Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências Biomédicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas Katia Carneiro de Paula Estudo do papel da via maternal de Sog/Dpp sobre o gradiente morfogenético de Dorsal durante o desenvolvimento de Drosophila melanogaster Rio de Janeiro 2007 14 Livros Grátis http://www.livrosgratis.com.br Milhares de livros grátis para download. Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências Biomédicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas Katia Carneiro de Paula Estudo do papel da via maternal de Sog/Dpp sobre o gradiente morfogenético de Dorsal durante o desenvolvimento de Drosophila melanogaster Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Morfológicas, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas Orientadora: Dra. Helena Maria Marcolla Araujo Rio de Janeiro 2007 15 À memória de minha mãe 16 Agradecimentos Gostaria de agradecer não somente às pessoas com quem compartilhei estes anos, mas também aos momentos vividos. Quero agradecer de início à nossa orientadora, Helena Araujo por nunca se restringir ao seu papel de orientadora. Na verdade, Helena é uma mentora, pois todo o tempo estimula nossa autonomia científica, seja através da ajuda por palavras ou ações e até mesmo no seu silêncio. Talvez este último seja o principal para darmos os passos mais largos e significativos em nossas carreiras. Agradeço aos amigos e compaheiros do lab, por compartilharmos os momentos bons: os congressos, as festas das crianças, os almoços juntos....e também os momentos turbulentos desta jornada: fechamento de artigos, experimentos, moscas que morrem.......: Erika, Adriana, Marcio, Rodrigo e Eriquinha. Aos alunos de iniciação científica, que sempre me auxiliam nas tarefas em que preciso dispor de 3 pares de mãos, 3 cérebros etc (simultaneamente): Cinthia, Viviane. E claro, à Dulci, por cuidar da comida das nossas moscas e à Juliana por sempre ajudar. Agradeço ao PCM pelo incentivo, marcante neste período tão fundamental. À CAPES e à FAPERJ pela concessão das bolsas. Agradeço a minha família: meus três meninos. Primeiro ao menor e primeiro de todos: Marcus meu companheiro de sempre e pra sempre, ao segundo: Pedro, meu companheiro nos momentos mais difíceis que já havia vivido, ao terceiro: João Vitor por ter me dado a oportunidade de experimentar a verdadeira sensação de ser mãe, sem me preocupar com mais nada. Ao meu pai e a minha mãe: nunca poderia resumir em palavras nossa jornada. Mamãe: há muito tempo não tenho chamado por esta palavra, sinto saudades. Apesar de ser mais uma etapa de minha caminhada profissional, é a primeira sem a sua presença em minha vida..... A Deus, por nunca estar longe................................ 17 Resumo Carneiro de Paula. Estudo do papel da via maternal de Sog/Dpp sobre o gradiente morfogenético de Dorsal durante o desenvolvimento de Drosophila melanogaster. Rio de Janeiro, 2007. Dissertação (Doutorado em Ciências Morfológicas) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federaldo Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007. Durante diferentes momentos do desenvolvimento animal a restrição do potencial celular é orientada pelo surgimento de campos morfogenéticos. Esta restrição pode ser traduzida como uma expressão gênica diferencial que resulta de distintos limiares de expressão gênica que estão diretamente relacionados ao perfil da inclinação do gradiente do campo morfogenético. O estabelecimento dos territórios de expressão gênica em Drosophila é controlado pela translocação nuclear do homólogo do fator de transcrição Rel-like, Dorsal (Dl). Após a fertilização, as vias maternais de Toll e Dpp (decapentaplegic)/BMP4 convergem citoplasmaticamente sobre o homólogo de IkB, Cactus, e controlam sua degradação. Este evento é responsável por gerar um gradiente nuclear do morfógeno Dl no embrião, que ativa a expressão de genes responsivos a diferentes limiares de Dl. No presente trabalho demonstramos que a via maternal de Sog (Short gastrulation)/Dpp é capaz de padronizar o eixo dorso ventral do embrião de Drosophila pelo mecanismo de “delayed induction”. Durante a oogênese de Drosophila Sog e Dpp são sintetizados pelas células foliculares e transferidos ao espaço perivitelínico, onde permanecem até estágios precoces da embriogênese. A restrição da expressão de tolloid à região ventral do folículo ovariano potencialmente restringe a clivagem de Sog por Tolloid a esta região. Nós propomos que diferentes fragmentos de Sog tenham propriedades de difusão distintas: enquanto fragmentos N-terminais têm sua mobilidade reduzida e permanecem associados à região ventral, fragmentos C-terminais difundiriam dorsalmente contribuindo para gerar uma assimetria DV na atividade de Dpp. A atividade do Dpp maternal está presente em estágios precoces da embriogênese e influencia diretamente a inclinação do gradiente nuclear de Dl por uma via independente do sinal de Toll. Além desta análise, investigamos os mecanismos que poderiam estar envolvidos no controle da mobilidade de Sog. Como tem sido demonstrada a importância de proteoglicanos de heparan sulfato na regulação de outros morfógenos, investigamos o envolvimento destas moléculas na atividade de Sog. Identificamos vários loci gênicos que interagem com sog durante a oogênese e desenvolviemnto das asas e que codificam proteinas da via de síntese de proteoglicanos. Estas interações sugerem papéis relevantes destas moléculas sobre a atividade de Sog. Também obtivemos indicios de que a glicosilação de Sog possa modular sua atividade. Palavras-chave: short gastrulation (sog), decapentaplegic (dpp), oogênese, padronização DorsoVentral, Drosophila 18 Abstract Carneiro de Paula. Estudo do papel da via maternal de Sog/Dpp sobre o gradiente morfogenético de Dorsal durante o desenvolvimento de Drosophila melanogaster. Rio de Janeiro, 2007. Dissertação (Doutorado em Ciências Morfológicas) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federaldo Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007. During different moments throughout animal development, cell potential restriction is driven by the emergence of morphogenetic fields. This restriction can be translated as differential gene expression resulting from distintic thresholds for a morphogen and thus dependent on the shape of a morphogenetic field. The establishment of proper gene expression territories in Drosophila relies on regulating nuclear translocation of the NFkB/c-Re transcription factor, Dorsal (Dl). After fertilization, the maternal pathways Toll (Tl) and Dpp (Decapentaplegic)/BMP4 converge to control degradation of the cytoplasmatic IkB homologue protein Cactus. This event gives rise to a nuclear gradient of morphogenetic Dl protein in the embryo that in turn activates genes that are sensitive to different thresholds for Dl. In the present work, we have demonstrated that a maternal Sog (Short gastrulation)/Dpp pathway is able to pattern the Drosophila dorsal-ventral (DV) axis of the embryo by delayed induction. During Drosophila oogenesis Sog and Dpp are synthesized by follicle cells and delivered to the periviteline space, where they remain until early stages of embryogenesis. The restriction of tolloid expression to the ventral region of the egg chamber potentially restricts Sog cleavage to this region. We propose that different Sog fragments have distinct diffusion properties: while N-terminal fragments have reduced mobility and remain associated to the ventral region, C-terminal fragments diffuse dorsally contributing to generate a DV asymmetry in Dpp activity. Maternal Dpp activity is found in early stage embryos and is able to directly influence the slope of the Dl nuclear gradient independent of Toll signaling. In addition, we have investigated the mechanisms that would control Sog mobility. As it has been demonstrated that several morphogens are regulated by heparan sulfate proteoglycans, we have searched for interactions of the morphogen Sog with molecules involved in the synthesis of proteoglicans. We have detected several loci that interact with Sog during oogenesis and pupal wing development, suggesting they may be relevant to regulating Sog activity. Furthermore, in similar assays we suggest a potential role for Sog glycosilation on its activity. Keywords: short gastrulation (sog), decapentaplegic (dpp), oogenesis, DV patterning, Drosophila 19 Lista de Figuras Figura 1: Esquemas ilustrando a oogênese de Drosophila.............................................................15 Figura 2: Esquema ilustrando a ativação da via de Toll.................................................................18 Figura 3: Esquema da geração da informação posicional a apartir do sinal de Dl ao longo do eixo DV do embrião...............................................................................................................................20 Esquema 1: Esquema da proteína Sog............................................................................................26 Figura 4: Esquema da geração das células que darão origem ao disco imaginal da asa de Drosophila......................................................................................................................................28 Figura 5: Esquema das etapas de O-glicosilação e genes envolvidos identificados em Drosophila melanogaster..................................................................................................................................33 Figura 6: O bloqueio do sinal maternal de Dpp não afeta e expressão do gene pipe.....................51 Esquema 2: Esquema ilustrando o sistema UAS/Gal4 de expressão ectópica...........................................................................................................................................55 Figura 7: Oócito expressando a construção CY2>UAS-tld;UAS-dpp imunomarcadas com 8a....................................................................................................................................................59 Figura 8: Fenótipos de asa adulta observados no screening genético............................................66 Figura 9: Caracterização da presença de moléculas de PGHS durante o desenvolvimento da asa de Drosophila.................................................................................................................................71 Figura 10: Distribuição de moléculas de heparan sulfato na asa de Drosophila............................72 Figura 11: Caracterização da presença de proteoglicanos de heparan sulfato e de Sog durante a oogênese de Drosophila.................................................................................................................77 Figura 12: Sog é substrato de Fringe connection...........................................................................79 20 Lista de Tabelas Tabela 1: Tabela com os genes escolhidos para o screening.........................................................................................................................................63 Tabela 2: Penetrância do fenótipo de invasão no mesoderma associado a cada genótipo maternal..........................................................................................................................................75 21 Lista de Abreviaturas AP Ântero-Posterior BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate BMP Bone Morphogenetic Protein BSA Bovine Serum Albumin (Soro de Albumina Bovina) CR Domínio rico em cisteínas cols colaboradores Cv Crossveinless DAB 3,3’-Diaminobenzidine DIG Digoxigenina Dl proteína Dorsal DNA Ácido Desoxinucleico Dpp Proteína Decapentaplegic dpp gene decapentaplegic DV Dorso-Ventral ea gene easter EDTA Ethylenediamine-tetra-acetic acid EGF Epidermal Growth Factor (Fator de desenvolvimento da epiderme) EGFR Receptor transmembrana de EGF EGTA Ethylene Glycol-bis (beta-aminoethyl ether) N’-Tetra-acetic Acid fig. figura FLP Flipase (Recombinase sítio específica), oriundo de elevedura FRT Flipase Recombination Target (alvo de recombinação da Flipase) GAL4 Proteína regulatória (Fator de transcrição) oriundo de levedura gd gene gastrulation defective GFP Green Fluorescent Protein GAG Glicosaminoglicano Grk Proteína Gurken HRP Horseradish Peroxidase HS Heparan Sulfato IκB Inhibitory κB (família de inibidores de κB) 22 kD Kilodalton(s) LSM Laser Scan Microscopy M Molar NaN3 Azida sódica NBT Nitro Blue Tetrazolium Ndl Proteína Nudel ndl gene nudel NDST família de enzimas N-desacetilase/N-sulfotransferases NF-κB Nuclear Factor κB (Família de fatores nucleares κB) NGS Normal Goat Serum (Soro Normal de Cabra) NP40 Dertegente (também chamado de Igepal) PBS Phosphate-Buffered Saline (Tampão fosfato salino) PBT Tampão PBS com Tween-20 PDT/BSA Tampão PBS com deoxicolato de sódio, Triton-X100 e BSA PGHS Proteoglicanos de Heparan Sulfato pipe gene pipe PMSF PVDF Phenylmethanesulfonyl Polyvinylidene Fluoride RNA Ácido Ribonucleico RNAm RNA mensageiro Rpm Rotações por minuto scw gene screw shw gene shrew sna gene snail snk gene snake Sog Proteína Short Gastrulation sog gene short gastrulation Spz Proteína Spätzle SSC Saline Sodium Citrate (solução citrato de sódio salino) TGF-α Transforming Factor Growth alfa (Fator de desenvolvimento transformante alfa) 23 TGF-β Transforming Factor Growth beta (Fator de desenvolvimento transformante beta) TKV Receptor Thick veins tl gene toll tld gene tolloid Tld Proteína Tolloid Tris Tris (hydroxymethyl) aminoethane tsg gene twisted gastrulation Tsg Proteína Twisted gastrulation UAS Upstream Activation Sequence, oriundo de levedura wind gene windbeutel zen gene zerknullt 24 Sumário Introdução.......................................................................................................................................14 1. Oogênese de Drosophila............................................................................................................14 1.1.1 A via maternal de Toll e o estabelecimento do eixo dorso-ventral do embrião....................14 1.1.2 A via maternal de Dpp e o eixo DV do embrião...................................................................21 1.2. Modelo da ação antagônica entre Sog e Dpp durante o desenvolvimento embrionário de Drosophila.....................................................................................................................................23 1.3. A ação de Sog e Dpp durante a morfogênese da asa de Drosophila.......................................27 1.4. Proteoglicanos como moduladores da atividade dos morfógenos...........................................31 2. Ojetivos.......................................................................................................................................35 3. Materiais e Métodos...................................................................................................................37 3.1 Nomenclatura Genética............................................................................................................37 3.2 Cromossomos de Drosophila melanogaser..............................................................................37 3.3 Cromossomos balanceadores....................................................................................................38 3.4 Preparação do Meio de Cultura de Drosophila........................................................................39 3.4.1 Meio de cultura......................................................................................................................39 3.4.2 Meio de Uva para oviposição................................................................................................40 3.5 Imunofluorescência de folículos ovarianos e asas de pupa......................................................40 3.6 Criopreservação de oócitos e imunofluorescência...................................................................41 3.7 Detecção de Dpp no espaço perivitelínico................................................................................42 3.8 Hibridização in situ...................................................................................................................42 3.8.1 Síntese de sondas RNA antisenso..........................................................................................42 3.8.2 Fixação de embriões..............................................................................................................43 3.8.3 Reação de hibridização in situ...............................................................................................44 3.9 Linhagens de Drosphila melanogaster.....................................................................................44 3.10 Coleta de fêmeas virgens e cruzamentos de moscas..............................................................46 3.11 Dissecção de asa de pupa.......................................................................................................46 3.12 Imunofluorecência em asas da pupa de Drosophila...............................................................47 25 3.13 Preparação de extratos proteícos para eletroforese de proteína desnaturante ........................48 3.14 Western blotting.............................................................................................................……49 4. Resultados...................................................................................................................…............50 4.1 Análise do mecanismo de ação de Sog e Dpp maternais sobre a padronização do eixo DV embrionário.....................................................................................................................................50 4.1.1 A via maternal de Dpp não afeta o padrão de expressão de pipe..........................................50 4.1.2 Sog é sintetizado pelas células foliculares que recobrem o oócito e é transferido para o espaço perivitelínico.......................................................................................................................52 4.1.3 O Dpp exógeno sintetizado pelas células foliculares é transferido para o espaço perivitelínico...................................................................................................................................54 4.1.4 O sinal de Dpp maternal é transduzido pelo receptor Tkv e afeta regiões ventrais do embrião...........................................................................................................................................55 4.1.5 Diferentes fragmentos de Sog apresentam diferentes propriedades difusoras.........................................................................................................................................57 4.1.6 Tolloid é capaz de clivar Sog durante a oogênese.................................................................58 4.1.7 A expressão de ectópica de Dpp-GFP evidencia o gradiente de Sog....................................60 4.2 Avaliação da contribuição de moléculas de proteoglicanos e da glicosilação de Sog sobre sua atividade durante a morfogênese da asa e durante a oogênese.......................................................61 4.2.1 sog interage geneticamente com loci gênicos responsáveis por gerar moléculas importantes para a síntese de glicosaminoglicanos e glicoproteínas no modelo da asa de Drosophila.....................................................................................................................................64 4.2.2 Proteoglicanos de Heparan Sulfato estão presentes durante o desenvolvimento da asa de Drosophila.....................................................................................................................................70 4.2.3 A via maternal de Sog/Dpp interage geneticamente com loci gênicos responsáveis por gerar moléculas importantes para a síntese de glicosaminoglicanos e glicoproteínas no modelo da oogênese de Drosophila.................................................................................................................73 4.2.4 Proteoglicanos de Heparan Sulfato estão presentes durante a oogênese de Drosophila................................................................................................................................76 4.2.5 Sog é substrato de Fringe connection durante o desenvolvimento da asa de Drosophila......................................................................................................................................78 5. Discussão....................................................................................................................................81 26 5.1 Sog e Dpp atuam pelo mecanismo de “delayed induction” para padronizar o eixo DV do embrião de Drosophila...................................................................................................................81 5.2 Um novo nó para a rede de expressão gênica do eixo dorso-ventral de Drosophila...............83 5.3 Como gerar um gradiente morfogenético: o papel de proteoglicanos......................................85 5.4 A glicoproteína Sog..................................................................................................................89 5.5 A via maternal de Dpp como uma via digital...........................................................................92 6. Conclusões Finais.......................................................................................................................97 6. Referências Bibliográficas..........................................................................................................98 Anexo 1.........................................................................................................................................122 Anexo 2 ........................................................................................................................................123 27 1.Oogênese de Drosophila 1..1. 