene eae nocauteado da 49 amostra 1551-2, é transcrita sem interrupção da transcrição dos genes adjacentes (Elliot & Kaper, 1997). Figura 11: Mapa do vetor suicida pJP5603 indicando o sítio de EcoRI onde o fragmento de 924 pb do gene eae foi clonado para a obtenção do plasmídio recombinante pRT2. 50 A figura 12 compara o padrão de adesão da amostra 1551-2 com o da amostra 1551-2:eae-. É importante destacar nessa figura o padrão de adesão da amostra 15512:eae- que, mesmo sem a presença da intimina, continua aderindo intensamente sobre células, só que agora num padrão semelhante ao padrão de adesão difusa (AD) da categoria diarreiogênica DAEC. Figura 12: Teste de adesão em células HeLa da amostra 1551-2 e derivada mutante em intimina. A: padrão de adesão da amostra selvagem 1551-2. Note a presença de microcolônias compactas e bem definidas (seta). B: padrão de adesão difusa da amostra 1551-2:eae-, mutada em intimina. O mutante 1551-2:eae- foi avaliado quanto a perda da capacidade de expressar intimina de 2 maneiras: por immunoblot e também pelo teste de FAS. A reação de immunoblot, realizada com extratos protéicos totais das amostras selvagem 1551-2 e mutada 15512:eae-, utilizando soro anti-intimina, revela que somente a amostra selvagem foi capaz de expressar uma proteína de 94 kDa correspondente a intimina, ao passo que a amostra mutada 1551-2:eae- não apresentou qualquer banda nessa altura. Assim sendo, podemos confirmar que a amostra 1551-2:eae- deixou de expressar intimina (Figura 13). 51 Figura 13: Ensaio de Immunoblot com soro anti-intimina de proteínas totais das amostras 1551-2 e mutante em eae. Observa-se a presença da proteína de 94 kDa referente a adesina intimina tanto na amostra controle (E2348/69), como na amostra selvagem, mas não na amostra 1551-2:eae- mutada em eae. 5. Southern-blot realizado para confirmar a mutação no gene eae da amostra 1551-2 Este experimento foi realizado para demonstrar que o gene eae, que codifica a adesina intimina, havia realmente sido interrompido pela inserção do vetor suicida pJP5603. Na figura 14, apresentamos um esquema do resultado esperado tanto na amostra 1551-2 como na 1551-2:eae-, provavelmente mutada no gene eae. A enzima escolhida para este experimento foi HindIII, pois não corta o gene eae (Nº de acesso no GenBank: AF022236), devendo, assim, gerar um fragmento de aproximadamente 10kb. Na amostra 1551-2:eae- esse fragmento não seria observado, mas, no lugar dele, seriam observados dois fragmentos menores. Como podemos observar na figura 15 a amostra selvagem 1551-2 revelou uma banda de aproximadamente 10 kb enquanto a amostra mutada revelou duas bandas. Com base nesses dados, podemos afirmar que o gene eae da amostra 1551-2 foi 52 interrompido pela inserção do vetor suicida pJP5603 por um processo de recombinação homóloga. Figura 14: Representação esquemática dos fragmentos HindIII observados na amostra selvagem 1551-2, e na amostra mutada em intimina 1551-2:eae-. Observa-se a inserção do vetor suicida pJP5603 no gene eae, e os fragmentos esperados no Southern-blot. Esquema adaptado de Miller & Mekalanos 1988. 53 A B Figura 12: Southern blot para comprovar a inserção do vetor suicida pJP5603 em eae. Em A, observa-se um gel de agarose a 1% com DNA das amostras 1551-2, 1551-2:eae- e do vetor pRT2, pJP5603 + fragmento de ~924 pb de eae clonado, digerido com HindIII. Em B, observa-se o Southern blot do DNA cromossômico das amostras selvagem 1551-2 e mutada 1551-2:eae- hibridizados com a sonda eae. Na amostra 1551-2, observa-se um fragmento de aproximadamente 10kb (A), enquanto, na amostra mutada, observa-se a presença de 2 fragmentos marcados pela sonda (B e C). O vetor pRT2 digerido com HindIII foi utilizado como controle positivo desse experimento (seta). 54 6. Microscopia eletrônica de transmissão Com o intuito de melhor entender os eventos que ocorrem durante o processo de adesão da amostra selvagem 1551-2, bem como de seu mutante em intimina 1551-2:eae, optamos por realizar um ensaio de interação com células HeLa e análise por microscopia eletrônica de transmissão. Como se pode observar na Figura 16A, a amostra selvagem não só adere às células HeLa como também as invade. É importante ressaltar que o campo ilustrado na foto da Figura 16A revela o que pode ser observado em qualquer área examinada nas preparações. Em pequenos aumentos, eram observadas apenas microcolônias compactas e frouxas, mas quando maiores aumentos foram utilizados, grande parte das bactérias dessas microcolônias encontrava-se interiorizada, de forma quase que individualizada, dentro de estruturas que lembram vacúolos. Em alguns desses vacúolos, foi possível detectar mais de uma bactéria, sugerindo um processo de multiplicação intracelular. Essa observação revela que a amostra selvagem 1551-2 não só foi capaz de invadir as células HeLa, como também foi, aparentemente, capaz de se multiplicar em seu interior. O mesmo não foi observado com a amostra 1551-2:eae-, mutante em intimina. Como se pode observar na Figura16D, essa amostra foi capaz de aderir às células HeLa num padrão bem diferente do observado na amostra selvagem, mas não foi capaz de invadi-las. O mutante em intimina perdeu a capacidade de se agregar formando microcolônias compactas, e passou a aderir às células HeLa num padrão que nos recorda a adesão difusa (AD). 