mestrado GM Garcia_2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS FUNCIONALIZADAS PARA DIRECIONAMENTO
DE FÁRMACOS: ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO E APLICAÇÕES NO
ENCAPSULAMENTO DE FÁRMACOS ANTI-TRYPANOSOMA CRUZI E ANTIATEROGÊNICO
GIANI MARTINS GARCIA
OURO PRETO
Setembro de 2011
Giani Martins Garcia
NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS FUNCIONALIZADAS PARA
DIRECIONAMENTO DE FÁRMACOS: ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO E APLICAÇÕES
NO ENCAPSULAMENTO DE FÁRMACOS ANTI-TRYPANOSOMA. CRUZI E ANTIATEROGÊNICO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
em
Ciências
Farmacêuticas da Escola de Farmácia da
Universidade Federal de Ouro Preto,
como requisito à obtenção do grau de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profª Drª Vanessa Carla
Furtado Mosqueira
Co-Orientador: Prof. Dr. Patrice Hildgen
(Université de Montréal –Canadá)
Ouro Preto
Setembro de 2011
ii
G216n
Garcia, Giani Martins.
Nanopartículas poliméricas funcionalizadas para direcionamento de
fármacos
[manuscrito]
:
estudo
físico-químico
e
aplicações
no
encapsulamento de fármacos anti-Trypanosama cruzi e anti-aterogênico /
Giani Martins Garcia – 2011.
159 f.: il. color.; grafs., tabs.
Orientadora: Profª Drª Vanessa Carla Furtado Mosqueira.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de
Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e Medicamentos.
Catalogação: [email protected]
iii
Este trabalho contou com a colaboração de:
Profa. Dra. Dulcinéia Saes Parra Abdalla
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, USP-SP.
Prof. Dr. Ivan da Rocha Pitta
Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos, UFPE-PE
Drª Margareth Spangler de Andrade
Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC-MG.
Dr José Mário Carneiro Vilela
Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC-MG.
Msc. Líliam Teixeira Oliveira
Laboratório Multiusuário/Cromatografia Líquida de Alta Eficiência; CIPHARMA,
UFOP-MG
iv
GARCIA, GM
DEDICATÓRIA
“Dedico este trabalho aos meus amados pais
por serem o alicerce da minha vida e por
fazerem dos meus sonhos os deles, e ao
meu irmão pela amizade e companheirismo.”
v
GARCIA, GM
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
A Deus, razão de tudo, por iluminar meus caminhos e decisões;
Aos meus pais, que acreditaram em mim e tornaram possíveis todos os
meus sonhos. Sem vocês nada disso seria possível;
Ao meu irmão e melhor amigo Geovani, pelos conselhos e incentivo sempre;
A minha família, vó, tios e primos, pela torcida;
A
minha
orientadora
Vanessa,
pela
oportunidade,
ensinamentos,
disponibilidade e ótima convivência durante todos esses anos;
Aos amigos do LDGNano, Raquel C., Raquel A., Renata, Bruno, Carina,
Alessandra, Diego, Emily, Larissa, Samantha, Daline e Leonardo, por
dividirem comigo os problemas e as conquistas, e pelos bons momentos no
laboratório. Em especial a Líliam, que esteve ao meu lado em todos os
momentos,
dentro
e
fora
do
laboratório,
pelo
carinho,
amizade
e
companheirismo, e por não medir esforços para que tudo saísse da melhor
forma possível;
Aos colegas de pós-graduação, em especial Patrícia Goto e Rodrigo
Moreira, pela amizade e boas conversas;
Aos professores do Programa pelos ensinamentos compartilhados;
Ao professor Vilela, pela ajuda na obtenção nas imagens de microscopia de
força atômica;
Aos professores Patrice Hildgen, Dulcinéia Abdalla e Ivan Pitta pela
colaboração;
As minhas queridas irmãs da República Hangar, pela amizade, apoio e
torcida, e por sempre entenderem meus momentos de reclusão;
Aos demais amigos pelo incentivo, em especial a Kyrla, pela amizade
incondicional;
vi
GARCIA, GM
AGRADECIMENTOS
A Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto, e ao
Programa de Pós-Graduação em Ciência Farmacêuticas/CIPHARMA pela
formação acadêmica;
Ao INCT-if e a Rede NanoBioMG/FAPEMIG pelo auxílio financeiro;
A todas as outras pessoas que com críticas, sugestões e elogios contribuíram
de forma direta ou indireta para conclusão deste trabalho.
vii
GARCIA, GM
Nunca, jamais desanimeis, embora venham ventos contrários!
(Santa Paulina)
viii
GARCIA, GM
RESUMO
RESUMO
Neste trabalho foi realizado o estudo de caracterização físico-química de nanopartículas
poliméricas (NP), produzidas a partir dos copolímeros do ácido polilático (PLA) ligados
covalentemente ao polietilenoglicol (PEG). Foram utilizados polímeros com arquitetura do
tipo dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA), com ou sem funcionalização, ao longo
da cadeia de PLA. Os grupamentos hidroxila, benzila foram inseridos ao longo da cadeia
de PLA, os quais permitiram a funcionalização do polímero com um ligante para o
receptor selectina-E (LSE), presente no endotélio dos vasos. Foram encapsulados dois
fármacos: o itraconazol, representando a classe de fármacos azólicos com promissores
resultados no tratamento da doença de Chagas experimental e uma nova substância sob
investigação pré-clínica da classe das tiazolidinodionas (TZD), denominada Lyso-7, que
vem apresentando resultados promissores na melhoria dos fatores associados a doenças
cardiovasculares, como a aterosclerose. As nanoestruturas foram analisadas e
caracterizadas quanto ao tamanho, índice de polidispersão (IP), potencial zeta e cinética
de liberação in vitro. As análises morfológicas foram realizadas por microscopia de força
atômica (MFA). Os resultados relacionados às nanoesferas (NS) mostram que foram
obtidas populações monodispersas (IP<0,20) com tamanho médio variando entre 116 a
284 nm, antes e após a associação de 0,5 mg/mL de itraconazol. A utilização de
copolímeros dibloco e tribloco conduziu a uma redução significativa no tamanho das
partículas, 116 e 146 nm, respectivamente, quando comparado ao tamanho daquelas
preparadas a partir do homopolímero PLA (206 nm). A redução de tamanho sugere a
presença de cadeias de PEG organizadas na superfície das NS. A introdução de grupos
hidroxila ou benzila induziu um aumentou significativo do tamanho médio das NS para
151 nm e 284 nm, respectivamente, indicando aumento do volume interno da matriz
polimérica para acomodação de grupamentos funcionais volumosos. A redução
significativa do potencial zeta em aproximadamente -16 mV para todas as formulações,
após inclusão do itraconazol, sugere interferência do fármaco na organização superficial
dos constituintes das NS. A porcentagem de encapsulação foi próxima de 100% para o
itraconazol na concentração de 0,5 mg/mL. Observou-se a presença de um forte contraste
nas imagens de fase, na superfície das NS contendo blocos de PEG, quando analisada
por AFM, que é sugestivo da presença de um material macio. Esse contraste não foi
observado em NS de homopolímero de PLA. As formulações contendo os polímeros
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GARCIA, GM
RESUMO
tribloco, dibloco e PLA liberaram aproximadamente 90, 75 e 40% do fármaco,
respectivamente, após 24h com perfis que obedecem ao modelo de liberação descrito por
Higuchi. Foram também desenvolvidas nanocápsulas (NC) com núcleo oleoso para
encapsulamento da Lyso-7. Os copolímeros dibloco e tribloco também induziram redução
significativa (p < 0,05) do tamanho das NC, 214 nm e 181 nm, respectivamente, quando
comparado ao tamanho médio das NC de PLA, 295 nm. A introdução de grupos hidroxila
ou benzila induziu o aumento do tamanho médio das NC para 225 nm e 227 nm,
respectivamente, como também observado para as NS. A associação da Lyso-7 a 0,5
mg/mL, induziu um aumento do tamanho médio das NC, para 240 e 212 nm, com os
polímeros dibloco e tribloco, respectivamente. As NC funcionalizadas com LSE
apresentaram tamanhos médios superiores aos das NC não funcionalizadas, 275 nm, o
que está provavelmente relacionado à sua organização na interface, o que induziu
variação no raio hidrodinâmico das NP. Foi realizado estudo farmacocinético da Lyso-7
livre e associada à NC de PLA. A área sob a curva, concentração versus tempo da Lyso-7
associada às NC aumentou 5,5 vezes em relação à Lyso-7 livre, sendo a depuração
reduzida de 75,27 para 19,08 mL/min.Kg. Além disso, observou-se uma dramática
diminuição dos efeitos tóxicos da Lyso-7 quando administrada por via intravenosa,
aumentando-se a DL100 para valores superiores a 2,17 mg/Kg de camundongo. Os
resultados apresentados neste estudo se mostraram promissores para posterior
investigação do efeito das NP in vitro e in vivo em modelos experimentais de inflamação
crônica de tecidos, especialmente associados à doença de chagas e à aterosclerose.
10
GARCIA, GM
LISTA DE FIGURAS
ABSTRACT
In this study we present a study of the physicochemical characterization of polymeric
nanoparticles (NP), produced from copolymers of polylactic acid (PLA) covalently linked to
polyethylene glycol (PEG). We used polymer with diblock (PLA-PEG) and triblock (PLAPEG-PLA) architecture, with or without functionalization along the PLA chain. The hydroxyl
and benzyl groups were inserted along the PLA chain, which allowed the functionalization
of the polymer with a ligand for the receptor E-selectin (LSE), present in the endothelium
of blood vessels. Two drugs were encapsulated: itraconazole, representing the azole class
of drugs with promising results in treatment of experimental Chagas' disease and a new
substance in preclinical research of tiazolidinodionas class (TZD), called Lyso-7, which
has shown results promising in improving risk factors for cardiovascular disease such as
atherosclerosis. The nanostructures were analyzed and characterized according to size,
polydispersity index (PI), zeta potential and release kinetics in vitro. The morphological
analysis were performed by atomic force microscopy (AFM). The results regarding
nanospheres (NS) show that monodispersed populations were obtained (PI <0.20) with
average size ranging from 116 to 284 nm before and after the association of 0.5 mg / mL
of itraconazole. The use of diblock and triblock copolymers led to a significant reduction in
particle size, 116 and 146 nm, respectively, when compared to the size of those prepared
from the PLA homopolymer (206 nm). The reduction in size suggests the presence of PEG
chains arranged on the surface of NS. The introduction of hydroxyl or benzyl groups
induced a significant increase in the average size of the NS to 151 nm and 284 nm,
respectively, indicating increased internal volume of the polymer matrix to accommodate
the bulky functional groups. The significant reduction of the zeta potential of approximately
-16 mV for all formulations after addition of itraconazole, suggests the interference of the
drug in the organization of the constituents of the NS surface. The percentage of
encapsulation was close to 100% for itraconazole at a concentration of 0.5 mg/ml. We
observed the presence of a strong contrast in phase images, on the surface of NS
containing PEG blocks, when analyzed by AFM, which is suggestive of the presence of a
soft material. This contrast was not observed in the NS homopolymer PLA. The
formulations containing triblock, diblock and PLA polymers released about 90, 75 and 40%
of the drug, respectively, after 24 hours with profiles that follow the model described by
Higuchi release. We also developed nanocapsules (NC) with oily core for encapsulation of
Lyso-7. The diblock and triblock copolymers also induced a significant size reduction
11
GARCIA, GM
LISTA DE FIGURAS
(p<0.05) of NC, 214 nm and 181 nm, respectively, when compared to the average size of
PLA NC, 295 nm. The introduction of hydroxyl or benzyl groups led to an increase in the
average size of the NC to 225 nm and 227 nm, respectively, as also observed for the NS.
The association of 0.5 mg/ml Lyso-7, induced an increase in the average size of NC for
240 and 212 nm, with the diblock and triblock polymers, respectively. The NC
functionalized with LSE had higher average sizes compared with non-functionalized NC,
275 nm, which is probably related to your organization at the interface, which induced
variation in the hydrodynamic radius of the NC. Pharmacokinetic study was conducted of
Lyso-7 free and associated with PLA NC. The area under the curve, concentration versus
time, associated to Lyso-7 NC increased 5.5 times compared to the free Lyso-7, and the
clearance reduced of 75.27 to 19.08 ml/min.kg. In addition, we observed a dramatic
decrease of the toxic effects of Lyso-7 when administered intravenously, increasing the
DL100 to values greater than 2.17 mg/kg of mice. The results of this study showed promise
for further investigation of the effect of NP in vitro and in vivo experimental models of
chronic inflammation of tissues, especially associated with Chagas disease and
atherosclerosis.
12
GARCIA, GM
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática de NC e NS poliméricas: a) fármaco dissolvido no
núcleo oleoso das NC; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das NC; c) fármaco
retido na matriz polimérica das NS; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na
matriz polimérica. ............................................................................................................... 32
Figura 2: Esquema representativo da dupla camada elétrica (Hotza, 1997). ................... 35
Figura 3: Arquitetura de copolímeros lineares (adaptado de Qui & Bae, 2006). ............... 38
Figura 4: Representação química dos copolímeros dibloco (A) e tribloco (B) e suas
funcionalizações. ............................................................................................................... 39
Figura 5: Esquema simplificado do início de um processo inflamatório demonstrando da
ativação de células do endotélio vascular e aumento da expressão de selectina-E (A) e o
processo de internalização de leucócitos (B) após a adesão dos mesmos mediados por
selectina-E. ........................................................................................................................ 41
Figura 6: Estrutura química do ligante natural de selectina-E, o Syalil-Lewis X (sLex). ... 42
Figura 7: Estrutura química do ligante sintético de selectinas E e P. ............................... 42
Figura 8: Estrutura química do itraconazol. ...................................................................... 45
Figura 9: Estrutura química do fármaco Rosiglitazona e Pioglitazona. Em vermelho a
tiazolidina-2,4-dionas, estrutura comum em todas as TZD. ............................................... 47
Figura 10: Estrutura química da Lyso-7. ........................................................................... 48
Figura 11:Cromatograma dos polímeros das diferentes NS: preto (tribloco-OH); vermelho
(dibloco-OBZ); verde (dibloco); azul (tribloco); laranja (dibloco-OH); marrom (triblocoOBz); cinza ITZ 10 µg/mL. ................................................................................................. 54
Figura 12: Curva de calibração do ITZ com detecção DAD no comprimento de onda de
260 nm; R2 = coeficiente de correlação linear. .................................................................. 54
Figura 13: Cromatograma do itraconazol nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 e 10
µg/mL com detecção DAD. ................................................................................................ 55
Figura 14: Curva de calibração do ITZ com detecção FLU a 320 nm de excitação e 380
nm de emissão; R2 = coeficiente de correlação linear. ...................................................... 56
Figura 15: Cromatograma do itraconazol na concentração de 0,1 µg/mL com detecção
FLU. ................................................................................................................................... 56
Figura 16: Etapas da Preparação de Nanoesferas. 1) A solução orgânica é vertida na
solução aquosa; 2) A suspensão obtida é mantida em agitação por 10 minutos; 3) O
solvente e o excesso de água são evaporados. ................................................................ 63
13
GARCIA, GM
LISTA DE FIGURAS
Figura 17: Representação esquemática das dosagens de ITZ realizadas nas formulações
de NS para determinação da porcentagem de encapsulação e eficiência de encapsulação.
........................................................................................................................................... 65
Figura 18: Representação dos polímeros dibloco (A) e tribloco (B) com os grupos
hidroxila (-OH) e benzila (-OBz) ligados covalentemente ao longo da cadeia. ............. Erro!
Indicador não definido.
Figura 19: Tamanho das NS dibloco recém-preparadas e após 12 meses de
armazenamento. ................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 20: Tamanho das NS tribloco recém-preparadas e após 12 meses de
armazenamento. ................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 21: Imagens de MFA de nanoesferas de PLA, altura (A) e imagem de fase (B).
Escaneamento de 5 µm x 5 µm. Z range: 1000 nm. ............. Erro! Indicador não definido.
Figura 22: Imagem de MFA de NS de PLA; (A) altura das nanoesferas e (B) perfil
topográfico (setas vermelhas) e diâmetro (setas verdes). .... Erro! Indicador não definido.
Figura 23: Imagens por MFA de nanoesferas de PLA, altura (a) e imagem de fase (b).
Escaneamento de 450 nm x 450 nm. Z range: 1000. ........... Erro! Indicador não definido.
Figura 24: Imagens de MFA de NS brancas. Visualização tridimensional (A e C) e
tamanho (B e D) usando os copolímeros dibloco (A e B) e tribloco (C e D). Escaneamento
de 1 µm × 1 µm..................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 25: Imagens de MFA de NS dibloco (PLA-PEG) (a) e o perfil topográfico (b)
demonstrando a altura das nanoesfeiras (setas vermelhas) e o diâmetro (setas verdes).
.............................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 26: Imagens de fase de NS preparadas com polímeros PLA (a), tribloco PLA-PEGPLA (b) e dibloco PLA-PEG (c). ............................................ Erro! Indicador não definido.
Figura 27: Imagen por MFA de NS tribloco com ITZ 0,5 mg/mL, altura (a) e imagem de
fase (b). Escaneamento de 1 µm x 1 µm. Z range: 500 nm. . Erro! Indicador não definido.
Figura 28: Imagen por MFA de NS tribloco com ITZ 0,5 mg/mL, altura (a) e imagem de
fase (b). Escaneamento de 1 µm x 1 µm. Z range: 500 nm. . Erro! Indicador não definido.
Figura 29: Mecanismos de liberação: (A) difusão através de poros preenchidos com
água; (B) difusão através do polímero; (C) bombeamento osmótico e (D) erosão
(Fredenberg et al, 2011). ...................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 30: Perfil de liberação in vitro de NS de ITZ na concentração de 0,5 mg/mL em
PBS, utilizando os polímeros dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA), e ácido
polilático (PLA). ..................................................................... Erro! Indicador não definido.
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GARCIA, GM
LISTA DE FIGURAS
Figura 31: Representação esquemática da estrutura de constituição das nanoesferas. (a)
NS convencional, (b) NS peguilada dibloco e (c) NS peguilada tribloco (adaptado de Essa
et al, 2010). ........................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 32: Perfil de liberação in vitro do ITZ em nanoesferas na concentração de 0,5
mg/mL em PBS, utilizando os diferentes copolímeros dibloco.Erro!
Indicador
não
definido.
Figura 33: Perfil de liberação in vitro do ITZ em nanoesferas na concentração de 0,5
mg/mL em PBS, utilizando os diferentes copolímeros tribloco.Erro!
Indicador
não
definido.
Figura 34: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS PLA.
.............................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 35: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS dibloco.
.............................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 36: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS tribloco.
.............................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Figura 37: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS diblocoOH. ....................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 38: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS triblocoOH. ....................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 39: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS diblocoOBz. ...................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 40: Representação gráfica dos modelos matemáticos da liberação de NS triblocoOBz. ...................................................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 41: Cromatograma do polímero PLA (preto) e da Lyso-7. ................................... 104
Figura 42: Curva de calibração da Lyso-7 no comprimento de onda de 385 nm; R2 =
coeficiente de correlação linear. ...................................................................................... 104
Figura 43: Cromatogramas do plasma branco (vermelho) e da Lyso-7 (preto) com padrão
interno (PI), demonstrando maior escala (A) e menor escala (B). ................................... 108
Figura 44: Cromatogramas demonstrando uma adequada resolução entre a Lyso-7 e seu
padrão interno (PI). (A) Lyso-7 0,01 µg/mL em preto e 10 µg/mL em azul e (B) Lyso-7 5
µg/mL em preto e 10 µg/mL em azul. .............................................................................. 108
Figura 45: Curva de calibração do método bioanalítico para quantificação de Lyso-7 em
plasma por cromatografia líqüida de alta eficiência. ........................................................ 111
15
GARCIA, GM
LISTA DE FIGURAS
Figura 46: Cromatograma da Lyso-7 a 5 µg/mL (preto) e a 10 µg/mL (azul), ambos com
padrão interno (PI). .......................................................................................................... 111
Figura 47: Perfil de dissolução/liberação in vitro da Lyso-7 livre e em nanocápsulas de
PLA (NC-PLA) na concentração de 0,35 µg/mL em PBS. ............................................... 128
Figura 48: Perfil da concentração plasmática da Lyso-7 após administração intravenosa
das doses: 1,55 mg/Kg de Lyso-7 livre e 2,17 mg/Kg de NC-PLA (média ± erro padrão, n =
6). *** p < 0,001, ** p < 0,05 usando two-way ANOVA. ................................................... 131
Figura 49: Cromatograma de amostra de plasma coletado 5 min após injeção de 300 µL
da suspensão de NC-PLA com 0,5 mg/mL de Lyso-7. .................................................... 132
16
GARCIA, GM
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Diferentes tipos de nanocarreadores e algumas de suas funções (adaptado de
Kanwar et al, 2011). ........................................................................................................... 31
Tabela 2: Parâmetros relativos à curva de calibração média do método analítico para
quantificação de ITZ com detecção FLU ........................................................................... 55
Tabela 3: Resultados do teste de precisão intra e interdia para validação do ITZ por
CLAE-DAD a 260 nm ......................................................................................................... 56
Tabela 4: Resultados do teste de precisão intra e interdia para validação do ITZ por
CLAE-FLU com 320 nm de excitação e 380 nm de emissão............................................. 57
Tabela 5: Exatidão do método de doseamento do ITZ por detecção DAD ....................... 58
Tabela 6: Exatidão do método de doseamento do ITZ por detecção FLU ........................ 58
Tabela 7: Limites de detecção e quantificação do ITZ com detecção DAD e FLU............ 58
Tabela 8: Diâmetro hidrodinâmico médio de nanoesferas de ITZ obtidas a partir de
diferentes polímeros ............................................................. Erro! Indicador não definido.
Tabela 9: Comparação de tamanho entre as NS brancas produzidas com polímeros
dibloco e tribloco com e sem o ligante de selectina. ............. Erro! Indicador não definido.
Tabela 10: Quadro comparativo do efeito do ITZ nas propriedades de tamanho e carga
superficial das NS ................................................................. Erro! Indicador não definido.
Tabela 11: Eficiência de encapsulação e porcentagem de encapsulação de formulações
de NS com 0,5 mg/ml de ITZ ................................................ Erro! Indicador não definido.
Tabela 12: Tamanho das NS brancas analisadas por PCS e MFAErro!
Indicador
não
definido.
Tabela 13: Tabela valores de R2 (coeficiente de correlação linear) referentes a cinética de
liberação do ITZ em PBS, obtidos através da construção de gráficos para modelo de
Ordem 0 (t x QNL ), 1ª Ordem (t x log %NL ), e Higuchi (√ t x %L ). Os valores em negrito
.............................................................................................. Erro! Indicador não definido.
Tabela 14: Valores de n (coeficiente de liberação) para as amostrasErro! Indicador não
definido.
Tabela 15: Preparo da curva de calibração..................................................................... 102
Tabela 16: Testes de recuperação da Lyso-7 em plasma de camundongo .................... 103
Tabela 17: Resultados do teste de precisão intra-dia para validação do doseamento por
CLAE-DAD da Lyso-7 a 385 nm ...................................................................................... 105
Tabela 18: Exatidão do método de doseamento da Lyso-7 ............................................ 106
Tabela 19: Testes de recuperação da Lyso-7 em plasma de camundongo .................... 109
17
GARCIA, GM
LISTA DE TABELAS
Tabela 20: Recuperação média do procedimento de extração das amostras de plasma de
controle de qualidade adicionadas de Lyso-7 (padrão) e benznidazol® (padrão interno).