1 A via maternal de Toll e o estabelecimento do eixo dorso-ventral do embrião A padronização do eixo dorso-ventral do embrião de Drosophila tem início em estágios precoces do desenvolvimento, mesmo antes da fecundação, durante o processo de amadurecimento dos folículos ovarianos maternos (fig. 1A). O oócito de Drosophila surge a partir de um sincicio celular que é originado por quatro ciclos de divisões celulares incompletas a partir de uma única célula germinativa (fig.1A, a), originando um cisto com 16 células irmãs que compartilham o mesmo citoplasma (fig. 1A, b) e são recobertas por um epitélio de origem somática derivado das células foliculares (fig. 1A, c) (Telter, 1975; Deng and Lin, 2001). Apenas uma destas células se desenvolverá em oócito, enquanto que as outras 15 células darão origem às células nutridoras que proverão o oócito com nutrientes e componentes citoplasmáticos (Theurkaut, 1994). Os eixos Ântero-Posterior (AP) e Dorso-Ventral (DV) do futuro embrião são estabelecidos durante a oogênese em um evento que envolve dois passos consecutivos de sinalização celular abrangendo o oócito e as células somáticas (González-Reyes e St. Johnston, 1994; González-Reyes e cols., 1995; Roth e cols., 1995). Ambos os passos são mediados pelo produto do gene gurken (grk), uma molécula que pertence à família TGF-α e que é expressa pelo oócito, e por seu ligante, o homólogo em Drosophila do receptor de EGF que é expresso pelas células foliculares que circundam o oócito, mas é ativado nos níveis mais elevados somente nas células foliculares adjacentes ao núcleo do oócito. Primeiro, a ativação do receptor de EGF por Grk na região posterior induz o subgrupo de células foliculares que receberam o sinal a adquirirem um destino posterior 28 Estágio 6 Germarium Estágio 3 A Células Foliculares P células nutridoras a germarium células tronco b . células nutridoras oócito apêndices dorsais C A . a células foliculares oócito c P . oócito dorsal anteri células nutridoras oócito membrana plasmática B ventral D espaço perivitelínico posterior c ó grânulos polares Figura 1: Esquemas ilustrando a oogênese de Drosophila. Em A e B pode ser observado o ovaríolo, estrutura que compreende vários folículos ovarianos em diversos estágios de maturação. Cada folículo surge a partir de uma estrutura especializada chamada germarium (A), localizado na região anterior de um ovaríolo. O germarium é dividido em quatro regiões morfologicamente distintas ao longo de seu eixo ântero-posterior (A: 1, 2A, 2B, 3). Cada célula tronco geminativa (A,a) passa por divisões sucessivas produzindo um sincício celular originando um cisto com 16 células irmãs que compartilham o mesmo citoplasma (A,b). Apenas uma destas células (A, b em amarelo) se desenvolverá em oócito, enquanto que as outras 15 células darão origem às células nutridoras que proverão o oócito com nutrientes e componentes citoplasmáticos (A,c; B,a). Durante o estágio 8 a migração do núcleo do oócito estabelece a região ântero-dorsal do folículo (B, pontilhado vermelho), onde Gurken ativará os receptores EGF. Na região ventral (B, pontilhado verde) a ausência de Gurken assegurará a expressão de pip e tld somente nesta região. C- Esquema de um folículo no estágio 10 da oogênese. D- Esquema ilustrando um folículo tardio (estágio 14) com suas estruturas ântero-dorsais (os apêndices dorsais) e o espaço perivitelínico, delimitado pela membrana vitelínica e membrana plasmática do oócito. O folículo tardio é morfologicamente idêntico ao futuro embrião. 29 (González-Reyes e cols., 1995; Roth e cols., 1995). Durante o estágio 8, o citoesqueleto do oócito sofre modificações em sua polaridade, levando à migração do núcleo do oócito em direção à futura região anterior dorsal (Clark e cols., 1994; Lane and Kalderon, 1994; Micklem e cols., 1997). Assim, após a migração do núcleo do oócito, a presença do mRNA de grk caracterizará a região dorsal do oócito, onde a ativação do receptor de EGF por Grk nas células foliculares será reponsável por especificar o destino dorsal (González-Reyes e cols., 1995; Roth e cols., 1995). Assim, o sinal disparado por Grk é capaz de especificar tanto o destino posterior quanto o eixo dorso-ventral do epitélio folicular e, conseqüentemente, do embrião, a partir de um sinal originado no oócito. Durante o estagio 10, o sinal dorsal do receptor de EGF restringe a transcrição do gene pipe (pip) a uma zona que compreende 30-40% das células mais ventrais ao longo da circunferência da camada de células foliculares que recobrem o oócito (Sen e cols., 1998). O gene pip codifica uma enzima modificadora de glicosaminoglicanos residente do complexo de Golgi das células foliculares (Sen e cols., 1998). Pipe é crítica para localizar o sinal que especifica o destino ventral no embrião em desenvolvimento. Sua homologia às enzimas sulfotransferase de glicosaminoglicano (GAG), em vertebrados, sugere fortemente que estes polímeros desempenham um importante papel em modificar a atividade de fatores secretáveis, que direcionam o destino ventral do embrião (Roth, 1998). Por outro lado, a geração de clones de células foliculares ventrais mutantes para os loci sulfateless, sugarless e fringe connection (descritos como importantes para ageração de GAGs) não afetou o eixo DV do embrião. Além disso, a geração de embriões mutantes para estes loci mostrou que a atividade sulfotransferase de pipe é importante para a geração de estruturas do embrião mas o seu alvo não seria um GAG de heparan sulfato (Zhu e cols., 2005). Além da expressão ventralmente restrita de pip, outro importante evento envolvido na padronização do eixo DV do embrião é a ativação de genes, tanto no oócito quanto nas células 30 foliculares, que irão agir somente após a fecundação por um mecanismo denominado de “delayed induction”. Além de pip, os genes windbeutel (wind) e nudel (ndl) (fig. 2A) são expressos transientemente pelas células foliculares durante os estágios intermediários da oogênese (Ray and Schüpbach, 1996). Já os genes gastrulation defective (gd), snake (snk) e easter (ea) (fig. 2A) são expressos pelas células germinativas e codificam proteínas estruturalmente relacionadas à zimogêneos de proteases semelhantes à tripsina serina, que são ativadas por clivagem proteolítica (DeLotto and Spierer, 1986; Chasan and Anderson, 1989; Konrad e cols, 1998). Todos estes genes codificam proteases que parecem atuar seqüencialmente, possivelmente através de uma cascata, como observado para a cascata de coagulação sangüínea de vertebrados (Chasan e cols., 1992; Smith and DeLotto, 1994). Trabalhos utilizando modelagem tri-dimensional de complexos enzima-substrato têm confirmado a hipótese da ativação seqüencial de Gd-Snk-Ea (fig. 2A), descrita incialmente através de experimentos genéticos de epistasia (Rose e cols, 2003). Esta cascata proteásica é regulada por fatores positivos intrínsecos e loops de feedback negativo, assim como pelo inibidor de Ea chamado Serpina 27A (Hashimoto e cols., 2003; Ligoxygaxis e cols., 2003). O início desta cascata proteolítica é essencial para o processamento da proteína Spätzle em um fragmento proteolítico C-terminal (Morisato and Anderson, 1994; Schneider e cols., 1994), resultando em uma proteína ativa que se ligará a um receptor transmembrana distribuído uniformemente ao longo da membrana do oócito, denominado 31 A 2 3 1 7 4 8 5 6 9 B Sog 1 4 3 2 5 Figura 2: A- Esquema ilustrando a ativação da via de Toll. A região ventral do folículo ovariano (cinza claro) é especificada pelo gene pip, que é expresso pela células foliculares (1). Windbeutel é necessário para permitir a exportação de Pipe do retículo endoplasmático para o Complexo de Golgi (2). Slalom é uma enzima necessária para o transporte do doador de enxofre de alta energia PAPS para o Golgi (3), onde ele funciona como substrato para a reação de sulfutransferase característica de Pipe. Nudel, uma enzima autocatalítica (4), é responsável por ativar Gd (5). Gd ativa Snake (6), que então ativa Easter (7) para processar Spätzle (8) e gerar o ligante ativo de Toll (9). B- Esquema dos eventos que ocorrem “downstream” ao sinal de Toll. A ativação de Toll pelo fragmento ativo de Spätzel (1), transduz um sinal citoplasmático que culmina na fosforilação e degradação de Cactus (2), liberando Dorsal para translocar aos núcleos (3). Dpp maternal sinaliza pelo receptor TKV (4) e transduz u sinal citoplasmático que culmina no bloqueio da degradação de Cactus (5), retendo Dorsal no citoplasma celular. Sog, ao se ligar a Dpp, impede sua sinalização pelos receptores TKV. As duas vias de sinalização, Toll e Sog/Dpp maternal, convergem sobre Cactus, regulando de forma antagônica a translocação nuclear de Dorsal e o eixo DV do embrião. 32 Toll (Hashimoto e cols., 1991). A ligação de Spätzle a Toll dispara um sinal citoplasmático que culmina na degradação da proteína Cactus, que apresenta homólogia estrutural a IκBα de mamíferos (fig. 2A) (Whalen and Steward, 1993). Cactus é uma proteína citoplasmática que se liga a Dorsal (Dl), um fator de transcrição relacionado à família NFκB/c-rel, restringindo assim sua localização ao citoplasma (fig. 2B) (Whalen e Steward, 1993). Após a degradação de Cactus pelo sinal enviado por Toll, Dl é translocado para o núcleo celular onde se ligará a seqüencias específicas em regiões promotoras de genes alvo de sua ação e dará início à expressão de genes zigóticos (fig. 2B). A resultante da via maternal de Toll é a geração de um padrão preciso da translocação nuclear de Dl ao longo do eixo DV do embrião. Este perfil pode ser expresso graficamente (fig. 3B) e é responsável por gerar diferentes limiares de expressão gênica zigótica (fig. 3A,C). Estes limiares são definidos pelo número e/ou afinidade de sítios responsivos nos genes alvo de Dorsal e pelas quantidades de Dl nuclear presentes ao longo do eixo, promovendo a transcrição de genes que caracterizarão cada tecido embrionário (fig. 3A). Como a região ventral possui a maior relação de receptores Toll ligada a Spätzle, ela apresentará a maior concentração nuclear de Dl (Steward e cols. 1988; Roth e cols. 1989; Rushlow e cols. 1989). Genes responsivos a altos limiares da concentração nuclear de Dl serão expressos, enquanto que outros terão sua expressão reprimida. A ativação da transcrição dos genes twist (twi) e snail (sna) por Dl dará início à especificação do mesoderma a partir da região ventral (fig. 3A) (Simpson 1983; Thisse e cols. 1987). Nas regiões laterais do embrião existe um número menor de receptores Toll ativados, e como a translocação nuclear de Dl parece estar diretamente relacionada ao número absoluto de receptores Toll ativados (Anderson e cols., 1985; Huang e cols., 1997), 33 A [Dl] B Territórios embrionários C Figura 3: Esquema da geração da informação posicional a partir do sinal de Dl ao longo do eixo DV do embrião. Os núcleos mais ventrais (em verde escuro) possuem as maiores concentrações de Dl, necessárias para ativar a transcrição de twist e especificar o mesoderma. Os núcleos laterais (em amarelo) possuem quantidades menores de Dl nuclear, que são suficientes para a ativar a transcrição de sog e rhomboid, por exemplo, e especificar neuroectoderma ou ectoderma lateral. Os núcleos mais dorsais (em branco) possuem quantidades mínimas ou mesmo não apresentam Dl nuclear, possibilitando a ativação de genes como dpp, necessários para a especificação do ectoderma dorsal e aminoserosa. B- Gráfico mostrando a inclinação do gradiente de Dl nuclear observadas ao longo do eixo DV de um embrião selvagem. As maiores concentrações nucleares de Dl correspondem às células que darão origem ao mesoderma (verde), concentrações intermediárias correspondem às células que darão origem ectoderma lateral (azul) enquanto que baixas concentrações correspondem às células que darão origem ao ectoderma dorsal (vermelho). C- Embrião selvagem processado para hibridização in situ para detecção da expressão da RNA mensageiro de twist (azul), single minded (vermelho) e sog (verde). Imagens obtidas de http://www.biology.ucsd.edu/~davek/images/tripz.html. 34 menores níveis de Dl serão encontrados nestes núcleos, acarretando uma disponibilidade menor deste fator de transcrição. Assim, os genes que devem ser ligados por Dl para iniciar a diferenciação do ectoderma neurogênico devem ser mais sensíveis a concentrações baixas de Dl, diferente daqueles genes ativados na região ventral, onde a disponibilidade de Dl é maior (fig. 3A). A restrição lateral de genes neuroectodermais é subseqüentemente reprimida em regiões ventrais por genes zigóticos alvos de Dl, como snail (Bier e cols., 1990; Ip e cols., 1992; Jiang e Levine 1993). De forma contrária, Dl também orienta a diferenciação dos tecidos dorsais do embrião. Embora ele não esteja presente nos núcleos das células dorsais, Dl assegura a repressão de dpp (zigótico) e zen nas regiões ventrais e laterais, restringindo assim sua expressão para as regiões mais dorsais do embrião (fig. 3A), onde estes genes serão necessários para a especificação do ectoderma dorsal e da aminoserosa (Wakimoto e cols., 1984; Irish e cols., 1987). 1.1.2 A via maternal de Dpp e o eixo DV do embrião A geração deste perfil preciso da translocação nuclear de Dl é regulada conjuntamente pelo sinal da via de Short Gastrulation (Sog) e Decapentaplegic (Dpp) maternal (Araujo e Bier, 2000). Sog é uma proteína secretável com alto de grau de homologia à Cordina de vertebrados, que contém 4 domínios ricos em resíduos de cisteína denominados CR (esquema 1. François and Bier, 1995). Sog e Cordina apresentam os domínios CR com extensão de 60 a 80 aminoácidos, sendo o primeiro domínio, CR1, localizado na extremidade N-terminal e os CR2-4 localizados na região C-teminal. A análise da seqüência do DNA do gene dpp mostrou que ele é um membro da superfamília 35 TGFβ de fatores de crescimento (Padgett e cols., 1987). dpp é o membro da superfamília TGFβ mais relacionado à BMP 2/4, com 75% de identidade com a região C-terminal do fator de crescimento (Wozney, 1988; Gelbart, 1989). A via maternal de Sog/Dpp é responsável por transduzir um sinal citoplasmático que culmina no bloqueio da degradação de Cactus (fig. 2B), impedindo a translocação nuclear de Dl por uma via independente do sinal de Toll (fig. 2B) (Araujo e Bier, 2000). Durante a oogênese, sog é expresso por células foliculares que migram posteriormente sobre o oócito, tornando-se restrita às células foliculares anteriores durante o estágio 10, enquanto dpp é expresso pelas células foliculares anteriores que migram centripetamente (Araujo e Bier, 2000). Uma vez que o efeito resultante da alteração da via maternal de Sog/Dpp se dá ao longo da borda entre o mesoderma e neuroectoderma ao longo de todo o eixo ântero-posterior do embrião, o padrão de distribuição das proteínas Sog e Dpp deve, necessariamente, ser mais amplo que o padrão anterior detectado para sog e dpp (Araujo e Bier, 2000). Além disso, foi demonstrada a importância da atividade de Dpp para o posicionamento e padronização corretos de estruturas dorsais anteriores do córion, os apêndices dorsais e o opérculo (Araujo e Bier, 2000; Twombly e cols., 1996). Estes dados sugerem a existência de um mecanismo celular/molecular ainda não descrito responsável por modificar pós-transcricionalmente o padrão de expressão anterior de dpp, atuando sobre a mobilidade ou atividade da proteína Dpp, direcionando um acúmulo dorsal de seus efeitos. Outro importante aspecto a ser ressaltado no estudo do efeito dos genes maternais é o período temporal que envolve a programação da via de Toll (que ocorre durante a oogênese) e seu efeito sobre a geração do gradiente de Dorsal (que ocorre durante etapas precoces da embriogênese). É necessário que todos os mediadores da cascata proteolítica sintetizados durante 36 a oogênese permaneçam em uma forma estável no espaço perivitelínico, desde o final da oogênese até o início da embriogênese, momento no qual espera-se que exerçam seus papéis. Desta característica foi cunhado o termo “delayed induction”, como citado anteriormente. O efeito maternal de Dpp sobre o embrião foi demonstrado através de experimentos de epistasia e alteração nas doses maternais de sog e dpp, sendo somente sugerido que sua ação se dê através do mecanismo de “delayed induction” (Araujo e Bier, 2000). Outra hipótese para explicar a ação da via de Dpp maternal sobre o gradiente de Dorsal, seria sua regulação sobre a expressão de genes “upstream” a Toll, como pipe por exemplo. Portanto, existem ainda características intrínsecas à via maternal de Dpp importantes para definir claramente sua contribuição exata para a geração do gradiente nuclear de Dorsal. Dentre elas, testar se sua ação se dá através do mecanismo de “delayed induction” e caracterizar o mecanismo celular/molecular que seria responsável por gerar um gradiente de atividade de Dpp ao longo do eixo DV do folículo ovariano. 1.2 Modelo da ação antagônica entre Sog e Dpp durante o desenvolvimento embrionário de Drosophila Um dos mais bem estudados mecanismos de indução do destino celular em Drosophila é o mecanismo de indução do ectoderma dorsal, onde Sog e Dpp zigóticos desempenham importantes papéis. Durante a embriogênese, dpp é expresso inicialmente em um padrão que engloba cerca de 40% das células localizadas dorsalmente no blastoderma celular embrionário, e sua expressão é autônoma em relação aos outros genes expressos dorsalmente. Mutações em scw (screw), shw (shrew), sog, tld (tolloid), tsg (twisted gastrulation) e zen não afetam o início nem a manutenção 37 da expressão de dpp. Em contraste, a expressão de zen e tld depende da atividade de dpp (Ray e cols., 1991). Wharton e colaboradores (1993) mostraram que o produto de dpp é parte integral de um gradiente de atividade zigótico que especifica diferentemente o destino celular dentro do ectoderma dorsal. O requerimento de dpp é dependente da dosagem e existe um requerimento gradual pelo produto de dpp ao longo do eixo DV (Wharton e cols.,1993). Células que darão origem à aminoserosa, a região mais dorsal do embrião, são mais sensíveis a reduções nos níveis da atividade de dpp do que as células que darão origem à epiderme dorsal, a região logo abaixo da aminoserosa, e do que as células que darão origem à epiderme ventral (Wharton e cols., 1993). Uma vez que a expressão de dpp é uniforme na região dorsal do embrião e que as células que expressam dpp respondem diferentemente ao seu produto, o modelo de simples difusão postulado para a ação de um morfógeno não é suficiente para explicar o estabelecimento nem a manutenção do gradiente de atividade da proteína Dpp. Estudos vêm demonstrando que a atividade de Dpp pode ser modulada através da formação de um complexo proteico envolvendo a participação do produto dos genes sog, tld e tsg. O produto do gene sog (François e cols., 1994) é um componente chave para a formação deste complexo. A padronização da região dorsal do embrião também depende da função deste gene, uma vez que embriões nulos para sog não desenvolvem aminoserosa (Zusman e cols., 1988; Rushlow e cols., 1990; Ray e cols., 1991; Ferguson and Anderson, 1992). Na região lateral Sog inibe a difusão e a autoativação de Dpp, garantindo a formação do neuroectoderma (Biehs e cols., 1996; Bier, 1997; Yu e cols., 2000). Como Sog é produzido pelas células laterais que não expressam dpp, sua difusão a partir desta região será responsável por gerar um gradiente de concentração, de forma que as células da região mais dorsal entrarão em contato com as menores concentrações de Sog (Srinivasan e cols., 2002). Assim, é possível inferir um modelo onde um gradiente inverso seria gerado por Dpp, uma vez que sua difusão a partir da região dorsal 38 permitiria às células desta região entrar em contato com as maiores concentrações deste morfógeno. Assim, à medida que Sog difunde em direção à região dorsal, ele carrearia e estabeleceria um gradiente de atividade de Dpp, pois as regiões laterais teriam os menores níveis de Dpp livre para atuar em seus receptores, enquanto que os menores níveis de Sog na região dorsal permitiriam uma quantidade maior de Dpp livre, assegurando assim, a manutenção do pico de atividade necessária para a formação da aminoserosa (Zusman e cols., 1988; Ray e cols., 1991; Ferguson and Anderson, 1992; Fraçois e cols., 1994). A atividade de Dpp pode ser modulada positivamente por Tld, uma vez que cópias extras de dpp suprimem completamente mutações fracas de tld e aumentos na dosagem de tld não têm efeitos sobre fenótipos causados por alelos de perda parcial de função em dpp (Ferguson and Anderson, 1992). Esta modulação se dá através da formação de um complexo proteico entre Dpp e Tld e requer a atividade proteásica de Tld para funcionar (Finelli e cols., 1994). Neste modelo, Sog carrearia Dpp para a região dorsal, onde Sog seria clivado por Tld (Marqués e cols., 1997a; Yu e cols., 2000; Serpe e cols., 2005) liberando Dpp para ligar seus recptores. De fato, Tld é capaz de clivar Sog em sítios específicos gerando diferentes fragmentos com diferentes atividades sobre Dpp (Yu e cols, 2000 e 2004). Em Sog existem quatro sítios passíveis de clivagem por Tolloid (Marqués e cols., 1997b; Shimmi and O’Connor, 2003). Na presença de Dpp, Tld é capaz de clivar Sog em um sítio próximo ao CR1 (sítio I), em um sítio próximo ao CR2 (sítio III), em um outro sítio minoritário próximo ao CR2 (entre os sítios I e III) e outro sítio entre o CR3 e o CR4 (esquema 1). 39 CR1 CR2 8a CR3 CR4 8b Esquema 1: Esquema da proteína Sog. Em vermelho estão os domínios CR e as setas azuis indicam sítios de glicosilação. As cabeças de setas amarelas indicam os sítios de clivagem utilizados por Tld. As barras verdes indicam os epítopos proteicos utilizados pelos anticorpos 8a e 8b. Evidências genéticas e bioquímicas têm sugerido a participação de outra molécula na formação do complexo proteico envolvido na sinalização por Dpp. Além de Sog, Dpp e Tld, o produto do gene tsg também está envolvido na formação deste complexo (Oelgeschlager e cols., 2000; Chang e cols., 2001; Ross e cols., 2001; Scott e cols., 2001). Em Drosophila Tsg parece ser necessário para uma potente ligação de Sog a Dpp, de modo que a formação do complexo Sog/Tsg inibe significativamente mais a sinalização por Dpp do que Sog apenas (Ross e cols., 2001). Estudos in vitro demonstraram que na presença de Tld, Tsg teria a função de aumentar a taxa de clivagem de Sog por Tld na presença de Dpp, restringindo assim, a maior atividade de Tld à região mais dorsal (Shimmi and O´Connor, 2003). Tsg teria também a função de alterar o padrão de clivagem de Sog, estando envolvido na geração de um fragmento N-terminal de Sog que abrange a região que contém o CR1 e uma porção da região espaçadora, denominado Supersog (Yu e cols, 2000; Shimmi and O´Connor, 2003). Estudos utilizando o modelo de asa de Drosophila demonstraram que a geração da molécula de Supersog é temporalmente controlada e que ela tem uma ação inibitória mais ampla sobre BMPs do que a molécula de Sog completa (Yu e cols, 2000). Estes resultados sugerem que na ausência de Tsg, Sog seja clivado por Tld gerando uma molécula sem função biológica, ao passo que em sua presença, a clivagem de Sog geraria uma molécula biologicamente ativa, Supersog. 40 Assim, o modelo proposto atualmente para a padronização da região dorsal do embrião propõe que na ausência de Sog e Tsg, Dpp é impedido de difundir-se, pois ele se ligaria imediatamente aos receptores disponíveis. Na presença de Sog e Tsg, no entanto, Dpp é impedido de se ligar ao seu receptor podendo difundir-se livremente na região do domínio dorsal, até que Tld atue processando Sog e liberando Dpp, permitindo que Dpp ou seja recapturado por outro complexo Sog/Tsg ou que se ligue ao seu receptor em um sítio distante do seu sítio de síntese. Assim, Sog ao se difundir auxiliaria na redistribuição de Dpp, mantendo sua concentração elevada na região dorsal, e à medida que a concentração de Dpp é sempre maior na região mais dorsal, a taxa de clivagem de Sog aumenta liberando mais Dpp ativo nesta região (Shimmi and O´Connor, 2003). 