55 Figura 16: Microscopia eletrônica de transmissão da interação das amostras 15512 (A e B) e 1551-2:eae- (C e D) com células HeLa. Observa-se que somente a amostra selvagem 1551-2 foi capaz de invadir as células HeLa em ensaios de 6h, ao passo que a amostra 1551-2:eae-, mutada em intimina, foi somente capaz de aderir num padrão semelhante ao difuso. A seta indica uma microcolônia com bactérias internalizadas. 56 7. Complementação da amostra 1551-2:eae- com o plasmídio pCVD438 A mutação no gene eae da amostra selvagem 1551-2 fez com que esta perdesse a capacidade de formar microcolônias, mas não de aderir. Tentando avaliar a similaridade funcional do gene eae da amostra selvagem 1551-2 com o da amostra protótipo de EPEC E2348/69, resolvemos complementar a amostra mutada em intimina, 1551-2:eae, com o plasmídio pCVD438, que consiste em um plasmídio recombinante contendo o gene eae da amostra protótipo E2348/69 (Donnenberg & Kaper 1991). Após realizada a eletroporação, as colônias resistentes a cloranfenicol foram selecionadas e primeiramente testadas quanto a capacidade de expressar intimina por immunoblot. Na figura 17, pode-se observar que a amostra complementada voltou a expressar a adesina. Figura 17: Ensaio de Immunoblot com soro anti-intimina de proteínas totais da amostra 1551-2:eae- complementada com o plasmídio recombinate pCVD438 bem como dos controles 1551-2:eae- (controle negativo) e 1551-2 (controle positivo). Observa-se a presença da proteína de 94 kDa referente a adesina intimina em todas as amostras com exceção do controle negativo. 57 Com base nesse resultado, decidiu-se averiguar se essas amostras complementadas com o gene eae, provenientes da amostra protótipo E2348/69, resgatariam a capacidade de promover a lesão A/E averiguada pelo teste de FAS (Figura 18). Diferentemente do que esperávamos essas amostras não foram capazes de promover a lesão A/E, sendo assim FAS negativas. Como controle positivo para esse experimento, a amostra CVD206 (E2348/69 mutada em intimina) foi transformada com o plasmídio recombinante pCVD438, onde foi possível observar que, após a complementação, a amostra restaurou a sua capacidade de acumular filamentos de actina avaliado através do teste de FAS. Para melhor compreender o papel do gene eae na invasão da amostra selvagem 1551-2, o mesmo foi submetido a seqüenciamento com o objetivo de se verificar se a intimina dessa amostra é semelhante a algum tipo já descrito, ou se seria um novo tipo de intimina, apresentando função de invasão celular. A B Figura 18: Teste de FAS das amostras 1551-2 (A) e 1551-2:eae- (B) complementada com o gene eae da amostra E2348/69, protótipo de tEPEC. Observa-se o acúmulo de filamentos de actina somente na amostra 1551-2 em A (seta), enquanto a amostra 1551-2:eae- (B) complementada foi incapaz de induzir o acúmulo dos filamentos de actina. 58 8. Construção de uma biblioteca de mutantes Não só os ensaios de microscopia eletrônica de transmissão, bem como os ensaios de microscopia óptica, realizados em células HeLa, revelaram que apesar da amostra 1551-2:eae- não formar microcolônias, ela não perdeu a capacidade de aderir às células HeLa em ensaios de 6 horas. Na ausência da adesina intimina, que outra estrutura poderia estar mediando a adesão entre a amostra 1551-2:eae- e as células HeLa? No intuito de tentar responder essa pergunta, construímos um banco de mutantes utilizando o vetor pBSL181 que contém o transposon mini-Tn10. Esse transposon insere-se ao acaso no cromossomo da célula provocando mutações aleatórias. Como o interesse era estudar a estrutura responsável pela adesão da amostra 1551-2:eae-, os mutantes obtidos foram testados quanto à perda da capacidade aderente. Foram selecionadas aproximadamente 2.000 colônias provenientes de vários eventos de conjugação. Todas essas colônias foram testadas individualmente e 5 mutantes não aderentes foram então selecionados para o prosseguimento deste estudo. Foi então realizada uma curva de crescimento dos cinco mutantes não aderentes e apenas dois deles foram capazes de se reproduzir de forma semelhante à amostra 15512:eae- . Esses dois mutantes foram então repurificados em placas de MacConkey (contendo ácido nalidíxico, kanamicina e cloranfenicol) e novamente submetidos a teste de adesão de 6 horas para confirmar a perda da capacidade de adesão. Como ambos os mutantes não aderentes selecionados apresentaram resultados muito similares, o mutante não aderente-143 foi selecionado para o prosseguimento deste estudo. Tanto os resultados obtidos com a curva de crescimento, como o teste de adesão às células HeLa encontram-se ilustrados na Figura 19. 