Cada valor representa a média de seis determinações. DP = desvio padrão,
CV=coeficiente................................................................................................................. 110
Tabela 21: Resultados de precisão e exatidão intra e inter-ensaios do método analítico
para quantificação de Lyso-7 em plasma. Os resultados expressam a média da análise de
6 amostras, durante 3 dias .............................................................................................. 113
Tabela 22: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas após permanência
à temperatura ambiente por 4 horas. Cada resultado representa a média de três
determinações ................................................................................................................. 114
Tabela 23: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas imediatamente
após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a um ciclo de
congelamento e descongelamento (n = 5)....................................................................... 115
Tabela 24: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas imediatamente
após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a dois ciclos de
congelamento e descongelamento, (n = 5)...................................................................... 115
Tabela 25: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas imediatamente
após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a três ciclos de
congelamento e descongelamento, (n = 5)...................................................................... 115
Tabela 26: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, purificadas e mantidas a
temperatura ambiente por 24 horas, (n = 5) .................................................................... 116
Tabela 27: Comparação do tamanho entre as NC brancas com diversos polímeros ..... 125
Tabela 28: Comparação de tamanho entre as NC com 0,5 mg/mL de Lyso-7 produzidas
com polímeros PLA, dibloco e tribloco, com e sem ligante de selectina .......................... 126
Tabela 29: Eficiência de encapsulação e rendimento de encapsulação de formulações de
NC com 0,5 mg/ml de Lyso-7 .......................................................................................... 127
Tabela 30: Tabela valores de R2 (coeficiente de correlação linear) referentes a cinética de
liberação de PLA-NC da Lyso-7 em PBS, obtidos através da construção de gráficos para
modelo de Ordem 0 (t x QND ), 1ª Ordem (t x log %ND ), e Higuchi (√ t x %D ) ............. 129
Tabela 31: Valores de n (coeficiente de liberação) para as amostras ............................. 129
Tabela 32: Parâmetros farmacocinéticos da Lyso-7 em diferentes formulações após
administração intravenosa ............................................................................................... 131
18
GARCIA, GM
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ζ- potencial zeta
ANOVA – análise de variância
ANVISA - agência nacional de vigilância sanitária
AUC – área sob a curva
CETEC - Centro Tecnológico de Minas Gerais
CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Cmédia - concentração média determinada
Cl= clearence
CLAE-DAD = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Associada a arranjos diidos
CLAE-FLU = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Associada a Fluorescência
CQA - controle de qualidade concentração alta
CQB - controle de qualidade concentrações baixa
CQ - controle de qualidade
CQM - controle de qualidade concentração média
CV(%) - coeficiente de variação em porcentagem
DMSO = dimetilsulfóxido
DP - desvio-padrão
FDA - Food and Drug Administration
FLU - fluorescência
ITZ = itraconazol
I.P - índice de polidispersão
kHz – kilohertz
kDa – kilodaltons
Kd - constante de distribuição
LD - limite de detecção
LIQ - limite inferior de quantificação
LQ - limite de quantificação
LSQ - limite superior de quantificação
MFA - microscopia de força atômica
mg/Kg – miligrama por kilo
mg/mL – miligramas por mililitro
mV – milivolt
NC – nanocápsulas
19
GARCIA, GM
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
NP – nanopartícula
NS - nanoesferas
PA – padrão analítico
PBS – tampão fosfato salina
PI - padrão interno
PCL - poli-ε-caprolactona
PK/PD – correlação entre farmacocinética e farmacodinâmica
ECF - espectroscopia de correlação de fótons
PEG - polietilenoglicol
PLA – ácido poliláctico
PLGA – ácido poli(lático-co-glicólico)
QND – quantidade não dissolvida
QNL – quantidade não liberada
rpm - rotações por minuto
SFM - sistema fagocítico mononuclear
T. cruzi = Trypanosoma cruzi
TGI = trato gastrointestinal
TZD = tiazolidona
UV = ultravioleta
20
GARCIA, GM
SUMÁRIO
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ......................................................................................................... vi
RESUMO ............................................................................................................................. 9
ABSTRACT ....................................................................................................................... 11
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... 13
LISTA DE TABELAS......................................................................................................... 17
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................... 19
SUMÁRIO .......................................................................................................................... 21
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 25
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 29
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 30
2.1 Sistemas Vetorizados ............................................................................................... 30
2.2 Polímeros e copolímeros utilizados no preparo de nanopartículas .......................... 35
2.3 Direcionamento ativo de fármacos: funcionalização................................................. 39
2.3.1 As selectinas como alvo do direcionamento ativo de fármacos ......................... 40
2.3.2 Inflamação associada à patogênese da doença de Chagas .............................. 43
2.3.3 Inflamação associada à patogênese da aterosclerose....................................... 46
OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 41
CAPÍTULO I ...................................................................................................................... 42
VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DOSEAMENTO DO
ITRACONAZOL ................................................................................................................. 42
1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 51
2 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................. 52
2.1 Materiais ................................................................................................................... 52
2.2 Equipamentos........................................................................................................... 52
2.3 Validação de metodologia analítica para quantificação do itraconazol nas
nanoesferas poliméricas por CLAE-DAD e para avaliação da cinética de liberação in
vitro por CLAE-FLU ........................................................................................................ 52
2.3.1 Condições cromatográficas ................................................................................ 52
2.3.2 Parâmetros de validação .................................................................................... 53
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 53
3.1 Especificidade .......................................................................................................... 53
3.2 Linearidade ............................................................................................................... 54
3.3 Precisão.................................................................................................................... 56
21
GARCIA, GM
SUMÁRIO
3.4 Exatidão.................................................................................................................... 57
3.5 Limite de detecção e limite de quantificação ............................................................ 58
4 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 59
CAPÍTULO II ..................................................................................................................... 60
Preparo de formulações e caracterização das nanopartículas contendo o itraconazol
........................................................................................................................................... 60
1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 61
2 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................. 62
2.1 Materiais ................................................................................................................... 62
2.2 Preparação das nanoesferas.................................................................................... 62
2.3 Caracterização Físico-Química das Nanopartículas ................................................. 63
2.3.1 Distribuição de Tamanho ................................................................................... 63
2.3.2 Potencial Zeta (ζ) ............................................................................................... 64
2.3.3 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação ...................................................... 64
2.3.4 Análise Morfológica das Nanopartículas ............................................................ 65
2.3.5 Avaliação da solubilidade do itraconazol em PBS.............................................. 66
2.3.6 Avaliação da cinética de liberação in vitro .......................................................... 66
2.4 Análise Estatística dos Dados .................................................................................. 67
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................ Erro! Indicador não definido.
3.1 Preparo das nanopartículas......................................... Erro! Indicador não definido.
3.2 Caracterização Físico-Química das Nanopartículas .... Erro! Indicador não definido.
3.2.1 Distribuição de Tamanho ...................................... Erro! Indicador não definido.
3.2.2 Estabilidade físico-química .................................... Erro! Indicador não definido.
3.2.3 Potencial Zeta (ζ) .................................................. Erro! Indicador não definido.
3.2.4 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação ......... Erro! Indicador não definido.
3.2.5 Avaliação morfológica das nanoesferas ................ Erro! Indicador não definido.
2.2.6 Avaliação da solubilidade do itraconazol ............... Erro! Indicador não definido.
2.2.7 Avaliação da cinética de liberação in vitro ............. Erro! Indicador não definido.
4 CONCLUSÕES ..................................................................... Erro! Indicador não definido.
CAPÍTULO III .................................................................................................................... 97
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA E
BIOANALÍTICA PARA DOSEAMENTO DA LYSO-7 ....................................................... 97
1 OBJETIVOS ................................................................................................................... 98
2 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................. 99
2.1 Materiais ................................................................................................................... 99
22
GARCIA, GM
SUMÁRIO
2.2 Validação analítica por CLAE-DAD .......................................................................... 99
2.2.1 Padrões de calibração ........................................................................................ 99
2.2.2 Condições cromatográficas ................................................................................ 99
2.3 Validação Bioanalítica em plasma por CLAE-DAD................................................. 100
2.3.1 Padrões de calibração ...................................................................................... 100
2.3.2 Condições cromatográficas .............................................................................. 100
2.3.3 Animais ............................................................................................................ 101
2.3.4 Preparo das amostras de plasma padrão para a curva de calibração ............. 101
2.3.5 Desenvolvimento do método de extração da Lyso-7........................................ 102
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 103
3.1 Validação analítica por CLAE-DAD ........................................................................ 103
3.1.1 Especificidade .................................................................................................. 103
3.1.2 Linearidade....................................................................................................... 104
3.1.3 Precisão ........................................................................................................... 105
3.1.4 Exatidão ........................................................................................................... 105
3.1.5 Limite de quantificação e limite de detecção .................................................... 106
3.2 Validação bioanalítica em plasma por CLAE-DAD ................................................. 107
3.2.1 Especificidade .................................................................................................. 107
3.2.2 Recuperação .................................................................................................... 108
3.2.3 Linearidade....................................................................................................... 110
3.2.4 Precisão ........................................................................................................... 112
3.2.5 Exatidão ........................................................................................................... 112
3.2.6 Limite de quantificação e limite de detecção .................................................... 113
3.2.7 Estabilidade ...................................................................................................... 113
3.2.7.1 Estabilidade de curta duração ....................................................................... 114
3.2.7.2 Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento ...................... 114
3.2.7.3 Estabilidade pós-processamento .................................................................. 116
4 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 117
CAPÍTULO IV .................................................................................................................. 118
PREPARO, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO FARMACOCINÉTICO DAS
NANOCÁPSULAS CONTENDO LYSO-7 ....................................................................... 118
1 OBJETIVOS ................................................................................................................. 119
2 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................ 120
2.1 Materiais ................................................................................................................. 120
23
GARCIA, GM
SUMÁRIO
2.2 Preparo das nanocápsulas ..................................................................................... 120
2.3 Caracterização Físico-Químicas das nanocápsulas ............................................... 121
2.3.1 Distribuição de tamanho ................................................................................... 121
2.3.2 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação .................................................... 121
2.3.3 Avaliação da solubilidade da Lyso-7 em óleo e PBS ....................................... 122
2.3.4 Avaliação da cinética de liberação in vitro ........................................................ 122
2.3.5 Estudo farmacocinético da Lyso-7 ................................................................... 123
2.4 Análise Estatística dos Dados ................................................................................ 124
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 124
3.1 Caracterização Físico-Químicas das nanocápsulas ............................................... 124
3.1.1 Distribuição de tamanho ................................................................................... 124
3.1.2 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação .................................................... 127
2.3.5 Avaliação da solubilidade da Lyso-7 ................................................................ 127
2.3.6 Avaliação da cinética de liberação in vitro ........................................................ 128
3.3 Estudo farmacocinético da Lyso-7 nanoencapsulado ............................................ 130
4 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 132
CONCLUSÃO .................................................................................................................. 133
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 136
ANEXOS - Resumos apresentados em congressos científicos: .............................. 149
24
INTRODUÇÃO
O conceito de vetorização surgiu como alternativa a certos obstáculos
apresentados pela terapia sistêmica convencional. Assim, as características físicoquímicas do vetor, e não mais aquelas do fármaco isoladamente, passam a governar o
perfil de distribuição tecidual da molécula ativa. Os sistemas utilizados são de natureza
variável, mas o princípio geral da vetorização é o mesmo e consiste na liberação do
fármaco de forma preferencial no órgão ou célula-alvo, permitindo deste modo, acentuar o
efeito farmacológico e reduzir os efeitos colaterais adversos (Mohanraj & Chen, 2006).
A utilização de vetores para o controle da liberação de fármacos em sítios
específicos de ação permite o aprimoramento da velocidade de liberação e do regime de
dosagem das substâncias e assim, tem sido uma área de intensa pesquisa nos últimos
vinte anos. Dentre os vetores, incluem-se as micropartículas e os sistemas coloidais
(lipossomas e nanopartículas) (Schaffazick & Guterres, 2003). A vetorização apresenta
múltiplas aplicações, como por exemplo, no tratamento de infecções parasitárias, no
tratamento de inflamações crônicas e agudas, no tratamento do câncer, entre outros
(Brigger et al., 2002; Mosqueira et al., 2004; Pereira et al., 2009).
As NP poliméricas são sistemas carreadores de fármacos que apresentam
diâmetro inferior a 1 µm. O termo nanopartícula inclui as nanocápsulas (NC) e as
nanoesferas (NS), as quais diferem entre si segundo a composição e organização
estrutural. As NC são constituídas de um núcleo oleoso e uma camada externa
polimérica, com surfactantes lipofílicos e/ou hidrofílicos em sua interface. Por outro lado,
as NS, que não apresentam óleo em sua composição, são formadas por uma matriz
polimérica, onde o fármaco pode ficar retido ou adsorvido (Takino et al., 1994).
As propriedades das nanopartículas poliméricas podem ser controladas pela
modificação das propriedades físico-químicas dos polímeros empregados. Polímeros tais
como
o
ácido
poli-D,L-láctico
(PLA),
ácido
poli-lático-co-glicólico
(PLGA),
os
polihidroxialcanoatos (PHAs), poli-ε-caprolactona (PCL), quitosana e seus derivados
(Prego et a.l, 2005) e copolímeros são os mais comumentes utilizados por serem
biodegradáveis e biocompatíveis (Couvreur et al., 2002). Os sistemas nanoparticulados
preparados a partir de tais polímeros permitem a encapsulação de fármacos com vistas à
liberação controlada dos mesmos ou ainda fornecer uma atividade terapêutica mais eficaz
quando comparada com aquela produzida pela administração do fármaco livre. Além
disso, tais sistemas possibilitam a administração intravenosa de moléculas hidrofóbicas,
em elevadas concentrações, melhorando ainda a estabilidade proporcionada pela
26
presença da barreira polimérica, frente à degradação química e enzimática em meio
fisiológico (Mosqueira et al., 2001, Pereira et al., 2009).
Quando administrados por via endovenosa, os vetores nanoparticulares
convencionais são rapidamente removidos da circulação sanguínea pelo sistema
fagocítico mononuclear (SFM), principalmente representado pelas células de Kupffer do
fígado e macrófagos do baço. Esta remoção da circulação geralmente ocorre através do
reconhecimento destes vetores pelos receptores celulares, em um mecanismo
intermediado pela adsorção de proteínas plasmáticas (opsonisação) nas partículas. Deste
modo, a remoção realizada pelo SFM é a maior limitação para a vetorização de fármacos
destinados a outros sítios no corpo humano, apesar deste fenômeno ter sido
vantajosamente empregado no tratamento de infecções intracelulares no fígado e baço
(Barratt et al., 2000).
Muitas técnicas têm sido desenvolvidas e testadas para a modificação da
superfície das nanopartículas para impedir a adsorção das proteínas plasmáticas. Os
polietilenoglicóis (PEG) são os polímeros mais utilizados para modificar a superfície
destas
partículas
(Gref et al., 1995;
Gref et al., 2000;
Li et al., 2001;
Mosqueira et al., 2001). Estes polímeros são não imunogênicos, hidrofílicos, pouco
tóxicos e neutros, aprovadas pelo Food and Drug Administration (FDA) para uso interno
humano, podendo ser adsorvido fisicamente ou ligado covalentemente na superfície das
nanocápsulas (Mosqueira et al., 2001). O mecanismo é baseado na formação de um
revestimento hidrofílico, que impede estericamente a opsonização pelas proteínas
plasmáticas (Gref et al., 1995). Estas partículas denominadas furtivas escapam da
captura pelos macrófagos apresentando um aumento do seu tempo de circulação
sanguínea e consequentemente uma maior concentração de fármaco atinge os tecidos
alvos.
A nanotecnologia associada ao uso de polímeros faz parte dos desafios para
se alcançar o direcionamento de fármacos. A possibilidade de sintetizar polímeros com
estruturas e composição bem definidas abre caminhos para a obtenção de NP com
propriedades
específicas
(Qiu & Bae, 2006).
A
importância
da
relação
arquitetura/propriedades do polímero tem sido progressivamente enfatizada, uma vez que
descreve a forma de uma única molécula do mesmo, que muitas vezes determina as
propriedades físico-químicas do vetor. Copolímeros em bloco são definidos como
polímeros que têm dois ou mais segmentos ou blocos organizados na cadeia principal e
podem ser classificados de acordo com sua arquitetura (Qiu & Bae, 2006). As
27
características específicas de cada bloco estão correlacionadas com a arquitetura do
copolímero em bloco, o que auxilia no ajuste das propriedades físico-químicas do
polímero para acrescentar novas funcionalidades ao núcleo ou a superfície de tais
arranjos.
Uma estratégia terapêutica que tem se mostrado promissora para o
direcionamento ativo de fármacos é pilotá-los para as células do endotélio vascular
ativado
para
modular,
dentre
outros
processos,
a
resposta
inflamatória
(Kessner et al., 2001). O mecanismo é baseado no acoplamento de ligantes na superfície
das NPs. Estes ligantes, que podem ser naturais ou sintéticos, são específicos para
moléculas que possuem sua expressão aumentada durante o processo inflamatório. Uma
vez que selectina-E é expressa na fase aguda e crônica da inflamação, ela pode ser
considerada como um bom candidato para o direcionamento de fármacos. Os ligantes
naturais de selectina E e P são conhecidos por estarem presentes em membranas
plasmáticas de leucócitos circulantes (Ehrhardt et al., 2004; Magnani, 2004). Análogos
sintéticos destes ligantes naturais têm sido investigados devido a sua habilidade de
bloquear
a
inflamação
(Ehrhardt et al., 2004;
Simanek et al., 1998;
Kaila & Thomas, 2002). Alguns desses análogos têm demonstrado ter alta afinidade ao
alvo se comparado com o ligante natural, tornando-os moléculas muito atrativas no
desenvolvimento de vetores para o direcionamento ativo de fármacos (funcionalização)
(Essa et al., 2008).
Portanto, neste trabalho objetiva-se o desenvolvimento e caracterização
físico-química de nanopartículas poliméricas produzidas a partir do ácido polilático (PLA)
ligado covalentemente ao polietilenoglicol (PEG) formando diblocos (PLA-PEG) e triblocos
(PLA-PEG-PLA), ambos apresentando ou não funcionalização ao longo da cadeia
(hidroxila, benzila ou selectina-E). Foi avaliada a influência das propriedades de superfície
desses polímeros nas características físico-químicas das nanopartículas, além da
capacidade de tais nanopartículas em modificar o perfil farmacocinético do fármaco a elas
associados. Para tal, foram testadas a encapsulação de dois fármacos: o itraconazol, com
promissores resultados para o tratamento da doença de Chagas; e uma nova substância
da classe das tiazolidonas (TZD), denomina Lyso-7. As TDZs possuem reconhecida
capacidade de melhoria dos fatores associados a doenças cardiovasculares, como a
aterosclerose. Métodos analíticos foram desenvolvidos utilizando cromatografia líquida de
alta eficiência para a quantificação desses fármacos nas nanopartículas e em matriz
biológica.
28
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Sistemas Vetorizados
Nos últimos anos, estudos têm demonstrado que uma abordagem eficaz
para aperfeiçoar a ação farmacológica dos fármacos é associar a molécula ativa em um
sistema de liberação nanoestruturado (Piñon-Segundo et al., 2005). A nanotecnologia tem
sido aplicada no desenvolvimento desses novos sistemas de liberação controlada, que
muitas vezes são veículos de fármacos para aplicações no tratamento do câncer,
doenças parasitárias, entre outras enfermidades (Mohanraj & Chen, 2006), além de
aplicação na cosmetologia. São exemplos destes tipos de veículos as nanopartículas (NP)
poliméricas, os dendrímeros, os lipossomos, as nanopartículas magnéticas, as
nanopartículas contendo ácidos nucleicos e as nanopartículas virais (Kanwar et al, 2011;
Alexis et al., 2008) (Tabela 01). Esses sistemas têm o potencial de aperfeiçoar o índice
terapêutico de diversos fármacos já disponíveis no mercado, aumentando a sua eficácia,
diminuindo a sua toxicidade e atingindo níveis plasmáticos constantes por um período
prolongado. Além disso, os nanocarreadores possibilitam a administração endovenosa de
substâncias de baixa solubilidade em água e a protegem de possíveis degradações. Tais
características permitem o desenvolvimento de novas formas farmacêuticas veiculando
entidades químicas que não haviam ultrapassado as fases pré-clínica e clínica devido às
suas propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e de biodisponibilidade (Alexis et al.,
2008).
Nanopartículas poliméricas podem ser definidas como sistemas coloidais ou
como carreadores sólidos de fármacos preparados a partir de polímeros naturais ou
sintéticos (Brigger et al., 2002; Reis et al., 2006). Esse tipo de sistema vetorizado possui a
habilidade de atingir órgãos ou tecidos específicos e, além disso, atuar como carreadores
de DNA, vacinas, proteínas e peptídeos, que por serem instáveis em meios biológicos
apresentavam testes pouco viáveis (Soppimath et al., 2001; Hans & Lowman, 2002).
30
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tabela 1: Diferentes tipos de nanocarreadores e algumas de suas funções (adaptado de Kanwar et al.,
2011).
Nome
Estrutura
Composição
Perspectivas e usos
Ref.
Nanotubos de
carbonos
Composto de
fulerenos
(compostos C60)
e/ou outros
carbonos formando
estruturas ocas
Aumentam o volume interno,
fácil de modificações
funcionais das superfícies
internas e externas. Com
uma camada superficial é
usado para direcionar
fármacos e genes, e duas
camadas para transfecção
Foley et al.,
2002;
Martin &
Kohli, 2003
Lipossomas
Lipídeos anfifílicos
Alteram o perfil
farmacocinético de fármacos
encapsulados
Rawat et
al., 2006
Nanopartículas
lipídica sólida
Lipídeos anfifílicos
Podem ser usadas como
adjuvantes em vacinas e
como agentes para
transfecção não-viral
Cevc, 2004
Nanopartículas
poliméricas
Polímeros
biodegradáveis e
biocompatíveis
Eles permitem maior controle
da farmacocinética do
fármaco carreado, gerando
níveis mais constantes dos
mesmos
Rawat et
al., 2008;
Mahidhara
et al. 2011
Micelas
poliméricas
Lipídeos anfifílicos
São formadas em meio
hidrofóbico sendo adequadas
para carrear fármacos
insolúveis em água devido à
composição do núcleo
Torchilin et
al., 2003
Dendrímeros
Monômeros do tipo
ABn
Oferecem vantagens como
tamanho nanométrico, fácil
modificação e preparo.
Podem ser usados como
agentes de revestimento com
proteção e direcionamento de
fármacos para vários sítios
Choi et al.,
2005
Nanopartículas
funcionalizadas
Metais inorgânicos,
anticorpos, ligantes
específicos
Podem ser incorporadas
propriedades fluorescentes
para uso como biosensores,
e também são usados como
marcador em biologia
molecular e direcionamento
específico de fármacos
Schneider
et al., 2000
31
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
As principais características a serem levadas em consideração no
desenvolvimento de NP são a composição, o tamanho, suas propriedades superficiais e o
perfil de liberação de agentes farmacologicamente ativos. Estas características físicoquímicas irão modificar a biodistribuição do fármaco no organismo, aumentando sua
concentração no local de ação e promovendo o aprimoramento da terapêutica, com
redução de doses e dos possíveis efeitos colaterais (Mohanraj & Chen, 2006).
As NP poliméricas são sistemas carreadores de fármacos que apresentam
diâmetro inferior a 1 µm. O termo nanopartícula inclui as nanocápsulas (NC) e as
nanoesferas (NS), as quais diferem entre si segundo a composição e organização
estrutural (Fig. 1).