1.3 A ação de Sog e Dpp durante a morfogênese da asa de Drosophila Assim como ocorre no embrião, diversos estudos indicam que Sog e outras moléculas extracelulares regulam a sinalização de BMP de forma particular durante o desenvolvimento da asa de Drosophila. A asa de Drosophila começa a ser formada a partir da delaminação de grupos de células originadas no neuroectoderma embrionário que dão origem a um grupo de células chamado de disco imaginal da asa (fig. 4A). A estrutura da asa adulta é caracterizada pela presença de cinco veias longitudinais, que correm paralelas 41 a ∗ b c ∗ B C a Posterior Anterior Dorsal Margem Ventral b superfície dorsal superfície ventral c Modificado de Developmental Biology 6a edição Modificado de Bier 2000 Curr.Opi.Gene.Dev. 10:393–398 Figura 4: A- Esquema da geração das células que darão origem ao disco imaginal da asa de Drosophila. A delaminação de grupos de células originadas no neuroectoderma embrionário (A, a asterisco) darão origem a um grupo de células chamado de disco imaginal da asa (A, b círculo vermelho; c asterisco). B e C- Esquema da formação das veias no disco imaginal da asa. Em B (a) mostra a monocamada de células do disco imaginal da asa durante o terceiro estágio larval. Formação das veias longitudinais (L1 a L5) e da região que originará as superfícies dorsal (azul) e ventral (vermelho) da futura asa. Em B (b) mostra a evaginação do disco da asa durante o início do período pré-pupal, levando à aposição das duas regiões (azul e vermelha) que originarão as superfícies dorsal e ventral da asa. C- A evaginação gera uma asa constituída por um epitélio bicamada formado pelas superfícies dorsal e ventral. B (c) mostra a asa adulta, que é formada pelas superfícies dorsal e ventral, veias longitudinais (L1 a L5), veias cruzadas e interveia. 42 ao eixo próximo-distal da asa (fig.4B). Entre as veias L3 e L4 existe a veia transversal anterior (VTA) e entre as veias longitudinais L4 e L5 existe a veia transversal posterior (VTP) (fig. 4B, c). As veias longitudinais surgem a partir de uma população específica de células do disco imaginal da asa durante o período larvar, enquanto que as veias transversais surgem nos estágios iniciais do período pupal (Conley e cols., 2000). A sinalização por BMP é importante em dois momentos distintos do desenvolvimento das veias. Durante o período larvar, sua participação, juntamente com moléculas da via de sinalização de EGFR e Notch (Sotillos e de Celis, 2005), é importante para posicionar cada veia longitudinal ao longo do eixo ântero-posterior da asa e sua expressão é restrita ao centro da margem deste eixo no disco imaginal, de onde difunde gerando um gradiente de concentração, como citado anteriormente. Durante este período no entanto, não há evidências da participação de Sog na modulação da atividade de Dpp (Shimmi e cols., 2005; Yu e cols., 1996). Após a entrada no período pupal, a expressão de dpp passa a ser restrita ao domínio das veias longitudinais (de Celis, 1997;Yu e cols., 1996), onde atua localmente para assegurar o destino de veia nestas células. Por isso, a perda da expressão de dpp na asa durante este período apresenta o fenótipo “shortvein”, diminuição do tamanho das veias longitudinais ou truncamento (de Celis, 1997; Posakony e cols., 1990; Ray and Wharton, 2001). Assim como ocorre no embrião e no disco imaginal da asa, no período pupal Dpp atua como um morfógeno, sendo capaz de difundir a partir do domínio das células das veias longitudinais para atuar na especificação das células das veias cruzadas, sendo o primeiro sinal na formação destas veias (Ralston and Blair, 2005). É importante ressaltar que durante a formação das veias, nos primeiros estágios pupais, sog e dpp são expressos segundo um padrão complementar, onde dpp é expresso 43 nos primórdios das veias e sog nas células da interveia adjacentes (Yu e cols., 1996). Este padrão permite a formação de veias retas e contínuas de tamanho e calibres definidos (Yu e cols., 1996). Como ocorre no embrião, Sog é necessário para a sinalização de Dpp além do seu sítio de provisão durante a formação das veias longitudinais e da veia transversal posterior. Durante a formação das veias longitudinais, Sog bloquearia a autoativação de Dpp, limitando sua atividade ao longo do eixo da veia (Yu e cols., 1996). Em relação à formação da veia cruzada posterior, foi mostrado que a perda do Sog endógeno interfere no sinal para sua formação, causando o fenótipo crossveinless, ou perda da veia transversal (Serpe e col., 2005; Shimmi e cols., 2005). Ao contrário do que foi descrito inicialmente, onde altos níveis de superexpressão de Sog foram associados à perda da veia transversal posterior (Yu e cols., 1996), níveis baixos de superexpressão de Sog (Shimmi e cols., 2005) bem como um fragmento de Sog contendo seu Nterminal (Yu e cols., 2004), foram capazes de estimular a sinalização de Dpp além do seu sítio de provisão. Assim como Dpp, Sog também é capaz de difundir a partir de seu sítio de provisão durante o período pupal, sugerindo fortemente um papel durante o transporte de Dpp, assim como ocorre no embrião (Shimmi e cols., 2005). O sinal para a formação da veia cruzada posterior também depende de um membro da família das metaloprotease, Tolloid-related (ou Tolkin) (Finelli e cols., 1994; Nguyen e cols., 1994; Serpe e cols.,2005) bem como de um membro da mesma família de TSG, Crossveinless 2 (Cv 2) (Shimmi e cols., 2005; Vilmos e cols., 2005). Tolloid-related é capaz de clivar Sog in vitro e sua perda está associada à perda da veia transversal posterior (Serpe e cols., 2005), indicando que a clivagem de Sog é importante para a sinalização de Dpp nesta região. Embora o excesso de Sog seja o responsável pelo transporte de Dpp, ele também impede sua ligação ao seu receptor, uma vez que o receptor de Dpp, Thick veins (Tkv), é expresso no domínio interveia (Ralston e Blair, 2005). Outro dado importante se 44 refere à cinética de clivagem de Sog por Tolloid-related. A presença do ligante, no caso Dpp, estimula a clivagem de Sog no complexo Sog-Dpp-Cv (Shimmi, e cols., 2005). Assim, o modelo atual para a padronização da veia transversal posterior consiste na formação do complexo SogDpp-Cv, que é importante para o transporte de Dpp a partir do domínio da veia para a região onde a veia transversal posterior se formará. Neste momento, Tld-related cliva Sog e Dpp é liberado do complexo para sinalizar na formação da veia transversal posterior. É interessante notar que as veias cruzadas são posicionadas em locais específicos da estrutura da asa, chamados de zonas competentes (Ralston e Blair, 2005). Nestas regiões existem fatores determinantes ainda não completamente caracterizados que asseguram o posicionamento correto das veias cruzadas. O papel de Sog neste modelo é importante somente para o início da formação da veia, mas não está envolvido no seu posicionamento ao longo do eixo próximodistal da asa (Ralston e Blair, 2005). 1.4 Proteoglicanos como moduladores da atividade dos morfógenos Tem sido demonstrado que o efeito dos morfógenos se dá em regiões distantes do seu sítio de síntese (Capdevila e Guerrero, 1994; Neumann e Cohen, 1997; Zecca e cols., 1995; Chen, and Struhl, 1996). Ao longo dos últimos anos, vários estudos sugeriram que proteoglicanos desempenham um papel chave no transporte e sinalização de morfógenos como FGF (Olwin e cols., 1992; Rapraeger e cols., 1991), Wingless (Wg)/Wints (Wnts) (Reichsman e cols., 1996), TGF-β (Lopez-Castillas e cols, 1993) e Hedgehog (Bellaiche e cols, 1998). No entanto, nenhum trabalho até o momento se propôs a estudar o envolvimento de proteoglicanos na regulação da atividade e mobilidade do morfógeno Sog. 45 Proteoglicanos são glicoproteínas cuja característica principal é a adição de polímeros de açúcar lineares modificados chamados glicosaminoglicanos (GAG). A glicosilação de proteínas tem início no citoplasma celular, onde as unidades sacarídicas (Ácido Glucorônico, Ácido Idurônico e N-Acetilglicosamina) são sintetizadas (fig.5). Estes açúcares são então transportados para o interior do retículo endoplasmático por uma família de transportadores de açúcares, (açúcar UDP transportador). A síntese de GAGs tem início a partir da adição inicial de uma ponte tetrasacarídica ao aminoácido serina do centro protéico. O primeiro elemento desta ponte é um resíduo de xilose, seguido por dois resíduos de galactose e o resíduo final de NAcetilglicosamina. Após a síntese desta ponte, unidades dissacarídicas formadas por NAcetilglicosamina e Ácido Glucorônico são adicionadas pela atividade de transferases específicas, alongando a cadeia sacarídica. Após a etapa da polimerização da cadeia de GAG, os resíduos de açúcar são modificados por N-desacetilação/N-sulfatação (remoção de grupos acetil do átomo de N do GlcNAc seguido pela adição de sulfato no mesmo átomo), epimerização (mudança na conformação do anel sacarídico) e O-sulfatação (adição de um grupo sulfato a um dos grupos hidroxila do anel sacarídico). Diferenças na composição destas unidades dissacrídicas definem os diferentes tipos de GAGs. O heparan sulfato (HS), abundante molécula presente na superfície celular e na matriz extracelular, em particular, consiste de unidades dissacarídicas compostas por ácido glucorônico (GlcA) e N-acetilglucosamina (GlcNAc) que sofrem Ndesacetilação/N-sulfatação e O-sulfatação. São exemplos de proteoglicanos de heparan sulfato (PGHS) o sindecan e o glipican, proteoglicanos de superfície celular (Bernfield e cols, 1999). A N-desacetilação/N-sulfatação do HS é catalizada por uma família de enzimas conhecida como N-desacetilase/N-sulfotransferases (NDST). Diferentes isoenzimas NDST com diferentes padrões de expressão foram isoladas de vertebrados (Fosberg e cols., 2001), 46 Ácido glucorônico (GlcA) Ácido Idurônico (IdoA) N-Acetilglicosamina (GlcNac) Xilose (Xil) Galactose (Gal) Enxofre Serina 2. Transportador de unidades sacarídicas fringe connection Centro Protéico 3. Xilose transferase Retículo Endoplasmático 4. Galactose transferase I 1. 5. Galactose transferase II citoplasma 6. Ácido Glucorônico transferase 8. N-desacetil/N-sulfotransferase- sulfatless 9. Epimerase 10. 2-O-Sulfotransferase - pipe 11. 6-O-sulfotransferase 12. 3-O-Sulfotransferase 7.Polimerase EXT tout velu Figura 5: Esquema das etapas de O-glicosilação e genes envolvidos identificados em Drosophila melanogaster (em itálico). A glicosilação de proteínas tem início no citoplasma, onde as unidades sacarídicas são sintetizadas (1). Em seguida, esta unidades são transportadas para o retículo endoplasmático (2) onde são transferidas para o centro protéico. A Xilose (3) é o primeiro sacarídeo a ser ligado ao resíduo de serina (3,vemelho). Em seguida são adicionados dois resíduos de galactose (4 e 5) e o resíduo final de ácido glucorônico (6). A etapa seguinte consiste na elongação do polímero de açúcar pela adição de unidades dissacarídicas modificadas. Cada unidade dissacarídica é passível de modificação por enzimas específicas, como ilustrado em 7,8,9,10,11 e 12. 47 enquanto que apenas uma isoenzima, codificada pelo gene sulfateless, foi descrita em Drosophila até o momento (Lin e cols., 1999). NDST é uma enzima crítica na biosíntese de heparan sulfato em vertebrados, trocando o acetil da N-acetilglicosamina por sulfato, tendo portanto, o potencial de afetar dramaticamente o estado de sulfatação do heparan sulfato. A sulfatação é a principal característica responsável pela grande diversidade estrutural típica dos GAGs dos proteglicanos bem como pela especificidade da interação entre estas moléculas e seus ligantes. Portanto, dentro deste contexto e com base na importância dos morfógenos Sog e Dpp durante várias etapas do desenvolvimento e, em particular, durante a oogênese nos propusemos inicialmente a verificar a possível existência de um gradiente de atividade de Dpp ao longo do eixo DV do folículo ovariano, que atuaria pelo mecanismo de “delayed induction” para regular a translocação nuclear de Dorsal. Propomos também estudar o envolvimento de proteoglicanos de heparan sulfato, além da importância da glicosilação de Sog para a regulação de sua mobilidade, através do estudo de sua atividade morfogenética em diferentes momentos do desenvolvimento de Drosophila melanogaster. 48 2. Ojetivos: 1) Analisar o mecanismo de ação de Sog e Dpp maternais sobre a padronização do eixo DV embrionário. 1.1 Analisar o padrão de distribuição da proteína Sog ao longo da maturação do folículo ovariano; 1.2 Verificar se Sog pode ser transferido das células foliculares para o espaço perivitelínico; 1.3 Analisar o padrão de distribuição de Sog e possíveis fragmentos no espaço perivitelínico; 1.4 Verificar se o Dpp sintetizado pelas células foliculares pode ser transferido para o espaço perivitelínico; 1.5 Analisar o padrão de distribuição do Dpp, sintetizado pelas células foliculares, no espaço perivitelínico. 2) Analisar se o efeito da via maternal de Dpp na translocação nuclear de Dl é transduzido pelo receptor Tkv. 2.1 Gerar, através de cruzamentos genéticos, embriões com a via de sinalização de Dpp bloqueada; 2.2 Avaliar por hibridização in situ as alterações ao longo do eixo DV geradas pelo bloqueio do sinal de Dpp durante a oogênese. 3) Avaliar a contribuição de moléculas de proteoglicanos e da glicosilação de Sog sobre sua atividade durante a oogênese e a morfogênese da asa 3.1 Testar geneticamente a interação entre Sog e moléculas que participam de diferentes etapas do processo de glicosilação no modelo de asa de Drosophila; 49 3.2 Testar geneticamente a interação entre a via maternal de Sog/Dpp e moléculas que participam de diferentes etapas do processo de glicosilação no modelo da oogênese de Drosophila; 3.3 Investigar a importância da glicosilação de Sog sobre sua atividade. 50 3. Materiais e Métodos 3.1 Nomenclatura Genética + indica alelo selvagem / separa cromossomos homólogos ; separa cromossomos não homólogos palavras em itálico indicam um gene (short gasrulation: sog) palavras com inicial maiúscula indicam proteína (decapentaplegic: Dpp) caracteres sobrescritos indicam o alelo de um gene X cromossomo X Y cromossomo Y F1 primeira geração resultante de um cruzamento 3.2 Cromossomos de Drosophila melanogaser A Drosophila melanogaster tem quatro pares de cromossomos. O cromossomo X ou cromossomo 1 está presente em duas doses nas fêmeas e uma dose nos machos. Os cromossomos 2 e 3 possuem dois braços denominados direito (R) e esquerdo (L) que são separados por um centrômero. O cromossomo 4 e o X têm os braços esquerdos bem maiores que os direitos. Os braços do cromossomo X, 2L, 2R, 3L e 3R têm tamanhos comparáveis entre si. No entanto, o cromossomo 4 tem somente 1/5 do tamanho dos demais. 51 X 2L 2R 3L 3R 4 Y 3.3 Cromossomos balanceadores Os cromossomos balanceadores são utilizados para manter os alelos mutantes dos cromossomos homólogos intactos durante um cruzamento genético ou no estoque. Esta importante função ocorre pela habilidade dos balanceadores em reduzir drasticamente a recombinação com os cromossomos homólogos. Primeiramente, a supressão de recombinações depende das múltiplas inversões que os balanceadores possuem em suas sequências. Além disto, como a maioria dos balanceadores são letais em homozigose, os cromossomos homólogos que também possuem alelos letais em homozigose permanecem balanceados em heterozigose (cromossoma com alelo mutante/cromossoma balanceador). Uma outra característica importante dos cromossomos balanceadores é que os indivíduos portadores do genótipo heterozigoto podem ser visualizados ou reconhecidos através de marcadores fenotípicos que são combinações de alelos mutantes dominantes ou recessivos. Existe uma grande variedade de marcadores para os vários braços de cromossomos cujas mutações afetam a cor ou a forma dos olhos, a forma das asas, a morfologia das veias das asas, cor e forma dos pêlos ou pigmentação da cutícula. As linhagens de moscas que carregam alelos mutantes em heterozigose com balanceadores marcados são facilmente visualizadas pelas alterações fenotípicas que possuem em várias partes do corpo. Desta forma é possível distinguir e selecionar as moscas com o genótipo 52 de interesse, seja pela presença ou ausência dos balanceadores. Outros detalhes sobre balanceadores podem ser encontrados em Lindsley e Zimm, 1992 ou na página Flybase da internet (Flybase stocks, http://flystocks.bio.indiana.edu/browse.htm). 3.4 Preparação do Meio de Cultura de Drosophila 3.4.1 Meio de cultura Componentes Volume Água destilada 4200 mL Melado 300 mL Ágar 44 g Fubá de milho 300 mL Fermento biológico seco 124 g p-hidroxibenzoato de metila 10% em Álcool etílico absoluto (Tegosept) 67 mL Ácido Propiônico 24 mL O melado foi dissolvido em água destilada, sob aquecimento, até obter uma mistura homogênea. O fubá foi adicionado misturando até dissolver e depois a levedura. Quando o meio estava prestes a ferver, adicionou-se o ágar sob agitação. O meio foi então fervido por 10 minutos. Após cozimento, o tegosept e o ácido propiônico foram adicionados. O meio foi distribuído em frascos/garrafas e tampados com algodão. Os frascos/garrafas foram armazenados a 4 ºC por uma semana. Adaptado de Ashburner, 1989. 53 3.4.2 Meio de Uva para oviposição Componentes Volume Água destilada 135,25 mL Suco de uva sem aditivos 88,75 mL Ágar 6,25 g Álcool etílico 95% 1,86 mL Ácido acético glacial 1,78 mL Água destilada para resfriar o meio 50 mL O ágar foi dissolvido em água destilada e suco de uva sob aquecimento. Adicionou-se o álcool etílico 95% e o ácido acético. O meio foi distribuido nas placas de coleta. O meio não usado e as placas de coleta com meio foram armazenados a 4 oC até o uso. Adaptado de Ashburner, 1989. 3.5 Imunofluorescência de folículos ovarianos e asas de pupa Os ovários foram dissecados e em seguida fixados em paraformaldeído 4% em PBS e heptano de 10 a 15 minutos. Foram lavados em PBS e foi utilizado NGS 5% para bloqueio de reações inespecíficas por 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida foram lavados em PBS e incubados com o anticorpo primário durante a noite a 4°C. No dia seguinte, foram lavados em PBS e incubados com o anticorpo secundário durante 2 horas à temperatura ambiente. Para a detecção de Sog foram utilizados dois anticorpos: anti-Sog 8a, que detecta um epítopo protéico próximo ao CR1, e o anticorpo anti-Sog 8b, que detecta um epítopo protéico próximo ao CR2, 54 ambos na diluição de 1:500. Para a detecção do sinal destes anticorpos foi utilizado o kit de amplificação de sinal com tiramida (TSA Fluorescence Systems, PerkinElmer). Para visualização dos núcleos dos oócitos foram utilizados os corantes TOPRO e DAPI. Para detecção de heparan sulfato em ovários e na asa foi utilizado o anticorpo anti-heparan sulfato (Seikagaku Corporation, mouse anti-heparan sulfato na diluição de 1:100). Os ovários e as asas foram montados sobre lâminas em glicerol 70% em água e analisados em microscópio confocal LSM 510 Zeiss e Apotome Zeiss. 3.6 Criopreservação de oócitos e imunofluorescência Os ovários foram dissecados e fixados em paraformaldeído 4% e heptano por 10 minutos e em seguida foram lavados em PBS/Triton, 0,3%/BSA 0,5% e incubados em PBT/Sacarose 0,5M por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida foram imersos em resina OCT e congelados em nitrogênio líquido. Os cortes de 8µm foram obtidos em criostato Leica CM 1850 e colocados sobre lâminas previamente gelatinizadas. Para a reação de imunocitoquímica, os cortes foram novamente fixados em paraformaldeído 4% em PBS por 5 minutos. Foram lavados em PBS e o bloqueio das reações inespecíficas foi feito com PBT/NGS 5% por 15 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos primários anti-Sog 8b (coelho, 1:500) e anti-actina (camundongo, 1:100) foram diluídos na solução de bloqueio e incubados por 90 minutos à temperatura ambiente. Em seguida os cortes foram lavados com PBT e incubados com os anticorpos secundários: anti-coelho conjugado à peroxidase (1:1000) e anti-camundongo Alexa 488 (1:200), por 30 minutos. A revelação do anticorpo anti-Sog 8b foi amplificada com o kit de 55 amplificação de sinal com tiramida (TSA Fluorescence Systems, PerkinElmer). Os cortes foram lavados, montados em glicerol e analisados no microscópio confocal LSM 510 Zeiss. 3.7 Detecção de Dpp no espaço perivitelínico Devido à escassez de anticorpos eficientes para a detecção do Dpp endógeno, utilizamos a técnica de expressão ectópica dirigida com a linhagem UAS-dpp-GFP (doada pelo Dr. GonzalezGaitan, Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Alemanha). Através da orientação do fator de transcrição GAL4 com o uso da linhagem CY2 obtivemos a expressão de Dpp exógeno pelas células foliculares que recobrem o oócito, podendo assim analisar o comportamento da molécula exógena para elaborar hipóteses para o comportamento da molécula endógena. Para a visualização do espaço perivitelínico neste experimento foi utilizada Phalloidina conjugada ao fluoróforo de 568nm (obtida da Molecular Probes) para evidenciar filamentos de actina. 3.8 Hibridização in situ 3.8.1 Síntese de sondas RNA antisenso Os vetores contendo a seqüência codante (cDNA) para os RNAm dos genes alvos foram utilizados para transformar bactérias competentes. As culturas bacterianas foram amplificadas em meio de cultura LB com 10 µg/mL de carbenicilina. Os plasmídeos foram então extraídos e purificados, com o kit de purificação de plasmídeo da Quiagen. Para sintetizar as sondas, o DNA 56 foi linearizado e o vetor foi digerido entre o final da sequência codante e do outro promotor, o qual não é utilizado para a síntese da sonda antisenso. A síntese da sonda de RNA antisenso e a hibridização in situ são realizadas conforme descrito em (O’Neill e Bier, 1994; Tautz e Pfeifle, 1989). A síntese das sondas de snail e vnd foi realizada com a RNA polimerase T3 ou T7 (Roche), respectivamente, a partir do vetor pBS SK+. A síntese foi realizada a 37oC por duas horas, utilizando na reação uma mistura de nucleotídeos com UTP ligado a digoxigenina (Roche) ou ligado a biotina (Roche), para sintetizar sondas marcadas com digoxigenina ou biotina, respectivamente. O RNA sintetizado foi hidrolizado em solução alcalina de tampão carbonato (Na2CO3 120 mM, NaHCO3 80 mM) a 65 0C por 20 minutos. A hidrólise é necessária para que sejam produzidos fragmentos de RNA marcado que penetrem com facilidade nos embriões fixados. A sonda de RNA foi precipitada e o pellet foi dissolvido na Solução de Hibridização e armazenado a – 20 ºC. 3.8.2 Fixação de embriões Os embriões foram decorionados em 50 % de água sanitária comercial por 3 minutos, e a seguir lavados em TXN 1X (0,04% Triton X-100 e 0,7% NaCl). A Solução de Fixação (1,5 mL de PBS 10 mM, 200 µL de EGTA 0,5 M, 250 µL de Formaldeído 37% e 2 mL de Heptano) foi adicionada e os embriões incubados em agitação vigorosa por 25 minutos. A fase aquosa foi removida e o álcool metílico absoluto adicionado, para remover o heptano. Os embriões em álcool metílico foram agitados vigorosamente 10 vezes para retirar a membrana vitelínica do embrião, lavados com álcool etílico absoluto e armazenados a –20 ºC até o uso. 57 3.8.3 Reação de hibridização in situ Para a incubação com a sonda os embriões foram fixados em solução contendo xilol 90% e etanol 10% durante 1 hora. Em seguida os embriões foram lavados com metanol e re-fixados em paraformaldeído 5% em PBT por 25 minutos. Foram lavados em PBT e incubados com proteinase K 10µg/ml durante 7 minutos. Foram lavados em PBT e fixados novamente em paraformaldeído 5% em PBT por 25 minutos. Em seguida foram lavados em PBT e préhibridizados com solução de hibridização (50% de Formamida, SSC 5x, 0,1 mg/mL de DNA de esperma de salmão, 0,05 mg/mL de heparina e 0,1% de Tween-20) durante 2 a 3 horas a 55°C. A sonda conjugada à digoxigenina foi então adicionada aos embriões e hibridizada durante 20 a 24 horas. No dia seguinte os embriões foram lavados em solução de hibridização durante 1 hora e em seguida lavados com PBT e re-fixados em paraformaldeído 5% em PBT , lavados e incubados com anticorpo anti-digoxigenina conjugado à fosfatase alcalina na diluição de 1: 1.500 durante 1 hora. Em segida foram lavados em PBT e APB e reagidos ao substrato da fosfatase alcalina, NBT/BCIP. A reação foi paralizada utilizando-se etanol e os embriões foram montados sobre lâminas com glicerol 70% em água. A reação foi analisada em microscópio Nikon Elcipse E600. 