59 O mutante não aderente 143 também foi avaliado através de Southern-blot, utilizando como sonda o gene cat, com o objetivo de avaliar se havia uma única cópia do transposon inserido no genoma dessa amostra não aderente. O DNA genômico do mutante não aderente 143 foi digerido com EcoRV e após hibridação com o gene cat revelou um único fragmento de aproximadamente 2,5 kb (dados não mostrados) Figura 19: Análise do mutante não aderente da amostra 1551-2:eae-. A: Curva de crescimento das amostras 1551-2, 1551-2:eae- e do mutante não aderente (143). B e C: Padrão de adesão da amostra 1551-2:eae- (B) e do seu mutante não aderente-143 (C) às células HeLa. Observa-se que o mutante não aderente (143) perdeu completamente a sua capacidade de aderir às células HeLa em ensaios de adesão de 6 horas. 60 9. Soro produzido com a amostra 1551-2:eae- e absorvido com o mutante não aderente 143: caracterização e inibição de adesão. A obtenção de um mutante não aderente que preserva sua capacidade de replicação sugere que o mesmo deixe de expressar alguma proteína fundamental para o fenótipo que se estuda. Ao absorver o soro produzido com a amostra mutada em intimina, 1551-2:eae- com o mutante não aderente 143, esperamos encontrar nesse soro apenas anticorpos contra proteínas que estejam relacionadas ao processo de adesão da amostra 1551-2:eae-. Como muitas fímbrias bacterianas têm sua expressão inibida com cultivos em temperaturas inferiores a 25ºC, foi realizado um teste de adesão, durante 6 h a 18ºC, da amostra 1551-2 e da amostra 1551-2:eae-. Na figura 20, está representada a inibição de adesão a células HeLa observada com essas amostras. Para visualizar qual ou quais seriam as proteínas que o mutante não aderente deixou de expressar, foi realizado um experimento de immunoblot com extratos bacterianos totais. Na Figura 21, pode-se observar que apenas uma banda de 25 kDa foi diferencial entre a amostra selvagem 1551-2 e o mutante não aderente 143. É importante ressaltar que essa banda não se tornou totalmente ausente no mutante 143, mas se apresentou muito mais tênue. Outro dado importante revelado por essa figura é que a amostra selvagem 15512 quando cultivada a 18ºC também deixa de expressar uma banda de aproximadamente 25 kDa. É importante ressaltar que são duas situações onde não se observa aderência, e que a banda de 25 kDa encontra-se diferencialmente expressa. 61 Figura 20: Teste de adesão em células HeLa das amostras 1551-2 (A) e 1551-2:eae(B) na temperatura de 18ºC (6h). Tanto a amostra selvagem como a amostra mutada em intimina tiveram sua adesão inibida nessa temperatura. Figura 21: Immunoblot de extrato de proteínas totais das amostras: 1551-2, 15512:eae-, mutante não aderente, 1551-2 cultivada à 37ºC e 1551-2 cultivada à 18ºC, utilizando o soro produzido com a amostra 1551-2:eae- e absorvido com o mutante não aderente. Observa-se nesse ensaio uma banda de aproximadamente 25 kDa que se encontra reduzida no mutante 143 e ausente quando a amostra 1551-2 é cultivada à 18ºC. 62 Esse soro também foi utilizado para a realização de um ensaio de inibição de adesão onde a adesão foi intensamente reduzida (Figura 22). A B Figura 22: Ensaio de inibição de adesão da amostra 1551-2:eae- com soro absorvido com o mutante 143, realizado em células HeLa durante 6 horas. Em A, observa-se a amostra 15512:eae-, utilizada nesse experimento como controle positivo, e em B, a amostra 1551-2:eae- na presença do soro diluído 1:10. Observa-se uma intensa redução do número de bactérias associadas ás células HeLa. 10. Clonagem do gene eae no vetor pMOS para seqüenciamento Para a realização do seqüenciamento do gene eae da amostra 1551-2, foi necessário realizar a clonagem desse gene em um vetor apropriado. Para a realização desse experimento foi utilizado o Kit pMOS Blue Blunt End (Amersham Biosciences, UK), que permite a clonagem de produtos de PCR. Para verificar se o fragmento de aproximadamente 3,1 kb que continha o gene eae realmente havia sido clonado no vetor pMOS, foi realizado um PCR utilizando os mesmos primers utilizados para a obtenção do fragmento, bem como digestão com a enzima de restrição HindIII. Como se pode observar na figura 23, foi possível detectar uma banda de aproximadamente 3,1 kb no clone selecionado, compatível com a amplificada na amostra 1551-2, utilizada como controle positivo da reação. Também se pode observar nessa figura que o DNA 63 plasmidial do clone selecionado, após digestão com a enzima HindIII, revelou uma banda de aproximadamente 6 kb (sendo 2,8 kb referentes ao vetor pMOS e 3,1 referentes ao fragmento clonado). Figura 23: Gel de agarose com o produto de amplificação do gene eae das amostras 1551-2 e derivadas: 2) pISEQ (pMOS + fragmento de 3,1 kb clonado); 3) 1551-2; 4) pISEQ digerido com HindIII e 5) pMOS. Observa-se a presença de uma banda de aproximadamente 3,1 kb tanto no pISEQ como na amostra 1551-2 utilizada como controle positivo. A digestão do pISEQ com HindIII gerou um fragmento de aproximadamente 6 kb, referente ao pMOS (2,8 kb) com o fragmento de 3,1 kb clonado. 