Figura 1: Representação esquemática de NC e NS poliméricas: a) fármaco dissolvido no núcleo oleoso das
NC; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das NC; c) fármaco retido na matriz polimérica das NS; d)
fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz polimérica.
As NC são constituídas de um núcleo, geralmente oleoso e uma camada
externa polimérica, com surfactantes lipofílicos e/ou hidrofílicos em sua interface. Vários
tipos de óleos podem ser utilizados na preparação das NC, como óleos vegetais e
minerais. O principal fator para a escolha do óleo é a solubilidade do fármaco a ser
encapsulado no núcleo oleoso. Em geral, fármacos que possuem um valor de coeficiente
de partição (log Poc/a) elevado são mais promissores a serem associadas às NC e
administradas
por
diferentes
vias
com
obtenção
de
liberação
controlada
(Takino et al., 1994). Por outro lado, as NS, que não apresentam óleo em sua
composição, são formadas por uma matriz polimérica, onde o fármaco pode ficar retido ou
adsorvido. A nanoencapsulação tornou-se uma estratégia adequada para aumentar a
biocompatibilidade e a dispersão em escala nanométrica de compostos lipofílicos em
meio aquoso e biológico (Deda et al., 2009).
Existem diversos métodos de preparo de nanopartículas descritos na
literatura e, dependendo das características físico-químicas do fármaco e do polímero,
deve-se escolher um método adequado obter uma encapsulação eficiente do fármaco
32
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
(Reis et al., 2006). Os métodos mais comuns são emulsificação e evaporação do
solvente, polimerização do monômero, nanoprecipitação e salting-out (Valthier &
Bouchemal, 2009).
A nanoprecipitação, também conhecida como deposição de um polímero
pré-formado seguida de evaporação do solvente, é uma técnica simples, reprodutível e
facilmente transponível para a produção de nanopartículas em grande escala
(Couvreur et al., 2002, Fessi et al, 1989; Legrand et al., 1999, Pereira et al., 2009). Este
método consiste basicamente em verter uma solução contendo o fármaco e polímero,
dissolvidos num solvente orgânico miscível em água, numa fase aquosa contendo um
tensoativo hidrofílico como estabilizante. Imediatamente após a injeção, o solvente
orgânico difunde-se na água, dando origem a uma suspensão coloidal de nanoesferas.
Para a obtenção de nanocápsulas, um óleo e um tensoativo lipofílico são adicionados à
fase orgânica da preparação. Após a formação das partículas, as suspensões são
submetidas à evaporação para remoção do solvente orgânico e concentração até o
volume desejado (Fessi et al, 1989).
Após o preparo, o estudo de caracterização das NP é uma importante etapa
em seu desenvolvimento, uma vez que as características do polímero como hidrofobia,
carga superficial e perfil de biodegradação das substâncias adjuvantes, assim como as
características do fármaco associado, como seu peso molecular, carga e localização nas
nanopartículas, seja por adsorção ou incorporação, têm grande influência nos processos
de absorção, biodistribuição e eliminação do fármaco veiculado ao nanocarreador (Reis et
al., 2006). Os principais fatores que devem ser avaliadas são o tamanho, a carga
superficial (potencial zeta) das nanopartículas, a eficiência de encapsulação e o perfil de
liberação do fármaco encapsulado (Hans & Lowman, 2002).
A técnica de espalhamento dinâmico da luz ou espectroscopia de correlação
de fótons baseia-se na determinação das flutuações na intensidade da luz espalhada
pelas partículas, em função do tempo, e no cálculo da respectiva função de
autocorrelação. Partículas em um meio líquido movem-se ao acaso (movimento
Browniano), devido a colisões com as moléculas do meio de dispersão. Partículas
menores se movimentam mais rapidamente que partículas grandes, portanto, possuem
coeficiente de difusão (D) maior. Para uma dispersão de partículas com viscosidade η, em
uma temperatura constante T, o coeficiente de difusão D é inversamente proporcional ao
diâmetro hidrodinâmico dH das partículas, como mostra a equação de Stokes-Einstein,
33
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
D= k T
3πηdH
onde k é a constante de Boltzmann (constante física que relaciona
temperatura e energia de moléculas). As flutuações de intensidade de luz espalhada ao
longo do tempo são representadas através de uma função de correlação. No caso de
partículas pequenas, essa função de correlação entre as intensidades diminui mais
rapidamente com o tempo, do que no caso de partículas grandes. No tempo t = t0 = 0, a
intensidade de espalhamento e a função de correlação possuem um valor máximo. Com o
passar do tempo, a intensidade de espalhamento em um tempo (t0 + τ) estará cada vez
menos correlacionada com a intensidade de espalhamento inicial, e a média dos produtos
das intensidades tende a zero. Para partículas esféricas e monodispersas, a função decai
exponencialmente num intervalo de tempo t, e a constante de decaimento da curva
exponencial gerada pela função de correlação está relacionada com o coeficiente de
difusão translacional das partículas. A constante de decaimento depende do índice de
refração do líquido que dispersa as partículas, do ângulo de detecção da luz espalhada e
do comprimento de onda da luz incidente (Calvo et al., 1995).
As medidas de potencial zeta se baseiam no fenômeno relacionado à carga
líquida na superfície da partícula que afeta a distribuição de íons na sua vizinhança,
aumentando a concentração de contraíons junto à superfície. Assim, forma-se uma dupla
camada elétrica na interface da partícula com o líquido. Essa dupla camada divide-se em
duas regiões: uma região interna que inclui íons fortemente ligados à superfície e uma
região exterior onde a distribuição dos íons é determinada pelo equilíbrio entre forças
eletrostáticas e movimento térmico. Dessa forma, o potencial nessa região decai com o
aumento da distancia da superfície até uma distância suficientemente grande, atingir o
potencial da solução. Esse potencial é convencionado como potencial zero. Em um
campo elétrico, como em microeletroforese, cada partícula e os íons mais fortemente
ligados à mesma se movem como uma unidade, e o potencial no plano de cizalhamento
entre essa unidade e o meio circundante é chamado potencial zeta (Fig. 16).
Quando uma camada de macromoléculas é adsorvida na superfície da
partícula, ela move o plano de cisalhamento para longe da superfície, alterando o
potencial zeta. O potencial zeta é função da carga superficial da partícula, de qualquer
camada adsorvida na interface com o meio e da natureza e composição do meio que a
circunda.
34
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 2: Esquema representativo da dupla camada elétrica (Hotza, 1997).
2.2 Polímeros e copolímeros utilizados no preparo de nanopartículas
As NP podem ser preparadas a partir de polímeros biodegradáveis naturais
ou sintéticos. Atualmente, o uso destes polímeros para a liberação controlada de agentes
terapêuticos já é bem estabelecido (Birnbaum et al., 2000). Para a aplicação biológica, o
polímero de escolha não deve causar reação inflamatória ou resposta tóxica quando
administrado, apresentar tempo de vida plasmático prolongado, possuir tempo de
degradação em acordo com o processo em que está sendo utilizado, ter permeabilidade
adequada nas membranas biológicas e gerar produtos de degradação que não sejam
tóxicos e que sejam biotransformados e eliminados do organismo (Nair & Laurencin,
2007).
Os polímeros sintéticos têm sido mais utilizados nessa área que os
polímeros naturais e podem apresentar variações na pureza (Hans & Lowman, 2002). Os
polímeros sintéticos mais utilizados são os poliésteres alifáticos, como o ácido
poliglicolítico (PGA), o ácido polilático (PLA), o ácido poli-(D,L-lático-co-glicólico) (PLGA) e
o poli-ε-caprolactona (PCL) (Sinha et al., 2004).
O PLA é um polímero amplamente utilizado em formulações de nano e
micropartículas, tendo sido aprovado pela Agência Regulatória Americana (FDA, Food
and Drug Adminstration) para uso intravenoso e intramuscular (Mosqueira et al, 2001).
Este polímero é hidrofóbico, insolúvel em água e solúvel em vários solventes orgânicos e
pode ser considerado como um poli-metabólito, pois seu produto de degradação é o ácido
láctico gerado pela quebra da porção terminal da cadeia polimérica. Nas células, o ácido
láctico é convertido em piruvato pela lactato desidrogenase presente como diferentes
isoenzimas no coração, músculos e fígado, e sua eliminação ocorre via ciclo de Krebs,
35
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
principalmente pelos pulmões e rins, na forma de dióxido de carbono e água (Dellacherie
et al., 2001; Makino et al., 2002).
O PLA tem sido amplamente usado na produção de NP devido à sua alta
capacidade de encapsulação de fármacos hidrofóbicos. Entretanto, a rápida captação
dessas nanopartículas convencionais, sem modificação de superfície, pelo sistema
fagocitário mononuclear (SFM) após a administração intravenosa é um grande problema
para se alcançar um direcionamento efetivo para locais específicos do corpo, além do
fígado e baço (Moghimi et al., 2001). Portanto, o desenvolvimento de NP de circulação
sanguínea prolongada (furtiva) surgiu como uma tentativa de escapar do reconhecimento
pelas células fagocíticas do sangue (Raghavan et al., 2000). A estratégia mais
comumente utilizada para desenvolver NP furtivas, capazes de evadir ao SFM, é a
introdução de um revestimento hidrofílico flexível nas superfícies hidrofóbicas,
protegendo-as contra a adsorção de proteínas plasmáticas, que é o primeiro passo do
mecanismo de depuração de partículas pelas células fagocitárias do sangue. As NP
convencionais (sem revestimento) concentram os fármacos nelas encapsulados em
células do SFM (fígado e baço), enquanto as NP furtivas representam um tipo especial de
carreador com cadeias de PEG ligadas covalentemente à superfície, tornando-as mais
hidrofílicas, prolonagando sua permanência no sangue e aumentando a possibilidade do
vetor se acumular em outros tecidos (Mosqueira et al, 2001).
Devido à natureza protéica dos componentes sanguíneos, os fatores que
determinam a adsorção de proteínas nas superfícies sólidas, como composição química,
carga e hidrofilicidade do polímero, sem dúvida desempenham um papel importante na
opsonização das NP. A carga da superfície das partículas influencia a sua interação
eletrostática com os componentes do meio circundante, sendo esta determinada pelas
propriedades eletrostáticas do polímero. É reconhecido que superfícies carregadas
negativamente conduzem à maior eliminação das partículas da circulação sistêmica
quando comparada às neutras. A hidrofilia/hidrofobia da superfície afeta sua força
atrativa, influenciando desse modo no processo de opsonização e na força de interação.
Assim, quanto mais hidrofóbica a partícula, maior é a adsorção de proteínas e mais rápida
é a sua remoção da circulação (Stolnik et al, 1995).
As propriedades do PEG têm sido exploradas para a modificação da
superfície das NP com o objetivo de prevenir a opsonização, após administração
endovenosa, uma vez que aumenta a hidrofilia da superfície. Para uma partícula
apresentar comportamento furtivo, dois critérios devem ser consideramos: o polímero
36
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
adsorvido não deve ser removido facilmente pelo fluxo in vivo e a densidade da barreira
estérica imposta por ele deve ser suficientemente grande para suprimir a opsonização
endógena ou prevenir a interação da superfície com os potenciais receptores dos
macrófagos (Moghimi & Hunter, 2001). Para tal, cadeias de PEG são ligadas
covalentemente na superfície das nanopartículas. Além disso, a flexibilidade das cadeias
de PEG permite a sua mobilidade na superfície devido à presença de água de solvatação,
resultando numa densa nuvem de várias conformações intercambiáveis. Isto faz com que
o sistema imune tenha dificuldades em modelar um anticorpo em volta desta estrutura
flexível. Este fenômeno explicaria a razão pela qual uma molécula hidrofílica, porém mais
rígida, como o dextrano, ligada à superfície das partículas, não aumenta o tempo de
permanência das mesmas na circulação sanguínea (Allen, 1994; Jeon et al, 1991a,
1991b).
Recentemente, aumentou-se o interesse pelos copolímeros em bloco. Estes
são definidos como polímeros que têm dois ou mais segmentos ou blocos ligados
covalentemente na cadeia principal (Fig. 2) e podem ser classificados de acordo com sua
arquitetura em diblocos tipo AB, tribloco tipo ABA ou BAB e multibloco tipo (ABA)n, onde
A representa o bloco solúvel em um solvente selecionado e B designa o bloco insolúvel.
Como exemplo tem-se os copolímeros dibloco PLA-PEG, onde uma cadeia de PEG
(bloco hidrofílico) encontra-se ligada covalentemente e na extremidade da cadeia de PLA
(bloco hidrofóbico), bem como os copolímeros tribloco PLA-PEG-PLA, onde cada bloco
também se encontra ligado a outro linear e covalentemente (Fig. 2). Existem variações
deste tipo de copolímeros, onde os blocos de PEG encontram-se grafitadas na cadeia de
PLA, formando assim, copolímeros não lineares (Essa et al., 2010). Além disso, outros
grupamentos químicos podem ser grafitados covalentemente aos copolímeros do tipo
dibloco e tribloco como os grupos funcionais hidroxila e benzila. Objetivas-se assim,
alterar
as
propriedades
físico-químicas
do
polímero
e
consequentemente
a
farmacocínetica do nanocarreadores com eles preparado (Fig. 3).
Devido às interações intrínsecas de afinidade desses segmentos e mesmas
propriedades físico-químicas, os copolímeros em bloco mostram muitas vezes uma
tendência de se auto-organizar em solventes orgânicos. No entanto, a mobilidade de cada
bloco é bastante restrita por razões estéricas e os domínios automontáveis compostos por
blocos idênticos, consequentemente, caem em escala nanométrica, ou micrométricas e
são segregados em estado mais entropicamente estabilizado. As características
detalhadas dos domínios automontáveis são sensíveis à arquitetura do copolímero em
37
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
bloco. Isso é prático para ajustar as propriedades físico-químicas do polímero para
acrescentar novas funcionalidades ao núcleo ou a superfície de tais arranjos
(Qiu & Bae, 2006).
Como diversos nanossistemas têm sido desenvolvidos para a veiculação de
fármacos, a importância da relação arquitetura/propriedades do polímero tem sido
progressivamente enfatizada. A arquitetura do polímero descreve a forma de uma única
molécula do mesmo, que, muitas vezes, determina suas propriedades físico-químicas
(Qiu & Bae, 2006).
Figura 3: Arquitetura de copolímeros lineares (adaptado de Qui & Bae, 2006).
A natureza polimérica do vetor nanoparticulado desempenha um importante
papel no perfil de distribuição in vivo e consequentemente, na eficácia terapêutica do
fármaco carreado. Em particular, a natureza da superfície da partícula e a carga
superficial são parâmetros determinantes, pois influenciam a travessia pelas barreiras
biológicas
favorecendo
ou
impedindo
a
penetração
em
células
específicas
(Dellacherie et al, 2001). O tamanho e as características de superfície das NP
desempenham um papel importante na sua opsonização e depuração sanguínea
(Owens & Peppas, 2006). Como já relatado, uma vez administrado por via intravenosa, as
NP com superfície hidrofóbica são reconhecidas pelo SFM, devido à opsonização por
proteínas do sistema do complemento. Partículas maiores que 250 nm também são
rapidamente depuradas do sangue porque elas ativam o sistema complemento. As NP
com estas características tendem a se acumular nos tecidos de endotélio mais fenestrado
como no fígado, baço e medula óssea, ressaltando, assim, a aplicabilidade da
manipulação da superfície das nanopartículas poliméricas com intuito de controlar suas
interações e seu destino dentro do sistema biológico.
38
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
R
O
O
O
HO
O
O
O
O
A
O
R
d,l-PLA
d,l-PLA
O
R= OH ,
n
z
d,l-PLA
CH3
O
x
R
O
PEO
O
O
HO
O
O
O
O
O
O
O
B
O
O
O
O
n
O
x
OH
O
O
O
O
z
y
Figura 4: Representação química dos copolímeros dibloco (A) e tribloco (B) e suas funcionalizações.
2.3 Direcionamento ativo de fármacos: funcionalização
O interesse no desenvolvimento de sistemas coloidais direcionados a um
alvo específico tem crescido durante as últimas décadas. Estes carreadores objetivam
liberar a fármaco próximo ao sítio de ação, protegendo a substância ativa da rápida
degradação e eliminação, possibilitando a redução da dose e evitando efeitos colaterais
(Banquy et al., 2008).
Diversas
abordagens,
tais
como
formas
farmacêuticas
imunoconjugadas (contendo anticorpos), bioconjugadas (contendo genes), lipossomas,
dendrímeros, micelas, ou NP revestidas (com carboidratos, lecitina ou ligantes) têm sido
propostas para alcançar o direcionamento de fármacos de forma ativa ou passiva
(Allen et al., 2004). No entanto, quando comparadas a outros sistemas carreadores de
fármacos, as NP poliméricas oferecem a possibilidade de encapsular vários tipos de
moléculas e protegê-las da degradação enzimática. Os polímeros que formam as NP
carreadoras são geralmente muito estáveis em meio fisiológico e permitem a liberação
controlada por degradação da matriz polimérica (Banquy et al., 2008).
A abordagem geral para conferir as capacidades de direcionamento ativo de
NP é funcionalizar a superfície das mesmas com um ligante específico. Esta abordagem é
fortemente limitada pela estabilidade da ligação entre o ligante e a superfície da NP. Se
39
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
esta ligação não é estável o suficiente nos meios fisiológicos, a liberação do ligante (por
hidrólise, por exemplo) da superfície NP pode ser rápida. Para contornar este grave
problema e para melhorar as propriedades de ligação do ligante ao polímero, novas
estratégias de ligação estão sendo investigadas, dentre elas o uso de ligantes sintéticos
(Banquy et al., 2008).
Um exemplo do direcionamento de fármacos por meio da funcionalização do
polímero foi descrito por Oh et al., (2007). Este estudo demonstrou o direcionamento de
nanopartículas funcionalizadas com anticorpo aminopeptidase P específico para caveolina
em endotélio pulmonar de ratos. A caveolina funciona como uma bomba, transportando a
nanopartícula conjugada com o anticorpo do sangue através do endotélio no tecido
pulmonar. Aproximadamente 80% da dose injetada foi captada em 30 min, com um
mínimo de captação por outros tecidos. Estas abordagens abrem uma nova perspectiva
para
melhorar
direcionamento
tecidual
de
nanopartículas
para
o
coração
(Romero & Morilla, 2010).
O direcionamento de fármacos específicos para células do endotélio
vascular ativado a fim de se modular a resposta inflamatória tem sido uma estratégia
terapêutica válida. Lipossomas contendo anticorpos imunoconjugados que reconhecem
moléculas que atuam no processo inflamatório assim como os lipossomas que incorporam
ligantes específicos destas moléculas estão entre os métodos mais descritos para se
regular a inflamação. Todos eles apresentam a desvantagem de utilizar ligantes naturais,
que competem com o homólogo livre presente na corrente sanguínea e assim, não
conseguem aumentar a interação com o alvo (Kessner et al., 2001).
2.3.1 As selectinas como alvo do direcionamento ativo de fármacos
A inflamação é um mecanismo de defesa natural do organismo após a
exposição a antígenos específicos, substâncias químicas, infecções e estresse físico. É
caracterizada por diversos eventos que ocorrem dentro ou perto da área lesada, incluindo
a ativação de células do endotélio vascular (CEV) e acúmulo de leucócitos (Fig. 4). As
CEV, após ativação por citocinas pró-inflamatórias, aumentam a expressão de moléculas
de adesão celular (MAC) em um processo altamente regulado e sequencial. Esta
sequência envolve a expressão das moléculas de adesão que são responsáveis pela
migração de leucócitos ao longo da parede do vaso sanguíneo (Simon & Green, 2005).
40
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
(A)
(B)
Figura 5: Esquema simplificado do início de um processo inflamatório demonstrando da ativação de células
do endotélio vascular e aumento da expressão de selectina-E (A) e o processo de internalização de
leucócitos (B) após a adesão dos mesmos mediados por selectina-E.
As selectinas são moléculas responsáveis pela adesão celular, e sua família
possui dois membros principais, selectina-E (selectina endotelial) e selectina-P (selectina
plaquetária). Estas moléculas têm como ligante um carboidrato sialilado, o Syalil-Lewis X
(sLex) (Fig. 5)(Ehrhardt et al., 2004; Magnani, 2004). Este ligante constitui o sacarídeo
terminal de muitas glicoproteínas da superfície celular, principalmente na superfície de
leucócitos. Assim sendo, a superfície da membrana celular dos leucócitos possui
oligossacarídeos do tipo sLex e estes se ligam a moléculas de adesão, as selectinas.
Quando há uma ativação deste processo, no decurso da inflamação, as selectinas são
expostas em maior quantidade na superfície do endotélio e o sLex dos leucócitos
circulantes têm assim, maior capacidade de ligação sobre o endotélio. Esta ligação entre
o sLex e as E e P-selectinas constituem o início para o processo descrito como rolamento,
que
culminará
com
a
migração
leucocitária
para
a
região
com
inflamação
(Janeway et al., 2001).
41
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 6: Estrutura química do ligante natural de selectina-E, o Syalil-Lewis X (sLex).
Após a estimulação inflamatória, selectina-P aparece rapidamente na
superfície da célula, devido ao seu armazenamento intracelular. Por outro lado, os níveis
máximos de selectina-E são alcançadas de 4-6 horas após a ativação, devido à síntese
de novo (Colden-Stanfield & Gallin, 1998). Uma vez que selectina-E é expressa na fase
aguda e crônica da inflamação, ela pode ser considerada como um bom candidato para o
direcionamento ativo de fármacos. Além disso, as citocinas IL-1β e TNFα, assim como o
lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), também são capazes de estimular a expressão da
selectina-E (Ye et al., 1995).
Análogos sintéticos (Fig. 6) destes ligantes de selectinas vêm sendo
investigados
devido
a
sua
habilidade
de
interagir
com
as
CEV
ativado
(Banquy et al, 2008) e bloquear a inflamação (Ehrhardt et al., 2004; Simanek et al., 1998;
Kaila & Thomas, 2002). Alguns desses análogos têm demonstrado ter alta afinidade ao
alvo se comparado com o ligante natural, tornando-os moléculas muito atrativas no
desenvolvimento de formas farmacêuticas nanoestruturadas para o direcionamento ativo
de fármacos.
Figura 7: Estrutura química do ligante sintético de selectinas E e P.
42
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Brunk & Hammer, (1997), utilizaram microesferas recobertas com selectinaE e com o seu ligante natural, sLex, em células que apresentam expressão de moléculas
similar aos leucócitos no processo de rolamento após estímulo do endotélio. Foi
evidenciado que a velocidade de rolamento é mais sensível à presença de selectina-E na
superfície das microesferas. Além disso, eles sugerem que outros carboidratos do tipo
Lewis são mais efetivos na mediação do processo de rolamento, ou seja, um ligante
sintético. Dickerson et al., (2001), desenvolveram microesferas de PCL estabilizadas com
PVA (álcool polivinílico). As microsesferas foram encubadas com anticorpo monoclonal
anti selectinas E e P (denominado HuEP5C7.g2 ou HuEP) e sua capacidade de adesão
foi estudada in vitro. Relatou-se que microesferas contendo o anticorpo exibiram adesão
específica a células endoteliais ativadas, e pouca adesão às células endoteliais não
ativadas. Baseado nestes dados, Blackwell et al., (2001) utilizaram nanoesferas
recobertas pelo mesmo anticorpo anti selectina-E e os ensaios de adesão revelaram que
estas NS exibiram adesão específica aumentada para expressão de selectina em células
mononucleares. Ham et al., (2009) desenvolveram micropartículas peguiladas revestidas
com HuEP e avaliaram o aumento da especificidade da ligação com selectina-P. A
inserção das cadeias de PEG deixou os anticorpos mais acessíveis, aumentando assim a
viabilidade de sua ligação com o alvo.