3. 9 Linhagens de Drosphila melanogaster Canton Special (CS): linhagem selvagem UAS-tld;UAS-tsg/CyO: linhagem com inserções de UAS-tsg e UAS-tld (Dr. O’Connor, Universidade de Minesota) UAS-dppGFP/CyO: linhagem contendo inserção de UAS-dpp fusionado com GFP (obtida do Dr. Gonzalez-Gaitan, Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Alemanha) 58 GAL4-CY2: linhagem que expressa o fator de transcrição Gal4 nas células foliculares que recobrem o oócito durante o estágio 10 da oogênese (obtida do Centro de estoques em Bloomington, Indiana) matαGal4-VP16: linhagem gal 4 utilizada para induzir a expressão ectópica de seqüências de construções sob o comando do promotor UAS durante os estágios iniciais da embriogênese. Tl[3]/TM3: linhagem que expressa um alelo ativado de Toll (obtida do estoque de Bloomington) ttv[00681b] / CyO; ry[506]: alelo perda de função do locus tout-velu notum[I6] / TM3, Sb[1]: alelo hipomórfico do lucus notum fringe connection[00073] / TM3, SB[1] : alelo perda de função do locus fringe connection slalom[EY02631] : linhagem gerada por inserção de elemento P dally[06464]: alelo hipomórfico, amorfo, perda de função do locus dally dally-like[00308]: linhagem gerada por inserção de elemento P dally-like[PL00325]: linhagem gerada por inserção de elemento P dally-like[PL00424]: linhagem gerada por inserção de elemento P syndecan [10608]: alelo letal recessivo do locus syndecan sulfateless[03844]: linhagem gerada por inserção de elemento P sugarless[08310]: alelo de perda de função Tld 68-62 FRT82B Sb / TM6 β: Linhagem que carrega o alelo mutante de tolloid recombinado com a sequência FRT, localizada no braço direito do cromossomo 3. Gal-e22c,UAS-FLP / CyO; FRT82B ubi-GFP.nls: Linhagem que expressa GAL4, FLP; FRTGFP nos precursores das células foliculares. A construção de GFP (Green Fluorescente Protein) é 59 expressa ubiquitariamente e possui um sinal de localização nuclear. A sequência FRT está localizada no braço direito do cromossomo 3. Linhagem do laboratório. 3.10 Coleta de fêmeas virgens e cruzamentos de moscas As fêmeas virgens foram coletadas em até 6 horas após a eclosão das pupas. As fêmeas foram cruzadas com machos numa proporção de três fêmeas para um macho. Após 5 dias, as moscas parentais foram transferidas para um novo frasco/garrafa, com o objetivo de obter uma prole numerosa. Os cruzamentos foram realizados a 25oC, e os fenótipos adultos são analisados após 9-12 dias. A coleta das pupas ocorre entre 24 a 30 horas após a formação do período pupário (APF). As moscas foram adormecidas em placas com CO2. 3.11 Dissecção de asa de pupa As pupas foram cuidadosamente retiradas das garrafas com uma espátula e colocadas em cima de papel de filtro umedecido com PBS 10 mMol, dentro de uma placa de cultura. As pupas com as idades desejadas foram selecionadas. Um corte transversal foi feito na altura da cabeça e na região final do corpo das pupas, cujos tóraxes foram então transferidos para uma placa de petri com PBS 10 mMol. Em seguida, um pequeno fluxo de PBS foi injetado e ejetado com pipeta pasteur dentro das pupas, para retirar toda a massa de tecidos, permanecendo apenas a cutícula envolvendo o tórax. Após este processo, com o auxílio de uma pinça, o tórax foi retirado de dentro das cascas e colocado num eppendorf com solução fixadora, por um período de 10 minutos. 60 Passado o tempo de fixação, segue a etapa de dissecção das asas em placa de Petri com PBS 10 mM. Esta etapa consiste em retirar apenas a cutícula que envolve cada asa. Este processo requer uma pinça extremamente fina e muito cuidado para manter as asas sem a cutícula, porém ligadas ao tórax. A remoção da cutícula é fundamental para que anticorpos ou sondas tenham acesso às células do tecido da asa. 3.12 Imunofluorecência em asas da pupa de Drosophila O protocolo para a imunohistoquímica tem como referência Araujo e colaboradores, 2003. No primeiro passo as pupas foram dissecadas em placa de Petri com PBS (NaCl 0,13 Mol, Na2HPO4.7H2O 0,007 Mol e NaH2PO4 0,003 Mol) 10 mMol, retirando o tórax com as asas envolvidas pela cutícula e colocando-os em meio de fixação (paraformaldeído 5 % - M/Vol - em PBS 10 mMol, por 1h à temperatura ambiente - TA). No caso de imunofluorescência para antiSog 8a, fixa-se por 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, seguem-se várias lavagens com PBS e coloca-se o tórax com as asas numa placa de Petri com PBS, para retirar as cutículas que envolvem as asas. Depois da dissecção, segue-se a etapa de bloqueio de inespecificidade antigênica mergulhando-se as asas dissecadas em solução PBS acrescida de 5% (Vol/Vol) de soro normal de cabra (NGS), por 1h à temperaura ambiente. Após o bloqueio, lava-se com PBS por 30min e incuba-se com anticorpo primário diluído em PBS, por uma noite a 4oC. No dia seguinte, lava-se com PBS por 30min e incuba-se com anticorpo secundário diluído em PBS, por 2 h / temperatura ambiente. Após algumas lavagens com PBS, as asas foram separadas do tórax e montadas em solução de glicerol (70 % Vol/Vol). 61 Nas imunomarcações com anti-Sog, após a incubação com anticorpo secundário conjugado a HRP (horseradish peroxidase), utilizamos o Kit 13 de amplificação de sinal com Alexa fluor 546 tiramida (Molecular Probes), que é preparado da seguinte forma: Em 200 µL do tampão de amplificação (componente E do fabricante) adicionou-se 1µl de solução peróxido de hidrogênio 30% (H2O2) (componente F). Adicionou-se 1µL desta solução em 100µL de tampão de amplificação (componente E), formando uma solução com 0,0015% de peróxido de hidrogênio (solução de amplificação/H2O2). Colocou-se 1µL de tiramida (estoque) em 100 µL de solução de amplificação/H2O2. Adicionou-se a solução de tiramida ao tórax com asas e por 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, lavou-se com PBS durante pelo menos 24h. As asas foram montadas em glicerol 70% em água e analisadas ao microscópio confocal Multiphoton LSM 510 Meta. 3.13 Preparação de extratos proteícos para eletroforese de proteína desnaturante As asas foram dissecadas como citado anteriormente e transferidas para tubo de 1,5 mL contendo 200 µL tampão de lise gelado (20 mM Tris 8,1, 150 mM de NaCl, 1mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, 0,5% NP40 e 0,02% NaN3) com o coquetel de inibidor de proteases Complete (Roche) e 100mM PMSF (inibidor de proteases). Aproximadamente 40 asas foram maceradas no tampão no gelo, com auxílio de um pistão. Após a maceração foi adicionado o tampão de amostra (SB 1x: 50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 0,1% Bromophenol e 10% glicerol) e 100 mM DTT. As amostras foram incubadas a 100 oC por 8 minutos e centrifugadas, para descartar os restos celulares. O pellet foi descartado e o sobrenadante condicionado a –20 °C, até o uso. 62 3.14 Western blotting As amostras previamente preparadas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS 10% no tampão de corrida (25 mM Tris, 250mM glicina e 0,1% SDS) com corrente constante de 30 mA. As amostras separadas no gel foram transferidas para membrana de PVDF (Millipore) em voltagem constante de 80 V, com o tampão de transferência (25 mM Tris, 250mM glicina, 0,1% SDS e 20% de metanol). Após a transferência, a membrana foi lavada em PBT 1x e depois incubada em BSA 1,5% para bloquear ligações inespecíficas. A membrana foi incubada com anticorpo primário policlonal, feito em camundongo, anti-Sog8a (1:500 - cedidos pelo Dr. Ethan Bier), por uma noite a 4 °C. Em seguida, a membrana foi incubada por 1 hora com o anticorpo, feito em cabra, anti-camundongo conjugado a peroxidase (Vector). Os complexos imunes foram visualizados utilizando um sistema de quimioluminescência da Pierce (SuperSignal West Pico). A revelação foi realizada em um sistema de revelação da Kodak, utilizando filme KODAK X-OMART AR para a detecção da quimioluminescência. 63 4. Resultados 4.1 Análise do mecanismo de ação de Sog e Dpp maternais sobre a padronização do eixo DV embrionário 4.1.1 A via maternal de Dpp não afeta o padrão de expressão de pipe Ao consideramos o efeito que a via maternal de Dpp tem sobre o eixo DV do embrião, é importante eslarecer o relacionamento hierárquico entre esta via e a via de Toll. Dpp poderia estar afetando o gradiente nuclear de Dl, indiretamente, através da alteração da expressão de pipe? Este gene é responsável por restringir à região ventral do folículo ovariano a cascata proteolítica que culmina na ativação do sinal de Toll e na translocação nuclear de Dorsal. Para esclarecer esta questão foram gerados folículos ovarianos que apresentavam o sinal de Dpp aumentado ou bloqueado, e analisado o padrão de expressão do gene pipe. Nestes casos foram gerados os seguintes genótipos maternais: CY2-GAL4 / pipe-LacZ; tkv[DN]/+, para bloquear o sinal maternal de Dpp, e CY2-GAL4 / pipe-LacZ;tkv[DA], para aumentar o sinal de Dpp. Ao contrário da forma dominante negativa, onde o sinal endógeno é impedido de ser transduzido, a forma dominante ativada do receptor Tkv simula a ativação da via de Dpp em todas as células em que a GAL4 for expressa, neste caso, de forma mais abrangente que o sinal endógeno. Quando o sinal maternal de Dpp foi bloqueado, não fomos capazes de detectar nehuma alteração na expressão do gene pipe (fig. 6A). Este resultado é corroborado por resultados recentes de Shravage e colaboradores 64 A pipelacz;tkv[DN] B pipelacz;tkv[A] C pipelacz;tkv[A] Figura 6: O bloqueio do sinal maternal de Dpp não afeta a expressão do gene pipe. AImunodetecção da construção repórter pipe-lacZ mostrando que o bloqueio do sinal de Dpp durante a oogênese através da construção UAS-tkv[DN] não afeta a expressão de pipe, que continua restrita à região ventral do folículo ovariano (setas). B- A superativação do sinal de Dpp através da construção UAS-tkv[A] altera a expressão selvagem de pipe (setas brancas), que passa a ser expresso nas regiões dorsais do folículo ovariano (seta preta). C- Plano focal superficial da imagem B. 65 (2007), onde clones de células foliculares nulas para o transdutor da via de Dpp, Medea, também não alteram a expressão de pipe. No entanto, ao induzirmos a expressão da forma ativada, fomos capazes de observar a expressão de pipe tanto pelas células foliculares ventrais quanto dorsais (fig.6B,C). Este resultado já havia sido descrito para a forma ativada de Tkv (Yakoby e cols, 2005). No entanto, ele não condiz com o bloqueio do receptor endógeno e, portanto pode ser explicado como um efeito da ativação de elementos responsivos a Smads mas que não tem significado fisiológico. Como a condição onde bloqueamos o sinal de Dpp se assemelha mais a uma condição fisiológica, concluímos que a expresão maternal de dpp pelas células foliculares não altera o eixo DV embrionário por um efeito indireto sobre a expressão de pipe. 4.1.2 Sog é sintetizado pelas células foliculares que recobrem o oócito e é transferido para o espaço perivitelínico Dpp maternal atua por uma via independente do sinal de Toll. Entretanto, assim como a via de Toll, Sog e Dpp poderiam atuar pelo mecanismo de “delayed induction”? Como demonstrado por Araujo e Bier (2000), o padrão de expressão do mRNA de sog maternal tem início durante o estágio 8 da oogênese e é restrito às células foliculares anteriores, enquanto que mRNA de dpp maternal é expresso a partir do estágio 10b pelas células foliculares anteriores que migram centripetamente (Twombly e cols., 1996; Araujo e Bier, 2000). Como o efeito desta via de sinalização se dá ao longo do eixo DV do embrião como um todo, é previsto que os padrões de expressão de ambas as proteínas sejam mais amplos que os padrões detectados pela hibridização in situ. 66 Assim, analisamos através de técnicas de imunofluorescência o padrão da distribuição temporal do Sog endógeno nas células foliculares, e avaliamos se a proteína Sog gerada durante a oogênese poderia atuar de forma retardada durante estágios precoces da embriogênese. Para isso utilizamos dois tipos de anticorpos: o anti Sog 8a, que reconhece uma região imediatamente após o domínio CR1 e parte da região espaçadora (Yu e cols., 2000), podendo portanto, reconhecer a molécula de Sog inteira e fragmentos que contenham o CR1; e o anti 8b que reconhece o domínio CR2 (Srinivasan, dados não publicados), identificando assim, tanto a molécula de Sog inteira quanto fragmentos que contenham o CR2, mas não identifica fragmentos contendo apenas o CR1. A detecção dos anticorpos 8a e 8b por imunofluorescência demonstrou que Sog é de fato sintetizado pelas células foliculares que recobrem o oócito desde estágios precoces da oogênese (Anexo 1, fig. 1A) e durante o estágio 10 (Anexo 1, fig.1B,C). Após a síntese, Sog é tranferido para o espaço perivitelínico (Anexo 1, fig.1D,E,F), podendo ser encontrado neste compartimento extracelular até estágios tardios da oogênese (Anexo 1, fig. 1G,H,I). Demonstramos também que a distribuição de Sog no espaço perivitelínico é uniforme. No entanto, no estágio 10B, quando sog passa a ser expresso em células foliculares ventro-anteriores (Araujo e Bier, 2000), observamos a existência de assimetria em relação à distribuição dos diferentes epítopos reconhecidos pelos anticorpos 8a e 8b dentro de espaço perivitelínico ou no interior das células foliculares (Anexo 1, fig1B, C). O anticorpo 8a revelou a existência de uma marcação mais intensa na região ventral anterior do oócito (Anexo 1, fig 1C,seta), que não foi detectada com o anticorpo 8b (Anexo 1, fig. 1B). 67 4.1.3 O Dpp exógeno sintetizado pelas células foliculares é transferido para o espaço perivitelínico Assim como Sog, Dpp também poderia ser transferido para o espaço perivitelínico e aí permanecer até estágios precoces da embriogênese para atuar pelo mecanismo de “delayed induction”? Devido à ausência de anticorpos eficazes para a detecção de Dpp, analisamos o padrão de distribuição do Dpp exógeno expresso pelas células foliculares através da expressão da construção UAS-dpp-GFP dirigida pela GAL4 CY2. Através desta técnica de expressão ectópica, o Dpp exógeno pôde ser expresso em sítios específicos do oócito pelas células foliculares (Anexo 1, fig. 3A) e detectado através da fluorescência associada ao GFP. Assim como esperado para o Dpp endógeno, o Dpp exógeno foi transferido para o espaço perivitelínico (Anexo 1, fig. 3G cabeça de seta, H, I), onde foi capaz de difundir por um espaço limitado a partir do seu sítio de provisão (Anexo 1, fig. 3A, cabeça de seta). É importante notar que a difusão do Dpp exógeno é limitada, uma vez que ele não é capaz de antingir a região posterior do oócito quando sintetizado por células foliculares anteriores (Anexo 1, fig. 3A seta) . Assim como Sog, Dpp-GFP também permanece no espaço perivitelínico até estágios tardios da oogênese (Anexo 1, fig. 3 D,E,F), sendo possível detectar sua presença nos estágios iniciais da embriogênese (Anexo 1, fig. 3J). Estes resultados em conjunto sustentam a hipótese da ação de Sog e Dpp pelo mecanismo de “delayed induction”. 68 4.1.4 O sinal de Dpp maternal é transduzido pelo receptor Tkv e afeta regiões ventrais do embrião Como demonstrado, a via maternal de Dpp atua independentemente da via de Toll para regular a translocação nuclear de Dorsal. No entanto, ela depende do sinal de Toll, indiretamente modificando-o. Para demonstrar que Dpp transduz seu sinal através do receptor Tkv presente na membrana do embrião, e que seu efeito é completamente distinto e independente do sinal de Dpp zigótico, geramos linhagens de Drosophila contendo alelos mutantes que alteram a via de sinalização de Toll. Sobre este background genético, bloqueamos o sinal de Dpp maternal no embrião através da expressão ectópica da forma dominante negativa do receptor de Dpp, Tkv. A expressão da construção tkv[DN] na linhagem germinativa foi obtida utilizando o sistema de expressão dirigida UAS/GAL4 esquematizada abaixo, fazendo com que receptores maternais na membrana plasmática do embrião fossem bloqueados (Brand e Perrimon, 1993). Esquema 2: Esquema ilustrando o sistema UAS/Gal4 de expressão ectópica. Neste sistema, a sequência UAS (Upstrean Activation Sequence) e Gal4 (fator de transcrição) são elementos de regulação da expressão gênica característicos de levedura, inseridos no genoma de Drosophila através de técnicas de transgênese animal. O fator de transcrição Gal4 se liga à sequência UAS e ativa a expressão do gene alvo sob controle desta sequência. A expressão de Gal4 depende do local de inserção no genoma de D. melanogaster. Por exemplo, se a inserção de GAL4 situar-se próxima de um enhancer de expressão tecido-específica, a expressão desta Gal4 responderá a este enhancer, ou seja, terá uma expressão tecido-específica. Deste modo, as construções são expressas no mesmo padrão de expressão da inserção de Gal4. 69 O gradiente nuclear de Dl é responsável por gerar todos os limiares de expressão gênica necessários para especificar cada território ao longo do eixo DV do embrião. Como citado na introdução, cada território de expressão gênica é dependente de concentrções específicas de Dorsal nuclear. Quando a dose de dpp maternal foi acrescida, seu efeito pôde ser observado pela expansão de territórios dorsais em detrimento de territórios ventrais, nas regiões ântero-ventrais do embrião (Araujo e Bier, 2000), apresentando, portanto uma atividade dorsalizante. É necessário, porém, verificar se este efeito é completamente distinto e independente do efeito dorsalizante do Dpp zigótico, que atua especificamente sobre estruturas dorsais do embrião. Na presença do alelo Tl[3] a expressão de dpp zigótico está ausente, restando apenas uma marcação nas regiões terminais do embrião (Anexo 1, fig. 4G, setas). Nestes embriões, o domínio de vnd se encontra expandido dorsalmente na forma de um anel anterior que circunda completamente o embrião (Anexo 1, fig.4G, asterisco), sendo observada também uma redução no domínio mesodermal (Anexo 1, fig. 4H). Quando a via maternal de Dpp foi bloqueada nestes embriões, foi possível observar a expansão do domínio de vnd (Anexo 1, fig. 4I), ou a expansão ventral de vnd acompanhada pela perda da expressão de sna no mesoderma (Anexo 1, fig. 4J). Uma vez que não foi possível detectar a presença da expressão de dpp zigótico na região dorsal, os fenótipos obtidos a partir de matαGal4>tkv[DN] podem ser atribuídos ao efeito maternal de dpp. Estes resultados indicam que o sinal de Dpp maternal é transduzido pelo receptor Tkv e gera uma alteração no gradiente nuclear de Dl, traduzida pela alteração no tamanho dos territórios de expressão gência ao longo do eixo DV do embrião, afetando especificamente, a região ventral. 70 4.1.5 Diferentes fragmentos de Sog apresentam diferentes propriedades difusoras A geração de um gradiente de atividade de Sog no espaço perivitelínico poderia estar envolvida na regulação da ativação de Tkv pelo Dpp presente no espaço perivitelínico? Como demonstrado in vitro e in vivo, a geração de fragmentos de Sog pela metaloprotease Tld é de extrema importância para a modulação da atividade de BMPs (Shimmi e O’Connor, 2003; Araujo e cols, 2003; Serpe e cols, 2005). A expressão de tld restrita à região ventral do folículo ovariano indica que a geração de fragmentos de Sog esteja restrita à esta região (Carneiro e cols., 2006). Além disto, a análise do córion de embriões, originados a partir de folículos com grupos de células foliculares que não expressavam sog, mostrou que Sog apresenta diferentes atividades sobre Dpp dependendo da localização destes grupos celulares sog- (Carneiro e cols., 2006). Estes dados sugerem que diferentes fragmentos de Sog possam ter diferentes propriedades difusoras, o que seria importante para a geração de um gradiente de Sog. Portanto, diferentes fragmentos de Sog estariam presentes durante a oogênese? Para investigar esta possibilidade, estudamos o padrão de distribuição dos epítopos reconhecidos pelos anticorpos 8a e 8b nas vizinhanças de grupos de células foliculares que não expressavam sog. Fomos capazes de detectar a presença da marcação associada ao 8b em mais de 8 células além da última célula que expressava sog, tanto em regiões ventrais (Anexo 1, fig. 6E, seta) quanto dorsais (Anexo 1, fig. 6D, cabeça de seta) do folículo ovariano. Em contraste, fragmentos de Sog reconhecidos pelo anticorpo 8a foram detectados no espaço perivitelínico associado às células que não expressavam Sog, somente na região dorsal do folículo ovariano (Anexo 1, fig. 6F). 