64 11. Seqüenciamento e Análise do gene eae da amostra 1551-2 Com o objetivo de melhor conhecermos o gene eae da amostra 1551-2 um fragmento de aproximadamente 3,1 kb (amplificado com os primers AE11 e escD) foi clonado no vetor pMOS. Foram selecionados 3 clones denominados de pISEQ 1, 2 e3. Esses 3 clones foram utilizados para o seqüenciamento de aproximadamente 1077 nucleotídeos pertencentes à região variável do gene eae denominada de Int280 (Frankel et al., 1995). A análise da desses 1077 nucleotídeos seqüenciados revelou 98% de identidade com o gene eae de uma amostra aEPEC do sorotipo O129:H-, pertencente ao subtipo omicron (ο) (Figura 24). Estudos recentes (Blanco et al., 2006) identificaram esse subtipo de intimina (omicron-ο) em outra amostra de aEPEC, sorogrupo não EPEC, do sorotipo O84:H-. Apesar do subtipo de intimina omicron (ο) ter sido relatado em duas amostras de aEPEC, sorogrupo não EPEC, pertencentes aos sorotipos O129:H- e O84:H-, a ocorrência de AL na ausência de BFP não foi reportada nessas amostras. 65 Figura 24: BLASTN da seqüência de 1077 nucleotídeos, obtida a partir do seqüenciamento dos clones pISEQ1, 2 e 3. A análise dos 1077 nucleotídeos da região C-terminal do gene eae da amostra 1551-2 revelou 98% de identidade com o subtipo de intimina omicron (ο). 66 Discussão Vários trabalhos vêm demonstrando que BFP, além de ser importante na aderência que precede a aderência mediada por intimina, tem também importante papel na formação das microcolônias bacterianas compactas observadas no padrão AL de tEPEC (Trabulsi et al., 2002). Entretanto, ao caracterizar uma coleção de amostras de aEPEC, não pertencentes aos sorogrupos clássicos de EPEC, Vieira et al. (2001) identificaram 9 amostras que exibiam um padrão de aderência muito semelhante ao padrão AL de tEPEC, exceto pelo fato de ser identificado apenas em ensaios mais prolongados (6 horas) e na ausência de BFP. Como o padrão de aderência mais freqüentemente observado entre as aEPEC é o ALL, onde se formam microcolônias bacterianas mais frouxas do que as do padrão AL (Trabulsi et al., 2002) e, ainda, como as aEPEC compreendem um grupo muito heterogêneo, acreditamos que estudos em subgrupos de amostras que compartilham determinadas propriedades poderiam auxiliar na identificação de novos fatores de virulência e/ou combinações de genes de virulência conhecidos, confirmando seu papel enteropatogênico bem como auxiliando em seu diagnóstico. Assim, neste estudo, inicialmente, buscamos analisar o conjunto de amostras de aEPEC desprovidas de BFP e produtoras de AL comparando diversas características fenotípicas e genotípicas, algumas das quais publicadas anteriormente e outras, obtidas neste estudo. Até a publicação de Vieira et al. (2001) a ocorrência de microcolônias bacterianas compactas (AL) em amostras de aEPEC desprovidas de BFP não havia sido relatada. Estudos posteriores descreveram a ocorrência de AL na ausência de BFP em algumas amostras de aEPEC do sorotipo O26:H11 (Scaletsky et al., 2005). Nesse estudo, foi descrito um operon, denominado LDA, responsável pela expressão de uma 67 adesina afímbrial que confere o padrão de aderência difusa quando clonado em amostra de E. coli-K12. Porém, os mecanismos pelos quais ocorre a formação de microcolônias bacterianas compactas na ausência de BFP ainda permanecem desconhecidos. Apesar do fenótipo de aderência comum, demonstramos que as 9 amostras de aEPEC de nossa coleção são diversas com relação aos seus sorotipos, conteúdo plasmidial, e perfil de genes de virulência. O amplo trabalho de caracterização teve o objetivo também de tentar associar a ocorrência de AL com alguma adesina descrita nas diversas categorias de DEC. As adesinas avaliadas por Colony-blot, nas nove amostras produtoras de AL foram: Saa, Paa, ToxB, Iha, Lpf e Lda. Entretanto, nessa caracterização, não pudemos associar a formação de microcolônias bacterianas compactas a nenhuma adesina descrita até o momento. Por essa razão, uma amostra (1551-2) foi selecionada com o intuito de se esclarecer como ocorre a formação de microcolônias bacterianas na ausência de BFP. Essa amostra foi selecionada por ter sido isolada de uma criança com diarréia na ausência de outro patógeno reconhecido, por não apresentar bandas de DNA plasmídial e por ser portadora apenas da adesina intimina entre todos os fatores testados. Conhecendo a importância do gene eae, que codifica a adesina intimina, a