Respostas inflamatórias exageradas e/ou prolongadas estão associadas a
um grande número de doenças agudas e crônicas, incluindo isquemia de órgãos,
reperfusão, asma alérgica, artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal, infecção por
determinados parasitas e na aterosclerose (Ehrhardt et al., 2004).
2.3.2 Inflamação associada à patogênese da doença de Chagas
Algumas infecções parasitárias podem ocasionar respostas inflamatórias
exacerbadas, como na doença de Chagas, que é uma condição clínica associada ao
parasito Trypanosoma cruzi, onde além da infecção pelo parasito, existe um processo
inflamatório intenso, principalmente no tecido cardíaco, culminando em lesões neste
tecido, que são posteriormente substituídas por tecido fibroso, aumentando a resistência
da musculatura cardíaca (Teixeira et al., 2006). É observado que ocorre um aumento de
mais de 900% no número de monócitos no sangue periférico de animais infectados em
até 12 dias após a infecção (Melo et al., 2001). Descrito pioneiramente pelo Dr. Carlos
43
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Chagas, esta doença atualmente afeta aproximadamente 16 milhões de pessoas no
continente americano, restrito à América do Sul, América Central e México (WHO, 2009).
Na doença de Chagas, a infecção pelo parasita é a maior causa de
miocardite aguda e crônica e cardiomiopatia nas áreas endêmicas na América Latina. A
patogênese do dano cardíaco associada com esta infecção é multifatorial. A manifestação
clínica da infecção por T. cruzi pode resultar em isquemia, resposta autoimune e invasão
direta do parasita nas células do miocárdio, os quais podem promover a inflamação do
miocárdio (Huang et al., 1999).
Huang et al., (1999) demonstraram que nas células endoteliais a infecção
por T. cruzi é associada com a ativação de NF-kB (desempenha um papel fundamental na
regulação da resposta imune a infecção) e expressão das moléculas de adesão
(selectina-E) nas células endoteliais. Esses achados sugerem um possível mecanismo de
recrutamento de leucócitos circulantes, que é um fator crítico para o início de uma
resposta inflamatória, como resultado da infecção por T. cruzi (Tanowitiz et al., 1996). A
origem de uma resposta inflamatória aguda é importante no controle inicial da infecção
aguda, mas pode ser prejudicial se persistir por períodos prolongados e pode contribuir
para a lesão do miocárdio.
Garcia et al. (2005) avaliaram o efeito do tratamento de camundongos com
cardiomiopatia chagásica. Eles constataram que os corações dos animais submetidos ao
tratamento com benzonidazol tiveram queda no parasitismo e na miocardite quando
comparado com os corações dos animais não tratados. Apesar do grupo de animais
infectados, submetidos ou não ao tratamento, apresentarem alterações significativas em
seus eletrocardiogramas em comparação com os animais não infectados, os animais não
tratados tiveram maiores alterações em relação aos tratados. Além disso, foi observada
correlação entre a queda na inflamação e o parasitismo do tecido cardíaco nos animais
submetidos ao tratamento, reforçando a importância do parasita no desenvolvimento da
cardiomiopatia chagásica. Neste contexto, é importante ressaltar, que os eventos
imunológicos desencadeados pela presença do parasita são múltiplos e incluem diversos
processos efetores e reguladores que resultam em um balanço entre resistência
e patogênese.
Estudos anteriores demonstram que alguns derivados azólicos já disponíveis
comercialmente, como o itraconazol (Fig. 7), apesar de muito efetivo no tratamento das
infecções fúngicas, não são suficientemente eficazes na erradicação do parasito causador
da doença de Chagas (T. cruzi) em modelo murino e humano (McCabe et al., 1986;
44
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Moreira et al., 1992).
Entretanto,
segundo
Apt et al. (1998;
2003),
o
itraconazol
administrado a 6mg/Kg/dia durante 120 dias a pacientes chagásicos crônicos foi capaz de
reduzir significativamente o número de testes xenodiagnósticos positivos, além de regredir
em 50% dos casos ou prevenir em 97,8% dos casos anormalidades eletrocardiográficas.
Apesar de todos os pacientes tratados apresentarem testes sorológicos positivos, após 9
anos de acompanhamento, os resultados sugerem uma expressiva redução na carga
parasitária desses pacientes, o que corrobora a hipótese de necessidade de tratamento
de pacientes na fase crônica da doença (Tarleton, 2001), sendo o itraconazol uma das
alternativas.
Figura 8: Estrutura química do itraconazol.
O itraconazol (ITZ) é um derivado triazólico fracamente básico (pKa=3,7) e
altamente hidrofóbico, com um coeficiente de partição octanol/água de logP=5,66 em
pH=8,1 (Chasteigner et al., 1996a, 1996b). É pouco solúvel em água (0,001 mg/mL em
pH=7,1) e por isso pode ser administrado somente por via oral. Consequentemente, temse relatado uma alta variação interindividual e intraindividual de sua biodisponibilidade
oral, influenciada principalmente pela acidez gástrica e o estado prandial do paciente
(Heykants et al., 1989) compromentendo o tratamento, o qual já é longo e de difícil
adesão pelo paciente. Assim sendo, o desenvolvimento de uma forma farmacêutica
nanoencapsulada e injetável para o tratamento da doença de Chagas, além de inédita,
pode ser extremamente útil para superar as desvantagem do tratamento convencional e
alcançar a dose terapêutica necessária de forma mais eficiente. Além disso, o
direcionamento ativo do fármaco nanoencapsulado através o uso de ligantes sintéticos
para selectinas nas regiões inflamadas do endotélio cardiovascular pode auxiliar no
tratamento da doença em sua fase crônica.
45
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.3.3 Inflamação associada à patogênese da aterosclerose
As doenças cardiovasculares também estão associadas a uma desordem
inflamatória crônica, onde a aterosclerose é a etiologia primária. Esta, por sua vez, é
caracterizada pelo acúmulo de monócitos/macrófagos, células musculares lisas e
linfócitos dentro da parede arterial em resposta à liberação de moléculas pró-inflamatórias
(Milioti et al., 2008). Esse acúmulo resulta na formação de placa aterosclerótica, a qual
está associada à disfunção endotelial, ativação de moléculas de adesão e propriedades
anticoagulantes prejudicadas. Suas complicações surgem da oclusão trombótica das
artérias, consecutiva à ruptura da placa aterosclerótica, e suas manifestações estão
diretamente relacionadas às síndromes coronarianas agudas, infarto do miocárdio e
derrame (Costopoulos et al., 2008).
Entretanto, uma vez que a doença aterosclerótica oclusiva desenvolve-se, o
tratamento padrão inclui angioplastia, enxerto de derivação (by-pass) na artéria coronária,
ou transplante cardíaco. Todas essas abordagens são limitadas pela quantidade de falhas
e re-oclusão do lúmen arterial (Gizard & Bruemmer, 2008), ocasionado principalmente
pela proliferação de células musculares lisas (Dzau et al., 2002), além de serem
tratamentos bem agressivos, necessitarem de internação ambulatorial do paciente e
apresentarem risco cirúrgico. Portanto, a terapia ideal para doença vascular oclusiva
ainda está para ser estabelecida.
As tiazolidina-2,4-dionas (TZD) são uma classe de fármacos com
reconhecida capacidade em melhorar a sensibilidade à insulina, e têm sido utilizadas
sozinhas ou em combinação com outros fármacos hipoglicêmicos para o tratamento do
diabetes mellitus tipo 2 (Patel et al., 2006). Novos dados surgem a cada dia sugerindo
uma boa eficácia das TZD em diversos fatores de risco associados a doenças
cardiovasculares. Um exemplo está em sua importante função na adipogênese,
modulando a diferenciação dos adipócitos, aumentando a sensibilidade desses à insulina,
e induzindo a transferência de gordura de depósitos viscerais para subcutâneos, um
padrão associado a um menor risco cardiovascular (Adams et al., 1997). Rosiglitazona e
pioglitazona (Fig. 8), TZD livremente comercializadas, interferem com o metabolismo dos
lipídeos aumentando as concentrações de lipoproteínas de alta densidade (HDL) e
lipoproteínas de baixa densidade (LDL), e reduzindo a proporção LDL/HDL, podendo
assim interferir na formação da placa aterosclerótica (Goldberg et al., 2005).
46
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 9: Estrutura química do fármaco Rosiglitazona e Pioglitazona. Em vermelho a
tiazolidina-2,4-dionas, estrutura comum em todas as TZD.
TZD também apresentam efeitos vasculares, como melhorar a vasodilatação
dependente de endotélio, por aumentar a liberação de óxido nítrico endotelial
(Scherrer & Sartori, 1997), e diminuir a circulação de marcadores inflamatórios como
TNFα, proteína C reativa, proteína de quimioatração de monócitos (MCP-1), matrix
metaloprotease
(MMP-9),
e
contagem
de
células
brancas
do
sangue
(Mohanty et al., 2004). Elas ainda inibem a expressão de moléculas de adesão, (MAC)
nas células endoteliais (Mehta et al., 2006), e são potentes inibidores de migração e
proliferação celular, importantes contribuintes da aterosclerose (Atkins et al., 2005).
Em
1997,
o
FDA
aprovou
a
troglitazona
(Rezulin®),
a
primeira
tiazolidinadiona avaliada na fase clínica nos Estados Unidos e Japão. Sérios efeitos
colaterais ocorreram com troglitazona, como necrose hepática maciça seguida de morte.
Sua interdição em alguns países motivou os pesquisadores a desenvolver novas
glitazonas. Assim, em 1999, o FDA aprovou dois novos fármacos da classe das TZD: o
maleato de rosiglitazona (Avandia®) e o hidrocloreto de pioglitazona (Actos®) (Fig. 8).
Apesar das TZD representarem uma inovação dentro do tratamento do diabetes mellitus
tipo 2, a retenção de fluidos, apresentada como rápido ganho de peso corporal e a
formação de edemas tem sido considerado o efeito colateral mais comum da rosiglitazona
(Zhang et al., 2005).
Várias TZD têm sido sintetizadas e muitas outras se encontram em estágios
pré-clínicos e clínicos de desenvolvimento. Todas elas compartilham uma estrutura
tiazolidina-2,4-diona substituída, na qual se têm realizado modificações químicas
seletivas, na tentativa de melhorar a eficácia farmacológica e minimizar os efeitos
colaterais desses agentes. Trabalhos desenvolvidos no Laboratório de Planejamento e
47
GARCIA, GM
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Síntese de Fármacos (LPSF), filiado ao Grupo de Pesquisa em Inovação Terapêutica
(GPIT) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) (http://www.ufpe.br/gpit) têm
explorado como “esqueleto” o anel tiazolidínico como novas entidades químicas com
potencial atividade biológica. Para avaliar a afinidade das TZD por reagentes orgânicos e
biomacromoléculas foram feitas modificações em sua estrutura química visando
derivatizações comportando diversos substituintes, de modo a obter espaçamento entre
os grupos funcionais para facilitar interações intermoleculares com sistemas biológicos.
Para tanto, o LPSF desenvolve vias de obtenção de novas TZD bioativas, o que culminou
com a construção de uma importante coleção de moléculas bioativas, incluindo a TDZ
utilizada neste trabalho (Fig. 9), denominada Lyso-7.
O
Br
N
N
H
S
O
Cl
Figura 10: Estrutura química da Lyso-7.
Portanto, TZD são seguras e efetivas no tratamento de hiperglicemia
associada a diabetes mellitus tipo 2, como monoterapia ou em combinação com terapias
já existentes. Os aparentes efeitos cardiovasculares pleiotrópicos destes fármacos têm
promovido otimismo com respeito ao seu uso no tratamento de doenças cardiovasculares
entre populações de alto risco.
Em virtude dos fatos abordados e os promissores resultados até então
obtidos com o direcionamento ativo de fármacos para regiões que apresentam processos
inflamatórios, este estudo tem como objetivo desenvolver e avaliar os parâmetros físicoquímicos de nanopartículas poliméricas utilizando copolímeros derivados do PLA
funcionalizados com ligante de selectina-E ou grupos hidroxila e benzila, contendo os
fármacos itraconazol e uma nova tiazolidona denominada Lyso-7.
48
GARCIA, GM
OBJETIVO GERAL
OBJETIVO GERAL
Desenvolver e caracterizar físico-químicamente NS poliméricas produzidas a partir do
PLA ligado linear e covalentemente PEG formando copolímeeros do tipo dibloco (PLAPEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA), ambos apresentando ou não funcionalização ao longo
da cadeia (hidroxila, benzila ou selectina-E). Objetiva-se também avaliar a influência das
propriedades de superfície desses polímeros nas características físico-químicas das NS,
além da capacidade das mesmas em modificar o perfil de liberação. Para tal, serão
testadas a encapsulação de dois fármacos: o itraconazol, com promissores resultados
para o tratamento da doença de Chagas e uma nova substância da classe das
tiazolidonas (TZD), denomina Lyso-7.
GARCIA, GM
OBJETIVO GERAL
CAPÍTULO I
Validação de metodologia analítica para doseamento do itraconazol
GARCIA, GM
CAPÍTULO I
1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Desenvolver uma metodologia analítica para o doseamento do itraconazol por
cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos diiodos (CLAE-DAD) e
com detector de fluorescência (CLAE-FLU);
•
Validar a metodologia analítica para o doseamento do itraconazol livre e associado
a nanoesferas por CLAE-DAD e para avaliação de sua cinética de liberação in vitro por
CLAE-FLU;
51
GARCIA, GM
CAPÍTULO I
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Materiais
Para o desenvolvimento e validação das metodologias foram utilizados:
Itraconazol [(±)-2-sec-butil-4-[4-(4-{4-[(2R*,4S*)-2-(2,4-diclorofenil)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ilmetil)-1,3-dioxolan-4-ilmetoxi]fenil}-piperazin-1-il)fenil-2,4-dihidro-1,2,4-triazol-3-ona]
PM
705,64 g/mol (Sigma, Alemanha); acetonitrila e metanol grau CLAE (Tedia, EUA). A água
ultrapura (Milli-Q) foi purificada no sistema Direct-Q, da Millipore®.
2.2 Equipamentos
O sistema cromatográfico utilizado consistiu de uma bomba de módulo de
separação Waters Alliance 2695, composto de injetor automático, forno de coluna,
detector de arranjo de diodos (DAD) Waters 2996 e detector de fluorescência (FLU)
Waters 2475. A separação foi realizada em uma coluna C18 Macherey-Nagel com
partícula de 4 µm, 150 mm x 4,6 mm, protegido por uma pré-coluna de segurança
Phenomenex AJO-7597 C18 (2 mm x 4,6 mm, 3 mm).
2.3 Validação de metodologia analítica para quantificação do itraconazol nas
nanoesferas poliméricas por CLAE-DAD e para avaliação da cinética de liberação in
vitro por CLAE-FLU
2.3.1 Condições cromatográficas
As condições cromatográficas foram as mesmas para os dois tipos de
detecção (DAD e FLU), sendo a fase móvel composta da mistura dos solventes metanol e
água (75:25 v/v), e utilizando acetonitrila para solubilizar as amostras. As soluções das
52
GARCIA, GM
CAPÍTULO I
amostras e de estoque foram preparadas no momento da sua utilização. O volume de
injeção foi de 50 µL e 25 µL para detecção no DAD e FLU, respectivamente. As condições
de operação foram adaptadas de Redmann & Charles (2006), com vazão de 1 mL min-1,
tempo de corrida de 13 min, temperatura de 40ºC e detecção no DAD em 260 nm e na
FLU a 320 nm de excitação e 380 nm de emissão.
2.3.2 Parâmetros de validação
Para a validação dos métodos foram determinadas a especificidade na
presença dos constituintes das nanoesferas, a linearidade, a precisão (inter e intradia), a
exatidão, o limite de detecção e o limite de quantificação, segundo os critérios de
aceitação estabelecidos pelo Guia da Conferência Internacional de Harmonização (ICH
Harmonised Tripartite guideline, 2005). A curva de calibração do ITZ (curva padrão) foi
realizada contendo oito pontos de concentrações conhecidas do fármaco: 0,5; 1,0; 2,5;
5,0; 10,0; 25,0; 50,0 e 100 µg/mL para detecção por DAD, e 0,075; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75,
1,0; 5,0; 10,0 µg/mL para detecção por FLU. A partir da curva de calibração foi possível
determinar a concentração de ITZ em uma amostra com concentração desconhecida.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Especificidade
A especificidade é definida como a capacidade do método em distinguir a
substância analisada de outras presentes na amostra (Causon, 1997). A interferência dos
componentes presentes nas nanopartículas (polímeros) na leitura das absorbâncias do
ITZ foi avaliada quando amostras de NS brancas (sem o fármaco) a 5% foram
solubilizadas em acetonitrila. A figura 10 demonstra, através do cromatograma, que no
comprimento de onda de 260 nm a absorbância do fármaco não sofre interferência dos
outros constituintes das NS no tempo de retenção do fármaco, aproximadamente 9
minutos. Portanto o método foi utilizado para o doseamento do ITZ na presença e na
53
GARCIA, GM
CAPÍTULO I
ausência dos outros constituintes das NS, sem que o resultado sofresse interferências. A
acetonitrila é capaz de dissolver os diversos polímeros, o que elimina a turbidez das
amostras.
0,060
0,050
0,040
AU
0,030
0,020
0,010
0,000
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
11,00
12,00
13,00
Minutes
Figura 11:Cromatograma dos polímeros das diferentes NS: preto (tribloco-OH); vermelho (dibloco-OBZ);
verde (dibloco); azul (tribloco); laranja (dibloco-OH); marrom (tribloco-OBz); cinza ITZ 10 µg/mL.
3.2 Linearidade
A curva padrão do ITZ com detecção no DAD, construída a partir das médias
da área sob a curva dos picos referentes ao ITZ nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,5; 5,0;
10,0; 25,0; 50,0 e 100 µg/mL, a equação da reta e o coeficiente de correlação linear (R2)
estão representados na figura 11.
Figura 12: Curva de calibração do ITZ com detecção DAD no comprimento de onda de 260 nm; R2 =
coeficiente de correlação linear.
54
GARCIA, GM
CAPÍTULO I
A equação da reta foi y = 19484x + 10673, onde o valor associado à variável x
corresponde à inclinação da reta (a = 19484) e 10673 ao intercepto da reta (b) com o eixo
das ordenadas. De acordo com o Guia da Conferência Internacional de Harmonização
(ICH Harmonised Tripartite guideline, 2005), os resultados de linearidade se encontraram
dentro do critério de aceitação, ou seja, o valor do coeficiente de variação (CV) foi abaixo
de 5%. A figura 12 demonstra o cromatograma do ITZ nas concentrações de 0,5 a
10,0 µg/mL com detecção DAD e a figura 14 o cromatograma do ITZ a 0,1 µg/mL na FLU.
0,100
0,090
0,080
0,070
AU
0,060
0,050
0,040
0,030
0,020
0,010
0,000
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Minutes
7,00
8,00
9,00
10,00
11,00
Figura 13: Cromatograma do itraconazol nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 e 10 µg/mL com detecção
DAD.
Devido à maior sensibilidade do detector de fluorescência, a curva padrão do
ITZ foi construída com pontos de menor concentração, sendo obtida a partir das médias
da área sob a curva dos picos nas concentrações de 0,075; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 5,0;
10,0 µg/mL. A curva de calibração do ITZ com detecção FLU está representada na figura
13 e os parâmetros da mesma estão na tabela 2.
Tabela 2: Parâmetros relativos à curva de calibração média do método analítico para quantificação de ITZ
com detecção FLU
Parâmetro
Valor
Coeficiente angular (a)
3406968
Coeficiente linear (b)
1404110
Coeficiente de correlação (r)
1
55
GARCIA, GM
CAPÍTULO I
Figura 14: Curva de calibração do ITZ com detecção FLU a 320 nm de excitação e 380 nm de emissão; R2
= coeficiente de correlação linear.
Figura 15: Cromatograma do itraconazol na concentração de 0,1 µg/mL com detecção FLU.
3.3 Precisão
A tabela 3 mostra os valores de área dos picos correspondentes aos
padrões de controle de concentrações 2,5; 10,0 e 50,0 µg/mL, obtidas em triplicata e em
um mesmo dia, e o CV de cada delas por detecção no DAD.
Tabela 3: Resultados do teste de precisão intra e interdia para validação do ITZ por CLAE-DAD a 260 nm
Concentração
CVb Intra-
Concentração
Desvio
CVb
Concentração
Desvio
nominal de
dia
real intra-dia
padão
Inter-dia
real inter-dia
padrão
a
ITZ (µg/mL)
a
intra dia
inter-dia
2,5
2,03
2,56
0,06
3,05
2,52
0,06
10,0
2,70
10,03
0,28
1,02
10,18
0,10
50,0
1,15
49,12
0,57
2,80
49,24
1,36
b
n = 3; CV = coeficiente de variação, dado por: (DP/área média) x 100.
56
GARCIA, GM
CAPÍTULO I
O método apresentou CV intradia na faixa de 1,15 a 2,7% para as
concentrações controle analisadas, e CV interdia entre 1,02 e 3,05%, sendo que valores
abaixo de 3% estão de acordo com o critério de aceitação estabelecido para a precisão
no Guia da Conferência Internacional de Harmonização (ICH Harmonised Tripartite
guideline, 2005).
Os dados de precisão intra e interdia para a validação do ITZ por CLAE-FLU
estão apresentados na tabela 4. O coeficiente de variação para as análises intra e interdia
também se mantiveram com valores inferiores a 3% mostrando assim uma boa precisão
do método.
Tabela 4: Resultados do teste de precisão intra e interdia para validação do ITZ por CLAE-FLU com 320 nm
de excitação e 380 nm de emissão
Concentração
CVb Intra-
Concentração
Desvio
CVb
Concentração
Desvio
de ITZa
dia
real intra-dia
padrão
Inter-dia
real inter-dia
padrão
(µg/mL)
a
intra-dia
inter-dia
0,25
0,25
0,25
0,002
0,14
0,29
0,001
0,75
0,49
0,75
0,005
0,24
0,76
0,001
5,0
1,45
4,96
0,078
1,02
4,75
0,045
2
n = 3; CV = coeficiente de variação, dado por: (DP/área média) x 100.
3.4 Exatidão
A exatidão foi avaliada comparando-se os valores de concentração obtidos
em triplicata a partir das áreas correspondentes aos picos de ITZ com detecção DAD nas
concentrações de 2,5; 10,0 e 50,0 µg/mL com seus valores teóricos, conforme mostra a
tabela 5.
Os resultados mostraram que os valores obtidos para exatidão variaram de
98,23% a 102,34% para as concentrações de 50,0 e 2,5 µg/mL, respectivamente. Esses
dados mostram que os valores encontrados nos experimentos diferiram cerca de 2,34%
dos valores teóricos, indicando uma boa exatidão para o doseamento por CLAE-DAD do
ITZ.
57
GARCIA, GM
CAPÍTULO I
Tabela 5: Exatidão do método de doseamento do ITZ por detecção DAD
a
Concentração
ITZ (µg/mL)
Área Médiaa ± DP1
2,5
34098 ± 1110
2,56
102,34
10,0
177791 ± 1913
10,03
100,31
50,0
911461 ± 25735
49,12
98,23
experimental (µg/mL)
Exatidão (%)
1
n = 3; DP = desvio padrão.