71 Na região ventral, fragmentos reconhecidos pelo 8a permaneceram associados às células que expressavam sog, não difundindo em direção à região de células que não expressavam sog (Anexo 1, fig. 6G, seta). Estes dados indicam que fragmentos que contém o CR1 possuam uma capacidade de difusão reduzida, permanecendo associados à região ventral do folículo ovariano, enquanto que fragmentos contendo o CR2 difundiriam dorsalmente gerando um gradiente de Sog. 4.1.6 Tolloid é capaz de clivar Sog durante a oogênese Com base no comportamento diferencial de epítopos reconhecidos pelos dois anticorpos, nos perguntamos se fragmentos de Sog poderiam ser gerados a partir da ação de Tolloid durante a oogênese. Para verificar esta possibilidade, primeiramente induzimos a expressão de ectópica da forma ativada da metaloprotease relacionada à família BMP1, Tolloid, utilizando o sistema GAL4/UAS ( CY2>UAS-tld). Dado que a taxa de clivagem de Sog por Tolloid é dependente da concentração de Dpp, expressamos simultaneamente tld e dpp. Assumindo que toda célula expressando dpp expressaria também tld, nos é possível visualizar concomitantemente as células que expressaram UAS-tld e UAS-dpp-GFP (fig.7A,C,D,F em verde) e células imunoreativas para o anti-Sog 8a (fig.7B,C,E,F em vermelho). Em cortes ópticos superficiais obtidos por microscopia confocal, foi possível observar que a região que contém a menor quantidade de células expressando UAS-tld/UAS-dpp (fig.7A) apresenta a maior intensidade de marcação para o 8a (fig. 7B), indicando que a degradação de Sog está sendo acelerada ou aumentada pela presença de Dpp e Tld exógenos. Outro corte óptico mais medial do mesmo oócito 72 A Dpp,Tld C E F Sog 8a D Dpp,Tld B Sog 8a Figura 7: Oócito expressando as construções CY2>UAS-tld;UAS-dpp, imunomarcadas com 8a. As figuras A,B,C mostram um corte óptico em plano focal superior de oócito no estágio 10. A linha tracejada indica a região posterior do oócito que possui a menor quantidade de células expressando UAS-tld e UAS-dpp (A) e a maior quantidade de células imunoreativas para o 8a (B). As figuras D,E,F mostram o mesmo oócito em plano focal medial. O espaço perivitelínico da região posterior (E,linha tracejada) apresenta marcação para o 8a e não possui células expressando tld e dpp exógenos (D, linha tracejada). A imagem C é a superposição das imagens A e B e a imagem F é a superposição das imagens D e E. 73 mostra que a distribuição de Sog no espaço perivitelínico também é alterada: apenas na região que não apresenta células expressando UAS-tld/UAS-dpp (fig.7D) é possível detectar Sog no espaço perivitelínico (fig.7E). Para melhor estudar o efeito de Tolloid sobre a geração de um possivel gradiente de Sog, analisamos a distribuição de Sog nas vizinhanças de grupos de células foliculares que não expressam tld. Enquanto que a distribuiçao uniforme de Sog detectada pelo 8b não foi afetada pela ausência de tld (Anexo 1, fig. 6H, seta), a distribuiçao detectada pelo 8a foi alterada nas proximidades de grupos de células ventrais tld-, mostrando-se menos intensa (Anexo 1, fig. 6I, seta; J, seta). Em contraste, nas proximidades de grupos celulares dorsais tld- não houve alteração da marcação associada ao 8a (Anexo 1, fig. I, cabeça de seta). Estes dados corroboram a hipótese de que a mobilidade de fragmentos que contém o CR1 seja diminuída na região ventral do folículo. 4.1.7 A expressão de ectópica de Dpp-GFP evidencia o gradiente de Sog Dada a capacidade de Sog ligar BMPs, a expressão ectópica de Dpp-GFP poderia alterar a distribuição dos fragmentos de Sog? De fato, esta hipótese é corroborada pelo fato de que a expressão ectópica de Dpp-GFP gerada pela GAL4 CY2 resulta no acúmulo de Dpp-GFP na região dorsal (Anexo 1, fig. 6L), acompanhada do aumento da intensidade de fluorescência associada ao 8b (Anexo 1, fig. 6K, seta). Este resultado sugere que fragmentos contendo o CR2 difundam dorsalmente carreando Dpp-GFP e contribuindo para a geração de um gradiente de atividade (Anexo 1, fig. 6N, seta). 74 Interessantemente, quando o anticorpo 8a foi utilizado, a marcação mostrou-se mais intensa na região ventral (Anexo 1, fig. 6N seta, O,P). Considerando-se que a expressão de DppGFP foi induzida de maneira uniforme ao longo do eixo DV, estes resultados, em conjunto, sugerem a existência de uma assimetria em relação à distribuição de diferentes fragmentos de Sog, que seria apenas exacerbada pela expressão ectópica de Dpp. Baseados em análises clonais descritas em Carneiro e colaboradores (2006), estes resultados foram interpretados como uma evidência da diminuição da mobilidade de fragmentos que não têm o CR2. Este tipo de fragmento permaneceria associado à região ventral do folículo enquanto que fragmentos contendo o CR2 difundiriam dorsalmente se concentrando nesta região. 4.2 Avaliação da contribuição de moléculas de proteoglicanos e da glicosilação de Sog sobre sua atividade durante a morfogênese da asa e durante a oogênese Como descrito na introdução, moléculas de PGHS têm sido mostradas como moduladores da atividade e difusão de morfógenos. Diante disso, nosso interesse se voltou para a investigação do possível envolvimento de PGHS na regulação da atividade/mobilidade de Sog. Para testar a hipótese da interação entre Sog e PGHS elaboramos como estratégia um screening genético direcionado utilizando o modelo da asa de Drosophila. Este modelo é um importante sensor para o estudo da via de sinalização de BMPs pois, além dos fenótipos de venação da asa adulta serem de fácil visualização, a observação de uma estrutura adulta como a asa permite a rápida identificação de genes que interagem. O desenho do nosso screening consiste na utilização de uma linhagem de Drosophila com um background genético de superexpressão do gene em estudo com outra linhagem que expressa um alelo nulo ou hipomórfico do gene a ser testado (Yu e cols., 1996; Araujo e cols., 2003). 75 Neste caso, realizamos cruzamentos entre uma linhagem transgênica que superexpressa sog (sogEP7 ) no domínio da veia e linhagens de mutantes que expressam prudutos não funcionais dos loci gênicos tout-velou, division abnormally delayed (dally), notum, sugarless, sulfatless, fringe connection, dally-like, syndecan e slalom. Estes genes foram selecionados por codificarem moléculas importantes em etapas distintas da geração de GAGs ou glicoproteínas (fringe connection), como detalhado na tabela 1 ( em Materiais e Métodos). A análise do screening é baseada no grau de alteração do fenótipo da asa entre as moscas controle (sogEP/+) e as moscas testadas (sogEP /+; alelo testado). A expressão ectópica de sog no domínio da veia da asa resulta no truncamento (diminuição) das veias longitudinais e/ou transversais devido à inibição do sinal de BMP durante os estágios pupais (Yu e cols., 1996). Moscas sogEP7 apresentam truncamento das veias L4 e L5, veia L2 não linear e material ectópico perto da L2 (fig.8A). Portanto, ao identificarmos um padrão de venação diferente do “background” sogEP7 teremos identificado um possível gene de interação. Decidimos também estudar as possíveis modificações que Fringe connection poderia gerar no padrão de glicosilação de Sog, pois já foi anteriormente demonstrado que Sog é glicosilado in vitro (Marqués e cols., 1997) e que há sítios potenciais de glicosilação ao longo da molécula (ver discussão). Além disso, o locus fringe connection codifica um transportador de açúcar UDP, responsável por transportar uma ampla gama de açúcares UDP que podem ser potencialmente utilizados para a síntese de diversos glicanos, incluindo açúcares N-ligados, GAGs e mucinas (Goto e cols., 2001; Selva e cols., 2001). 76 Locus Função gênico tout (ttv) Homólogo Série alélica Interação com sogEP7 Vertebrado Perda função velour Heparan sulfato EXT 1 co-polimerase EXT 2 +++ division abnormallty delayed (dally) Proteoglicano Glipicano de superfície celular sulfateless (sfl) Modificações em moléculas de heparan sulfato N-desacetil Nsulfotransferase -------------- Participação na bissíntese de glicosaminoglican os UDP-glicose desidrogenase Perda função sugarless (sgl) notum Regulação de morfógenos que ligam proteoglicanos de heparan sulfato Hipomórfico N N α/β-hidrolase, pectina acetiltransferase Hipomórfico +++ Regulação do sinal dos morfógenos Wingless e Notch transportador de UDP slallom Sulfatação Transportador de adenosina 3`fosfato 5`fosfosulfato Elemento P proteoglicano de heparan sulfato de superfície celular recessivo letal Glipicano Elemento-P dally like Extensão axonal Extensão axonal, regulação do sinal de Dpp, Wg de N fringe connection (frc) syndecan de Perda função de ++ ++++ N N Tabela 1: Esta tabela resume os genes utilizados no screening, os alelos escolhidos, a função conhecida de cada produto gênico e o tipo de interação com sogEP7. ttv, notum, frc, e sll interagiram com sog dimunindo o efeito de sua superexpressão, enquanto que sgl, sfl, dally, dally-like e syndecan não alteraram o fenótipo do background sogEP7. +, ++ e +++ se referem à expressividade crescente do fenótipo sogEP7 e N se refere a ausência de interação. 77 Inesperadamente, apesar de sua função ser primariamente associada à geração de diferentes tipos de glicanos, estudos utilizando alelos de perda de função de frc revelaram que sua atividade é seletivamente requerida para a glicosilação de Notch e não para a geração de GAGs (Goto e cols., 2001; Selva e cols., 2001). Moscas homozigotas frc00073/frc00073 morrem em estágios tardios da pupa, não havendo portanto, moscas homozigotas para este alelo na população. Por isso, foi gerada uma linhagem frc00073 sobre o cromossomo balanceador TM6c, Sb, Tb. Esta estratégia nos permite selecionar, ainda na pupa, os indivíduos homozigotos para o alelo 00073 pois o alelo dominante Tb, que é um marcador do cromossomo balanceador, nos permite diferenciar os indivíduos pelo fenótipo gerado na pupa (casulos mais curtos). Indivíduos heterozigotos apresentarão a pupa menor do que os indivíduos homozigotos. Assim, foi possível coletar asas de indivíduos homozigotos para análise do perfil eletroforético de Sog e seus fragmentos e avaliar o tipo de modificação que a ausência da atividade de Fringe connection gera neste perfil. Avaliamos também o padrão de venação da asas em indivíduos homozigotos frc00073/frc00073 pois este padrão é um forte indicativo da alteração na atividade biológica de Sog na ausência de Fringe connection. 4.2.1 sog interage geneticamente com loci gênicos responsáveis por gerar moléculas importantes para a síntese de glicosaminoglicanos e glicoproteínas no modelo da asa de Drosophila Como descrito na tabela 1, identificamos 4 genes potencialmente importantes para a atividade/mobilidade de Sog nos epitélios da asa da pupa: ttv, notum, sll e fgc. Por outro lado, sfl, sgl e dally, dally-like e syndecam foram considerados como não interatores com sog. O critério inicial para a seleção dos genes candidatos foi a alteração do background sogEP7, através da 78 supressão ou acentuação do truncamento de L4 e L5 bem como o surgimento de veias ectópicas (fig.8A), o que indica uma supressão do fenótipo de sogEP7. O locus ttv pertence a uma família de genes homólogos aos EXT de vertebrados, também envolvida na biossíntese de GAGs, tem sido estudado em grandes detalhes. A família de genes de Drosophila homólogos a EXT em vertebrados é composta por três membros: tout-velu (ttv), sister of tout velu (sotv) e brother of tout velu (botv). EXT1, EXT2 e EXT3 humanas codificam copolimerases de heparan sulfato que catalisam a adição seqüencial do ácido glucorônico e Nacetilglicosamina às cadeias polissacarídicas em extensão (como ilustrado na figura 5 etapa 7) (Lind e cols., 1998; McCornick e cols., 1998). A análise de mutantes para ttv tem mostrado que este gene afeta seletivamente o movimento e a resposta celular de Hh e Dpp, tanto no disco imaginal da asa quanto no embrião de Drosophila, alterando sua distribuição ao longo do epitélio em desenvolvimento. ttv também desempenha diferentes papéis na sinalização de Wg (Bellaiche e Perrimon, 1998; The e cols., 1999; Han e cols., 2004). Moscas sogEP7;ttv apresentaram veias ectópicas entre L2 e L3 associadas à perda do truncamento de L4 e L5 79 B A L1 L2 L3 VTA VTP L4 * L5 * sogEP7 C D * * * sogEP7;ttv * EP7 sog sog ;sll E * F * * sogEP7;frc * sogEP7;notum Figura 8: Fenótipos de asa adulta observados no screening genético para loci que interagem com sogEP. A- Asa selvagem apresentando as veias longitudinais L1, L2, L3, L4 e L5 e as veias transversais anterior (VTA) e posterior (VTP). B) asa adulta exemplificando o fenótipo do background sogEP7 , com truncamento de L4 e L5 (asterisco), L2 tortuosa (seta) e material ectópico entre L2/ L3 e L4/L5 (cabeças de seta). Asas heterozigotas sogEP7;ttv apresentaram aumento do material ectópico entre L2 e L3 (C, cabeças de seta) e perda do truncamento de L4 e L5 (C, asterisco). Asas heterozigotas sogEP7; sll apresentaram uma série de fenótipos que atingem a padronização da veia transversal posterior (D, seta preta), aumento do material ectópico entre L2 e L3 (D, cabeça de seta), perda do truncamento de L4 e L5 (D, asterisco), além de uma veia transversal cruzada anterior ectópica (D, seta vermelha). Asas heterozigotas sogEP7;frc apresentaram aumento de material ectópico entre L2 e L3 (E, cabeça de seta) e perda de truncamento de L4 e L5 (E, asterisco). Asas heterozigotas sogEP7; notum apresentaram um fenótipo onde foi possível identificar aumento de material ectópico entre L2 e L3 (F, cabeça de seta) associado à perda do truncamento de L4 e L5 (F, asterisco) bem como fortes efeitos sobre a padronização da veia transversal posterior (F, seta), 80 (fig.8C), indicando um fenótipo de supressão da atividade de Sog como será discutido posteriormente. Em vertebrados, a sulfatação de todas as macromoléculas necessita de uma via secretória que ocorre no complexo de Golgi e requer a adenosina 3`-fosfato 5`-fosfosulfato, um doador de sulfato de alta energia. Em 2003, Lüders e colaboradores, a partir de estudos em Drosophila, clonaram o primeiro gene a codificar uma proteína transmembrana necessária para o transporte da adenosina 3`-fosfato 5`-fosfosulfato do citosol para o lúmem do complexo de Golgi. Neste trabalho, foi demonstrado que mutações neste gene, chamado slalom (sll), resultavam em problemas nas vias de sinalização de Wg e Hh, sugerindo ausência de sulfatação dos GAGs por sfl. Além disto, a análise de ovários com grupos de células foliculares que não expressavam sll demonstrou que a função de sll é essencial para a formação do eixo DV do embrião, sugerindo que sll transporta o doador de sulfato necessário para a atividade sulfotransferase de pip. Além de sll, outro gene chamado dPAPST2 foi recentemente clonado apresentando característricas similares (Goda e cols., 2006). Moscas sogEP7;sll apresentaram alterações na padronização da VTP (fig.8D seta), acréscimo de uma veia transversal anterior (fig.8D, seta vermelha) bem como veias ectópicas entre L2 e L3 (fig.8D, cabeça de seta) associadas à perda do truncamento de L4 e L5 (fig.8D, asterisco), representando o fenótipo mais acentuado obtido neste screening. Este resultado aponta para uma supressão do fenótipo da superexpressão de Sog na ausência de moléculas sulfatadas. O locus fgc codifica um transportador de açúcar UDP, responsável por transportar uma ampla gama de açúcares UDP que podem ser potencialmente utilizados para a síntese de diversos glicanos, incluindo açúcares N-ligados, GAGs e mucinas, como citado anteriormente (Goto e cols., 2001; Selva e cols., 2001). Moscas sogEP7;fgc apresentaram aumento de material ectópico 81 entre L2 e L3 associado à perda de truncamento de L4 e L5 (fig.8E). Novamente, este locus provocou uma diminuição do fenótipo de superexpressão de Sog. O locus notum codifica uma proteína secretável que pertence à superfamília α/βhidrolase, similar à pectina acetiltransferase (Giraldez e cols., 2002). Moscas sogEP7;notum apresentaram um fenótipo onde foi possível detectar aumento de material ectópico entre L2 e L3 (fig.8F, cabeça de seta), perda da truncamento de L4 e L5 (fig.8F, asterisco) e também alterações na padronização da veia transversal posterior (fig.8F, seta). Assim como ttv, frc e sll, notum também apresentou um fenótipo de supressão da superexpressão de Sog, indicando que glipicanos de superfície celular poderiam atuar na regulação da mobilidade/atividade de Sog. Para testar esta hipótese, utilizamos o locus division abnormally delayed (dally), que codifica um glipicano e que foi o primeiro gene que afeta etapas distintas da biossíntese de GAGs a ser estudado (Nakato e cols., 1995). Moscas sogEP7;dally e sogEP7;dally-like, no entanto, não apresentaram fenótipo diferente do background sogEP7. Estes dados corroboram os resultados obtidos por Araujo e cols. (2003), onde também não foi detectada interação genética entre Sog e Dally. É importante ressaltar que o alelo dally-like utilizado no screening foi gerado por inserção de elemento P e a série alélica a qual pertence ainda não foi estudada em detalhes. Isto não permite, portanto, concluir com exatidão se a ausência de interação em nosso modelo de screening representa de fato um dado real. Para solucionar esta dúvida, é necessária a utilização de alelos nulos do locus dally-like. Syndecan é um PGHS transmembrana que tem sido mostrado estar envolvido na migração neuronal durante a embriogênese de Drosophila (Spring e cols., 1994) e foi mostrado interagir com Dally-like (Rawson e cols., 2005). Dado que Syndecan foi mostrado ter um papel chave na ligação entre hemócitos e laminina α3/5 cadeia LG4-5 em Drosophila (Narita e cols., 82 2004) e que laminina interage geneticamente com sog (Araujo e cols., 2003), seria extremamente interessante testar a interação entre sog e syndecan. Em nosso screening, no entanto, não foi detectado nehum tipo de alteração significativa em relação ao fenótipo de venação do background sogEP7 quando utilizamos o alelo 10608 de syndecan. sulfateless (sfl) é um gene que codifica uma proteína relacionada à N-desacetil Nsulfotransferase (NDST, figura 5 etapa 8) e tem sido mostrado de grande importância para a sinalização de Wg, do receptor de FGF (Fibroblast Growth Factor) e Hh (The e cols., 1999; Lin e cols., 1999). Moscas sogEP7;sfl não apresentaram fenótipo diferente do background sogEP7. sugarless (sgl), que codifica uma proteína relacionada à uridina difosfoglicose (UDP) desidrogenase de vertebrados, é uma enzima necessária para a síntese de UDP glucoronato a partir da UDP glicose (Häcker e cols., 1997; Haerry e cols., 1997; Binari e cols., 1997). Mutações em sgl comprometem, portanto, a biosíntese de condroitina e heparan sulafato. Assim como dally e sfl, sgl também não alterou o background de superexpressão de sog. Evidências de nossos estudos a partir destes testes sugerem que os proteoglicanos modificados dependentes da ação dos produtos dos loci dos genes ttv, sll e notum podem ser importantes para a atividade biológica de Sog. Outro aspecto importante a ser considerado é o estudo do papel da glicosilação de Sog sobre sua atividade biológica, uma vez que frc, uma enzima envolvida na geração de glicoproteínas N-ligadas, parece ser importante para atividade biológica de Sog. No entanto, o padrão de expressão bem como a caracterização bioquímica dos resíduos de açúcar adicionados a Sog, além de sua possível interação com PGHS, não foram explorados até o momento. 83 4.2.2 Proteoglicanos de Heparan Sulfato estão presentes durante o desenvolvimento da asa de Drosophila Dado que detectamos interações de sog com loci envolvidos na síntese de PGHS na asa, tornava-se fundamental caracterizar o padrão de distribuição de moléculas de heparan sulfato durante o desenvolvimento da asa. Inicialmente, utilizamos a imunomarcação em asas da pupa com anticorpo específico contra heparan sulfato. Os PGHS apresentaram, assim como Sog, um padrão de distribuição extremamente dinâmico durante o desenvolvimento da asa de Drosophila. Durante os estágios iniciais do desenvolvimento da asa da pupa (20 a 24 horas após a entrada no período pupal) PGHS são sintetizados pelas células do domínio interveia (fig.9A), apresentando uma distribuição pericelular/extracelular como esperado para estas moléculas (fig.9B, em vermelho). No período de 24 a 26 horas, PGHS são sintetizados pelas células da interveia (fig.9G, em vermelho) e também pelas células do domínio proveia (fig.9G, amarelo). Após 30 horas, PGHS voltam a ser expressos somente pelas células da interveia (fig.9B, quadrado branco) no mesmo padrão pericelular/extracelular observado em estágios precoces (fig.9D) e intermediários (fig.9G). Este mesmo comportamento foi descrito para Sog durante estes períodos (Araujo e cols, 2003), indicando que os PGHS podem ser elementos chave para a mobilidade de Sog a partir do domínio interveia para o domínio proveia. Analisamos também a distribuição dos PGHS ao longo da superfície DV do epitélio da asa, uma vez que foi demonstrado que somente na superfície dorsal Sog é capaz de 84 Figura 9: Caracterização da presença de moléculas de PGHS durante o desenvolvimento da asa de Drosophila. PGHS apresentam um localização extremamente dinâmica durante o desenvolvimento da asa. PGHS são distribuídos pelas células da interveia desde estágios precoces da asa de pupa (asa de 20 a 24 horas, A), apresentando um padrão de distribuição pericelular e extracelular, como esperado para PGHS (B, em vermelho). No estágio de 24 a 26 horas (E), momento no qual Sog invade o domínio proveia, PGHS são distribuídos por células da interveia (G, em vermelho) bem como por células do domínio proveia, invadindo completamente este domínio durante este estágio (F, quadrado e G, amarelo). Após este período (mais de 30 horas) PGHS voltam a ser distribuídos somente por células da interveia (C,quadrado branco), apresentando o mesmo padrão de distribuição pericelular/extracelular (D, vermelho) observado em asas jovens (B, vermelho). Durante este período, os PGHS ficam restritos às células da interveia que estão em contato com as células do domínio proveia (C, cabeças de seta), não mais invadindo o domínio proveia. F representa a mesma imagem de E com os territórios proveia indicados por linhas brancas. O quadrado branco em E indica a região aumentada mostrada em G. 85 B A C D D E’ interveia veia interveia V E’’ E Figura 10: Distribuição de moléculas de heparan sulfato na asa de Drosophila. Imunfluorescência utilizando a sonda faloidina (A, vermelho) e anti heparan sulafato (B, verde) mostrando a distribição homogênea de moléculas de heparan sulfato na asa. C- Imofluorescência utilizando a sonda faloidina (intracelular, D seta) revela que moléculas de heparan sulfato encontram-se no domínio extracelular da membrana plasmática ou no espaço extracelular (D, verde). E- Asa de mais de 30 horas imunomarcadas para heparan sulfato (verde) e faloidina (em vermelho). E’ mostra que moléculas de heparan sulfato são distribuídas homogeneamente nas células ao longo do eixo DV da asa e não estão presentes no domínio da veia durante este período, como mostrado na figura 5C. E’’ mostra que moléculas de heparan sulfato são igualmente distribuídas homogenemente ao longo do eixo ântero-posterior da asa. 86 4.2.3 A via maternal de Sog/Dpp interage geneticamente com loci gênicos responsáveis por gerar moléculas importantes para a síntese de glicosaminoglicanos e glicoproteínas no modelo da oogênese de Drosophila Além da utilização do modelo da asa de Drosophila para a elaboração de screenings, também é possível utilizar o modelo da oogênese para estudar a interação genética entre a via maternal de Sog/Dpp e loci gênicos de interesse. Esta estratégia consiste em gerar genótipos maternais com a duplicação de dpp e alelo em teste, coletar os embriões e realizar hibridização in situ. Para identificar a interação, é necessário comparar a penetrância do fenótipo gerado pela duplicação de dpp (que consiste na invasão anterior do domínio do mesoderma por genes dorsais) com a penetrância da duplicação de dpp acrescida do alelo em teste. Utilizamos esta estratégia para identificar possíveis interações entre Sog/Dpp e os alelos utilizados no screening da asa durante a oogênese. Foram gerados genótipos maternais utilizando dois tipos diferentes de duplicação de dpp: dlI5Dp(dpp), que apresenta a duplicação de dpp no segundo cromossomo e que tem uma penetrância de 37% do fenótipo de invasão do mesoderma por vnd; e Dp(dpp)/+ ; dlI5/+, que apresenta a duplicação de dpp no primeiro cromossomo e tem uma penetrância de 65% do fenótipo da invasão de vnd. Para verificar se a diferença entre as penetrâncias é significativa, foi realizado o teste do χ 2 (qui-quadrado). O teste foi realizado para cada genótipo maternal que inclui o alelo em teste, e o número esperado, calculado a partir da penetrância de dl5Dp(dpp)/+ ou Dp(dpp)/+; dl15/+, foi confrontado com o número observado, utilizando a fórmula χ 2 2 2 ( ( o1 − e1 ) o2 − e2 ) = + , onde o e1 e2 1 e e1 são o número observado e esperado, respectivamente, de embriões com fenótipo de invasão, e o2 e e2 são o número observado e esperado, respectivamente, de embriões com fenótipo 87 selvagem. Como em cada χ 2 foram utilizadas duas classes (embriões com fenótipo de invasão e com fenótipo selvagem), foi utilizado 1 grau de liberdade para a consulta da distribuição do χ 2 . Na tabela a seguir está exposto o resultado do teste (tabela 2). Os fenótipos de invasão do mesoderma foram classificados de acordo com a expressividade. Foi possível classificar embriões com a região anterior invadida pela expressão de vnd (+); embriões com invasão desde a região anterior até a região mediana (++); e embriões com invasão completa do mesoderma pela expressão de vnd (+++). Foi extremamente interessante notar que alguns dos alelos que apresentaram interação no modelo da asa (com excessão de syndecam), também interagiram geneticamente com a via maternal de Dpp, como mostrado pela tabela 2. Estes dados indicam que o produto destes loci gênicos também podem participar da padronização do eixo DV do embrião. 