primeira pergunta foi qual seria o papel da intimina na aderência localizada de uma amostra de aEPEC às células HeLa, na ausência de BFP. Com o objetivo de responder essa pergunta, o sistema que utiliza do vetor suicida pJP5603 foi utilizado para obtenção de um mutante não polar no gene eae da amostra 1551-2. Dados da literatura revelam que a intimina desempenha diferentes papéis quanto a sua importância na aderência às células HeLa. Donnenberg & Kaper (1991) construíram um mutante em intimina da amostra E2348/69 denominado CVD206. Estudos posteriores conduzidos por Cleary et al. (2004) mostraram que a capacidade da 68 amostra CVD206 de formar microcolônias bacterianas compactas não se encontrava comprometida, mas a sua capacidade em promover o acúmulo dos filamentos de actina, característicos da lesão A/E, avaliado pelo teste de FAS, não pode mais ser observada. Nesse mesmo estudo, os autores demonstraram que essa propriedade só se encontrou comprometida quando os autores utilizaram um mutante em bfpA, denominado UMD901. Esse mutante foi capaz de aderir fracamente às células HeLa, perdendo, assim, a capacidade de promover a aderência localizada característica da amostra selvagem E2348/69. Esses mesmos autores também destacaram a importância de EspA como uma adesina transitória ao utilizar um duplo mutante (bfpA e eae) denominado de UMD886. Analisando nossos resultados, ao contrário do que foi reportado por Cleary et al (2004), observamos que, na ausência de intimina, a amostra 1551-2 continua aderindo abundantemente às células HeLa, porém em um padrão distinto do observado com amostra selvagem. A amostra 1551-2:eae-, mutada em intima, passou a aderir em um padrão semelhante ao padrão AD, característico da categoria DAEC. Entretanto, o mais importante é ressaltar que a amostra mutada em intimina perdeu a capacidade de forma microcolônias compactas observadas no padrão AL. Ensaios de microscopia eletrônica de transmissão revelaram que as microcolônias bacterianas compactas, observadas por microscopia óptica, na realidade, consistem em um processo de internalização totalmente dependente de intimina, e que a ausência desta adesina, embora não tenha comprometido a aderência da amostra às células HeLa, inibiu completamente a formação de microcolônias compactas e, consequentemente, a sua internalização. Se compararmos esses resultados com os obtidos por Carvalho et al. (2005) em ensaios de inibição de adesão da amostra JPN15 (amostra E2348/69, segregante espontânea de pEAF) com anticorpos contra a região variável de intimina, podemos 69 observar que, enquanto o bloqueio da intimina, por anticorpo, foi capaz de inibir a aderência dessa amostra à células HeLa o mesmo não foi observado com a amostra utilizada neste estudo, que continuou aderindo a essa linhagem, mesmo na ausência de intimina, embora em um padrão diferente da amostra selvagem. Uma tentativa de complementação do gene eae da amostra 1551-2:eae- foi realizada utilizando-se o plasmídio recombinante pCVD438, que carreia o gene eae (subtipo α) da amostra E2348/69 (protótipo de tEPEC) (Donnenberg & Kaper 1991). Em ensaios de immunoblot, verificamos que a amostra 1551-2:eae- (pCVD438) teve restaurada a sua capacidade de expressar a proteína de 94 kDa (intimina). Surpreendentemente, quando fomos avaliar o padrão de adesão da amostra complementada, observamos que o subtipo de intimina α não foi capaz de restaurar sua capacidade de formar microcolônias compactas como observado na amostra selvagem 1551-2. A incapacidade de restaurar a lesão A/E poderia estar relacionada com uma incompatibilidade entre a intimina expressa por E2348/69 com a proteína Tir (receptor de intimina, injetado pela bactéria na célula hospedeira) da amostra 1551-2; a ligação de intimina com Tir é que resulta na modulação do citoesqueleto e conseqüente formação da lesão A/E (Knutton et al., 1989). Como a amostra selvagem teve o seu subtipo de intimina não determinado, entre aqueles que foram testados, resolveu-se então clonar e seqüenciar a região variável do gene eae da amostra 1551-2, que corresponde aos últimos 280 aminoácidos da região Cterminal. Um recente trabalho realizado por Garrido et al. (2006) avalia a existência de aproximadamente 20 subtipos de intimina, com base na tipagem com primers específicos para cada subtipo, localizados dentro dessa região da intimina, que, além de ser variável, corresponde à região que se liga ao receptor Tir. Os dados obtidos com o seqüenciamento da Int280 da amostra 1551-2 revelaram 98% de identidade com o 70 subtipo de intimina omicron (ο) descrito em duas amostras de aEPEC pertencentes aos sorotipos O129:H- e O84:H- (Garrido et al., 2006; Blanco et al., 2006). Nenhum trabalho da literatura pesquisou até o momento se existe algum envolvimento entre a ocorrência desse subtipo de intimina com padrão AL ou com a capacidade de