Também para as análises de exatidão utilizando o detector FLU o método
apresentou-se dentro dos parâmetros estabelecidos pelo guia (Tabela 6).
Tabela 6: Exatidão do método de doseamento do ITZ por detecção FLU
Concentração
de ITZa (µg/mL)
a
Concentração
Área Médiaa ± DPb
experimental (µg/mL)
Exatidão (%)
0,25
3465994 ± 1042369
0,25
101,42
0,75
5054309 ± 949108
0,75
99,85
5
18556826 ± 637951
4,96
99,23
1
n = 3; DP = desvio padrão.
3.5 Limite de detecção e limite de quantificação
O limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma
amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as
condições experimentais estabelecidas. O limite de detecção é estabelecido por meio da
análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor
nível detectável (Tabela 7).
Tabela 7: Limites de detecção e quantificação do ITZ com detecção DAD e FLU
Limite de detecção
Limite de quantificação
(ng/mL)
(ng/mL)
DAD
10
500
FLU
1
75
Detector
58
GARCIA, GM
CAPÍTULO I
Já o limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma
amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições
experimentais estabelecidas. O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise
de soluções contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível
determinável com precisão e exatidão aceitáveis (Tabela 7).
4 CONCLUSÕES
Os métodos de doseamento, utilizando o detector de arranjos diiodos e
fluorescência apresentaram linearidade na faixa de 0,5 a 100 µg/mL e 0,075 a 10 µg/mL,
respectivamente, e foram precisos e exatos. Os CV intra e interdias da calibração dos
métodos foram baixos e dentro dos limites máximos estabelecidos. Como esperado, a
utilização do detector de fluorescência aumentou a sensibilidade do método,
proporcionando a quantificação precisa e exata de amostras com baixa concentração do
fármaco, necessário para o estudo do perfil de liberação in vitro do mesmo a partir das
NP. Os métodos foram, portanto, considerados validados para quantificação do fármaco
nas amostras a serem analisadas e foram utilizados nos estudos subsequentes.
59
CAPÍTULO II
Preparo de formulações e caracterização das nanopartículas contendo o itraconazol
GARCIA, GM
CAPÍTULO II
1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Preparar suspensões coloidais de nanoesferas contendo itraconazol a partir dos
polímeros do ácido polilático (PLA), dos copolímeros do ácido polilático-copolietilenoglicol (PLA-PEG, dibloco) e do ácido polilático-co-polietilenoglicol-coácido polilático (PLA-PEG-PLA, tribloco). Também foram utilizados oligopoliméros
dos polímeros dibloco e tribloco modificados por funcionalização (grupamentos
hidroxila (-OH) ou benzila (-OBz) desses polímeros ao longo da cadeia polimérica
do PLA e com acoplamento covalente de um ligante de selectina-E.
• Caracterizar as nanoesferas preparadas à partir desses polímeros quanto ao
tamanho médio, índice de polidispersão da população das partículas e
determinação do potencial zeta;
• Avaliar a morfologia e as características da superfície das nanoesferas preparadas
com os diferentes polímeros por microscopia de força atômica;
• Avaliar a eficiência de encapsulação e o teor de ITZ encapsulado nas nanoesferas;
• Avaliar o perfil de liberação in vitro do itraconazol a partir das nanoesferas em
condições sink.
61
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Materiais
Para a preparação das NS foram utilizados os copolímeros do ácido
polilático (PLA) ligados covalentemente ao poli(etileno)glicol (PEG; PM 2000 g/mol) do
tipo dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA) com grupos hidroxila (-OH) ou benzila
(-OBz) ligados ao longo do bloco de PLA, por inserção randômica de grupamentos
alilglicidil éter (oligômeros). Estes polímeros foram sintetizados e caracterizados na
Universidade de Montreal (Canadá) pelos professores Patrice Hildgen e Vanessa
Mosqueira
como
previamente
descrito
por
Mosqueira
et
al.,
2009a;
Mosqueira et al., 2009b). Os solventes utilizados, como acetona PA, foram adquiridos da
Vetec, Brasil. O Itraconazol [(±)-2-sec-butil-4-[4-(4-{4-[(2R*,4S*)-2-(2,4-diclorofenil)-2-(1H1,2,4-triazol-1-il-metil)-1,3-dioxolan-4-ilmetoxi]fenil}-piperazin-1-il)fenil-2,4-dihidro-1,2,4triazol-3-ona] PM 705,63 g/mol, foi adquirido da Sigma-Aldrich (EUA). A água ultra pura
(MilliQ) foi purificada no sistema Direct-Q, da Millipore®.
2.2 Preparação das nanoesferas
As nanoesferas de PLA (convencionais) foram preparadas pelo processo de
deposição interfacial de um polímero pré-formado, descrito por Fessi et al., 1989. As
nanoesferas furtivas (NS contendo PEG) foram preparadas pelo método descrito por
Mosqueira et al., 2001. O processo consiste da mistura de uma fase orgânica miscível em
água em uma solução aquosa contendo ou não um surfactante hidrofílico (Fig. 15).
Uma solução contendo 2% (p/v) de polímero e diferentes concentrações de
ITZ (0,5 e 1 mg) foram dissolvidos em 4 mL de acetona com o auxílio de um agitador
magnético, sem aquecimento. A solução obtida foi transferida para a fase aquosa (8 mL),
sem a presença de tensoativo. A mistura foi então mantida sob agitação durante 10
minutos com auxílio de um agitador magnético (modelo PC-200, Corning, EUA), a
500 rpm. Posteriormente, o excesso de solvente foi evaporado a pressão reduzida em
rotavapor (Laborota 4000/4001 Heidolph Instruments, Alemanha) a uma temperatura de
45˚C até o volume final de 2 mL. Para o preparo das formulações contendo o ligante de
62
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
selectina foi adicionada a fase orgânica 0,02% (p/v) do polímero funcionalizado e 1,8%
(p/v) do polímero sem funcionalização. Com isso, o polímero contendo ligante de selectina
correspondeu a 10% da quantidade total de polímero na formulação.
Figura 16: Etapas da Preparação de Nanoesferas. 1) A solução orgânica é vertida na solução aquosa; 2) A
suspensão obtida é mantida em agitação por 10 minutos; 3) O solvente e o excesso de água são
evaporados.
A influência da presença do diferentes grupos ligados ao longo da cadeia
dos copolímeros, na eficiência de encapsulação, no índice de polidispersão, no potencial
zeta e no perfil de liberação in vitro do ITZ foi avaliada para as suspensões coloidais.
2.3 Caracterização Físico-Química das Nanopartículas
2.3.1 Distribuição de Tamanho
O tamanho médio das NS e o índice de polidispersão das suspensões de
nanopartículas foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons (PCS),
utilizando o equipamento Nanosizer N5 PLUS Beckmann Coulter (Fullerton, EUA). As
medidas de tamanho foram realizadas em quadruplicata em alíquotas da mesma amostra
e os resultados obtidos foram expressos como média + desvio padrão. O índice de
polidispersão determinado pelo equipamento reflete a homogeneidade no tamanho das
63
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
nanopartículas presentes na amostra, sendo que as amostras que apresentaram índice
de polidispersão inferior a 0,3 foram consideradas monodispersas, segundo instruções do
fabricante do equipamento (Beckmann Coulter).
O diâmetro médio efetivo das partículas e sua dispersão foram
determinados através da técnica de espalhamento dinâmico de luz, a um ângulo de
detecção da luz espalhada fixo em 90°, na temperatura de 20°C em meio aquoso.
2.3.2 Potencial Zeta (ζ)
O potencial zeta foi determinado pela técnica de microeletroforese associada
à anemometria de laser dopler (ALD) utilizando-se um equipamento Zetasizer 3000 HS
(Malvern Instruments, UK). As amostras foram analisadas diluindo-se 20 µL da suspensão
de nanopartículas em 4980µL de NaCl 1 mM, obtendo-se, assim, suspensões coloidais
com forças iônicas semelhantes (1,2 ± 0,2 mS/cm2). As medidas de potencial zeta foram
realizadas em triplicata em alíquotas da mesma amostra e os resultados obtidos foram
expressos como média + desvio padrão.
2.3.3 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação
As análises foram feitas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) no aparelho Waters Alliance 2695 acoplado a um detector de arranjo de diodos
(DAD) Waters 2996, por um método de doseamento previamente validado, descrito no
capítulo 1. A porcentagem de encapsulação objetiva determinar o teor de fármaco
incorporado à nanopartícula em relação ao total de fármaco adicionado no preparo da
formulação. A porcentagem é calculada pela diferença entre a quantidade total de ITZ na
suspensão coloidal e a quantidade de ITZ livre solúvel na fase aquosa externa, dividida
pela quantidade total de ITZ na suspensão após a filtração x 100. A porcentagem de
encapsulação foi calculada, portanto, pela seguinte equação:
% encapsulação = (ITZ total na suspensão (mL) - ITZ no ultrafiltrado (mL) x 100
ITZ total na suspensão (mL)
O fármaco total foi determinado pela completa dissolução de 80 µL da
suspensão de NP em acetonitrila. O ITZ livre solúvel na fase externa aquosa foi obtido
pelo método de ultrafiltração/centrifugação de 200 µL da suspensão de NP a 500 × g por
64
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
30 minutos em unidades AMICON (membranas MICROCON de 100 kDa, Millipore®)
(Fig. 17). A quantidade de ITZ ligado à membrana foi determinada após a
ultrafiltração/centrifugação. Para tal, a membrana do AMICON foi retirada, lavada com
água MilliQ, imersa em 500 µL de etanol/acetonitrila (1:1), levada ao vórtex por 15
minutos, centrifugada e o ITZ dosado no sobrenadante. A eficiência de encapsulação das
NP foi calculada pela quantidade de ITZ encapsulado em 80 µL de suspensão de NP
dividido pela quantidade de ITZ pesado e adicionado ao preparo da suspensão de NP x
100. A eficiência de encapsulação foi calculada, portanto, pela seguinte fórmula:
Eficiência de Encapsulação % = _Quantidade total de ITZ encapsulado (mL) x 100
Quantidade de ITZ pesado colocado na NP (mL)
Figura 17: Representação esquemática das dosagens de ITZ realizadas nas formulações de NS para
determinação da porcentagem de encapsulação e eficiência de encapsulação.
2.3.4 Análise Morfológica das Nanopartículas
A análise morfológica é obtida por microscopia de força atômica (MFA). As
imagens de MFA foram coletas nos equipamentos Multimode e Dimension 3000, ambos
monitorados por controlador Nanoscope IIIa (Digital Instruments, Santa Bárbara, EUA), no
Centro Tecnológico de Minas Gerais (CETEC, MG). As imagens foram obtidas no modo
de contato intermitente (tapping mode) utilizando sondas de silício de comprimento de
228 µm, com uma freqüência de ressonância de 75-98 kHz, força constante de 29-61 N/m
e raio de curvatura de 5 nm a 10 nm.
Para obtenção das imagens das NPs, aproximadamente 5 µL das amostras
foram depositados em superfícies atomicamente planas de mica clivadas no momento do
65
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
uso. As amostras foram desidratadas e espalhadas com um jato de argônio unidirecional.
A varredura foi efetuada em uma velocidade de 1Hz com resolução de 512 x 512 pixels. A
análise das amostras foi realizada utilizando o programa de análise do sistema (Section
Analysis).
2.3.5 Avaliação da solubilidade do itraconazol em PBS
A solubilidade do ITZ em meio tampão fosfato (PBS) foi determinada num
período de 24 horas. Para isso, 2 mg de ITZ foram precisamente pesados e
acrescentados a tubos eppendorfs. A esses tubos foram adicionados 2 mL de PBS e o
sistema foi mantido em agitação a 37°C. Em tempos pré-determinados (15, 30 e 60 min,
3, 6, 12 e 24 horas) coletou-se 100 µL do meio, ultracentrifugou-se a 8.000 rpm por 5
minutos, retirou-se 50 µL do sobrenadante e diluiu-se com 250 µL de metanol. Essa
solução foi agitada em vórtex por 10 minutos e novamente ultracentrifugada a 8.000 rpm.
O sobrenadante foi quantificado por CLAE. Esse experimento foi realizado em três
réplicas (n = 3) e os resultados foram expressos como média e desvio padrão.
2.3.6 Avaliação da cinética de liberação in vitro
As formulações preparadas usando os diferentes polímeros foram avaliadas
quanto à liberação in vitro de ITZ em triplicata em tampão fosfato salina (PBS pH 7,4).
Para o doseamento o ITZ liberado utilizou-se a técnica de diálise reversa. Para tal, sacos
de diálise contendo 1 mL de PBS foram completamente imersos em 500 mL de PBS e
deixados em equilíbrio por 3 horas sob agitação a 37ºC. Em seguida, adicionou-se a
formulação ao meio externo. Nos tempos pré-determinados (15, 30 e 60 min, 3, 6, 12 e 24
horas) retirou-se um saco de diálise do meio e alíquotas de 500 µL foram coletadas,
solubilizadas em 500 µL de acetonitrila e o ITZ liberado foi quantificado em CLAE com
detector de fluorescência. A solubilidade do ITZ em PBS foi determinada previamente e a
quantidade de formulação adicionada respeitou a condição sink ( < 20% da concentração
de saturação no meio).
66
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
Os dados obtidos dos perfis de dissolução foram submetidos a tratamentos
matemáticos para a determinação de cinética de liberação/dissolução e para isso foram
aplicados três modelos matemáticos:
• Cinética de ordem zero: para cada formulação foram construídos gráficos de tempo
versus quantidade total menos a quantidade liberada/dissolvida do fármaco, ou
seja, quantidade não liberada de fármaco (t x QNL).
• Cinética de primeira ordem: para cada formulação foram construídos gráficos de
tempo versus ln da porcentagem não liberada (t x ln %NL).
• Modelo de Higuchi: para cada formulação foram construídos gráficos da raiz
quadrada do tempo versus porcentagem liberada (√t x %D)
Foi também aplicado o modelo de cinética desenvolvido por Korsemeyer et
al. (1983), que permite calcular o exponencial de liberação do fármaco. Este prevê uma
avaliação mais detalhada sobre o mecanismo de transporte do fármaco. O expoente de
liberação (n) foi calculado a partir da construção de gráficos de log do tempo pelo log da
porcentagem de fármaco não liberada (log t x log %NL).
2.4 Análise Estatística dos Dados
O diâmetro médio e o potencial zeta das NS vazias e contendo o fármaco
foram comparados por análise da variância (ANOVA) utilizando o programa Prisma®
versão 5.0. Adotou-se intervalo de confiança de 95%, sendo os valores de p<0,05 aceitos
como estatisticamente significativos.
67
CAPÍTULO III
Desenvolvimento e validação de metodologia analítica e bioanalítica para doseamento da Lyso-7
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
1 OBJETIVOS
• Desenvolver e validar uma metodologia analítica para o doseamento da Lyso-7 livre e
associada a nanopartículas por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de
arranjos diiodos (CLAE-DAD);
• Desenvolver e validar uma metodologia bioanalítica para extração e quantificação da
Lyso-7 em plasma de camundongo por cromatografia líquida de alta eficiência com
detector de arranjos diiodos (CLAE-DAD);
98
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Materiais
Para o desenvolvimento e validação das metodologias foram utilizados:
Lyso-7 [(5Z)-5-[(5-bromo-1H-indol-3-il)metileno]-3-(4-clorobenzil)-tiazolidina-2,4-diona] PM
447,73 g/mol, sintetizada, purificada e gentilmente cedidas pelo professor Dr. Ivan da
Rocha Pitta (UFPE); benzonidazol (BZ) (N-benzil-2-nitroimidazolacetamida) (Sigma
Aldrich),
acetonitrila,
metanol
e
acetato
de
etila
grau
CLAE
(Tedia,
EUA).
Dimetilacetamida (DMA), PEG 300, TWEEN 80 e Dimetilsulfóxido foram fornecidos pela
Vetec. A água ultrapura (MilliQ) foi purificada no sistema Direct-Q, da Millipore®.
2.2 Validação analítica por CLAE-DAD
2.2.1 Padrões de calibração
Foi preparada uma solução estoque de 1 mg/mL de Lyso-7 em metanol e
acetato de etila (80:20 v/v). A curva de calibração da Lyso-7 (curva padrão) foi realizada
através de diluições da solução estoque, contendo oito pontos de concentrações
conhecidas do fármaco: 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0 e 100 µg/mL. A partir da curva
de calibração foi possível determinar a concentração de Lyso-7 em uma amostra com
concentração desconhecida.
2.2.2 Condições cromatográficas
O sistema cromatográfico utilizado consistiu de uma bomba de módulo de
separação Waters Alliance 2695, composto de injetor automático, forno de coluna e
detector de arranjo de diodos Waters 2996. A separação foi realizada em uma coluna C18
99
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
Macherey-Nagel, 150 mm x 4,6 mm com tamanho de partícula de 4 µm, protegido por
uma pré-coluna de segurança Phenomenex AJO-7597 C18 (2 mm x 4,6 mm, 3 µm).
A fase móvel utilizada foi composta da mistura dos solventes metanol e água
(90:10 v/v). As condições de operação foram vazão de 1 mL min-1, volume de injeção de
50 µl, temperatura de 35ºC e detecção no DAD em 385 nm.
Para a validação do método foram determinadas a especificidade, na
presença dos constituintes das nanocápsulas, a linearidade, a precisão (inter e intradia), a
exatidão, o limite de detecção e o limite de quantificação, segundos os critérios de
aceitação estabelecidos pelo Guia da Conferência Internacional de Harmonização (ICH
Harmonised Tripartite guideline, 2005).
2.3 Validação Bioanalítica em plasma por CLAE-DAD
2.3.1 Padrões de calibração
Foi preparada uma solução estoque de 1 mg/mL de Lyso-7 em acetato de
etila, e o fármaco benznidazol® foi utilizado como padrão interno (PI). A curva de
calibração da Lyso-7 (curva padrão) foi construída utilizando soluções de trabalho nas
concentrações de 0,1; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 75,0; 100,0 µg/mL. Estas soluções de
trabalho foram preparadas por diluição seriada à partir da solução estoque e todas as
soluções foram armazenadas a -80ºC.
2.3.2 Condições cromatográficas
O sistema cromatográfico utilizado foi o mesmo mencionado na validação
analítica. A fase móvel foi composta da mistura dos solventes metanol e água (90:10, v/v).
As condições de operação foram vazão de 1 mL min-1, volume de injeção de 25 µl, tempo
de corrida de 7 min, temperatura do forno de coluna de 35ºC e detecção no DAD no
comprimento de onda de 385 nm.
100
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
2.3.3 Animais
Os experimentos in vivo foram aprovados pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal da Universidade Federal de Ouro Preto (protocolo nº 2009/29).
Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas pesando de 29,5 g a 30,5 g com comida e
água ad libitum.
2.3.4 Preparo das amostras de plasma padrão para a curva de calibração
Foi utilizado plasma de animais sadios para validação do método. O sangue
de camundongos anestesiados foi coletado pelo plexo sinu-orbital em tubos eppendorf
contendo heparina e o plasma foi imediatamente separado por centrifugação a 400 × g
por 10 minutos e estocado a -80ºC. As amostras de plasma padrão da curva de
calibração foram preparadas a cada dia de análise a partir de soluções-padrão de 0,5 a
100 µg/mL de Lyso-7 em acetato de etila, conforme descrito na Tabela 15. Em todas as
análises adicionou-se 10 µL de solução-padrão de benznidazol® na concentração de 500
µg/mL (padrão-interno), 10 µL das soluções de trabalho de Lyso-7 e 80 µL de plasma
branco. As amostras foram homogeneizadas em agitador de tubo tipo vórtex por 15
segundos, e submetidas ao procedimento de extração imediatamente após o preparo.
101
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
Tabela 8: Preparo da curva de calibração
Concentração da
Solução de
trabalho
(µg/mL)
1,0
2,5
5,0
10,0
25,0
50,0
75,0
100,0
Volume de
solução-padrão
(µL)
Volume de plasma
(µL)
10
10
10
10
10
10
10
10
80
80
80
80
80
80
80
80
Concentração final
presente na curva
de calibração
(µg/mL)
0,1
0,25
0,5
1,0
2,5
5,0
7,5
10,0
Aos tubos foram adicionados 10 µl da solução estoque de PI.
2.3.5 Desenvolvimento do método de extração da Lyso-7
Para a extração da Lyso-7 em plasma de camundongo foram testados os
métodos de extração líquido-líquido e precipitação das proteínas do plasma. A extração
líquido-líquido foi realizada adicionando 300 µl de acetato de etila aos 80 µL de plasma
contendo 10 µL da solução de trabalho (100 µg/mL) de Lyso-7 e 10 µL de PI, e
homogeneizando-se em agitador vórtex em tempos variados (Tabela 16). Após
centrifugação a 900 × g por 10 minutos, o sobrenadante resultante foi filtrada em unidade
filtrante Millex com membrana Durapore® de 13 mm de diâmetro e poro de 0,45 µm. Este
procedimento foi repetido mais duas vezes. O solvente foi evaporado sob baixa pressão
em dessecador ao abrigo da luz. Ressuspendeu-se o resíduo em 100 µL de fase móvel
para injeção em CLAE. A extração por precipitação das proteínas do plasma foi realizada
adicionando acetonitrila ou metanol de acordo com a tabela 2, homogeneizando em
agitador vórtex por 2 min e centrifugando a 900 × g por 10 min. O solvente foi evaporado
sob baixa pressão em dessecador ao abrigo da luz e o resíduo foi ressuspendido em 100
µL de fase móvel para injeção em CLAE.
102
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
Tabela 9:Testes de recuperação da Lyso-7 em plasma de camundongo
Método de extração
Solvente
Volume
(µL)
Agitação
em
vórtex (min)
Líquido-líquido
Acetato de Etila
300
1
Líquido-líquido
Acetato de Etila
300
5
Líquido-líquido
Acetato de Etila
300
10
Precipitação de proteínas
Acetonitrila
500
2
Precipitação de proteínas
Acetonitrila
1000
2
Precipitação de proteínas
Metanol
500
2
Precipitação de proteínas
Metanol
1000
2
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1 Validação analítica por CLAE-DAD
3.1.1 Especificidade
A interferência dos outros componentes do sistema nanoestruturado
(polímeros) na leitura das absorbâncias da Lyso-7 foi avaliada quando amostras de NC
brancas (sem o fármaco) a 5% foram solubilizadas em acetonitrila. A figura 41 demonstra,
através do cromatograma, que no comprimento de onda de 385 nm a absorbância do
fármaco não sofre interferência dos outros constituintes das NC nas concentrações de 5%
próxima do tempo de retenção da Lyso-7 (aproximadamente 4,8 minutos). Portanto o
método foi utilizado para o doseamento da Lyso-7 na presença e na ausência dos outros
constituintes das NC, sem que o resultado sofresse interferências. A acetonitrila é capaz
de dissolver os diversos polímeros, o que elimina a turbidez das amostras.
103
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
0,20
Lyso-7
AU
0,15
0,10
0,05
0,00
2,00
4,00
6,00
Minutes
Figura 18: Cromatograma do polímero PLA (preto) e da Lyso-7.
3.1.2 Linearidade
A linearidade indica a faixa de concentração do fármaco em que as
respostas obtidas pela metodologia são diretamente proporcionais à quantidade de
fármaco presente na amostra (United States Pharmacopeia, 2007). A avaliação foi
realizada por meio da construção de três curvas de calibração com soluções Lyso-7 que
variaram de 0,5 µg/mL a 100 µg/mL.