88 Expressividade Genótipo materno Penetrância (Porcentagem) dlI5Dp(dpp)/+ (+++) (++) (+) χ2 37% 37% dlI5Dp(dpp)/ttv 26% 15% 11.9% 53% 7,04* dlI5Dp(dpp)/+;frc/+ 29% 29% 8% 84% 32* 27.8% 13.9% 57% 28* dlI5Dp(dpp)/syndecan 15.8% dlI5Dp(dpp)/+;sfl/+ 25% 13.9% 6.6% 45% 4,3 dlI5Dp(dpp)/+;sll/+ 0 0 100% 100% 135* Dp(dpp)/+ ; dlI5/+ Dp(dpp)/+ ; dlI5/+ ; 65% 65% 5.7% 53.7% 22.3% 81.8% 19,5* 0 45.8% 8.2% 54% 4,8 notum/+ Dp(dpp)/+ ; dlI5/+; sgl/+ Tabela 2: Penetrância do fenótipo de invasão no mesoderma associado a cada genótipo maternal. O asterisco indica que a diferença na penetrância é significativa ao nível de significância de 1%. + - indica invasão do mesoderma por vnd somente na região que corresponde ao terço anterior do embrião; ++ - indica invasão do mesoderma por vnd até a metade do embrião; +++ - indica a invasão completa do mesoderma pela expressão de vnd. 89 4.2.4 Proteoglicanos de Heparan Sulfato estão presentes durante a oogênese de Drosophila Visto que os loci ttv, sll, notum e frc que interagem com sog na asa também mostraram interação na padronização maternal do embrião, decidimos investigar o padrão de distribuição dos PGHS nos folículos ovarianos. Utilizando a técnica de imuno-histoquímica para PGHS verificamos que estão presentes durante a oogênese de Drosophila e apresentam um padrão altamente dinâmico. PGHS estão presentes desde etapas precoces da oogênese (fig.11B), sendo sintetizados por células foliculares que recobrem o folículo (fig.11B,C,D). Durante o desenvolvimento dos folículos ovarianos, este padrão é refinado e no estágio 9 os PGHS estão restritos à região anterior do folículo ovariano (fig.11C, setas). No estágio 10, no entanto, este padrão é perdido e a presença dos PGHS pode ser notada nas células foliculares posteriores (fig.11D, pontilhado), ocupando preferencialmante a região basal das células foliculares (fig.11E, setas). Além disto, é justamente na região anterior que são gerados os fragmentos de Sog pela ação de Tld, evidenciados em ovários que expressam ectopicamente Dpp-GFP (fig.11G, seta). Esta região coincide com a região de síntese de PGHS (fig.11C). Foi extremamente interessante notar que o padrão de marcação para PGHS coincide temporalmente com o momento no qual Sog estaria sendo clivado por Tld (estágio 9) além de coincidir espacialmente com a rota que fragmentos de Sog C-terminais supostamente utilizam para difundir-se dorsalmente. 90 ger célu estágio8 oócito estágio A estágio célula células nutridoras oócito B estágio 8 WT C Cy2>UASdppGFP 8a WT J 8b estágio D E estágio 10 estágio 9 F oócito G Cy2>UASdppGFP H I L M 8a Cy2>UASdppGFP K Cy2>UASdppGFP 8b Figura 11: Caracterização da presença de proteoglicanos de heparan sulfato e de Sog durante a oogênese de Drosophila. A) esquema ilustrando os diferentes estágios de amadurecimento dos folículos ovarianos. Os PGHS são expressos desde estágios precoces da oogenêse (B, estágio 8) pelas células foliculares que recobrem o folículo, sofrendo um refinamento onde, a partir do estágio 9 são restritos a uma faixa de células foliculares anteriores que recobrem o oócito (C, setas). No estágio 10 (D e E), os PGHS são encontrados nas células foliculares anteriores que recobrem o oócito (D, pontilhado), apresentando uma distribuição intracelular associada à região basal da célula folicular (E, seta). A distribuição de Sog revelada pelo anticorpo 8a, mostra um acúmulo de fragmentos N-terminais na região ventral anterior de folículos selvagens (F, seta), enquanto que o anticorpo 8B revela uma distribuição uniforme em folículos selvagens (J, setas). Quando a expressão ectópica de UASdppGFP é induzida pela gal 4 CY2 nas células foliculares (H, em verde) é possível notar um aumento na presença de fragmentos N-terminais na região ventral anterior deste folículo (G, seta). O anticorpo 8b, no entanto, revela uma distribuição dorsal de fragmentos C-terminais (K, seta) ao mesmo tempo que pode ser notada a concentração de Dpp-GFP na região dorsal deste mesmo folículo (L, seta). As imagens I e M são a sobreposição de G/H e K/L, respectivamente. 91 4.2.5 Sog como substrato de Fringe connection durante o desenvolvimento da asa de Drosophila Como a atividade de Fringe connection tem sido caracterizada sobre outras moléculas de glicoproteínas N-ligadas e não de proteoglicanos, decidimos investigar se Fringe connection tem ação sobre a glicosilação de Sog, uma vez que este locus gênico interagiu geneticamente com Sog no modelo da asa. A partir de asas de pupa homozigotas para o alelo frc00073, foram obtidos extratos proteicos para a análise do padrão de migração eletroforética de Sog. Se de fato Sog fosse substrato para Fringe connection, esperávamos observar um aumento em sua mobilidade eletroforética devido à ausência da glicosilação. No entanto, observamos a ausência de 6 bandas (fig.12B) que são reconhecidas em extratos selvagens (fig.12B). Estas bandas correspondem, provavelmente, ao fragmento de Sog que contém o CR1/2 e que tem um tamanho de 100 kDa (fig.12B, banda B), SuperSog1, como tamanho de 38 kDa (fig.12B, banda D). Estes resultados sugerem que Sog possa ser substrato de Fringe connection e que a ausência de sua atividade modifique o padrão de clivagem de Sog por Tld, ou que o epítopo reconhecido pelo antisoro seja perdido ou mascarado na ausência de Fringe connection . Um dado que fortalece a hipótese de que Sog seja substrato de Fringe connection, é o padrão de venação da asa de indivíduos homozigotos frc00073/frc00073. Nestas asas as veias apresentam um calibre aumentado (fig.12C, asterisco) e a formação de um delta na região terminal próxima à borda da extremidade distal da asa (fig.12C, setas). A padronização da veia cruzada posterior também foi alterada, podendo ser observado um alargamento no domínio da veia em detrimento do domínio interveia (fig.12C, cabeça de seta). Estes fenótipos se assemelham ao fenótipo observado para a superexpressão de Dpp induzida por 92 Epítopo 8A A 00073 asa frc00073/frc as a W B A B C 116 kDa 92kDa C D E F * 50 kDa 37 kDa 28 kDa Figura 12: Sog como substrato de Fringe connection. A- Esquema ilustrando os diferentes fragmentos de Sog possivelmente gerados pela clivagem por Tolloid e os respectivos pesos moleculares estimados. B- Eletroforese de extrato de asa selvagem (WT) e asa homozigota frc00073/frc00073. É possível notar que a banda de cerca de 38 kDa de um fragmento de Sog (seta D) está ausente em extratos de asas homozigotas para frc00073, enaquanto que bandas em torno de 100 kDa (setas A e B), 50 kDa (seta C) e 30 kDa (setas D e E) apresentam menor intensidade quando comparadas com asas selvagens. As bandas não indicadas por setas constituem padrão de marcação inespecífica. C- O padrão de venação da asa adulta de indivíduos homozigotos frc00073 apresenta alargamento da veia cruzada posterior (cabeça de seta),alargamento na região terminal das veias L2 e L3 (setas) e aumento do calibre da L3 (asterisco). 93 choque térmico (Yu e cols., 1996), indicando que a sinalização de Dpp nestas asas possa estar sendo potencializada devido à ausência de fragmentos N-termians de Sog (contendo CR1) que anatagonizariam Dpp. No entanto, neste ponto cabe lembrar que outros genes da via de Notch e EGFR também estão envolvidos em definir a largura das veias durante o período pupal, sendo necessário no futuro esclarecer se este fenótipo se deve a um efeito conjunto sobre diferentes vias de sinalização. 94 5. Discussão 5.1 Sog e Dpp atuam pelo mecanismo de “delayed induction” para padronizar o eixo DV do embrião de Drosophila Neste estudo fomos capazes de demonstrar uma série de características essencias ao modelo proposto por Araujo e Bier (2000) para a participação da via maternal de Sog/Dpp na padronização do eixo DV do embrião de Drosophila. Naquele momento, foi demonstrado, através de experimentos genéticos de epistasia, o relacionamento entre a via de Dpp e a via de Toll. Foi proposto que a via maternal de Sog/Dpp atua pelo mecanismo de “delayed induction” para alterar a translocação nuclear de Dl por um mecanismo independente do sinal de Toll. Naquele trabalho pioneiro foi mostrado que o padrão de expressão do gene sog é restrito à região anterior do folículo ovariano, sem que sua expressão tivesse sido detectada pelas células foliculares remanescentes. dpp também apresentou um padrão de expressão restrito às células foliculares anteriores. Experimentos de epistasia localizaram a via maternal de Sog/Dpp “downstream” ou em paralelo à via de Toll. Neste trabalho nós confirmamos a hipótese da atuação de Dpp em paralelo à de Toll ao demonstrar que a expressão do gene “upstream” a Toll, pipe, não é alterada quando o sinal de Dpp é bloqueado (fig.6A). Além disto, quando analisamos o padrão de distribuição das proteínas Sog e Dpp-GFP observamos que este padrão é bem mais amplo que o padrão de expressão de seus respectivos RNA mensageiros (Anexo 1, fig. 1 e fig. 3). 95 Demonstramos também que as proteínas Sog e Dpp-GFP são transferidas para o espaço perivitelínico e que permanecem neste compartimento extracelular até estágios tardios da oogênese e início da embriogênese, característica essencial para corroborar a hipótese de suas ações através do mecanismo de “delayed induction”. Outro importante aspecto revelado por nossas análises foi a proposição de um mecanismo molecular que fosse capaz de alterar pós-traducionalmente o padrão originalmente simétrico de Dpp ao longo do eixo DV, como previsto pela expressão de seu RNA mensageiro. Apesar de vários trabalhos anteriores demonstrarem um importante papel de Dpp na formação de estruturas dorsais anteriores do córion, seu efeito restrito a esta região era explicado pela convergência da via de Dpp com a ativação restrita da via de EGFR (Deng e Bownes, 1997; Peri and Roth, 2000; Twombly e cols., 1996). Dada a propriedade difusora de Dpp ter sido demonstrada em diferentes momentos do desenvolvimento de Drosophila, bem como a importância de Sog em regular a mobilidade de Dpp, consideramos a possibilidade de um mecanismo similar estar atuando durante a oogênese de Drosophila. De fato, fomos capazes de mostrar que Sog sintetizado pelas células foliculares é capaz de modificar a distribuição de Dpp. No entanto, nossas análises adicionam complexidade a este mecanismo básico, já que fomos capazes de associar diferentes fragmentos de Sog a distintas atividades sobre Dpp. Enquanto fragmentos N-terminais permanecem associados à região ventral e antagonizam a atividade de Dpp nesta região, fragmentos C-terminais migrariam dorsalmente carreando Dpp e contribuindo para a geração de um gradiente de atividade de Dpp, que permaneceria estável e seria utilizado pelo embrião em estágios iniciais do desenvolvimento (Anexo 1, fig. 8). Neste modelo, o mecanismo molecular responsável pela geração de um gradiente de atividade de Dpp durante a oogênese é controlado pelo produto do gene tolloid (tld), que restringe à região ventral do folículo ovariano a clivagem do antagonista de Dpp, Sog (Carneiro e 96 cols, 2006). Tld é um membro da família de metaloproteases relacionadas à BMP-1 (Shimell e cols., 1991) apresentando em sua porção N-terminal uma região de similaridade à família astacina de metaloproteases (Jiang, e Bond, 1992; Stöcker, W., Gomis-Rüth e cols., 1993). Nossos estudos se assemelham em parte com aqueles relativos à embriogênese de Drosophila, onde a atividade de Dpp zigótico pode ser modulada positivamente através da formação de um complexo proteico envolvendo a participação de Tld e Sog, necessitando da atividade proteásica de Tld para funcionar (Finelli e cols., 1994). Por outro lado, o modelo proposto para a oogênese sugere o mecanismo adicional da geração de diferentes atividades de Sog. Será interessante investigar se este mecanismo, por nós proposto, será utilizado em outros contextos do desenvolvimento onde a difusão e atividade de Dpp precisam ser controladas. 5.2 Um novo nó para a rede de expressão gênica do eixo dorso-ventral de Drosophila No estágio 10 da oogênese, o padrão de expressão de tolloid fica restrito às 18 células foliculares mais ventrais, correspondendo à 50% da circunferência do folículo ovariano (Carneiro e cols., 2006). Sua localização restrita dirige a clivagem de Sog nesta região, levando a um acúmulo localizado de fragmentos N-terminais (Anexo 1 fig. 1). Quando a expressão de gurken foi eliminada, tolloid passou a ser expresso por todas as células foliculares, não havendo mais restrição ventral (Carneiro e cols., 2006). Isto potencialmente modifica o padrão de clivagem de Sog, assim como a distribuição espacial da atividade de Dpp. Este resultado demonstra que o sinal de Gurken é importante para regular tanto a via de Toll, através da restrição ventral da expressão de pipe, quanto a via maternal de Dpp, através da restrição da expressão de tolloid à esta mesma região. 97 A rede de interação gênica que caracteriza o eixo DV do embrião de Drosophila é composta por mais de 60 genes (diagrama a baixo), onde cerca de 12 codificam proteínas importantes para a ativação da via de Toll, enquanto que cerca de 50 genes são responsivos ao gradiente de Dorsal (Stathopoulos e cols., 2002). Toda essa gama de moléculas, que em última análise caracteriza o eixo DV do embrião molecularmente, é controlada pelo sinal de Gurken, como proposto pelo diagrama abaixo (Levine e Davidson, 2005). tolloid Sog Dpp Modificado de Levine e Davidson, 2005 Neste diagrama Levine e Davidson (2005) apresentam a rede regulatória de expressão gênica para o estabelecimento do eixo DV do embrião. À esquerda (em roxo) estão os eventos que ocorrem durante a oogênese e são controlados por Gurken, e à direita está a rede de interações que ocorre durante a embriogênese. Propomos a inclusão de mais um nó para rede: a 98 via maternal de Sog/Dpp (setas em amarelo no lado esquerdo do diagrama) que é regula por Gurken, através da restrição da expressão de tolloid à região ventral do folículo ovariano. 5.3 Como gerar um gradiente morfogenético: o papel de proteoglicanos Passamos a considerar os mecanismos moleculares que poderiam estar envolvidos na geração do gradiente de Sog ao longo do eixo DV do folículo ovariano. Ao contrário dos mecanismos que regulam a difusão de outros morfógenos como Dpp, Wg e Hh terem sido intensamente estudados ao longo dos últimos anos, nenhum trabalho havia se proposto a explorar os mecanismos que atuam sobre a mobilidade de Sog. Como citado anteriormente, moléculas de PGHS têm sido apontadas como reguladoras da mobilidade de morfógenos. Decidimos, baseados nestas evidências, testar a hipótese do envolvimento de moléculas de PGHS na regulação da mobilidade/ atividade de Sog. A análise do padrão de venação tem sido utilizada como uma importante ferramenta para a identificação, isolamento e análise de novos componentes de diversas vias de sinalização como EGF, BMP, Hedgehog, Notch e Wnt (revisado em Blair, 2006). Foi demonstrado que PGHS são capazes de ligar Cordina e de potencializar sua atividade antagônica sobre BMP, o homólogo vertebrado de Dpp (Jasuja. e cols., 2004). Foi demonstrado também que Cordina se liga aos PGHS de matriz extracelular como o Perlecan (Jasuja. e cols., 2004). Dada a similaridade de seqüência entre Cordina e Sog, estes dados sugeriam que Sog também fosse capaz de ligar PGHS e que esta ligação seria importante para a sua atividade. Moléculas de heparan sulfato são sintetizadas durante o desenvolvimento da asa e apresentam o mesmo padrão espaço/temporal caracterizado para Sog. 99 Durante estágios iniciais da pupa (24 horas após a formação da pupa), Sog é capaz de invadir o domínio proveia e este movimento é dependente de integrina (Araujo e clos., 2003). Moléculas de heparan sulfato também apresentam a mesma dinâmica, invadindo a região da veia durante este mesmo período (fig.9), sugerindo que estas moléculas possam participar da movimentação de Sog. Sog antagoniza Dpp durante o período pupal para assegurar a formação correta das veias, retas e contínuas (Yu e cols., 1996). Uma vez que a expressão de dpp dentro do domínio da veia é crucial para a manutenção do destino de veia nestas células em estágios avançados da pupa (Conley e cols., 2000), e que a expressão de sog é restrita às células da interveia (Yu e cols., 1996), para Sog exercer sua atividade antagônica sobre Dpp, é necessário que ele difunda a partir deste domínio para a região proveia. Como citado, a atividade de TTV (que tem sido descrito durante o alongamento da cadeia dissacarídica) foi mostrada ser importante para a movimentação de outros morfógenos. Dado que ttv interagiu com sog eliminando o truncamento das veias e durante a oogênese, será interessante testar a hipótese da participação de ttv na regulação da mobilidade de Sog. Este mesmo tipo de fenótipo de perda de truncamento também foi descrito para a ausência da subunidade de integrina αPS1, que está diretamente envolvida na mobilidade de Sog a partir do domínio interveia para o domínio veia (Araujo e cols., 2003). Para demonstrar a participação do produto do locus ttv na atividade de Sog, estão sendo construídas linhagens recombinantes ttv/FRT 42D. Através desta estratégia, serão gerados grupos de células que não expressam ttv durante o desenvolvimento da asa e oogênese. Através de imunomarcações com 8a e 8b seremos capazes de avaliar se haverá alguma alteração na mobilidade de fragmentos de Sog nos arredores destes grupos celulares. 100 PGHS estão presente em grande quantidade sobre a superfície celular e são responsáveis por gerar sítios de ligação de baixa afinidade para moléculas sinalizadoras secretadas como Wg/Wnt. Um dos modelos mais bem descritos para a interação entre morfógenos e PGHS é a interação entre Wg e glipicanos. Wg é capaz de se ligar a GAGs em células em cultura (Reichsman et al., 1996), e os proteoglicanos de superfície celular, Dally e Dally-like estão envolvidos neste processo. Notum, por sua vez, é capaz de alterar o gradiente morfogenético de Wg gerando modificações nestes glipicanos (Giraldez e cols., 2002). Notum codifica uma α/β hridrolase, uma superfamília de esterases que inclui peptidades, lipases esterase e uma variedade de enzimas hidrolíticas (Nardine e Dijkstra, 1999). A forte interação detectada entre sog e notum levantou a possibilidade da regulação da mobilidade de Sog por glipicanos. No entanto, não fomos capazes de detectar interação entre sog e dally, resultado que já havia sido mostrado por Araujo e colaboradores em 2003. Havia, no entanto, a possibilidade de sog interagir com dallylike, o que faria uma ligação entre Sog e Notum, já que Notum também atua sobre Dally-like. Não foi possível, no entanto, detectar interação genética entre sog e dally-like, permanecendo em aberto o elemento que possivelmente conectaria Sog e Notum. A modificação de PGHS por sulfatação é extremamente relevante para sua função. A desacetilação e a sulfatação de parte dos resíduos de GlcNAc das unidades dissacarídicas dos GAGs de PGHS, pelas enzimas NDST, é necessária para a subseqüente epimerização e sulfatação, que enriquecem a diversidade estrutural e funcional das cadeias de GAGs. A enzima NDST de Drosophila é codificada pelo locus sulfateless. Células que não apresentam a atividade desta enzima apresentam redução nos níveis de Dally e Dally-like, redução na ligação de Wg e sensibilidade diminuída a Wg (Baeg e cols., 2001; Lin e Perrimon, 1999). 101 Apesar de não detectarmos interação entre sog EP7 e sfl, fomos capazes de detectar uma forte interação entre sog e slalom, que codifica um doador de sulfato de alta energia 3’fosfato5’fosfosulfato (PAPS). A sulfatação de moléculas secretáveis ocorre no aparelho de Golgi e necessita que este doador de alta energia PAPS esteja presente dentro desta organela. Em Drosophila o PAPS é sintetizado no citoplasma pela PAPS sintase (Julien e cols., 1997). O PAPS tem que ser transportado para dentro do Golgi (Lyle e cols., 1994) para servir como substrato para a sulfotransferase. Foi sugerido que a função de Slalom seja essencial para pelo menos dois tipos de sulfotransferase: Sulfateless e Pipe. Não fomos capazes de detectar nenhum tipo de interação entre sog e sulfateless no modelo da asa nem durante a oogênese. De forma alternativa, Slalon pode ser importante para sulfotransferases características de glicoproteínas, e neste caso poderia ser importante para a sulfatação de unidades dissacarídicas do próprio Sog. Dados do screening sugerem que a polimerização das cadeias de GAGs, a sulfatação e a dinâmica de clivagem de PGHS de superfície celular podem ser importantes para a atividade biológica da interação entre Sog e Dpp no modelo da asa. O screening, no entanto, não é capaz de nos fornecer um dado comprovador da interação direta entre os produtos de loci gênicos testados. Isto é devido a algumas limitações desta técnica, como: a classe de alelo em teste no background EP e 2. o resultado do screening não indica a direção da interação (supressão X potencialização). Esta técnica, por outro lado, nos permite traçar de forma mais direta novas estratégias para desvendar a verdadeira relação entre as moléculas testadas. 