invadir células HeLa. A mutação no gene eae revelou não só que a formação de microcolônias compactas é um processo dependente de intimina, como sugeriu a existência de uma nova adesina que medeia uma adesão difusa do mutante em intimina às células HeLa. Com o objetivo de realizar uma caracterização inicial dessa adesina resolvemos investir na construção de um banco de mutantes não aderentes. Nossa opção por realizar um banco de mutantes e não clonar o referido gene, baseia-se no fato de que a aderência de amostras de DEC tem se mostrado um fenótipo multifatorial e muitas vezes dependente de grandes regiões de DNA cromossômico. Após a obtenção desse banco de mutantes não aderentes (utilizando o transposon Mini-Tn10), as amostras resultantes foram analisadas quanto à manutenção de sua capacidade de multiplicação pela construção de uma curva de crescimento. Esse cuidado foi tomado com o intuito de avaliar se o fato das bactérias não aderirem às células HeLa poderia estar relacionado com a perda da sua capacidade de adesão ou com algum comprometimento com a sua capacidade de replicação ocasionada pela inserção do transposon em algum gene não propriamente relacionado à aderência da amostra 1551-2. Um mutante com capacidade normal de multiplicação foi, então, utilizado para a absorção de um soro policlonal produzido com a amostra mutada em intimina. Esse experimento foi conduzido com o objetivo de se evidenciar alguma proteína que estivesse presente na amostra selvagem, mas não no mutante não aderente, para que, 71 posteriormente, se pudesse averiguar o envolvimento dessa proteína com a adesão difusa da amostra 1551-2:eae-. Após realizada a etapa de seleção acima descrita foi selecionado, para a continuidade deste estudo, o mutante não aderente 143. O soro absorvido com esse mutante revelou uma banda de aproximadamente 25 kDa que se encontrava presente tanto na amostra selvagem (1551-2) como na amostra mutada em intimina (1551-2:eae), mas muito reduzida no mutante não aderente 143. Como muitas adesinas são termorreguladas, fomos averiguar se essa proteína de ~25 kDa também se encontrava ausente quando a amostra era cultivada a 18ºC, condição onde a adesão da amostra 1551-2:eae- encontra-se totalmente comprometida. Pudemos observar que o soro não foi capaz de detectar a presença dessa proteína em extrato total da amostra 1551-2 à 18ºC. Portanto, tem-se aqui duas situações onde a aderência da amostra 1551-2 se encontra comprometida e em que essa proteína de ~25 kDa, encontra-se diferencialmente expressa. Esses dados nos levam a acreditar que essa proteína possa desempenhar importante papel na aderência da amostra 1551-2 às células HeLa em ensaios de 6 horas. Nossa hipótese pode ser reforçada pelo fato do soro absorvido com o mutante não aderente, e que reconhece a proteína de ~25 kDa em ensaios de immunoblot, ser capaz de inibir a aderência da amostra 1551-2:eae- em ensaios de inibição de adesão realizado na presença desse soro. Até o presente momento, os dados obtidos sugerem que a intimina teria, na amostra selvagem 1551-2, um papel muito mais importante do que o esperado. Poucos ou quase que nenhum trabalho da literatura tem dado muito importância ao processo de invasão observado dentre as EPEC. Consideramos que esse fato não poderia passar despercebido dentro de nosso estudo uma vez que o que encontramos não foram apenas algumas bactérias interiorizadas como conseqüência de um evento não muito bem 72 esclarecido (conforme se observa na literatura com amostras de EPEC típicas), mas sim, um evento extremamente comum em nosso ensaio. É lógico que também foram observadas bactérias extracelulares, mas que talvez, em ensaios mais prolongados, pudessem também invadir. O que nos chamou a atenção foi o fato da amostra 15512:eae-, mutada em intimina, não demonstrar qualquer tendência à invasão. Devemos ressaltar que, com base no descrito na literatura, a mutação que realizamos em nossa amostra foi direcionada, não provocando alteração em nenhum outro gene que não o da adesina intimina. Com base nessas informações poderíamos atribuir à intimina a capacidade da amostra selvagem 1551-2 em invadir as células HeLa? Acreditamos que para responder essa pergunta mais estudos seriam necessários, mas temos aqui um forte indicativo de que, se não a única responsável, a intimina tem papel fundamental nos resultados aqui descritos. 73 Conclusões A formação do padrão AL6 em uma amostra de aEPEC selecionada é resultante, na realidade, de um processo de internalização mediado principalmente pela expressão de intimina. O fato de que uma mutação não-polar, no gene eae de uma amostra de aEPEC analisada neste estudo (1551-2), não aboliu por completo a adesão dessa amostra às células HeLa, reforça a idéia de que novas adesinas devem contribuir para a patogênese de amostras de aEPEC isoladas em nosso meio. 74 Referências Bibliográficas ADU-BOBIE, J.; FRANKEL, G.; BAIN, C.; GONCALVES, A.G.; TRABULSI, L.R.; DOUCE, G.; KNUTTON, S.; DOUGAN, G. (1998). 