A curva padrão da Lyso-7, construída a partir das médias da área sob a
curva dos picos referentes a Lyso-7 nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0;
50,0 e 100 µg/mL, a equação da reta e o coeficiente de correlação linear (R2) estão
representados na figura 42.
Figura 19: Curva de calibração da Lyso-7 no comprimento de onda de 385 nm; R2 = coeficiente de
correlação linear.
O valor de R2 encontrado significa que 99,99% dos dados são explicados
pela curva. A curva de calibração apresentou valor do coeficiente de correlação
104
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
R2 = 0,9997, demonstrando a existência de correlação linear entre as concentrações e a
área sob a curva, na faixa de 0,5 a 100 µg/mL. A equação da reta foi
y = 119817x + 8229,4, onde o valor associado à variável x corresponde à inclinação da
reta (a = 119817) e 8229,4 ao intercepto da reta (b) com o eixo das ordenadas. De acordo
com o Guia da Conferência Internacional de Harmonização (ICH Harmonised Tripartite
Guideline, 2005), os resultados se mostraram lineares e dentro dos parâmetros de
aceitação, ou seja, o coeficiente de variação (CV) abaixo de 2%.
3.1.3 Precisão
A precisão de um método indica o grau de concordância entre resultados
individuais obtidos pela aplicação repetitiva do método à mesma amostra (United States
Pharmacopeia, 2007). A tabela 17 demonstra a avaliação deste parâmetro analisado em
três diferentes concentrações, baixa, média e alta (1,0; 10,0 e 75,0 µg/mL), em réplicas de
três, num mesmo dia (precisão intra-ensaio).
Tabela 10: Resultados do teste de precisão intra-dia para validação do doseamento por CLAE-DAD da
Lyso-7 a 385 nm
a
Lyso-7 (µg/mL)
Área Médiaa ± DP1
CV
1,0
258859 ± 3013
1,16
10,0
2073509 ± 41330
1,99
75,0
14926111 ± 64278
0,43
1
2
n = 3; DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação, dado por: (DP/absorbância média) x 100.
O método apresentou CV intradia na faixa de 0,43 a 1,99% para todas as
concentrações analisadas, sendo que valores abaixo de 2% estão de acordo com o
critério de aceitação estabelecido para a precisão no Guia da Conferência Internacional
de Harmonização. Esses valores demonstram a boa precisão do método quanto à
repetibilidade.
3.1.4 Exatidão
105
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
A exatidão foi avaliada comparando-se os valores de concentração obtidos
em triplicata a partir das áreas correspondentes aos picos de Lyso-7 nas concentrações
de 1,0; 10,0 e 75,0 µg/mL com seus valores teóricos, conforme mostra a tabela 18.
Os resultados mostraram que os valores obtidos para exatidão variaram de
um valor mínimo de 98,10% para a concentração de 75 µg/mL, até um valor máximo de
99,74%, para a concentração de 10 µg/mL, sendo o valor médio de 99,08 %. Esses dados
mostram que os valores encontrados nos experimentos diferiram menos de 2% dos
valores teóricos, indicando uma boa exatidão para o doseamento por CLAE-DAD da Lyso7.
Tabela 11: Exatidão do método de doseamento da Lyso-7
Lyso-7
(µg/mL)
a
Área Médiaa ± DP1
Concentração
experimental (µg/mL)
Exatidão (%)
1,0
258859 ± 3013
0,99
99,40
10,0
2073509 ± 41330
9,97
99,74
75,0
14926111 ± 64278
73,58
98,10
1
n = 3; DP = desvio padrão.
3.1.5 Limite de quantificação e limite de detecção
O limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma
amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as
condições experimentais estabelecidas. O limite de detecção é estabelecido por meio da
análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor
nível detectável. Nas condições estabelecidas, o limite de detecção deste método foi de
50 ng/ml.
Já o limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma
amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições
experimentais estabelecidas. O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise
de soluções contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível
determinável com precisão e exatidão aceitáveis. Nas condições estabelecidas, o limite
de quantificação deste método foi de 500 ng/ml.
106
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
O método de doseamento CLAE-DAD desenvolvido apresentou linearidade
na faixa de 0,5 a 100 µg/mL, e foi preciso e exato. Os CV intra e interdias da calibração do
método foram baixos e dentro dos limites máximos estabelecidos. O método foi, portanto,
considerado validado para quantificação do fármaco nas amostras a serem analisadas e
foi utilizado nos estudos subsequentes. Foram avaliados todos os parâmetros indicados
pelo Guia da Conferência Internacional de Harmonização, e estes se encontraram dentro
dos critérios de aceitação.
3.2 Validação bioanalítica em plasma por CLAE-DAD
3.2.1 Especificidade
A especificidade é definida como a capacidade do método em distinguir a
substância analisada de outras presentes na amostra (Causon, 1997). Na análise de
amostras
biológicas,
interferentes
potenciais
incluem
componentes
endógenos,
metabólitos, produtos de decomposição ou medicação administrada concomitantemente
ao estudo, além dos anticoagulantes, quando utilizados.
Tal parâmetro foi investigado pela análise de seis amostras de plasma
branco (plasma obtido de seis animais sadios), sendo quatro plasmas normais e dois
plasmas hemolisados para verificação da existência de interferência por parte de
componentes endógenos (US Food and Drug Administration, 2001). A amostra de plasma
hemolisado foi obtida por congelamento do sangue e posterior centrifugação por 10
minutos a 300 × g.
A seletividade e/ou especificidade de um método bioanalítico é um
importante parâmetro a ser avaliado para garantir que a quantificação do analito de
interesse não seja afetada pela presença de metabólitos, produtos de degradação,
fármacos
co-administrados
ou
compostos
endógenos
(Lang et al., 1991, Buick et al., 1990). O método desenvolvido apresentou boa separação
dos analitos (Padrão e PI) entre si e entre estes e os componentes do plasma branco e
hemolisado (Fig. 43). Os sinais cromatográficos referentes à Lyso-7 e seu padrão interno
107
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
apresentaram adequada resolução, com tempos de retenção de aproximadamente 1,8 e
4,85 minutos respectivamente (Fig. 44). A comparação entre os cromatogramas obtidos
de plasma branco normal e hemolisado e plasma obtido após adição de padrão de
referência de Lyso-7 e padrão-interno não revelaram a presença de interferentes nos
tempos de retenção dos mesmos.
Figura 20: Cromatogramas do plasma branco (vermelho) e da Lyso-7 (preto) com padrão interno (PI),
demonstrando maior escala (A) e menor escala (B).
0,08
0,08
Lyso-7
0,04
PI
0,04
PI
0,02
0,02
0,00
0,00
Lyso-7
0,06
AU
AU
0,06
1,00
2,00
3,00
Minutes
4,00
5,00
6,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
Minutes
4,00
5,00
6,00
Figura 21: Cromatogramas demonstrando uma adequada resolução entre a Lyso-7 e seu padrão interno
(PI). (A) Lyso-7 0,01 µg/mL em preto e 10 µg/mL em azul e (B) Lyso-7 5 µg/mL em preto e 10 µg/mL em
azul.
3.2.2 Recuperação
A recuperação indica a eficiência do procedimento de extração das amostras
estabelecido no método e indica a quantidade do fármaco obtida após a amostra de
plasma ser processada, ou seja, avalia se as condições empregadas no método são
adequadas o suficiente para extrair o princípio ativo da amostra. Assim, a recuperação
108
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
corresponde ao resultado obtido após análise de amostra de plasma “branco” acrescida
de padrão (PA), submetida ao pré-tratamento, expresso como porcentagem do resultado
obtido após análise de padrão puro, não submetido ao pré-tratamento (Causon, 1997). O
método de extração escolhido foi precipitação de proteínas do plasma utilizando 1000 µL
de acetonitrila uma vez que foi este que apresentou a maior porcentagem de recuperação
(tabela 19).
Tabela 12: Testes de recuperação da Lyso-7 em plasma de camundongo
Solvente
Volume (µL)
Agitação (min)
% Recuperação
Líquido-líquido
Acetato de Etila
300
1
67,5
Líquido-líquido
Acetato de Etila
300
5
63,81
Líquido-líquido
Acetato de Etila
300
10
96,02
Precipitação de
proteínas
Acetonitrila
500
2
99,26
Precipitação de
proteínas
Acetonitrila
1000
2
100,72
Precipitação de
proteínas
Metanol
500
2
90,8
Precipitação de
proteínas
Metanol
1000
2
91,53
Método
extração
de
Esse parâmetro foi determinado comparando-se resultados de análises de
amostras de controle de qualidade submetidas ao processo de extração a resultados de
análises de amostras de soluções padrões não submetidos a esse processo, mas que
foram adicionadas as amostras de plasmas brancos submetidas ao processo de
purificação. A resposta das amostras não submetidas ao processo de extração representa
a quantidade total de fármaco presente na amostra de plasma, ou seja, 100%, enquanto
que a resposta das amostras submetidas ao processo de extração representa a
porcentagem recuperada. Embora porcentagens próximas a 100% de recuperação sejam
desejáveis, admitem-se valores menores de recuperação, desde que o método seja
preciso e exato (US Food and Drug Administration, 2001).
A recuperação foi investigada em três diferentes concentrações em cinco
repetições, conforme recomendado pelo Guia de Validação de Métodos Bioanalíticos do
FDA (US Food and Drug Administration, 2001).
109
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
Nos métodos bioanalíticos, a recuperação deve ser também avaliada para
os compostos utilizados como padrão interno, independente da concentração usada.
Aceita-se uma variação de até 15% do valor de recuperação determinado para os analitos
8de interesse.
A recuperação média do procedimento de purificação de amostras de plasma
está apresentada na tabela 20. O padrão-interno utilizado no presente trabalho foi o
beznidazol® que apresentou adequadas sensibilidade, seletividade e % de recuperação
nas amostras de plasma de camundongo.
Tabela 13: Recuperação média do procedimento de extração das amostras de plasma de controle de
qualidade adicionadas de Lyso-7 (padrão) e benznidazol® (padrão interno). Cada valor representa a média
de seis determinações. DP = desvio padrão, CV=coeficiente
Concentração
(µg/mL)
Recuperação (%)
PA
PI
0,25
99,94
106,24
2,5
95,73
101,69
7,5
96,72
104,88
Média
97,46
104,27
DP
2,20
2,34
CV
2,26
2,24
3.2.3 Linearidade
A curva de calibração corresponde ao modelo matemático que estabelece
uma relação entre a resposta instrumental (área/altura da banda cromatográfica) e a
concentração do analito. É necessário elaborar uma curva de calibração para cada analito
que se deseja determinar e para cada corrida analítica, de acordo com ANVISA e FDA.
O modelo de calibração deve ser construído a partir da análise de, no
mínimo, 6 a 8 concentrações conhecidas do analito (padrões de calibração) adicionadas
na mesma matriz biológica para a qual o método foi desenvolvido e será aplicado
(superposição de matriz) (Ribani, et al., 2004). As concentrações estabelecidas devem
contemplar o intervalo de variação esperado, desde o limite de quantificação (LQ) até
120% da máxima concentração que se pretende analisar (US Food and Drug
110
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
Administration, 2001). Além disso, deve-se realizar análise da amostra branca (matriz
isenta da adição do analito e do padrão interno, quando for o caso) e da amostra zero
(matriz adicionada do padrão interno, quando for o caso).
Os critérios para aceitação da curva de calibração seguem normas
estabelecidas por guias de validação publicados por agências reguladoras oficiais. De
acordo com as normas atualmente em vigor, da ANVISA e FDA, se aceita um coeficiente
de variação menor ou igual a 20% em relação à concentração nominal para o LQ e menor
ou igual a 15% para as demais concentrações. Além disso, o coeficiente de correlação
linear (r2) deve ser igual ou superior a 0,98.
Obteve-se correlação linear entre concentração de fármaco e resposta do
método na faixa de concentração de 0,1 µg/mL a 10 µg/mL de Lyso-7 em plasma. A figura
45 apresenta a curva de calibração definida no método, e a figura 46 apresenta o
cromatograma da Lyso-7 nas concentrações de 5 e 10 µg/mL com o padrão interno.
Figura 22: Curva de calibração do método bioanalítico para quantificação de Lyso-7 em plasma por
cromatografia líqüida de alta eficiência.
0,08
AU
0,06
Lyso-7
0,04
PI
0,02
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
Minutes
4,00
5,00
6,00
Figura 23: Cromatograma da Lyso-7 a 5 µg/mL (preto) e a 10 µg/mL (azul), ambos com padrão interno (PI).
111
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
3.2.4 Precisão
A precisão de um método analítico representa o grau de concordância dos
resultados obtidos quando um procedimento analítico é aplicado repetidamente, sendo
expressa como coeficiente de variação (CV) dessas medidas. A precisão intradia referese ao CV obtido por repetição do método com o mesmo analista, utilizando o mesmo
equipamento e os mesmos reagentes, em curto intervalo de tempo (por exemplo, no
mesmo dia). A precisão interdia é obtida por meio de alteração das condições, como
mudança de analista ou reagente e utilização do método durante várias semanas ou
meses (Causon, 1997). Este parâmetro foi determinado analisando-se amostras de
plasma de controle de qualidade em três concentrações diferentes e em cinco réplicas no
mesmo dia (precisão intradia) e em dias consecutivos (precisão interdias).
A precisão do método esteve entre 0,012% e 0,071% para amostras de
plasma analisadas no mesmo dia (intraensaio) e entre 3,28% e 5,95% para amostras
analisadas em dias diferentes (interensaios). Os resultados estão apresentados na Tabela
21.
3.2.5 Exatidão
A exatidão de métodos analíticos é uma medida de erro sistemático e é
definida como concordância entre o valor determinado e o valor real (Causon, 1997). O
referido parâmetro foi determinado pela análise de amostras de plasma de controle de
qualidade em três diferentes concentrações e em cinco repetições em um mesmo dia
(exatidão intradia) e em dias diferentes (exatidão interdia).
Todas as amostras de controle de qualidade em plasma adicionadas de
Lyso-7 apresentaram desvios em relação aos valores nominais menores que 15%. A
exatidão do método para amostras analisadas no mesmo dia variou de 98,86% a
103,59% e para amostras analisadas em diferentes dias variou de 100,47% a 104,20%.
Os resultados estão resumidos na Tabela 21.
112
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
Tabela 14: Resultados de precisão e exatidão intra e inter-ensaios do método analítico para quantificação
de Lyso-7 em plasma. Os resultados expressam a média da análise de 6 amostras, durante 3 dias
Concentração
Precisão (%)
Exatidão (%)
µg/mL
Intra-ensaio
Inter-ensaios
Intra-ensaio Inter-ensaios
0,25
0,012
5,95
103,59
100,47
2,5
0,064
3,68
99,09
104,20
7,5
0,071
3,28
98,86
103,40
3.2.6 Limite de quantificação e limite de detecção
O limite de quantificação foi de 100 ng/mL, com precisão e exatidão de
0,065% e 109,45%, respectivamente, para o plasma. Valores adquiridos a partir da curva
de linearidade para o plasma. O limite de detecção foi de 50 ng/mL.
3.2.7 Estabilidade
A determinação da estabilidade de um fármaco numa matriz biológica
depende de vários fatores, tais como propriedades químicas do fármaco, condições de
armazenamento da amostra, tipo de matriz biológica e material de acondicionamento. A
determinação da estabilidade de uma amostra é fundamental para garantir que a
concentração da substância a ser analisada não sofreu alteração entre a sua coleta e o
momento da análise (Causon, 1997). Assim, é importante que se determine a estabilidade
das amostras de Lyso-7 em plasma em temperatura ambiente, em ciclos de
congelamento e descongelamento e após longos períodos de armazenamento. A
avaliação da estabilidade pós-processamento das amostras permite que amostras
processadas possam ser avaliadas após longos períodos de espera no autoinjetor do
sistema cromatográfico. Além disso, o monitoramento da estabilidade das soluçõespadrão é fundamental para garantir a confiabilidade dos resultados obtidos das análises
das amostras de plasma de voluntários. Conforme recomendado pelo Guia de Validação
de Métodos Bioanalíticos do FDA (US Food and Drug Administration, 2001), foram
determinadas as estabilidades descritas a seguir.
113
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
3.2.7.1 Estabilidade de curta duração
Foram utilizadas três amostras de plasma padrão de controle de qualidade
em três concentrações (baixa, média e alta), submetidas a descongelamento natural e
mantidas à temperatura ambiente durante 4 horas e submetidas ao processo de
purificação. Os resultados foram comparados com amostras descongeladas e
imediatamente analisadas. Os resultados da avaliação da estabilidade de curta duração
mostraram que amostras de plasma de controle de qualidade mantidas à temperatura
ambiente por 4 horas mantiveram-se estáveis (Tabela 22).
Tabela 15: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas após permanência à temperatura
ambiente por 4 horas. Cada resultado representa a média de três determinações
Conc.
Amostras processadas
Amostras processadas após 4 horas à
nominal
imediatamente após o preparo
temperatura ambiente
(µg/mL)
Conc.det. Precisão Exatidão Conc.det. Precisão Exatidão Desvio
(µg/mL)
(%)
(%)
(µg/mL)
(%)
(%)
(%)
0,25
0,26
0,01
103,59
0,23
11,23
91,37
0,01
2,5
2,48
0,06
99,09
2,75
2,13
109,81
0,02
7,5
7,41
0,07
98,86
8,14
1,83
108,53
0,05
3.2.7.2 Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento
Foram utilizadas três amostras de plasma padrão de controle de qualidade
(CQ) em três concentrações (baixa, média e alta), submetidas às seguintes condições:
congelamento a –80°C por, no mínimo, 12 horas, descongelamento e recongelamento
por, no mínimo, 12 horas e assim sucessivamente até completar três ciclos. A
concentração do fármaco nas amostras de plasma padrão de controle de qualidade foi
determinada nos três ciclos, inclusive no tempo zero, correspondente à preparação das
amostras de plasma de controle de qualidade e análise das mesmas sem submetê-las ao
congelamento.
114
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
A avaliação dos resultados da estabilidade das amostras de plasma de
controle de qualidade avaliadas por três ciclos de congelamento e descongelamento
mostrou que estas se mantiveram estáveis (tabelas 23, 24, 25).
Tabela 16: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas imediatamente após o preparo,
mantidas à temperatura de -80°C e submetida a um ciclo de congelamento e descongelamento (n = 5)
Conc.
Amostras processadas
Ciclo 1
Nominal
imediatamente após o preparo
(µg/mL)
Conc.det. Precisão Exatidão Conc.det. Precisão Exatidão Desvio
(µg/mL)
(%)
(%)
(µg/mL)
(%)
(%)
(%)
0,25
0,26
0,01
103,59
0,22
12,03
88,70
0,01
2,5
2,48
0,06
99,09
2,52
3,62
100,65
0,03
7,5
7,41
0,07
98,86
7,75
3,67
103,37
0,09
Tabela 17: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas imediatamente após o preparo,
mantidas à temperatura de -80°C e submetida a dois ciclos de congelamento e descongelamento, (n = 5)
Conc.
Amostras processadas
Nominal
imediatamente após o preparo
(µg/mL)
Conc.det. Precisão Exatidão Conc.det. Precisão Exatidão Desvio
Ciclo 2
(µg/mL)
(%)
(%)
(µg/mL)
(%)
(%)
(%)
0,25
0,26
0,01
103,59
0,23
13,44
93,99
0,01
2,5
2,48
0,06
99,09
2,64
11,77
105,65
0,1
7,5
7,41
0,07
98,86
8,07
2,80
107,61
0,07
Tabela 18: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, analisadas imediatamente após o preparo,
mantidas à temperatura de -80°C e submetida a três ciclos de congelamento e descongelamento, (n = 5)
Conc.
Amostras processadas
Nominal
imediatamente após o preparo
(µg/mL)
Conc.det. Precisão Exatidão Conc.det. Precisão Exatidão Desvio
Ciclo 3
(µg/mL)
(%)
(%)
(µg/mL)
(%)
(%)
(%)
0,25
0,26
0,01
103,59
0,22
10,81
89,27
0,01
2,5
2,48
0,06
99,09
2,34
6,01
93,50
0,04
7,5
7,41
0,07
98,86
6,91
9,19
92,18
0,2
115
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
3.2.7.3 Estabilidade pós-processamento
Problemas de instabilidade podem ocorrer não somente na matriz biológica
e/ou durante o tratamento das amostras, mas também nas amostras processadas.
Portanto, é necessário testar a estabilidade do analito no solvente em que foram extraídos
ou reconstituídos, na temperatura do auto-injetor e também em temperaturas mais baixas
(sob refrigeração), caso os extratos das amostras sejam armazenados antes das análises.
Em relação ao tempo, o mesmo deve ser superior ao esperado para a duração da análise
cromatográfica, o que possibilita, se necessário, a reinjeção dos extratos ou um tempo de
espera devido a circunstâncias não previstas como, por exemplo, o mau funcionamento
do sistema cromatográfico.
Foram utilizadas três amostras de plasma padrão de controle de qualidade
em três concentrações (baixa, média e alta), submetidas a descongelamento natural, a
temperatura ambiente, e analisadas na mesma temperatura e condições em que foram
analisadas as amostras de plasma dos animais. A avaliação deste parâmetro contemplou
o período máximo de espera das amostras processadas no auto-injetor do cromatógrafo
(até 24 horas).
Foi avaliada a estabilidade pós-processamento por 24 horas a temperatura
ambiente. Os resultados estão apresentados na tabela 26. As amostras de controle de
qualidade de plasma não apresentaram variações acima de 15% comparando com as
amostras processadas logo após o preparo.
Tabela 19: Estabilidade de Lyso-7 em amostras de plasma, purificadas e mantidas a temperatura ambiente
por 24 horas, (n = 5)
Conc.
(µg/mL)
Amostras processadas
Conc.det. Precisão
Exatidão
Amostras analisadas 24 horas
após a extração
Conc.det. Precisão Exatidão Desvio
(µg/mL)
(%)
(%)
(µg/mL)
(%)
(%)
(%)
0,25
0,26
0,01
103,59
0,23
9,34
93,99
0,01
2,5
2,48
0,06
99,09
2,64
4,23
105,65
0,03
7,5
7,41
0,07
98,86
8,07
2,05
107,61
0,05
Diante dos resultados apresentados o método foi considerado validado, pois
permitiu a análise de todos os parâmetros necessários que se encontraram dentro dos
limites de especificação. Embora a Lyso-7 seja um analito de difícil quantificação, pois
116
GARCIA, GM
CAPÍTULO III
possui baixa solubilidade nos meios utilizados, esse método permitiu sua detecção em
concentrações aceitáveis para sua posterior aplicação em estudos in vivo.
4 CONCLUSÕES
Os parâmetros dos métodos desenvolvidos, analítico e bioanalítico, se
encontraram dentro dos critérios de aceitação estabelecidos pelas agências reguladoras.
Dessa forma, eles podem ser usados com confiabilidade para a quantificação da Lyso-7
nos sistemas coloidais (analítico) e em plasma de camundongo (bioanalítico). Até o
presente trabalho não foi encontrada na literatura nenhum método cromatográfico para
quantificação
da
Lyso-7
[(5Z)-5-[(5-bromo-1H-indol-3-il)metileno]-3-(4-clorobenzil)-
tiazolidina-2,4-diona]. Portanto, tanto o método analítico quanto o bioanalítico são
inéditos. Isto permite os estudos pré-clínicos de desenvolvimento deste novo princípio
ativo e avaliação de seus efeitos biológicos em posteriores avaliações de PK/PD. O
método de extração desenvolvido e validado para recuperação da substância de plasma
de camundongos foi eficiente, simples, de alto rendimento e de rápida execução.