102 5.4 A glicoproteína Sog Foi mostrado que Sog é uma glicoproteína (Marqués e cols., 1997), e ao estudarmos em detalhes os possíveis sítios para N-glicosilação através da utilização do programa NetNGlyc 1.0, disponibilizado na internet pelo servidor Expert Protein Analysis System (ExPASy), do Instituto Suiço de Bioinformática (http://us.expasy.org/tools/#primary), foi possível identificar 6 sítios passíveis de glicosilação, como mostrado no anexo 2. Ao compararmos a distribuição dos sítios passíveis de glicosilação em Cordina de Xenopus laevis, Danio rerio e Mus musculus identificamos uma série de características físicoquímicas que parecem ser preservadas ao longo destas espécies: Região logo após ao CR1: somente Drosophila possui sítio potencial de glicosilação nesta região que possui um potencial acima do limiar. Região espaçadora 1: sítios para glicosilação podem ser encontrados na região espaçadora de Sog de Drosophila e Cordina de Xenopus mas não de Danio rerio e Mus musculus. Região espaçadora 3: Este sítio possui um potencial de glicosilação maior que 0.5. Além disso, os aminoácidos isoleucina (I) e serina (S), que compõe o sítio de glicosilação em Drosophila, são trocados em Xenopus por glicina (G) e treonina (T), respectivamente, que pertencem à mesma classe de aminoácidos (isoleucina e glicina são aminoácidos com cadeias laterais não polares e serina e treonina são aminoácidos com cadeias laterais polares não carregadas). Drosophila melanogaster 433 TRDRP NISL IEEQGKRKAKLEDLTPSFNFNQAIGSVEKLG 473 Xenopus laevis 378 SITLHE NGTL EYQIQIAGTMSTVTAVTLETKPRRKTKRNI 418 Danio rerio 376 VFTLHP NGSL DYQLLVAGLSSAVLSVSIEMKPRRRNKRSV 416 Mus musculus 375 SFILLG NGSL IYQVQVVGTGSEVVAMTLETKPQRKNQRTV 415 103 Região contendo CR2: este sítio possui um potencial de glicosilação menor que 0.5 e Xenopus laevis, Danio rerio e Mus musculus não possuem nenhum sítio de glicosilação presente nesta região de Cordina. Região entre o CR2 e o CR3: Este sítio em Drosophila tem os aminoácidos alanina (A) e treonina (T) substituídos em Xenopus por prolina (P) e serina (S). Estes aminoácidos apresentam características químicas similares. Drosophila melanogaster 747 QSSPAT NATD LLQQRRGCRL 767 Xenopus laevis 739 TNPIRA NPSD CCKQCPVE 759 Danio rerio 741 SRPIRR NPSD CCKECPPEET 761 Mus musculus 831 GQWFPE NQSW HPSVPPFGEM 851 Esta análise cuidadosa da distribuição dos sítios passíveis de glicosilação em Sog e Cordina, seu grau de conservação molecular e sua posição ao longo das moléculas sugerem fortemente que a glicosilação destas proteínas seja um fator chave para a regulação de suas atividades biológicas. Também foi demonstrado que fragmentos de Cordina que correspondem aos fragmentos gerados pela clivagem por Tolloid também são capazes de ligar PGHS (Jusuja e cols., 2004), de modo que fragmentos que contém o CR1 e o CR2/3 têm maior afinidade do que fragmentos que contém o CR4 (Jusuja e cols., 2004). Ao analisarmos a distribuição dos sítios de glicosilação ao longo de Sog, é possível perceber que existe um sítio logo após o CR1, que poderia ser importante para a clivagem por Tolloid além de importante para a ligação a moléculas de heparan sulfato, uma vez que este tipo de fragmento tem uma grande afinidade por estas moléculas; existe um sítio sobre o CR2 e mais um sítio entre o CR2 e CR3, o que poderia novamente ser importante para a ligação a moléculas de heparan sulfato dada sua alta afinidade por estas 104 moléculas. O CR4, que não possui nenhum sítio de glicosilação em sua proximidade, é justamente o fragmento que apresenta a menor afinidade por moléculas de heparan sulfato. Ao analisarmos nosso experimento utilizando moscas homozigotas frc00073 para detectar possíveis efeitos dessa enzima sobre Sog, foi observada a ausência de um fragmento de Sog de cerca de 39 kDa. Caso mostremos que Frc participa da glicosilação de Sog, este resultado pode ser iterpretado como uma incapacidade de Tolloid de agir sobre Sog na ausência da glicosilação. É interessante notar a presença de um sítio passível de glicosilação logo após o CR1, que coincide com a localização aproximada de um sítio utilizado por Tolloid para gerar fragmentos de Sog contendo CR1 (Serpe e cols., 2005). Fragmentos N-terminais deste tipo foram descritos como apresentando uma atividade bloqueadora da ação de BMP (Yu e cols., 2004). Como hipótese de trabalho poderíamos sugerir que na ausência da atividade de Frc (moscas homozigotas para frc00073), fragmentos contendo o CR1 não seriam gerados, originando um padrão de venação reminiscente de um aumento de Dpp durante o período pupal (Yu e cols., 1996) Estudos anteriores foram capazes de distinguir 3 funções distintas para diferentes fragmentos de Sog: o Sog inteiro é capaz de bloquear o sinal de Dpp; Sog contendo o CR1 e parte da região espaçadora (Supersog) exerce uma atividade inibidora sobre BMP e Sog contendo os CR1/2 que apresenta uma atividade potecializadora sobre BMP (Yu e cols., 2004). Estes resultados foram gerados através da superexpressão de contruções de diferentes fragmentos de Sog utilizando o sistema UAS-GAL4, sem a demonstração de que tais fragmentos fossem de fato gerados ou que apresentassem dadas atividades in vivo. Estudos recentes mostraram que a superexpressão de uma forma ativada de Tolloid, durante o desenvolvimento da asa no período pupal, gerou fenótipos tanto de excesso do sinal de Dpp (expansão da veia cruzada posterior) quanto de diminuição (perda parcial ou total da veia cruzada posterior) (Serpe e cols., 2005), 105 além de demonstrar que este efeito de Tolloid é dependente de Sog. Juntos, estes trabalhos mostram que fragmentos de Sog são gerados in vivo durante o período pupal e que exercem diferentes efeitos sobre o sinal de Dpp. Este resultado mostrou que Sog pode execer uma atividade positiva ou negativa sobre Dpp durante o período da pupa, como ocorreria durante a oogênese (Carneiro e cols., 2006). Para explorar melhor o aspecto da importância da glicosilação de Sog sobre sua atividade bem como sua importância para a ligação a moléculas de heparan sulfato, estamos gerando, através de mutação por PCR, moléculas de Sog sem os sítios de glicosilação. Através de técnicas de transgênese animal serão geradas linhagens de moscas mutantes para estes sítios, possibilitando a avaliação in vivo da importância dos eventos de glicosilação sobre a atividade de Sog. 5.5 A via maternal de Dpp como uma via digital O desenvolvimento de organismos multicelulares se baseia na geração de diferentes tipos celulares caracterizados por diferentes formas e funções. Um estado celular específico poderia ser definido por um perfil específico de expressão gênica, e, portanto, pelo conjunto de fatores transcricionais que caracterizam um determinado fenótipo. Em sua essência, o desenvolvimento animal poderia ser definido como uma seqüência de transições entre estados celulares caracterizados pelo código transcricional de cada célula, ou o conjunto de fatores transcricionais de determinada célula em um dado momento. Uma seqüência de transições do destino celular podem ser representadas como uma seqüência de eventos na qual cada passo depende exclusivamente da posição do sistema, gerando 106 escolhas binárias. A cada ponto de escolha, as células devem decidir entre dois perfis distintos de expressão gênica, que por sua vez, determinarão seu próximo estado celular. Mesmo a resposta de uma célula a um morfógeno pode ser construída desta forma, pois em uma dada posição dentro de um campo morfogenético, a célula que é exposta a um morfógeno, deve tomar uma decisão binária, representada pela escolha entre permancer neste estágio ou expressar genes que são ativados pela concentração local do morfógeno. Se levarmos em consideração o grande número de estados celulares que podem ser caracterizados durante a existência de um organismo, e a fidelidade com a qual eles são gerados através de programas específicos, podemos dizer que estes eventos são cruciais e possuem um grande poder de auto ajuste para assegurar, diante de qualquer perturbação, o prosseguimento da vida daquele organismo e a precisão informacional. Quanto mais forte for este poder de auto ajuste, maior é a robustez deste sistema. Dada a importância chave da via de Toll para o desenvolvimento de Drosophila, não seria difícil imaginar a existência de mecanismos que assegurariam sua execução. Além de participar de mecanismos importantes que envolvem a sinalização celular no ambiente extracelular, a interação entre Sog e Dpp também regula a transdução citoplasmática de sinais que são cruciais para a restrição do potencial celular, durante os momentos iniciais da embriogênese. A via de Toll e Dpp maternal, ao regularem a translocação nuclear de Dl, influenciam diretamente na restrição do potencial celular, pois as células se comprometem fenotipicamente (ou adotam perfis específicos de expressão gênica) e a diferenciação em tipos celulares específicos passa a ser cada vez mais restrita. Um importante mecanismo que assegura a precisão da expressão gênica nos momentos iniciais da embriogênese de Drosophila, é a existência de seqüências enhancer com diferentes afinidades por Dl. Este mecanismo de controle da expressão gênica, através de enhancers, pode 107 ser um importante ponto de regulação e uma maneira de assegurar a especificação correta dos três domínios iniciais de expressão gênica neste estágio. Mas o que aconteria se o gradiente de Dl fosse perturbado e alterações significativas neste gradiente fossem capazes de gerar imprecisões na escolha binária de uma dada célula posicionada ao longo do eixo DV? Este efeito seria mais fortemente sentido em regiões de transição entre um perfil A e B de expressão gênica. Isto se daria pelo fato de que, justamente nestas regiões de borda, haveria concentrações nucleares de Dorsal muito próximas, mas que são capazes de ser diferenciadas entre células imediatamente adjacentes, graças a mecanismos específicos de tamponamento de flutuações no “output” da expressão gênica. Quando bloqueamos o sinal maternal de Dpp, a identidade celular é comprometida e a informação guardada na forma de limiares precisos de expressão gênica é perdida (Anexo 1, fig. 4). Este efeito se dá pela alteração da inclinação do gradiente de Dl pelo bloqueio do sinal maternal de Dpp. É interessante notar que a informação posicional não é completamente perdida. Apenas a precisão é afetada, indicando que a via de Sog/Dpp possa ser um fator chave para a manutenção da robustez do sinal de Toll. As variações fenotípicas dentro de uma população de embriões (como por exemplo, variações nos domínios de expressão gênica como citado para a largura da região ventral do neuroectoderma, que pode variar de 3 a 5 células dentro do fenótipo selvagem) podem ser explicadas por flutuações na efetividade de mecanismos moleculares. Estas flutuações são definidas como o grau de ruído de uma via de sinal específica. No entanto, ao falarmos em desenvolvimento de um organismo e geração de padrões axiais, esta variabilidade se opõe totalmente à alta precisão e reprodutibilidade que é observada nas populações celulares. As transições entre diferentes estados celulares durante o desenvolvimento são dirigidas por uma combinação específica de transcrição e tradução, isto é, a regulação exata entre DNA, RNA e proteínas. Assim como qualquer interação molecular, estas transições são objeto de 108 flutuações que podem influenciar o efeito final de um sinal, ou seja, são fontes de ruído. Trabalhos recentes em bactérias e leveduras demonstraram que o ruído é um importante componente da expressão gênica (Rao e cols., 2002; Blake e cols., 2003; Paulsson e cols., 2004; Raser e cols., 2004; Elowitz e cols., 2002; KÆrm e cols., 2005). O ruído também é caraterístico para cada gene e pode ser filtrado durante a transcrição bem como durante a tradução (Blake e cols., 2003; Paulsson e cols., 2004; KÆrm e cols., 2005). Portanto, parece que o ruído é uma característica intrínseca de um dado sistema biológico. Um importante aspecto a ser estudado seria como controlar o ruído caraterístico de um dado sistema, e qual seria sua contribuição durante a construção de um organismo (Rao e cols., 2002). A existência de mecanismos de filtragem de ruídos foi descrita para a padronização do eixo ântero-posterior de Drosophila e evidenciada em genes alvo de bicoid (Houchmandzadeh e cols., 2002). Foi demonstrado que, embora a variação individual na expressão de bicoid seja grande dentro de uma população de embriões, o sinal da resposta de genes alvo de bicoid é precisa e apresenta pequena variação dentro desta mesma população (Houchmandzadeh e cols., 2002). Para o eixo ântero-posterior ainda não há hipóteses sobre os mecanismos reguladores que filtrem o ruído da expressão de bicoid. Para o eixo DV, no entanto, gostaríamos de sugerir que a via de Sog/Dpp maternal fosse parte deste mecanismo. Podemos citar outro exemplo de via de sinalização que atua como mecanismo de filtragem do ruído: a via de Wingless/Wnt. Durante as etapas iniciais do desenvolvimento de Drosophila a expressão de engrailed necessita do sinal de Wingless para atingir um grau estável de expressão gênica (DiNardo e cols., 1988; Martinez Arias e cols., 1988). Na ausência do sinal de wingless, a expressão de engrailed tem início, mas decai logo em seguida (Bejsovec e Martinez Arias, 1991). Outro exemplo é o enhancer responsivo a Wingless do complexo Achaeta-Scute, que direciona a expressão de achaeta e scute em posições precisas da epiderme 109 do indivíduo adulto. Em indivíduos mutantes para wingless, a atividade do enhancer não é abolida, mas se torna reduzida e altamente variável de indivíduo para indivíduo (Garcia-Garcia e cols., 1999). Em vertebrados, o estudo da hiperativação do sinal de Wnt durante a ativação de células tronco em camundongos mostrou que a principal função do sinal de Wnt é coordenar e diminuir o limiar da resposta destas células a outros sinais que irão ativá-las, ao invés de atuar para especificar o destino celular (Lowry e cols., 2005). Os resultados destes estudos sustentam a idéia de que o sinal de Wnt afetaria a estabilização ao invés do início da expressão gênica (Lucchetta e cols., 2005; Martinez Arias, 2000). De forma análoga, dados de nosso laboratório indicam que a via maternal de Dpp atue regulando a estabilidade, ou a qualidade, do “output” através de mecanismos de controle de estabilidade de RNA mensageiro de loci que codificam proteínas que seriam alvo de sua sinalização (Agrellos Costa, não publicados). Quando a via maternal de Dpp foi bloqueada através da expressão ectópica da forma dominante negativa do receptor de Dpp, Tkv, os níveis do RNA mensageiro de Calpanína A, Calcineurina B2 e Caseína Quinase II foram alterados, o que por sua vez alterou os níveis de Cactus em paralelo ao sinal de Toll. Estes resultados sugerem que a via maternal de Dpp possa atuar sobre o “output” final e não sobre a regulação da expressão gênica propriamente dita. 110 6. Conclusões Finais .O Dpp produzido durante a oogênese atua por um mecanismo independente do sinal de Toll sinalizando através de recepotores Tkv maternais para padronizar o eixo DV do embrião. .A geração de um gradiente de atividade de Dpp durante a oogênese é regulada por diferentes fragmentos da proteína Sog. .Tolloid é capaz de clivar Sog durante a oogênese gerando diferentes fragmentos de Sog com propriedades de difusão distintas. .Loci gênicos responsáveis por codificar moléculas importantes em diferentes etapas da geração de PGHS interagem geneticamente com sog durante a oogênese e o desenvolvimento da asa de Drosophila.PGHS estão presentes durante a oogênese e o desenvolvimento da asa de Drosophila .O perfil eletroforético de Sog a partir de extratos de asa de pupa é alterado em indivíduos homozigotos nulos para o locus fringe connection, indicando que Sog seja glicosilado por Fringe connecton 111 7. Referências Bibliográficas Agrellos Costa, R. Dpp maternal e a padronização do eixo dorso-ventral de Drosophila melanogaster: interações com a via de cálcio. Rio de Janeiro; 2007. Dissertação de Mestrado [Ciências Biológicas-Genética] – Instituto de Biologia- Universidade Federal do Rio de Janeiro. Anderson, K. V., Bokla, L., and Nüsslein-Volhard, C. (1985). Establishment of dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo: The induction of polarity by the Toll gene product. Cell 42, 791-798. Araujo, H. and Bier, E. (2000). sog and dpp exert opposing maternal functions to modufy Toll signaling and pattern the dorsoventral axis of the Drosophila embryo. Development 127, 36313644. Araujo, H., Negreiros, E. and Bier, E. (2003). Integrins modulate Sog activity in the Drosophila wing. Development 130, 3851-3864. Ashburner, M. (1989). Drosophila. A laboratory manual. Cold Springer Harbor Laboratory Press. Baeg, H. G., Lin, X., Khare, N., Baumgartner, S. and Perrimon, N. (2001). Heparan sulfate proteoglycans are critical for the organization of the extracellular distribution of Wingless. Development 188, 87-91. 112 Barnard, J.A., Lyons, R.M. and Moses, H.L. (1990). The cell biology of transforming growth factor beta.Biochim Biophys Acta. 1032, 79-87. Bejsovec, A. & Martinez Arias, A. (1991) Roles of Wingless in patterning the larval epidermis of Drosophila. Development 113, 471–485. Bellaiche, Y., Tho, I., Perrimon, N. (1998). Tout-velu is a Drosophila homologue of the putative tumor suppressor EXT-1 and is needed for Hh diffusion. Nature 394, 85-88. Bernfield, M., Gotte, M., Park, P.W., Reizes, O., Fitzgerald, M. L., Lincecum, J. and Zako, M.(1999). Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans. Annu Rev Biochem. 68,72977. Biehs B, Francois V, Bier E. (1996) The Drosophila short gastrulation gene prevents Dpp from autoactivating and suppressing neurogenesis in the neuroectoderm. Genes Dev Nov 15;10(22):2922-34. Bier, E., Jan, L.Y., and Jan, Y. N. (1990). Rhomboid, a gene required for dorsoventral axis establishment and peripheral nervous system development in Drosophila melanogaster. Genes Develp. 4, 190-203. Bier E. (1997) Anti-neural-inhibition: a conserved mechanism for neural induction. Cell. 1997 May 30;89(5):681-4. 113 Binari, R. C., Staveley, B. E., Johnson, W. A., Godavarti, R., Sasisekharan, R. and Manoukiam, A. S. (1997). Genetic evidence that heparin-like glycosaminoglycans are involved in wingless signaling. Development 124, 2623-2632. Blair, SS. (2006). Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 8. Blake, W.J., Kaern, M., Cantor, C.R. and Collins, J.J. (2003). Noise in eukariotic gene expression. Nature 422, 633-637. Brand, A. H. e Perrimon, N. (1993). Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development 118, 401-15. Capdevila, J. and Guerrero, J. (1994). Targeted expression of the signaling molecule decapentaplegic induces pattern duplications and growth alterations in Drosophila wings. EMBO J.13,4459-68. Carneiro, K., Fontenele, M., Negreiros, E., Lopes, E., Bier, E. And Araujo, H. (2006). Graded maternal short gastrulation protein contributes to embryonic dorsal-ventral patterning by delayed induction. Developmental Biology 296, 203-218. de Celis, J. F. (1997). Expression and function of decapentaplegic and thickveins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development 124, 1007-1018. 114 Chang, C., Holtzman, D.A., Chan, S., Chickering, T., Woolf, E.A., Holmgren, L.M., Bodorova, J., Gearing, D.P., Holmes, W.E. and Brivanlou, A.H. (2001). Twisted gastrulation can function as a BMP antagonist. Nature 410, 483-487. Chasan, R. and Anderson, K. V. (1989). The role of easter, an apparent serine protease, in organizing the dorsal-ventral pattern of the Drosophila embryo. Cell 56, 391-400. Chasan, R., Jin, Y. and Anderson, K. V. (1992). Activation of the easter zymogen is regulated by five other genes to define dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo. Development 115, 607-616. Chen, Y. and Struhl,G.(1996). Dual roles for Patched in sequesteing and transducing Hedgehog. Cell 87, 553-563. Conley, C.A., Silburn, R., Singer, M.A., Ralston, A., Rohwer-Nutter, D., Olson, D.J., Gelbart, W., Blair, SS. (2000). Crossveinless 2 contains cysteine-rich domains and is required for high levels of BMP-like signaling during the formation of the cross veins in Drosophila. Development 127, 3947– 3959. Clark L., Giniger, E., Ruohola-Baker, H., Jan, L. Y. and Jan, Y. N. (1994). Transient posterior localization of a kinesin fusion protein reflects anteroposterior polarity of the Drosophila oocyte. Curr. Biol. 4, 289-300. 115 Conley, C. A., Silburn, R., Singer, M. A., Ralston, A., Rohwer-Nutter, D.,Olson, D. J., Gelbart, W. and Blair, S. S. (2000). Crossveinless 2 contains cysteine-rich domains and is required for high levels of BMP-like activity during the formation of the cross veins in Drosophila. Development 127, 3947-3959. de Celis, J.F. (1997). Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development 124, 1007– 1018. DeLotto, R. and Spierer, P. (1986). A gene required for the specification of dorsal-ventral pattern in Drosophila appears to encode a serine protease. Nature 323, 688-692. Deng, W.M. and Bownes, M., (1997). Two signaling pathways specify localized expression of the Broad-Complex in Drosophila eggshell patterning and morphogenesis. Development 124, 4639-4647. Deng, W.M. and Bownes, M. (1997). Two signalling pathways specify localised expression of the Broad-Complex in Drosophila eggshell patterning and morphogenesis. Development 124, 4639-4647. Deng, W. and Lin, H. (2001). Asymetric germ cell division and oocyte determination during Drosophila oogenesis. Int. Rev. Cytol. 203, 93-138. 116 DiNardo, S., Sher, E., Heemskerk-Jongens, J., Kassis, J. A. & O’Farrell, P. H. (1988) Two-tiered regulation of spatially patterned engrailed gene expression during Drosophila embryogenesis. Nature 332, 604–609. Elowitz, M.B., Levine, A.J., Siggia, E.D. and Swain, P.S. (2002). Stochastic gene expression in a single cell. Science 297, 1183-1186. Ferguson, E. L. and Anderson, K. V. (1992). Lacalized enhancement and repression of the activityof the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development 114, 583-597. Finelli, A. L., Bossie, C.A., Xie, T. and Padgett, R. W. (1994). Mutational analysis of the Drosophila tolloid gene, a human BMP-1 homolog. Development 120, 861-870 Forsberg, E. and Kjellen, L. (2001). Heparan sulfate: lessons from knockout mice. J. Clin. Invest. 108, 175-180. Francois, V., Solloway, M., O'Neill, J. W., Emery, J., and Bier, E. (1994). Dorsal-ventral patterning of the Drosophila embryo depends on a putative negative growth factor encoded by tha short gastrulation gene. Genes Develop. 8, 2602-2616. François, V. and Bier, E. (1995). Xenopus Chordin and Drosophila short gastrulation genes encode homologous proteins functioning in dorsal-ventral axis formation. Cell 80, 19-20. 117 Garcia-Garcia, M. J., Ramain, P., Simpson, P. and Modolell, J. (1999) Different contributions of Pannier and Wingless to the patterning of the dorsal mesothorax of Drosophila. Development 126, 3523–3532 Gelbart, W.M. (1989). The decapentaplegic gene: a TGF-beta homologue controlling pattern formation in Drosophila. Development 107, 65-74. Gerlitz, O. and Basler, K. Wingful, an extracellular feedback inhibitor of Wingless. (2002) Genes Dev 16, 1055 –1059. Giraldez, A. J., Copley, R. R. and Cohen, S. M. (2002) HSPG modification by the secreted enzyme Notum shapes the Wingless morphogen gradient. Dev. Cell 2, 667-676 Goda, E., Kamiyama, S., Uno, T., Yoshida, H., Ueyama, M., Kinoshita-Toyoda A., Toyoda, H., Ueda, R. and Nishihara, S. (2006) Identification and characterization of a novel Drosophila 3'phosphoadenosine 5'-phosphosulfate transporter. J. Biol. Chem. 281, 28508-28517. González-Reyes, A., and St. Johnston, D. (1994). Role of oocyte position in establishment of anterior-posterior polarity in Drosophila. Science 266, 639-642. González-Reyes, A., Elliot, H., and St. Johnston, D. (1995) Polarization of both major body axis in Drosophila by gurken-torpedo signalling. Nature 375, 654-658. 