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Os demais reagentes utilizados foram provenientes da Sigma (Sigma-Aldrich Chemical, Missouri, EUA), Invitrogen (Life Tecnologies Ic, Gaithenesburg MD, EUA), Amersham (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden), tendo sido preparados conforme especificações dos fabricantes. Os meios de cultura, obtidos sob a forma desidratada foram preparados com água destilada e purificada pelo sistema Mili-Q (Milipore Inc., Massachusetts, EUA) e autoclavados a 121ºC por 15 minutos. Foram utilizados os meios ágar MacConkey, ágar nutriente e o caldo de soja tripticase (TSB – Triptic Soy Broth – Difco Laboratories, Michigan, EUA). 1.1 Caldo Luria Bertani (LB) Triptona 10 g Extrato de levedura 5g Cloreto de Sódio 10 g Água bidestilada q.s.p. 100 mL Todos os elementos foram adicionados à água destilada e o meio esterilizado, em autoclave a 121ºC por 15 minutos. Para a preparação de LB ágar, foi adicionado à solução acima 2% de bacto agar (Difco). 95 2. Soluções e meios de cultura utilizados para os testes de adesão em células HeLa 2.1 Solução tampão salina Fosfato (PBS) NaCl 136,9 mM KCl 2,7 mM Na2HPO4 8,1 mM KH2PO4 1,5 mM Os sais foram dissolvidos em água destilada e a solução foi autoclavada a 121ºC durante 15 minutos. Para a solução salina fosfato com pH 7,2, o pH foi ajustado com ácido clorídrico. 2.2 Dulbecco´s Modified Eagle Médium (DMEM) O meio foi dissolvido em água bidestilada, conforme recomendações do fabricante. O pH foi ajustado para 7,0 com uma solução de bicarbonato de sódio a 7,5%; o meio foi acrescido de 10% ou 2% de soro fetal bovino (SFB), conforme a necessidade. Em seguida, o meio foi filtrado em membranas de acetato de celulose com poros de 0,22 μm (sistema de filtração Millipore Corporation, EUA) e armazenado a 4ºC. 2.3 Solução estoque de D-manose A solução de D-manose foi preparada em água bidestilada na concentração final de 10% e esterilizada em vapor fluente por 1 hora. A solução foi armazenada a 4ºC até o momento do uso. 96 2.4 Solução tampão de S∅rënsen Solução A KH2PO4 0,64 g Água bidestilada q.s.p. 70 mL Solução B Na2HPO4 2,36 g Água bidestilada q.s.p. 250 mL Para a solução final foi adicionado 69,6 mL da solução A em 230,4 mL da solução B. Essa solução foi armazenada a 4ºC até o momento do uso. 2.5 Solução corante de May-Grünwald Após dissolução total de 0,2g do corante em 100 mL de metanol (p.a.), em banho-maria a 65ºC, a solução foi filtrada em papel de filtro comum e armazenada à temperatura ambiente. No momento do uso, foi diluída na proporção 1:2 (v/v) em tampão de Sφrënsen. 2.6 Solução corante de Giemsa A solução comercial foi diluída no momento do uso na proporção 1:3 (v/v) em tampão de Sφrënsen. 3. Soluções e Reagentes utilizados no teste de FAS 3.1 Solução de formadeído a 3% O formadeído (Merck) foi diluído em PBS no momento do uso 97 3.2 Solução de Triton X-100 a 1% Triton X-100 (Sigma) foi diluído em PBS esterilizado, no momento do uso. 3.3 Solução de isoticianato de faloidina marcado com fluoresceína a 5 μg/mL A solução foi preparada dissolvendo-se 100 μg de isotiocianato de faloidina (Sigma) em 2 mL de PBS esterilizado. O armazenamento foi em alíquotas, em tubos escuros, à temperatura de -20ºC. No momento do uso, após o descongelamento, a alíquota foi diluída em PBS, obtendo-se uma concentração final de 5 μg/mL. 4. Soluções usadas na eletroforese de proteínas em SDS-PAGE 4.1 Tampão de Amostra (5x) Tris-HCl a 1 M (pH6,8) 60 mM Glicerol 25% SDS a 10% 2% 2-mercaptoetanol 14,4 mM Azul de Bromofenol 0,1% Água destilada q.s.p. 10 mL A solução foi mantida a 4ºC 4.2 Solução de Acrilamida bis-Acrilamida Acrilamida 30 g N,N, - metilenobisacrilamida 0,8 g Água destilada q.s.p. 100 mL A solução foi filtrada em papel de filtro e armazenada em frasco escuro à 4ºC. 98 4.3 Gel de Empacotamento Acrilamida 870 μL Tris-HCl 1 M (pH6,8) 660 μL SDS a 10% 52 μL Persulfato de amônio 52 μL TEMED 5 μL Água destilada 3,57 mL 4.4 Gel de Corrida a 12% Acrilamida 4,0 mL Tris-HCl 1M (pH8,8) 1,3 mL SDS a 10% 100 μL Persulfato de amônio 100 μL TEMED 4 μL Água destilada q.s.p. 4,5 mL 4.5 Tampão de Eletroforese Trisma base (Sigma) 25 mM Glicina pH 8,3 (Sigma) 250 mM Os componentes foram dissolvidos em 200 mL de água destilada. No momento da corrida, foi utilizado o tampão diluído 10 vezes adicionado de SDS para uma concentração final de 1%. 