117
CAPÍTULO IV
Preparo, caracterização e estudo farmacocinético das nanocápsulas contendo Lyso-7
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
1 OBJETIVOS
• Preparar suspensões coloidais de nanocápsulas contendo Lyso-7 a partir dos
polímeros dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA), funcionalizados ao longo da
cadeia de PLA, contendo ou não o ligante de selectina-E ligado covalentemente;
• Caracterizar
as
nanocápsulas
preparadas
quanto
ao
tamanho,
índice
de
polidispersão e potencial zeta, avaliando a influência das diferenças químicas e
arquiteturais dos polímeros nesses parâmetros;
• Avaliar a eficiência de encapsulação e o teor de Lyso-7 nas nanocápsulas;
• Comparar os perfis farmacocinéticos da Lyso-7 livre em solução e encapsulada em
NC quando administrados por via endovenosa em camundongos saudáveis.
119
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Materiais
Para a preparação das NC foram utilizados o ácido poly(D,L-lactide) (PLA)
Mw 42.000Da (Sigma-Aldrich), os copolímeros dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PEG; PM
2000 g/mol) com grupos hidroxila (-OH) ou benzila (-OBz) ligados ao longo da cadeia.
Estes copolímeros foram sintetizados na Universidade de Montreal (Canadá) e
gentilmente cedidos pelos professores Dr. Patrice Hildgen e Dra. Vanessa Mosqueira.
Acetona
PA
(Vetec,
Brasil).
Lyso-7
[(5Z)-5-[(5-bromo-1H-indol-3-il)metileno]-3-(4-
clorobenzil)-tiazolidina-2,4-diona] PM 447,73 g/mol, sintetizada, purificada e gentilmente
cedida pelo professor Dr. Ivan da Rocha Pitta (UFPE). Epikuron 170 (fosfatidilcolina de
soja, ≈70% fosfatidilcolina), Lucas Meyer (França); Synperonic PE/F68 [PM 8400,
poloxamer 188, ICI Surfactants (Cleveland, UK)]; triglicerídeos de cadeia média (Miglyol
810N ,Hulls, Alemanha). A água ultra pura (Milli-Q) foi purificada no sistema Simplicity, da
Millipore®.
2.2 Preparo das nanocápsulas
As nanocápsulas de PLA foram preparadas pelo processo de deposição
interfacial de um polímero pré-formado, descrito por Fessi et al., 1989 e segundo
metodologia descrita por Mosqueira et al, 2009 (conforme documento técnico PI09056270). As nanocápsulas furtivas (NC contendo PEG) foram preparadas pelo método descrito
por Mosqueira et al., 2001, o qual é semelhante ao arterior.
A influência da presença do diferentes grupos ligados ao longo da cadeia
dos copolímeros na eficiência de encapsulação dos respectivos fármacos, no índice de
polidispersão e no potencial zeta foi avaliada para as suspensões de NC de PLA, dibloco
e tribloco, com e sem ligante de selectina.
120
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
2.3 Caracterização Físico-Químicas das nanocápsulas
2.3.1 Distribuição de tamanho
O tamanho médio das NC e o índice de polidispersão das suspensões de
nanopartículas foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons (ECF),
utilizando o equipamento Nanosizer N5 PLUS Beckmann Coulter (Fullerton, EUA). As
medidas de tamanho foram realizadas em quadruplicata em alíquotas da mesma amostra
e os resultados obtidos foram expressos como média + desvio padrão. O índice de
polidispersão determinado pelo equipamento reflete a homogeneidade no tamanho das
nanopartículas presentes na amostra, sendo que as amostras que apresentaram índice
de polidispersão inferior a 0,3 foram consideradas monodispersas, segundo instruções do
fabricante do equipamento (Beckmann Coulter).
2.3.2 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação
As análises foram feitas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) no aparelho Waters Alliance 2695 acoplado a um detector de arranjo de diodos
(DAD) Waters 2996, por um método de doseamento validado e descrito anteriormente. A
porcentagem de encapsulação e a eficiência de encapsulação foram realizados de acordo
com a metodologia descrita por Mosqueira et al, 2006. A porcentagem de encapsulação
objetiva determinar o teor de Lyso-7 incorporado à nanocápsulas em relação ao total de
Lyso-7 adicionado no preparo da formulação e foi calcula pela seguinte fórmula:
% encapsulação = (Lyso-7 total na suspensão (mL) – Lyso-7 no ultrafiltrado (mL) x 100
Lyso-7 total na suspensão (mL)
O fármaco total foi determinado pela completa dissolução de 80 µL da
suspensão de NC em acetonitrila. A Lyso-7 livre solúvel na fase externa aquosa foi obtida
pelo método de ultrafiltração/centrifugação de 200 µL da suspensão de NP a 500 × g por
30 minutos em unidades de ultrafiltração. A quantidade de Lyso-7 ligado à membrana foi
determinada após a ultrafiltração/centrifugação. Para tal, a membrana do AMICON foi
121
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
retirada, lavada com água MilliQ, imersa em 500 µL de etanol/acetonitrila (1:1), levada ao
vórtex por 15 minutos, centrifugada e o Lyso-7 dosado no sobrenadante. A eficiência de
encapsulação foi calculada pela seguinte fórmula:
Eficiência de Encapsulação% = Quantidade total de Lyso-7 encapsulado (mL) x 100
Quantidade de Lyso-7 pesado colocado na NP (mL)
2.3.3 Avaliação da solubilidade da Lyso-7 em óleo e PBS
A solubilidade da Lyso-7 em tampão fosfato (PBS) foi determinada num
período de 24 horas. Para isso, 2 mg de Lyso-7 foram precisamente pesados e
acrescentado a tubos Eppendorf®. A esses tubos foram acrescentados 2 mL de PBS e o
sistema foi mantido em agitação a 37°C. Em tempos pré-determinados (15, 30 e 60 min,
3, 6, 12, 24 e 48 horas) coletou-se 100 µL do meio, ultracentrifugou-se a 8.000 rpm por 5
minutos, retirou-se 50 µL do sobrenadante e diluiu-se com 250 µL de metanol. Essa
solução foi vórtexada por 10 minutos e novamente ultracentrifugada a 8.000 rpm. O
sobrenadante foi quantificado por CLAE. Esse experimento foi realizado em três réplicas
(n=3) e os resultados foram expressos como média e desvio padrão.
Para a avaliação da solubilidade em óleo (Mygliol), pesou-se 2 mg de Lyso-7
e acrescentou-se a tubos Eppendorf® contendo 2 mL do óleo. Esses tubos foram
mantidos em agitação a 37ºC por 24 horas. Ao final deste tempo, coletou-se 50 µL do
meio, que foi diluído volumetricamente com metanol até um volume de 2 mL. Desta
diluição foram retiras alíquotas de 300 µL e quantificadas por CLAE, em réplicas de três
(n=3) sendo os resultados também expressos como média e desvio padrão.
2.3.4 Avaliação da cinética de liberação in vitro
A formulação preparada usando o polímero PLA foi avaliada quanto à
liberação in vitro de Lyso-7, na concentração de 0,35 µg/mL no meio, em triplicata, em
tampão fosfato salina (PBS pH 7,4). Para o doseamento da Lyso-7 liberada utilizou-se a
técnica de diálise reversa. Para tal, sacos de diálise contendo 1 mL de PBS foram
emergidos em 500 mL de PBS e deixados em equilíbrio por 3 horas sob agitação a 37ºC.
122
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
Em seguida, adicionou-se a formulação ao meio externo (350 µL da suspensão de NC
contendo 0,5 mg/mL de Lyso-7). Nos tempos pré-determinados (15, 30 e 60 min, 3, 6, 12,
24 e 48 horas) retirou-se um saco de diálise do meio e alíquotas de 500 µL foram
coletadas, solubilizadas em 500 µL de acetonitrila e a Lyso-7 liberado foi quantificado em
CLAE-DAD. A solubilidade da Lyso-7 em PBS foi determinada previamente e a
quantidade de formulação adicionada respeitou a condição sink (20% da concentração de
saturação no meio).
Os dados obtidos dos perfis de dissolução foram submetidos a tratamentos
matemáticos para a determinação de cinética de liberação/dissolução e para isso foram
aplicados os mesmos modelos matemáticos descritos no capítulo II, sendo eles o modelo
de ordem zero, o modelo de primeira ordem, o modelo de Higuchi e o modelo de cinética
desenvolvido por Korsemeyer et al. (1983).
2.3.5 Estudo farmacocinético da Lyso-7
Realizou-se o estudo farmacocinético com a Lyso-7 livre e encapsulada em
nanocápsulas de ácido poli-lactico (NC-PLA). A solução da Lyso-7 livre foi preparada
solubilizando 2 mg da substância em 400 µL de DMA, 600 µL de PEG 300, 20 µL de
Tween 80 e 20 µL de DMSO. Após agitação por 10 min em vórtex, esta solução foi
centrifugada por 5 min a 900 × g, o sobrenadante foi coletado e diluído em solução de
glicose 5% até uma concentração final de 0,5 mg/mL de Lyso-7. A solução de Lyso-7 e a
suspensão de NC-PLA encapsulando 0,5 mg/ml de Lyso-7 foram filtradas em filtro estéril
de 0,8 µm e administrou-se 300 µL e 200 µL, respectivamente, por via endovenosa. Nos
intervalos de tempos de 5, 20, 40, 60 min e 2, 3 horas após a injeção, o sangue (200 µL)
foi coletado em tubos heparinizados, centrifugado por 15 min a 800 × g separando-se 50
µL de plasma e adicionando 10 µL da solução de PI. As amostras foram então extraídas,
o solvente foi evaporado e o resíduo ressuspenso com 100 µL de fase móvel. Para
determinar a quantidade total de Lyso-7 no plasma, foi assumido que o volume de plasma
por camundongo é 4,9% do peso total (Auletta, 1995). Os resultados foram expressos
como média da porcentagem da dose administrada ± erro padrão (n=6 camundongos).
Para comparar as diferentes formulações, a área sob a curva (AUC) (concentração x
tempo) da Lyso-7 livre e encapsulada em NC-PLA foi calculada pelo método trapezoidal
123
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
durante o tempo experimental (AUC[0-3]). A área extrapolada (AUC[t-ω]) pode ser calculada
pela divisão da última concentração experimental (Ct) pela constante de eliminação (K),
porém uma vez que esta representa aproximadamente 1% da AUC experimental, ela foi
retirada dos cálculos. Assim, a estimativa da depuração plasmática (Cl) foi calculada
através da seguinte equação: Cl = Doseiv/AUC0–3
2.4 Análise Estatística dos Dados
Os dados de farmacocinética foram comparados por two-way ANOVA. O
diâmetro médio e o potencial zeta das NC vazias e contendo os fármacos foram
comparadas por análise da variância (ANOVA), utilizando o programa Prisma® versão
5.0. Adotou-se intervalo de confiança de 95%, sendo os valores de p<0,05 aceitos como
estatisticamente significativos.
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1 Caracterização Físico-Químicas das nanocápsulas
3.1.1 Distribuição de tamanho
A técnica de espectroscopia de correlação de fótons (ECF), como já
relatado, fornece o diâmetro médio das nanoestruturas e o índice de polidispersão (I.P.)
da população analisada.
A determinação do raio hidrodiâmetro das nanopartículas é uma das
importantes análises para a caracterização físico-química das formulações. Através desta,
é possível acompanhar a estabilidade das formulações e a tendência das partículas
presentes
na
suspensão
(Magenheim e Benita, 1991).
coloidal
de
se
agregarem
O tamanho das partículas
e
de
sedimentarem
representa um aspecto
importante, também, para sua biodistribuição e eliminação, sendo que partículas maiores
(acima de 300 nm) são mais rapidamente reconhecidas pelo sistema fagocitário
124
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
mononuclear e facilmente retirado da circulação sanguínea. Além disso, quando se
pretende uma administração intravenosa, está análise deve ser estritamente controlada,
pois os pequenos capilares sanguíneos do corpo humano possuem de 4 a 7 mm de
diâmetro e partículas maiores que 4 mm podem causar sua oclusão (Chorny et al., 2002),
clinicamente conhecida como embolia. O tamanho das nanocápsulas produzidas por
nanoprecipitação, geralmente, varia de 100 a 500 nm e depende de vários fatores, como
o método de preparação, a concentração do polímero e do fármaco encapsulado, a
proporção entre solvente orgânico e água e da velocidade de difusão da fase orgânica na
aquosa (Legrand et al., 1999 e Mosqueira et al., 2001).
Os resultados obtidos na avaliação do tamanho médio das NC brancas (sem
o fármaco) e contendo Lyso-7 são demonstrados nas tabelas 27 e 28. Populações
monodispersas de partículas foram obtidas com a utilização de todos os polímeros antes
e após encapsulamento da substância. Além disso, o tamanho médio das partículas e o
índice de polidispersão obtidos são considerados aceitáveis para a utilização dessas
nanopartículas in vivo, comparando-se com outras nanocápsulas dentro de uma mesma
escala de tamanho (Mosqueira et al., 2001).
Tabela 20: Comparação do tamanho entre as NC brancas com diversos polímeros
a
NC Brancasa
Tamanho médio ± DPb
I.Pc ± DP
PLA
295,50 ± 5,17
0,14 ± 0,04
Dibloco
214,20 ± 3,03*
0,18 ± 0,04
Tribloco
181,80 ± 0,98*
0,14 ± 0,02
Dibloco-OH
225,70 ± 2,86*
0,13 ± 0,02
Tribloco-OH
198,10 ± 1,38*
0,16 ± 0,04
Dibloco-OBz
227,80 ± 2,28*
0,19 ± 0,03
Tribloco-OBz
215,80 ± 4,67*
0,11 ± 0,06
b
c
Volume final de 2 mL; DP= desvio padrão (n=4); amostras monodispersas (abaixo de 0,3);
*significativamente diferente das formulações com PLA (p<0,05).
A utilização de copolímeros dibloco (PLA-PEG) e tribloco (PLA-PEG-PLA) e
dos copolímeros funcionalizados com grupamentos hidroxila ou benzila conduziu a uma
redução significativa no tamanho das partículas quando comparado ao tamanho daquelas
preparadas a partir do homopolímero de PLA. Esta redução no tamanho das NC,
produzida pela presença das cadeias de PEG covalentemente ligadas na superfície das
nanocápsulas, também foi observada por outros autores (Tobio et al., 1998; Ameller et al.,
125
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
2003; Essa et al., 2010), e está provavelmente associada à característica anfifílica do
copolímero que conduz à redução da tensão interfacial do sistema. A introdução de
grupos hidroxila ou benzila aumentou o tamanho das NC, comparado às NPs preparadas
com os copolímeros dibloco e tribloco, devido à dificuldade de acomodação de grupos
volumosos no interior do núcleo das NC (benzila). No caso das hidroxilas há um provável
aumento da camada de solvação no entorno das cadeias de PLA funcionalizado.
Tabela 21: Comparação de tamanho entre as NC com 0,5 mg/mL de Lyso-7 produzidas com polímeros
PLA, dibloco e tribloco, com e sem ligante de selectina
Formulaçãoa
Tamanho médio ± DPb
I.Pc ± DPb
PLA
273,6 ± 1,20
0,177 ± 0,019
Dibloco
240,7 ± 2,54*
0,147 ± 0,016
Tribloco
212,6 ± 2,99*
0,178 ± 0,022
Dibloco-g-ligante
275,7 ± 0,17
0,164 ± 0,035
Tribloco-g-ligante
229,3 ± 2,30*
0,183 ± 0,020
a
b
c
Volume final de 2 mL; DP= desvio padrão (n=4); amostras monodispersas (abaixo de 0,3);
*significativamente diferente das formulações com PLA (p<0,05).
Foi observada uma diferença significativa (p < 0,05) no aumento do tamanho
das formulações coloidais dos dois tipos básicos de polímeros utilizados, PLA-PEG e
PLA-PEG-PLA, quando foi incorporado a Lyso-7 às formulações quando comparado com
as formulações brancas, sem o fármaco. Para explicar o aumento do tamanho quando
adicionamos o fármaco há algumas hipóteses: a presença de Lyso-7 no meio altera o
tamanho crítico das gotas na separação de fase, o que pode indicar maior solvatação pela
água (cadeias mais relaxadas expõem melhor os grupos carboxilato para o exterior) ou
maior adsorção de poloxamer na superfície de partículas bastante hidrofóbicas pela
presença de Lyso-7. Há também a hipótese mais provável de acomodação das moléculas
do fármaco no núcleo oleoso que aumenta consequentemente o volume interno das NC.
Na literatura vários casos de aumento no tamanho das NC após incorporação do fármaco
são encontrados (Govender et al., 1999; Guterres et al., 1995). A incorporação do ligante
de selectina provocou um aumento significativo (p<0,05) no tamanho das nanocápsulas,
comparado com a mesma formulação, porém sem ligante, o que está provavelmente
associado a sua organização na interface, que pode alterar o diâmetro hidrodinâmico
medido por PCS.
126
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
3.1.2 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação
A concentração de fármaco associada às nanoestruturas é calculada pela
diferença entre as concentrações de fármaco total, após dissolução das NC em solvente e
da quantidade de fármaco livre disperso ou dissolvido na fase externa.
As NC são constituídas de um núcleo oleoso, no qual o fármaco lipofílico
pode
estar
dissolvido
ou
disperso,
revestido
por
uma
parede
polimérica
(Legrand et al., 1999). Devido ao elevado caráter hidrofóbico da Lyso-7, as NC
mostraram-se carreadores adequados para a incorporação desse fármaco, pois todas as
formulações apresentaram um teor de encapsulação próximo de 100%. Não foi
encontrado Lyso-7 livre solúvel na fase aquosa da suspensão coloidal, ou aderida à
membrana de ultrafiltração utilizada para a separação das NP, em concentrações
detectáveis (tabela 29). Por outro lado, a eficiência de encapsulação, que leva em conta
as perdas do processo de preparo das NC variou de acordo com a formulação utilizada. O
valor de 100% de encapsulação possibilita a utilização dessas formulações de NC in vitro
e in vivo, sem necessidade de processos de purificação adicionais.
Tabela 22: Eficiência de encapsulação e rendimento de encapsulação de formulações de NC com 0,5
mg/ml de Lyso-7
Formulação de NCa
PLA
Dibloco
Tribloco
a
Eficiência de
encapsulação ± DPb (%)
82,85 ± 0,012
88,50 ± 0,003
94,30 ± 0,015
% encapsulação
98,97
99,37
99,41
b
Volume final de 2 mL; DP= desvio padrão (n=4).
2.3.5 Avaliação da solubilidade da Lyso-7
A solubilidade da Lyso-7 em PBS e em Mygliol foi determinada por CLAE.
Dessa forma, após 24 horas de incubação a 37°C sob agitação pode-se verificar que a
solubilidade da Lyso-7 no Miglyol é de 2,74 ± 0,13 mg/mL e após 48 horas de incubação a
solubilidade no PBS é de 1,66 ± 0,45 µg/mL. Baseando-se neste resultado, é possível
explicar os altos teores de encapsulação da Lyso-7 no núcleo oleoso das NC.
127
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
2.3.6 Avaliação da cinética de liberação in vitro
Observa-se que ambos os perfis, de dissolução e de liberação da Lyso-7,
mostraram-se semelhantes. Na liberação a partir das NC há um efeito “burst” até 12
horas. Mais de 82% da substância foi dissolvida em 12h, tempo no qual apenas 58% de
Lyso-7 foram liberados da formulação de NC.
Figura 24: Perfil de dissolução/liberação in vitro da Lyso-7 livre e em nanocápsulas de PLA (NC-PLA) na
concentração de 0,35 µg/mL em PBS.
A partir desse tempo ocorre uma dissolução/liberação lenta em ambos os
casos, até o tempo de 48h com a dissolução completa da Lyso-7 livre e uma quantidade
inferior a 77% de liberação da Lyso-7 a partir das NC (Fig. 47). Esta segunda fase
controlada pode ser dependente principalmente da difusão do fármaco e da erosão da
matriz, fenômenos esses que ocorrem mais lentamente devido à hidrofobia do polímero
(Fredenberg et al., 2011), além de poder ser atribuída à densidade do polímero com baixa
porosidade, mas também pelas interações polímero-fármaco e fármaco-fármaco que
inibem a liberação do mesmo (Blanco and Alonso, 1997; Kang et al., 2008; Kang and
Schwendeman, 2007).
Na tabela 30 estão apresentados os valores de coeficiente de correlação
linear (R2) obtidos através de construção de gráficos nos modelos de Ordem Zero (tempo
em função da quantidade não liberada de fármaco) comparados com Primeira Ordem
128
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
(tempo em função do log da % não liberada de fármaco) e Higuchi (raiz quadrada do
tempo em função da % liberada).
Tabela 23: Tabela valores de R2 (coeficiente de correlação linear) referentes a cinética de liberação de
PLA-NC da Lyso-7 em PBS, obtidos através da construção de gráficos para modelo de Ordem 0 (t x QND ),
1ª Ordem (t x log %ND ), e Higuchi (√ t x %D )
Modelo Matemático
Formulação
Ordem Zero
Primeira Ordem
Higuchi
Equação da cinética
PLA
0,5056
0,6810
0,8573
y = 27,038ln(x) – 38,374*
Dissolução
0,6158
0,9562
0,7765
y = 1,9249e-0,059x**
2
2
* R = 0,9371; ** R = 0,8774
Todos os perfis apresentaram diferentes valores de coeficiente de
correlação, o que facilita a escolha de um modelo ideal. De acordo com os dados, a
liberação das NC-PLA segue o modelo matemático de Higuchi, o qual prediz que a
liberação ocorre pela difusão do fármaco através da matriz das NC e da erosão da
mesma.
Também foi calculado o n (coeficiente de liberação) de cada perfil, através
da equação de Korsemeyer et al. (1983). Essa equação é geralmente utilizada para
interpretar e descrever a liberação do fármaco quando o mecanismo que prevalece não é
bem conhecido ou resulta da combinação de dois processos aparentemente
independentes: um devido ao transporte de fármaco que obedece as leis de Fick ou
transporte Fickiano, e outro em consequência dos fenômenos de inchamento/relaxamento
das cadeias (expansão dinâmica) e que envolve a transição de um estado semi-rígido a
outro mais flexível, chamado transporte Caso II. De acordo com a forma geométrica da
preparação, variam os valores de n usados para interpretar e caracterizar o mecanismo
de liberação. A tabela 31 mostra os valores de n encontrado para cada perfil de liberação.
Tabela 24: Valores de n (coeficiente de liberação) para as amostras
Formulação
N
PLA
0,3952
Dissolução
0,1920
Aplicado a formas farmacêuticas esféricas, um valor de n até 0,43 indica que
a liberação se dá pelo mecanismo de difusão Fickiana. Quando os valores de n estão
entre 0,43 e 0,85 o mecanismo de liberação é tipo anômalo, ou seja, envolvendo
129
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
fenômenos de difusão e erosão, e para valores de n a partir de 0,85 o mecanismo
controlador da liberação do fármaco é do tipo transporte caso II. Para a determinação do
n é usada somente a porção da curva de liberação onde a razão Mt/M∞ tem valores
menores que 0,6 (Costa & Lobo, 2001).
Tanto o perfil de liberação da PLA-NC quanto à dissolução da Lyso-7
apresentaram um valor de n inferior a 0,43, indicando que o mecanismo de
liberação/dissolução que prevalece para estas formulações é a difusão de Fick.