118 Goto, S., Taniguchi, M., Masatoshi, M., Hidenao, T., Sado, Y., Kawakita, M and Hayashi, S. (2001) UDP-sugar transporter implicated in glycosylation and processing of Notch. Nat. Cell Biol. 3, 816-822. Hacker, U., Lin, X. and Perrimon, N. (1997). The Drosophila sugarless gene modulates Wingless signaling and encodes an enzyme involved in polysaccharide biosynthesis. Development 124, 3565-3573. Haerry, T.E., Heslip, T.R., Marsh, J.L. and O’Connor, M.B. (1997). Defects in glucuronate biosynthesis disrupt Wingless signaling in Drosophila. Development. 1243055-64. Han, C., Belenkaya, T. Y., Khodoun, M., Tauchi, M. and Lin, X. (2004). Distinct and collaborative roles of Drosophila EXT family proteins in morphogen signalling and gradient formation. Development 131,1563-75. Han, C., Yan, D., Belenka, T. Y. and Lin, X. (2005). Drosophila glypicans Dally and Dally-like shape the extracellular Wingless morphogen gradient in the wing disc. Development 132, 667679. Hashimoto, C., Gerttula, S. and Anderson, K. V. (1991). Plasma membrane localization of the Toll protein in the syncytial Drosophila embryo: importance of transmembrane signaling for dorsal-ventral pattern formation. Development 111, 1021-1028. 119 Hashimoto, C., Kim, D.R., Weiss, L.A., Miller, J.W. and Morisato, D. (2003). Spatial regulation of developmental signaling by a serpin. Dev. Cell 5,945-950. Houchmandzadeh, B., Wieschaus, E. and Leibler, S. (2002). Establishment of developmental precision and proportions in the early Drosophila embryo. Nature 415, 798-802. Huang, A. D., Rusch, J., and Levine, M. (1997). An antero-posterior Dorsal gradiente in the Drosophila embryo. Genes Develop. 11, 1963-1973. Ip, Y. T., Park, R. E., Kosman, D., Yazdanbakhsh, K., and Levine, M. (1992). Dorsal-twist interactions stablish sanil expression in the presumptive mesoderm of the Drosophila embryo. Genes Develp 6, 1518-1530. Irish, V. F., and Gelbart, W. M. (1987). The decapentaplegic gene is required for dorsal-ventral patterning of the Drosophila embryo. Genes Develop. 1, 868-879. Jackson, S.M., Nakato,H, Sugiura, M., Jannuzi, A., Oakes, R., Kaluza, V., Golden, C. and Selleck S.B. (1997). dally, a Drosophila glypican, controls cellular responses to the TGF-βrelated morphogen, Dpp. Development 124, 4113-4120. Jasuja, R., Allen, B.L., Pappano, W.N., Rapraeger, A.C and Greenspan, D.S. (2004). Cell-surface Heparan Sulfate Proteoglycans potentiate Chordin antagonism of Bone Morphogenetic Protein 120 signaling and are necessary for cellular uptake of Chordin. Journal Biol Chem 279, 51289– 51297. Jiang, W. and Bond, J. S. (1992). Families of metalloendopeptidases and their relationships. FEBS Lett 312, 110-114. Jiang, J., and Levine, M. (1993). Binding affinities and cooperative interactions with bHLH activators delimit treshold responses to the dorsal gradient morphogen. Cell 72, 741-752. Jordan, K.C., Hatfield, S.D., Tworoger, M., Ward, E.J., Fischer, K.A., Bowers, S. and RuoholaBaker, H. (2005). Genome wide analysis of transcript levels after perturbation of the EGFR pathway in the Drosophila ovary. Dev. Dyn. 232, 709-724. Jullien,D., Crozatier,M. and Kas,E. (1997). cDNA sequence and expression pattern of the Drosophila melanogaster PAPS synthetase gene: a new salivary gland marker. Mech. Dev. 68, 179-186. Kaern, m., Elston, T.C., Blake, W.J. and Collins, J.J. (2005). Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Rev. Genet. 6, 451-464. Kirkpatrick, C. A., Dimitroff, B. D., Rawson, J. M. and Selleck, S. B. (2004). Spatial regulation of Wingless morphogen distribution and signaling by Dally-like protein. Dev. Cell 7, 513 –523. 121 Konrad, K. D., Goralski, T. J., Mahowald, A. P. and Marsh, J. L. (1998). The gastrulation defective gene of Drosophila melanogaster is a member of the serine protease superfamily. PNAS 95, 6819-6824. Kreuger, J., Perez, L., Giraldez, A. J. and Cohen, S. M. (2004) Opposing activities of Dally-like glypican at high and low levels of Wingless morphogen activity. Dev. Cell 7, 503-512. Lane, M. E. and Kalderon, D. (1994). RNA localization along the anteroposterior axis of the Drosophila oocyte requires PKA-mediated signal transduction to direct normal microtubule organization. Genes Dev. 8, 2986-2995. Levine, M. and Davidson, E.H. (2005). Gene regulatory networks for development. PNAS 102,4936-4942. Lin, X., Perrimon, N. (1999). Dally cooperates with Drosophila Frizzled 2 to transduce Wingless signalling. Nature 400, 281-284. Lind, T., Tufaro, F., McCornick, C., Lindahl, U. and Lidholt, K. (1998). The putative tumor suppressors EXT1 and EXT2 are glycosyltransferases required for the biosynthesis of heparan sulfate. J Biol Chem. 273,26265-8. Lindsley, D. L. e Zimm, G. G. (1992). The Genome of Drosophila melanogaster. Academic Press. 122 Ligoxygakis, P., Roth, S. and Reichhart, J.M. (2003). A serpin regulates dorsal-ventral axis formation in the Drosophila embryo. Curr. Biol. 13, 2097-2102. Lyle,S., Stanczak,J., Ng,K. and Schwartz,N.B. (1994). Rat chondrosarcoma ATP sulfurylase and adenosine 5`-phosphosulfate kinase reside on a single bifunctional protein. Biochemistry, 33, 5920-5925 Lopez-Casillas. F., Wrana, J.L. and Massague, J. (1993). Betaglycan presents ligand to the TGF beta signaling receptor. Cell 73, 1435-44. Lowry, W. E., Blanpain, C., Nowak, J.A., Guash, G., Lewis, L. and Fuchs, E. (2005) Defining the impact of β-catenin/Tcf transactivation on epithelial stem cells. GenesDev. 19, 1596–1611. Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H. and Ismagilov, R. F. (2005) Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature 434, 1134–1138. Luders, F., Segawa, H., Stein, D., Selva, E. M., Perrimon, N., Turco, S. J. and Hacker, U. (2003). Slalom encodes an adenosine 3'-phosphate 5'-phosphosulfate transporter essential for development in Drosophila. EMBO 22, 3635-3644. 123 Marqués, G., Musacchio, M., Shimell, M.J., Wunnenberg-Staplenton, K. ans O´Connor, M.B. (1997a). Production of a DPP activity gradient in the early Drosophila embryo through the opposing actions of the SOG and TLD proteins. Cell 91, 417-426. Martinez Arias, A. (2000) The informational content of gradients of Wnt proteins. Sci. STKE 2000, PE1. Martinez Arias, A., Baker, N. E. & Ingham, P. W. (1988) Role of segment polarity genes in the definition and maintenance of cell states in the Drosophila embryo. Development 103, 157–170. Massagué, J. (1990). Transforming growth factor-alpha. A model for membrane-anchored growth factors.J Biol Chem. 265,:21393-6. McCornick, C., Leuduc, Y., Martindale, D., Marttison, K., Esford, L.E., Dyer, A.P. and Tufaro, F. (1998). The putative tumour suppressor EXT1 alters the expression of cell-surface heparan sulfate.Nat Genet.19,158-61. Micklen, D. R., Dasgunta, R., Elliot, H., Gergely, E., Davidson, C., Brand, A., González Reyes, A. and St. Johnston, D. (1997). The mago nashi gene is required for the polarization of the oocyte and the formation of perpendicular axes in Drosophila. Curr. Biol. 7, 468-478. 124 Morisato, D. and Anderson, K. V. (1994). The spätzel gene encodes a component of the extracellular signaling pathway establishing the dorsal-ventral pattern of the Drosophila embryo.Cell 76, 677-688. Nakato, H., Futch, T.A. and Selleck, S.B.(1995). The division abnormally delayed (dally) gene: a putative integral membrane proteoglycan required for cell division patterning during postembryonic development of the nervous system in Drosophila. Development 121, 3687-3702. Nardini. M. and Dijkstra, B.W. (1999). Alpha/beta hydrolase fold enzymes: the family keeps growing. Curr Opin Struc Biol 9, 732-737. Narita, R., Yamashita, H., Goto, A., Imai, H., Ichihara, S., Mori, H. and Kitagawa, Y. (2004) Syndecan-dependent binding of Drosophila hemocytes to laminin alpha3/5 chain LG4-5 modules: potential role in sessile hemocyte islets formation. FEBS Lett. 576,127-32. Neumann, C.J. and Cohen, S.M.(1997). Long range action of Wingless organizes the dorsalventral axis of the Drosophila wing. Development 124, 871-880. Nguyen T, Jamal J, Shimell MJ, Arora K, O`Connor MB. (1994) Characterization of tolloidrelated-1: a BMP-1-like product that is required during larval and pupal stages of Drosophila development. Dev Biol. 166,569-86. 125 Nguyen, M., Park, S., Marques, G., Arora, K. (1998). Interpretation of a BMP activity gradient in Drosophila embryos depends on synergistic signaling by two type I receptors, SAX and TKV. Cell 95, 495– 506. Oelgeschlager, M., Larrain, J., Geissert, D. and Robertis, E..M. (2000). The evolutionary conserved BMP-binding protein Twisted gastrulation promotes BMP signaling. Nature 405, 757763. O'Neill, J. W. e Bier, E. (1994). Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenintagged RNA probes. Biotechniques 17(5): 870, 874-5. Olwin, B.B., Rapraeger, A. (1992). Repression of myogenic differentiation by aFGF, bFGF, and K-FGF is dependent on cellular heparan sulfate. J. Cell Biol. 118, 631-639. Padgett, R.W., St. Johnston, R.D. and Gelbart, W.M.(1987). A transcript from a Drosophila pattern gene predicts a protein homologous to the transforming growth factor-beta family. Nature 325, 81-84. Peri, F. and Roth, S. (2000). Combined activities of Gurken and decapentaplegic specify dorsal chorion structures of the Drosophila egg. Development 127, 841-850. Posakony, L.G., Raftery, L.A. and Gelbart, W.M. (1990). Wing formation in Drosophila melanogaster requires decapentaplegic gene function along the anterior-posterior compartment boundary. Mech Dev 33,69-82. 126 Paulsson, J. (2004). Summing up the noise in gene networks. Nature 427, 415-418. Raser, J.M. and O’Shea, E.K. (2004). Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science 1811-1814. Ralston, A. and Blair, S. S. (2005). Long-range Dpp signaling is regulated to restrict BMP signaling to a crossvein competent zone. Dev. Biol. 280, 187-200. Rao, C.V., Wolf, D.M. and Arkin, A.P. (2002). Control, exploitation and tolerance of intracellular noise. Nature 420, 231-237. Rapraeger, A.C, Krufka, A., Olwin, B.B. (1991). Requirement of heparan sulfate for bFGFmediated fibroblast growth and myoblast differentiation. Science 252, 1705-1708. Ray, R. P., Arora, K., Nüsslein-Volhard, C. and Gelbart, W.M. (1991). The control of the fate along the dorsal-ventral axis of the Drosophila embryo. Development 113, 35-54. Ray, R. P. and Schüpbach, T. (1996). Intercellular signaling and the polarization of body axis during Drosophila oogenesis. Genes Develp 10, 1711-1723. 127 Ray, R.P., Wharton, K.A. (2001). Context-dependent relationships between the BMPs gbb and dpp during development of the Drosophila wing imaginal disk. Development 128, 3913– 3925. Reichsman. F., Smith. L. and Cumberledge, S. (1996). Glycosaminoglycans can modulate extracellular localization of the wingless protein and promote signal transduction. .J Cell Biol. 135, 819-27. Ross, J.J., Shimmi, O., Vilmos, P., Petryk, A., Kin, H., Gaudez, K., Hermanson, S., Ekker, S.C., O´Connor, M.B and Marsh, J.L. (2001). Twisted gastrulation is a conserved extracellular BMP antagonist. Nature 410, 479-483. Rose, T., LeMosy, E.K., Cantwell, A.M., Banerjee-Roy, D., Skeath, J.B. and Di Cera, E. (2003). Three-dimensional models of proteases involved in patterning of the Drosophila embryo. Crucial role of pre-dicted cation binding sites. J. Biol. Chem. 278, 11320-11330. Roth, S., Neuman-Silberbeg, E. S., Barcelo, G., and Schüpbach, T. (1995). cornichon and the EGF receptor signalling process are necessary for both anterior-posterior and dorsal-ventral pattern formation in Drosophila. Cell 81, 967-978. Roth, S. (1998). Drosophila development: the secrets of delayed induction.Curr Biol. 31, R90610. Rowson, J.M., Dimitroff, B., Johnson, K.G., Rowson, J.M., Ge, X., Van Vactor, D. and Selleck, S.B. (2005). The heparan sulfate proteoglycans Dally-like and Syndecan have distinct functions in axon guidance and visual-system assembly in Drosophila. Curr. Biol. 15, 833-838. 128 Rushlow, C., Han, K., Manley, J.L. and Levine, M. (1989). The graded distribution of the dorsal morphogen is initiated by selective nuclear transport in Drosophila. Cell 59, 1165-1177. Rushlow, C. and Levine, M.(1990). Role of zerknüllt gene in dorsal-ventral pattern formation in Drosophila. Adv. Genet. 27, 277-307. Scott, I.C., Blitz, I.L., Pappano, W.N., Maas, S.A., Chon, K.W. and Greenspan, D.S.(2001). Homologues of Twisted gastrulation are extracellular cofactors in antagonism of BMP signaling. Nature 410, 475-478. Selva, E.M., Hong, K., Baeg, G.H., Beverley, S.M., Turco, S.J., Perrimon, N. and Hacker, N. (1999). Dual role of the fringe connection gene in both heparan sulphate and fringe-dependent signalling events.Nat Cell Biol. 3,809-15. Sen, J., Goltz, J.S., Stevens, L. and Stein, D. (1998). Spatially restricted expression of pipe in the Drosophila egg chamber defines embryonic dorsal-ventral polarity. Cell 95, 471-481. Serpe, M., Ralston, A., Blair, S. S., O’Connor, M.B. (2005). Matching catalytic activity to developmental function: Tolloid-related process Sog in order to help specify the posterior crossvein in the Drosophila wing. Development 132, 2645-2656. 129 Schneider, D. S., Jin, Y., Morisato, D. and Anderson, K. V. (1994). A processed form of the spätzel protein defines the dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo. Development 120, 1243-1250. Shimell, M. J., Ferguson, E. L., Childs, S. R. and O’Connor, M. B. (1991). The Drosophila dorsal-ventral patterning gene tolloid is related to human bone morphogenetic protein 1. Cell, 67, 469-481. Shimme, O. and O´Connor, M.B.(2003). Physical properties of Tld, Sog, Tsg and Dpp protein interactions are predicted to help create a sharp boundary in BMP signals during dorsoventral patterning of the Drosophila embryo. Development 130, 4673-4682. Shimmi, O., Ralston, A., Blair, S. S. and O’Connor, M. B. (2005). The crossveinless gene encodes a new member of the Twisted gastrulation family of BMP-binding proteins which, with Short gastrulation, promotes BMP signaling in the crossveins of the Drosophila wing. Dev. Biol. 282 70-83. Shravage, B.V., Altmann, G., Technau, M. and Roth, S. (2007). The role of Dpp and its inhibitors during eggshell patterning in Drosophila. Development 134,2261-2271. Simpson, P. (1983). Maternal-zygotic gene interactions during formation of the dorsoventral pattern in Drosophila embryos. Genetics 105, 615-632. 130 Smith, C. L. and DeLotto, R. (1994). Ventralizing signal determined by protease activation in Drosophila embryogenesis. Nature 368, 548-551. Spring, J., Paine-Saunders, S., Hynes, R.O., Bernfield, M. (1994). Drosophila syndecan: conservation of a cell-surface heparan sulfate proteoglycan. PNAS 8, 3334-3338. Sotillos S, de Celis JF (2005) Interactions between the Notch, EGFR, and Decapentaplegic signaling pathways regulate vein differentiation during Drosophila pupal wing development. Dev Dyn. 232,738-52. Srinivasan, S., Rashka, K. E. and Bier, E. (2002). Creation of a Sog morphogen gradient in the Drosophila embryo. Dev. Cell 2, 91-101. Stathopoulos, A., Van Dreth, M., Erives, A., Markstein, M. and Levine, M. (2002). Wholegenome analysis of dorsal-ventral patterning in the Drosophila embryo. Cell 111, 687-701. Stöcker, W., Gomis-Rüth, F-X., Bode, W., and Zwilling, R. (1993). Implications of the treedimensional structure of astacin for the structure and function of the astacin family of zincendopeptidades. Eur. J. Biochem. 214, 215-231. Steward, R., Zusman, S. B., Juang, L.H. and Schedl, P. (1988). The dorsal protein is distributed in a gradient in early Drosophila embryos. Cell 55,487-495. 131 Tautz, D. and Pfeifle, C. (1989). A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma 98(2): 81-85. Telter, W. (1975). Development and physiology of the oocyte-nurse cell syncitium. Adv. Insect Physiol. 11, 223-319. The, I., Bellaiche, Y. and Perrimon, N. (1999). Hedgehog movement is regulated through tout velu-dependent synthesis of heparan sulfate proteoglycan. Mol. Cell 4, 633-639. Theurkaut, W.C.(1994). Microtubules and cytoplasm organization during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 165, 352-360. Thisse,B., Stoezel, C., El Messal, M and Perrin-Schmitt, F. (1987). Genes of the Drosophila maternal group control the spacific expression of the zygotic gene twist in presumptive mesodermal cells. Genes Dev. 1, 709-715 Twombly, V., Blackman, R.K., Jin, H., Graft, J.M., Padgett, R.W., Gelbart, W.M. (1996). The TGF-beta signaling pathway is essential for Drosophila oogenesis. Development, 122, 15551565. Tsuda, M., Kamimura, K., Nakato, H., Archer, M., Staatz, W., Fox, B., Humphrev, M., Olson, S., Fuich, T., Kaluza, V., Siegfried, E., Stam, L., Stam, Selleck, S.B. (1999). The cell-surface proteoglycan Dally regulates Wingless signalling in Drosophila. Nature 276-280. 132 Vilmos, P., Sousa-Neves, R., Lukacsovich, T. and Marsh, J. L. (2005). The crossveinless gene of Drosophila represents a new family of Twisted Gastrulation-like modulators of BMP signaling. EMBO Rep. 6, 262-267. Wakimoto, . B. T., Turner, F. R., and Kaufman, T. C. (1984). Defects in embryogenesis in mutants associated with the Antennapedia gene complex of Drosophila melanogaster. Develp Biol. 102, 147-172. Whalen, A. M. and Steward, R. (1993). Dissociation of the dorsal-cactus complex and phosphorylation of the dorsal protein correlate with the nuclear localization of dorsal. J. Cell Biol. 123, 523-534. Wharton, K. A., Ray, R. P. and Gelbart, W. M. (1993). An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development 117, 807-822. Wozney, J.M., Rosen, V., Celeste, A.J., Mitsock, L.M., Whitters, M.J., Kriz, R.W., Hewick, R.M. and Wang, E.A. (1988). Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science 242, 1528-1534. 133 Yakoby, N., Bristow, C.A., Kalifa, R., Schüpbach, T. and Shvartsman, S.Y. Transcriptional profile of EGFR signaling in Drosophila ovary. [Apresentação no 46º Encontro Anual de Drosophila; 2005 abril. 30 março-3 abril; San Diego, USA]. Yu, K., Sturtevant, M. A., Biehs, B., Francois, V., Padgett, R. W., Blackman, R. K. and Bier, E. (1996). The Drosophila decapentaplegic and short gastrulation genes function antagonistically during adult wing vein development. Development 122, 4033-4044. Yu, K., Srinivasan, S., Shimmi, O., Biehs, B., rashka, K.E., Kimelmas, D., O´Connor, M.B. and Bier, E.(2000). Processing of the Drosophila Sog protein creates a novel BMP inhibitory activity. Development 127, 2143-2154. Yu, K., Kang, K. H., Heine, P., Pyati, U., Srinivasan, S., Biehs, B., Kimelman, D. and Bier, E. (2004). Cysteine repeat domains and adjacent sequences determine distinct bone morphogenetic protein modulatory activities of the Drosophila Sog protein. Genetics 166, 1323-1336. Zecca, M., Basler, K. and Struhl, G.(1995). Sequential organizing activities of engrailed, hedgehog, and decapentaplegic in the Drosophila wing. Development 121, 2265-2278. Zhu, X., Sen, J., Stevens, L., Goltz, J.S. and Stein, D. (2005). Drosophila Pipe protein activity in the ovary and the embryonic salivary gland does not require heparan sulfate glycosaminoglycans. Development 132, 3813-3822. 134 Zusman, S. B., Sweeton, D. and Wieschaus, E. F. (1988). short gastrulation, a mutation causing delays in stage specific cell shape changes during gastrulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 129, 417-427. 135 Anexo 1 Artigo: Graded maternal short gastrulation protein contributes to embryonic dorsalventral patterning by delayed induction. Carneiro,K., Fontenele, M., Negreiros, E., Bier, E. and Araujo, H. 136 Anexo 2 MANKLRKSNAIEWATATGTVPLLERSCCHSEDAALEPQASKTSH REQAPILRHLSQLSHLLIIAGLLIVCLAGVTEGRRHAPLMFEESDTGRRSNRPAVTEC QFGKVLRELGSTWYADLGPPFGVMYCIKCECVAIPKKRRIVARVQCRNIKNECPPAKC DDPISLPGKCCKTCPGDRNDTDVALDVPVPNEEEERNMKHYAALLTGRTSYFLKGEEM KSMYTTYNPQNVVATARFLFHKKNLYYSFYTSSRIGRPRAIQFVDDAGVILEEHQLET TLAGTLSVYQNATGKICGVWRRVPRDYKRILRDDRLHVVLLWGNKQQAELALAGKVAK YTALQTELFSSLLEAPLPDGKTDPQLAGAGGTAIVSTSSGAASSMHLTLVFNGVFGAE EYADAALSVKIELAERKEVIFDEIPRVRKPSAEINVLELSSPISIQNLRLMSRGKLLL TVESKKYPHLRIQGHIVTRASCEIFQTLLAPHSAESSTKSSGLAWVYLNTDGSLAYNI ETEHVNTRDRPNISLIEEQGKRKAKLEDLTPSFNFNQAIGSVEKLGPKVLESLYAGEL GVNVATEHETSLIRGRLVPRPVADARDSAEPILLKRQEHTDAQNPHAVGMAWMSIDNE CNLHYEVTLNGVPAQDLQLYLEEKPIEAIGAPVTRKLLEEFNGSYLEGFFLSMPSAEL IKLEMSVCYLEVHSKHSKQLLLRGKLKSTKVPGHCFPVYTDNNVPVPGDHNDNHLVNG ETKCFHSGRFYNESEQWRSAQDSCQMCACLRGQSSCEVIKCPALKCKSTEQLLQRDGE CCPSCVPKKEAADYSAQSSPATNATDLLQQRRGCRLGEQFHPAGASWHPFLPPNGFDT CTTCSCDPLTLEIRCPRLVCPPLQCSEKLAYRPDKKACCKICPEGKQSSSNGHKTTPN NPNVLQDQAMQRSPSHSAEEVLANGGCKVVNKVYENGQEWHPILMSHGEQKCIKCRCK DSKVNCDRKRCSRSTCQQQTRVTSKRRLFEKPDAAAPAIDECCSTQCRRSRRHHKRQP HHQQRSSS Os 6 sítios passíveis de glicosilação encontram-se em azul, o CR1 em vermelho, oCR2 em verde, o CR3 em verde e o CR4 em roxo. Na tabela a seguir está representada a posição de cada possível sítio de N-glicosilação dentro da proteína Sog além da seqüencia de aminoácidos que caracterizam cada sítio. Está representado também o potencial de cada sítio de ser glicosilado. Se este potencial for superior a 0.5 o sítio é considerado como glicosilado. 137 Drosophila melanogaster Xenopus laevis Danio rerio Mus musculus Posição e Sítio 179 NTDA 287 NATG 520 NISL 666 NGSY 752 NESE 821 NATD 244 NRST 350 NISA 416 NPTK 433 NGTL 735 NCSQ 829 NPSD 347 NITA 430 NGSL 827 NPSD 347 NTSA 430 NGSL 837 NPTD 877 NQSW 138 Potencial 0.6940 0.4709 0.6192 0.4699 0.4721 0.4829 0.5143 0.7003 0.7720 0.7311 0.6003 0.5560 0.7357 0.7044 0.6171 0.5806 0.7299 0.6048 0.4038 + + + ++ +++ ++ + + ++ ++ + ++ ++ - Livros Grátis ( http://www.livrosgratis.com.br ) Milhares de Livros para Download: Baixar livros de Administração Baixar livros de Agronomia Baixar livros de Arquitetura Baixar livros de Artes Baixar livros de Astronomia Baixar livros de Biologia Geral Baixar livros de Ciência da Computação Baixar livros de Ciência da Informação Baixar livros de Ciência Política Baixar livros de Ciências da Saúde Baixar livros de Comunicação Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE Baixar livros de Defesa civil Baixar livros de Direito Baixar livros de Direitos humanos Baixar livros de Economia Baixar livros de Economia Doméstica Baixar livros de Educação Baixar livros de Educação - Trânsito Baixar livros de Educação Física Baixar livros de Engenharia Aeroespacial Baixar livros de Farmácia Baixar livros de Filosofia Baixar livros de Física Baixar livros de Geociências Baixar livros de Geografia Baixar livros de História Baixar livros de Línguas Baixar livros de Literatura Baixar livros de Literatura de Cordel Baixar livros de Literatura Infantil Baixar livros de Matemática Baixar livros de Medicina Baixar livros de Medicina Veterinária Baixar livros de Meio Ambiente Baixar livros de Meteorologia Baixar Monografias e TCC Baixar livros Multidisciplinar Baixar livros de Música Baixar livros de Psicologia Baixar livros de Química Baixar livros de Saúde Coletiva Baixar livros de Serviço Social Baixar livros de Sociologia Baixar livros de Teologia Baixar livros de Trabalho Baixar livros de Turismo