99 5. Soluções para Immuno-blot 5.1 Tampão de Transferência Trisma base 8,7 g Glicina 43,2 g Metanol 600 mL Água destilada q.s.p. 3000 mL Os componentes do tampão foram dissolvidos em água e a solução conservada à 4ºC. 5.2 Tampão de Bloqueio Soroalbumina bovina (BSA) 3% A soroalbumina foi dissolvida em tampão Tris e conservada à 4ºC. 5.3 Tampão Tris Tris-HCl a 1 M pH 7,3 10,0 mL BSA (Sigma) 1,0 g Tween-20 (Synth) 0,5 mL NaCl 9,0g Água destilada q.s.p. 1000 mL Os componentes foram dissolvidos em água e o tampão resultante conservado a 4ºC. 100 6. Soluções utilizadas para a realização da Microscopia Eletrônica de Transmissão e Imunomarcação 6.1 Solução Fixadora Solução de aldeído glutárico a 1,5% (Sigma), paraformaldeído a 1% (Sigma) em solução fosfato a 0,1 M pH 7,3. 6.2 Solução de tampão cacodilato de sódio a 0,4 M pH 7,2 O cacodilato de sódio foi dissolvido em água bidestilada e o pH ajustado com HCl a 0,2 M. A solução final foi conservada a 4ºC. Para as lavagens, durante o processamento do material para microscopia eletrônica, esta solução foi utilizada na concentração de 0,1 M. 6.3 Tetróxido de ósmio a 4% O tetróxido de ósmio (EMS – Electron Microscopy Sciences, Enc., USA) é vendido na forma de cristal embalado em ampolas contendo 1 g. A ampola foi cuidadosamente lavada externamente para a eliminação total da gordura e sujeira. Dentro da capela, a ampola foi colocada em um frasco escuro contendo 25 mL de água destilada e foi quebrada com um bastão de vidro. A preparação foi homogeneizada e mantida à temperatura ambiente, durante 24 horas, a fim de permitir a dissolução completa dos cristais. Após este período, a solução foi armazenada a 4ºC. No momento do uso, esta solução foi diluída a 1% em tampão cacodilato de sadio a 0,1% (anexo 6.2) 101 6.4 Acetato de uranila aquosa a 2% No preparo desta solução, 2 g de acetato de uranila foram dissolvidos em 100 mL de água destilada. A solução foi filtrada e armazenada, em frasco escuro, à temperatura ambiente. 6.5 Citrato de chumbo Nitrato de chumbo 1,33 g Citrato de sódio 1,76 g Um volume de 100 mL de água destilada foi fervida e resfriada imediatamente antes da sua utilização no preparo desta solução. O nitrato de chumbo e o citrato de sódio inicialmente dissolvidos em 30 mL de água destilada, em um balão volumétrico. A preparação foi vigorosamente agitada durante 5 minutos e posteriormente, agitada moderadamente durante mais 30 minutos, até a dissolução completa dos reagentes e a formação de uma solução leitosa. Uma solução de NaOH a 1 M, preparada no momento do uso, foi adicionada à preparação, até que esta se tornasse transparente. Em seguida, adicionou-se um volume de água destilada suficiente para se completar 50 mL de solução. Esta solução corante foi mantida no mesmo frasco, em descanso, por pelo menos um dia antes de ser utilizado. 102 7. Soluções utilizadas para a extração de DNA plasmidial (Birnboim & Doly) 7.1 Solução lítica para extração de DNA plasmidial (Solução I) Na2EDTA.H2O 10 mM Tris-HCl 25 mM Glicose 50 mM Lisozima 2 mg/mL A solução foi preparada somente no momento do uso, imersa em banho de gelo. 7.2 Solução de lise alcalina (Solução II) NaOH 0,2 N SDS 1% O SDS foi dissolvido em água bidestilada esterilizada. Após a dissolução, a solução de NaOH foi acrescentada e o volume final completado com água bidestilada esterilizada. A solução foi mantida à temperatura ambiente e preparada no momento do uso. 7.3 Solução de acetato de sódio a 3 M pH 4,8 (Solução III) O preparo da solução foi feito dissolvendo acetato de sódio anidro (CH3COONa) em água bidestilada, e o pH foi ajustado com ácido acético glacial. Em seguida, esta solução foi autoclavada (121ºC durante 15 minutos) e mantida à temperatura ambiente até o momento do uso. 103 7.4 Solução de acetato de sódio (Solução IV) Acetato de sódio 0,1 M Tri-HCl – pH 8,0 0,05 M O acetato de sódio foi dissolvido em água bidestilada e, após a adição do TrisHCL, o volume foi completado com água bidestilada esterilizada. A solução foi mantida à temperatura ambiente. 7.5 Solução tampão Tris-EDTA (TE) – pH 8,0 (10x) Trizma base 100 mM Na2EDTA 10 mM Inicialmente o Na2EDTA foi dissolvido a quente com uma parte de água destilada, adicionando-se, em seguida, Trizma base e ajustando o pH com HCl. Completar o volume da solução, autoclavar a 121ºC por 15 minutos. 8. Soluções usadas para Colony-blot 8.1 Solução desnaturante NaOH 0,5 M NaCl 1,5 M 8.2 Solução Neutralizante Tris base 1 M pH 7,0 NaCl 2M 104 8.3 Solução salina padrão com citrato (SSC) 20X pH 7,0 NaCl 3,0 M Citrato de sódio 0,3 M Os sais foram dissolvidos em água bidestilada e a solução resultante foi esterilizada por autoclavação e conservada à temperatura ambiente. 8.4 Solução de Pré-Hibridização SDS a 10% 0,1% Solução de Denhardt (Eppendorf, New York, USA) 2x SSC 5x A solução foi preparada no momento do uso, sendo os componentes adicionados à água bidestilada até dissolução completa. 9. Soluções usadas para Southern-blot. 9.1 Solução desnaturante NaOH 0,5 M NaCL 1,5 M 9.2 Solução neutralizante Tris base 1 M pH 7,0 NaCL 2M 105 10. Meio SOC Triptona 2,0 g Extrato de levedura 0,5 g NaCL (1M) 1 mL KCl (1M) 0,25 mL Água destilada q.s.p. 100 mL Na hora do uso adicionar 20 mM de Mg++ e 20 mM de glicose. 106