3.3 Estudo farmacocinético da Lyso-7 nanoencapsulado
A avaliação do perfil farmacocinético foi inicialmente realizada com a
suspensão de PLA-NC com 0,5 mg/mL de Lyso-7. Injetou-se por via endovenosa 300 µL
da suspensão (2,17 mg/Kg de Lyso-7 em NC-PLA) e o sangue foi coletado nos tempos já
indicados. Porém, a injeção de 300 µL da solução contendo a mesma dose de Lyso-7 livre
levou a morte imediata de todos os animais (n = 6). Com isso, avaliou-se o perfil
plasmático da Lyso-7 livre injetando uma dose menor da mesma (1,55 mg/Kg de Lyso-7
livre). Para avaliar se os solventes e adjuvantes utilizados no preparo da solução de Lyso7 foram os responsáveis pela letealidade da formulação, um mesmo veículo foi preparado
sem Lyso-7 e administrado por via endovenosa em camundongos, sendo que não foi
observada nenhuma reação anormal ou posterior morte dos mesmos.
Como os volumes e consequentemente as doses administradas do princípio
ativo foram diferentes nos dois grupos, os valores plasmáticos foram expressos em
porcentagem da dose administrada, sendo que a Lyso-7 foi quantificada tanto na
suspensão coloidal quanto na solução para corresponder exatamente a 100% da dose
administrada.
Os perfis farmacocinéticos obtidos após a administração intravenosa da
solução de Lyso-7 e de Lyso-7 encapsulado em NC-PLA estão demonstrados da figura
48. A concentração plasmática da Lyso-7 em NC-PLA foi significativamente maior
(p<0,001) que a sua concentração livre após 5 (Fig. 49) e 20 minutos de injeção,
sugerindo uma rápida depuração plasmática da substância. Após 1h a concentração de
ambas as formulações assumiram um perfil similar indicando que a Lyso-7 foi
provavelmente liberada das NC ou as NC de PLA foram fagocitadas pelas células do
130
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
SFM. Pode ser observado que as nanocápsulas modificaram o perfil plasmático da Lyso7, como demonstrado na tabela 32. A AUC foi aumentada estatisticamente (p<0,001)
aproximadamente 5,5 vezes e a depuração foi reduzida pela encapsulação da Lyso-7
neste nanocarreador polimérico.
Por esse estudo farmacocinético foram evidenciadas algumas das
vantagens da utilização de sistemas vetorizados. A primeira foi a modificação do perfil
farmacocinético do princípio ativo e a segunda, a diminuição da toxicidade da substância,
que foi letal quando administrada livre em solução na mesma concentração que nas
nanocápsulas poliméricas. Assim sendo, a nanoencapsulação da Lyso-7 viabiliza sua
administração por via endovenosa em doses maiores que quando veiculada em outros
tipos de formulações.
Figura 25: Perfil da concentração plasmática da Lyso-7 após administração intravenosa das doses: 1,55
mg/Kg de Lyso-7 livre e 2,17 mg/Kg de NC-PLA (média ± erro padrão, n = 6). *** p < 0,001, ** p < 0,05
usando two-way ANOVA.
Tabela 25: Parâmetros farmacocinéticos da Lyso-7 em diferentes formulações após administração
intravenosa
Parâmetro
Lyso-7 livre
NC-PLA
AUC[0-3] (µg.min/mL)
20,54 ***
113,60
Depuração (mL/(min.Kg))
75,27 ***
19,08
AUC, área sob a curva; NC, nanocápsulas. Doses administradas: 1,55 mg/Kg de Lyso-7 livre e 2,17 mg/Kg
de NC-PLA. *** p < 0,0001.
131
GARCIA, GM
CAPÍTULO IV
A
U
0,030
PI
Lyso-7
0,020
0,010
0,000
0,00
1,00
2,00
3,00
Minutes
4,00
5,00
6,00
Figura 26: Cromatograma de amostra de plasma coletado 5 min após injeção de 300 µL da suspensão de
NC-PLA com 0,5 mg/mL de Lyso-7.
Trabalhos posteriores serão realizados para verificar o perfil farmacocinético
e a biodistribuição corpórea de NC com superfície modificada, preparadas a partir de
polímeros distintos; como os peguilados e os funcionalizados.
4 CONCLUSÕES
Neste estudo foi observada a influência da arquitetura dos polímeros sobre o
tamanho
e
o
potencial
zeta
das
mesmas.
Durante
o
desenvolvimento
dos
nanocarreadores foi avaliado a produção de NC e NS. Entretanto, estas não
apresentaram uma boa encapsulação, sendo observada a formação de precipitado logo
após a evaporação do solvente. Assim sendo, as NC se apresentaram como uma opção
para o encapsulamento da Lyso-7, uma vez que por apresentarem um núcleo oleoso,
pode facilitar a encapsulação de fármacos pouco solúveis em água. Além disso, a
funcionalização dos polímeros pode ser útil para a ligação de grupos químicos
responsáveis pelo reconhecimento celular, tal como foi feito com o ligante da selectina.
Por fim, os estudos farmacocinéticos das NC encapsulando a Lyso-7 mostraram que as
mesmas modificaram o perfil da substância em plasma de camundongo após a
administração endovenosa aumentando o tempo de meia vida plasmática e diminuindo
sua depuração. Além disso, as NC diminuíram a toxicidade da Lyso-7, que se mostrou ser
tóxica e letal aos animais quando administrada numa mesma dose da substância
encapsulada. Dessa forma, as nanocápsulas de Lyso-7 são uma opção como forma
farmacêutica que viabiliza a possibilidade de administração endovenosa dessa substância
em concentrações maiores reduzindo a toxicidade geral.
132
CONCLUSÃO
GARCIA, GM
CONCLUSÃO
• O preparo das suspensões coloidais de nanoesferas contendo o itraconazol a partir
do homopolímero do ácido poliláctico (PLA) e de seus copolímeros com cadeias de
polietilenoglicol
(PEG)
mostraram-se
viáveis,
resultando
em
formulações
monodispersas que se mantiveram estáveis durante os 12 meses avaliados. A
diferença na arquitetura desses copolímeros influenciou no tamanho das
nanoesferas, sendo que aquelas produzidas a partir do copolímero dibloco
apresentaram diâmetro médio inferior se comparado com as tribloco. O fármaco
itraconazol foi eficientemente associado às nanoesferas e as formulações
produzidas apresentaram porcentagem de encapsulação próximos de 100%, o que
indica que o sistema foi adequado para associação do ITZ;
• As diferentes nanoesferas apresentaram perfis de liberação diferenciados, isso
devido às diferentes interações que podem ocorrer entre polímero/fármaco. Assim,
essas diferenças podem ser úteis no delineamento de sistemas de liberação
controlada obtidos a partir destes polímeros, visando aumentar ou reduzir as
interações entre fármaco e polímero, obetendo um maior controle da velocidade de
liberação.
• Foi desenvolvida e validada uma metodologia inédita para a quantificação da Lyso7 em plasma por CLAE-DAD. O método desenvolvido se apresentou sensível,
simples, estável e adequado para quantificação da Lyso-7 em amostras de plasma.
A validação do método garantiu a qualidade e a confiabilidade dos resultados
obtidos no estudo in vivo, justificando seu uso na avaliação da farmacocinética
desta substância associada a outros nanocarreadores;
• A Lyso-7 foi eficientemente associada às nanocápsulas com diferentes copolímeros
e as formulações se mantiveram estáveis durante os experimentos. Especialmente
as formulações produzidas com os copolímeros dibloco e tribloco encapsularam o
fármaco com porcentagem de encapsulação próximos de 100%, o que indica que o
sistema foi adequado para associação da Lyso-7;
• Através da farmacocinética da Lyso-7, livre e nanoencapsulada em nanocápsulas
de PLA, foi observado que as mesmas modificaram o perfil plasmático da Lyso-7
reduzindo significativamente a depuração da mesma neste nanocarreador
polimérico. Além disso, durante estes experimentos observou-se que nanocápsulas
de PLA reduziram o efeito tóxico da Lyso-7 por via endovenosa, uma vez que a
mesma dose da substância livre levou os camundongos a óbito;
134
GARCIA, GM
CONCLUSÃO
• Por fim, o presente trabalho ressalta a importância do uso de nanopartículas
poliméricas como um sistema controlado de liberação de fármacos. A
funcionalização dos polímeros pode ser útil para a ligação de grupos químicos
responsáveis pelo reconhecimento celular, tal como foi feito com o ligante da
selectina. Também o uso de ligantes interfere nas propriedades físico-químicas das
nanoesferas carreadoras, efeitos estes que devem ser investigados para melhorar
as chances de sucesso no carreamento direcionado de fármacos (targeting).
135
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
GARCIA, GM
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WANG, J., WANG, B.M., SCHWENDEMAN, S.P. Characterization of the initial burst
release of a model peptide from poly(d,l-lactide-co-glycolide) microspheres. J. Control.
Release, v.82, p.289–307, 2002.
WHO,
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YE, C., KIRIYAMA, K., MISTUOKA, C., KANNAGI, R., ITO, K., WATANABE, T., KONDO,
K., AKIYAMA, S., TAKAGI, H. Expression of E-selectin on endothelial cells of small veins
in human colorectal cancer. Int J Cancer, v.61 (4), p.455–60, 1995.
147
GARCIA, GM
REFERÊNCIAS
ZHANG, H., ZHANG, A., KOHAN, E.D. et al. Collecting duct-specific deletion of
peroxisome proliferator-activated recepto γ blocks thiazolidinedione-induced fluid
retention. PNAS, v.102, p.9406-11, 2005.
148
GARCIA, GM
ANEXOS
ANEXOS
GARCIA, GM
ANEXOS
ANEXOS - Resumos apresentados em congressos científicos:
Simpósio Nacional de Cromatografia e Métodos Afins – Campos do Jordão/SP
ESTUDO COMPARATIVO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO
ITRACONAZOL
Giani Martins GARCIA, Líliam Teixeira OLIVEIRA, Vanessa Carla Furtado MOSQUEIRA
Laboratório de Desenvolvimento Galênico e Nanobiotecnologia, CiPharma, Universidade
Federal de Ouro Preto, Campus Morro do Cruzeiro, Ouro Preto, Brasil
O itraconazol é um fármaco antifúngico com característica química de um bis-triazólico.
Apresenta amplo espectro de ação sendo empregado no tratamento de micoses sistêmicas,
como aspergilose e candidíase, micoses superficiais como candidíase oral e dermatofitoses e
mais recentemente seu uso vem sendo avaliado para o tratamento da doença de Chagas. Seu
mecanismo de ação baseia-se na inibição da síntese do ergosterol, um componente vital da
membrana da célula de fungos e parasitas. A conseqüência do bloqueio desta síntese é um
aumento da permeabilidade da membrana celular, desencadeando alterações morfológicas que
resultam em necrose celular. O itraconazol é altamente lipofílico (pKa = 3,7), apresentando
baixa solubilidade em soluções aquosas e rápida absorção oral. Métodos analíticos de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção de arranjo de diodos (CLAE-DAD) e
espectrofotometria ultravioleta foram desenvolvidos e validados para a quantificação do
itraconazol em diferentes formulações de nanoesferas poliméricas. O sistema cromatográfico
utilizado consistiu de uma bomba de módulo de separação Waters Alliance 2695, composto de
injetor automático, forno de coluna e detector de arranjo de diodos Waters 2996. A separação
foi realizada em uma coluna C18 Macherey-Nagel com partícula de 4 µm, 150 mm x 4,6 mm,
protegido por uma pré-coluna de segurança Phenomenex AJO-7597 C18 (2 mm x 4,6 mm, 3
mm). A fase móvel consistiu de uma mistura de metanol:água (75:25 v/v). As condições de
operação foram vazão de 1 ml/min, tempo de corrida de 13 min, volume de injeção de 50 µl e
detecção no DAD em 260 nm. Para espectrofotometria foi utilizado o aparelho Heλios α,
Thermo Spectronic, com detecção no UV-Vis em 260 nm. O tempo de retenção obtido foi de
9,75 min. O método foi linear nas concentrações variando de 500 ng/ml a 100 µg/ml, com um
coeficiente de correlação linear R2 = 0,9999 (y = 19299x + 11155) para CLAE, e nas
concentrações de 500 ng/ml a 50 µg/ml com o coeficiente R2 = 0,9996 (y = 0,0519x + 0,001)
para espectrofotometria. A precisão e exatidão dos métodos tiveram valores adequados
(variação inferior a 5% nas amostras para análise). O limite de quantificação foi de 500 ng/ml
para ambos os métodos analíticos. Já o limite de detecção foi de 10 ng/ml e 50 ng/ml para
CLAE-DAD e espectrofotometria, respectivamente, ressaltando a maior sensibilidade do
método cromatográfico. Além disso, nenhum polímero constituinte das formulações de
nanoesferas apresentaram picos interferentes no mesmo tempo de retenção do itraconazol. Os
métodos propostos foram desenvolvidos seguindo os protocolos e valores determinados pela
ANVISA e FDA e mostraram-se eficientes para o uso em quantificações do itraconazol nas
formulações nanoestruturadas propostas.
GARCIA, GM
ANEXOS
2nd Conference Innovation in Drug Delivery – França
ITRACONAZOLE ASSOCIATION WITH FUNCTIONALIZED NANOSPHERES IS
INFLUENCED BY CHEMICAL GROUPS LINKED TO PLA
Giani Martins Garcia1, Patrice Hildgen2, Jean-Michel Rabanel2 and Vanessa Carla Furtado
Mosqueira1*
1
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Universidade
Federal de Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil.
Faculté de Pharmacie, Université de Montreal, QC, Canada.
*
email: [email protected]
Purpose: The drug loading and encapsulation efficiency of itraconazole in PLA derivatives
nanospheres (NS) were investigated.
Methods: The oligopolymers containing functional groups (-OH or -benzyl) grafted in linear
chain of PLA were prepared by ring opening polymerization of dilactides in the presence of PEG
or methoxi-PEG producing block olipolymers with different characteristics.
Results: All the polymers used produces NS with very low polydispersity (<0.1) using polymer
deposition method followed by solvent displacement. However, NS made of diblock
homopolymers have lower size (116nm, 0.080) than triblock (146nm, 0.083). Introducing benzyl
groups in the polymer increases significantly the size of NS (180-285nm). The itraconazole
association with these nanospheres is high and loading yielding was always near 100% at 2.55% w/w. Hydrophilicity of polymer slightly reduces itraconazole loading. However, loading
efficiency was lower with the polymers functionalized with benzyl groups (64-68%) compared to
hydroxyl groups (73%), indicating that probably steric constraints with itraconazole large
molecule could occurs, which reduces drug association with the carrier. This fact was reinforced
when encapsulation efficiency was compared with non-functionalized groups (95-100%).
Conclusions: This investigation open up a wide range of possibilities in chemical modification
of biodegradable polymers in order to improve loading efficiency of different types of molecules,
by increasing hydrophobic and hydrophilic interactions with rationally functionalized polymers.
This work was supported by Nanobiotechnology Network-FAPEMIG and INCT-if scholarship
from Brazil Science and Technology Ministry.
GARCIA, GM
ANEXOS
rd
23
Internacional Symposium of Pharmaceutical & Biomedinal
Analysis – João Pessoa/PB
Validation of HPLC-DAD analytical method for determining a new thiazolidine-2,4-dione
in polymeric nanocapsules
Giani M. Garciaa, Líliam T. Oliveiraa, Ivan R. Pittab, Dulcinéia S. P. Abdallac, Vanessa C. F.
Mosqueiraa
a-Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Ouro
Preto, MG, Brazil
b–Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, PE, Brazil
c–Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, SP, Brazil
Keywords: thiazolidinones, HPLC-DAD, nanocapsules
INTRODUCTION
The clinical use of non-steroidal anti-inflammatory drugs is associated with significant toxicity
particularly in the gastrointestinal tract and kidney. Novel thiazolidinones (TZD) have been
synthesized and exhibited anti-inflammatory activity [1]. An analytical method for quantitative
analysis of a new TZD in polymeric nanocapsules (NC) was developed and validated using highperformance liquid chromatography with diodes array detection (HPLC-DAD).
MATERIALS AND METHODS
All solvents used were HPLC grade and were purchased from Tedia (Brazil) and the new TZD
(GMG-7) was kindly given by Prof. Ivan Pitta. The different NC formulations were prepared
according to Fessi et al.[2]. The HPLC system employed consisted of a Water Alliance 2695
separation module with DAD detection (Waters 2996), using a C18-RP column
(150mm×4.6mm) protected by a security guard C18 column (2mm×4.6mm, 3µm). The isocratic
mobile phase is consisted of a mixture of methanol/water (90:10), pumped 1ml/min. The
analysis was performed at 35ºC and the volume injection was 50µl. The column eluent was
monitored at 385nm. The amount of GMG-7 loaded on the different formulations were
determined according to Mosqueira et al.[3].
RESULTS AND DISCUSSION
It was evaluated selectivity (Fig.1), limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ),
linearity, accuracy and precision, and all parameters were in accordance with International
Conference on Harmonization (ICH) guidelines [4]. The linearity was over 0.5-100µg/ml, and the
slopes, intercepts and the coefficients of determination were found to be 119817 (a), 8229.4 (b),
0.9997 (r2), respectively. The LOD was 50ng/ml and the LOQ was 500ng/ml. Due to the
hydrophobic character of GMG-7, the NCs proved to be suitable carriers for the incorporation of
this drug, as all formulations showed a level of near 100% encapsulation (Table 1).
Fig.1-Chromatogram
loaded PLA-NC.
0,20
GMG-7
A
U
0,15
of
GMG-7
0,10
0,05
0,00
2,00
4,00
6,00
Minutes
Table 1 - Quantitative analysis of different GMG-7 nanocapsules.
NC formulationa
Encapsulation efficiency(%)
Drug loading(%)
PLAb
82.85
98.97
PLA-PEGc
88.50
99.37
PLA-PEG-PLA
94.30
99.41
a
0.5mg/ml; b PLA = polylactide; c PEG = poly(ethylene)glycol
CONCLUSIONS
A specific, accurate, and precise isocratic reverse-phase HPLC-DAD method was described for
the determination of new TZD in polymeric nanocapsules formulations.
GARCIA, GM
ANEXOS
ACKNOWLEDGMENTS
This work was funded by Rede de Nanobiotecnologia-FAPEMIG and supported by the
scholarship to the first author from INCT-if (MCT-CNPq).
REFERENCES
[1] F.T. Uchôa, V.B. Cattani, M.C.A. Lima, S.L. Galdino, I.R. Pitta, T.C.T.D. Costa. Development
and application of lc-uv method for the quantification of the anti-inflammatory thiazolidinone
pg15 in rat plasma. J. Braz. Chem. Soc. 19 (2008) 1553-1559.
[2] H. Fessi, F. Pusieux, J.P. Devissaguet, N. Ammoury, S. Benita, Nanocapsule formation by
interfacial polymer deposition following solvent displacement, Int. J. Pharm. 55 (1989) R1–R4.
[3] V.C.F. Mosqueira, P. Legrand, G. Barrat, Surface-modified and conventional nanocapsules
as novel formulations for parenteral delivery of halofantrine, J. Nanosci. Nanotechnol. 6 (2006)
3193–3202.
[4] ICH Harmonised Tripartite guideline, International Conference on Harmonisation of
Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of
Analytical Procedures: Text and methodology Q29(R1), ICH Steering Committee, Geneva,
Switzerland, 2005, pp. 1–13.
23rd Internacional Symposium of Pharmaceutical & Biomedinal Analysis – João
Pessoa/PB
HPLC-DAD bioanalytical method to quantify nanocapsules with a new thiazolidine-2,4dione in mice plasma and application in pharmacokinetic study
a
a
b
c
Giani M. Garcia , Líliam T. Oliveira , Ivan R. Pitta , Dulcinéia S.P. Abdalla , Vanessa
a
C.F. Mosqueira
a-Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de
Ouro Preto, MG, Brazil
b–Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, PE, Brazil
c–Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, SP, Brazil
Keywords: thiazolidinones, HPLC-DAD, nanocapsules
INTRODUCTION
The clinical use of non-steroidal anti-inflammatory drugs is associated with significant toxicity
particularly in the gastrointestinal tract and kidney. Novel thiazolidinones (TZD) have been
synthesized and exhibited anti-inflammatory activity [1]. Nanoparticles are able to entrap
poor water soluble drugs, protected them from degradation and reduce side effects. A new
bioanalytical method for quantitative analysis of a new TZD in mice plasma and
pharmacokinetic (Pk) study was developed and validated using high-performance liquid
chromatography with diodes array detection (HPLC-DAD).
MATERIALS AND METHODS
All solvents used were HPLC grade and were purchased from Tedia (Brazil) and the new
TZD (GMG-7) was kindly given by Prof. Ivan Pitta. The polylactide NC formulations (PLANC) was prepared according to Fessi et al.[2]. The HPLC system employed consisted of a
Water Alliance 2695 separation module with DAD detection (Waters 2996), using a C18RP column (150mm×4.6mm) protected by a security guard C18 column (2mm×4.6mm,
3µm). The isocratic mobile phase is consisted of a mixture of methanol/water (90:10),
pumped 1ml/min. The analysis was performed at 35ºC, the volume injection was 20µl and
monitored at 385nm. Female Swiss mice received a single i.v. dose of free (1.55mg/kg)
and PLA-NC GMG-7 loaded (2.17mg/kg) for evaluation of Pk parameters. Internal
standard (IS) (Benznidazole® 5µg/ml) was added in plasma samples (90µl).
RESULTS AND DISCUSSION
It was evaluated selectivity (Fig.1), limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ),
linearity, recovery, stability, accuracy and precision, and all parameters were in accordance
with FDA guideline [3]. The linearity was over 0.1-10µg/ml, and the slopes, intercepts and
coefficients of were found to be 1 (a), 0 (b), 0.9998 (r2), respectively. The LOD was 50ng/ml
and the LOQ was 100ng/ml. The samples extractions were performed by protein
precipitation with acetonitrile and the recovery was 92% (GMG-7) and 96% (IS). While the
encapsulated drug does not demonstrated toxicity, the same dose of free drug was lethal.
The Pk study showed that NC were able to modified the plasmatic profile of GMG-7
(Fig.2).
158
GARCIA, GM
ANEXOS
AU
0,030
Fig.1 - Chromatogram of GMG-7 loaded
PLA-NC extracted from plasma.
IS
0,020
0,010
0,000
0,00
1,00
2,00
3,00
Minutes
4,00
5,00
6,00
Fig.2 - Plasmatic concentration profiles of
free and encapsulated GMG-7.
CONCLUSIONS
A new specific, accurate, and precise isocratic reverse-phase HPLC-DAD bioanalytical
method was described for the determination of new TZD in mice plasma and application in
Pk study.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was funded by Rede de Nanobiotecnologia-FAPEMIG and supported by the
scholarship to the first author from INCT-if (MCT-CNPq).
REFERENCES
[1] F.T. Uchôa, V.B. Cattani, M.C.A. Lima, S.L. Galdino, I.R. Pitta, T.C.T.D. Costa.
Development and application of lc-uv method for the quantification of the anti-inflammatory
thiazolidinone pg15 in rat plasma. J. Braz. Chem. Soc. 19 (2008) 1553-1559.
[2] H. Fessi, F. Pusieux, J.P. Devissaguet, N. Ammoury, S. Benita, Nanocapsule formation
by interfacial polymer deposition following solvent displacement, Int. J. Pharm. 55 (1989)
R1–R4.
[3]US Food and Drug Administration, Guidance for Industry, Bioanalytical Method
Validation, Centre for Drug Evaluation and Research (CDER), Rockville, 2001.
159