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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
MARCIA LUZIA DIAS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA CREATINA QUINASE EM CÉREBRO
DE RATOS SUBMETIDOS À INSUFICIÊNCIA RENAL AGUDA
CRICIÚMA, JANEIRO DE 2008
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MARCIA LUZIA DIAS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA CREATINA QUINASE EM CÉREBRO
DE RATOS SUBMETIDOS À INSUFICIÊNCIA RENAL AGUDA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências da Saúde da
Universidade do Extremo Sul Catarinense
para obtenção do Título de Mestre em
Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Emilio Luiz Streck
CRICIÚMA, JANEIRO DE 2008
RESUMO
A encefalopatia pode ocorrer em pacientes com insuficiência renal aguda (IRA) ou
crônica.
Os
mecanismos
fisiopatológicos
responsáveis
pelas
complicações
neurológicas desses pacientes ainda não estão completamente elucidados.
Considerando que a creatina quinase (CK) é uma enzima crucial para a manutenção
da homeostase energética de tecidos altamente metabólicos, como o cérebro, que
esta pode ser inibida por radicais livres e que o estresse oxidativo está
possivelmente envolvido na patogênese da encefalopatia urêmica, nesse trabalho
verificou-se a atividade da CK em cérebro (cerebelo, córtex cerebral, córtex préfrontal, estriado e hipocampo) de ratos submetidos a modelo animal de IRA por
isquemia e reperfusão e o efeito de antioxidantes (N-acetilcisteína (NAC) e
deferoxamina (DFX)) sobre a atividade da enzima. Verificou-se que a CK não foi
alterada no cerebelo e estriado dos animais submetidos à insuficiência renal aguda.
Os resultados também mostraram que 12 horas após a indução da insuficiência
renal aguda a CK estava inibida no córtex pré-frontal e hipocampo dos ratos e que o
tratamento com antioxidantes preveniu este efeito. A indução de IRA também inibiu
a atividade de CK no córtex cerebral, porem a inibição ocorreu tanto no grupo das 6
horas como no de 12 horas após a indução. Além disso, NAC isolada ou em
associação com DFX apresentou-se apta a evitar a inibição da atividade de CK.
Contudo, a inibição da atividade da CK cerebral após a indução da IRA pode estar
associada a um dano neuronal como também pode estar envolvida na patogênese
da encefalopatia urêmica.
Palavras-chave:
deferoxamina.
insuficiência
renal;
creatina
quinase;
N-acetilcisteína;
ABSTRACT
Encephalopathy may accompany acute or chronic renal failure, and the mechanisms
responsible for neurological complications in patients with renal failure are poorly
known. Considering that creatine kinase (CK) is important for brain energy
homeostasis and is inhibited by free radicals, and that oxidative stress is probably
involved in the pathogenesis of uremic encephalopathy, we measured CK activity
(hippocampus, striatum, cerebellum, cerebral cortex and prefrontal cortex) in brain if
rats submitted to renal ischemia and the effect of administration of antioxidants (Nacetylcysteine, NAC and deferoxamine, DFX) on this enzyme. We verified that CK
activity was not altered in cerebellum and striatum of rats. CK activity was inhibited in
prefrontal cortex and hippocampus of rats 12 hours after renal ischemia. The
treatment with antioxidants prevented such effect. Cerebral cortex was also affected,
but in this area CK activity was inhibited 6 and 12 hours after renal ischemia.
Moreover, only NAC or NAC plus DFX were able to prevent the inhibition on the
enzyme. Although it is difficult to extrapolate our findings to the human condition, the
inhibition of brain CK activity after renal failure may be associated to neuronal loss
and may be involved in the pathogenesis of uremic encephalopathy.
Keywords: renal failure; creatine kinase; N-acetylcysteine; deferoxamine.
SUMÁRIO
1 Introdução
6
1.1 Metabolismo energético
6
1.2 Perfil metabólico do cérebro
9
1.3 Creatina quinase
10
1.4 Insuficiência renal aguda
13
1.5 Defesas antioxidantes
16
1.5.1 N-acetilcisteína
17
1.5.2 Deferoxamina
18
2 Objetivos
20
2.1 Objetivo geral
20
2.2 Objetivos específicos
20
3 Métodos e Resultados
21
Artigo: “Inhibition of brain creatine kinase activity after renal ischemia is
attenuated by N-acetylcysteine and deferoxamine administration”,
submetido para publicação na revista Neuroscience Letters.
22
4 Discussão
37
5 Referências
40
1 INTRODUÇÃO
1.1 Metabolismo energético
Os seres vivos precisam de energia para realizar várias funções, como, por
exemplo, o transporte ativo de íons e moléculas, síntese de macromoléculas e
outras biomoléculas a partir de precursores simples e para a contração muscular. A
energia necessária para realizar essas funções é obtida com a oxidação de
substâncias pela respiração celular. Adenosina trifosfato (ATP) é o principal
combustível da célula na maioria dos processos que precisam de energia. A energia
é liberada pela hidrólise de ATP e serve para impulsionar uma série de reações
(Lehninger et al., 2002; Voet et al., 2002).
A glicose é a principal fonte de energia utilizada pela maioria das células e
ocupa uma posição central no metabolismo. A glicose é transportada para dentro
das células por proteínas transportadoras específicas. Ao entrar na célula, a glicose
pode ser metabolizada em diferentes rotas metabólicas. A principal via de
degradação da glicose é a glicólise, uma rota que envolve uma seqüência de
reações que ocorre no citosol e forma como produto final o piruvato. Uma molécula
de glicose gera duas moléculas de piruvato e de ATP. Além disso, a glicose pode
participar do ciclo das pentoses, que tem como objetivo formar nicotinamida adenina
dinucleotídio fosfato (NADPH), um doador de elétrons de fundamental importância
em biossínteses redutoras, e ribose-5-fosfato, precursor na biossíntese de
nucleotídios. Quando a célula está com elevados níveis de ATP, a glicose pode ser
armazenada na forma de glicogênio, que pode ser liberado e utilizado rapidamente
se a célula necessitar de energia, ou formar triacilglicerol (Lehninger et al., 2002).
Em organismos superiores, o piruvato, formado na glicólise a partir de glicose,
pode seguir duas rotas metabólicas distintas. Quando há baixa quantidade de
oxigênio, como no trabalho muscular forçado ou na hipóxia, o piruvato pode ser
convertido em lactato pela enzima lactato desidrogenase, formando ATP e
consumindo nicotinamida adenina dinucleotídio (NADH). No entanto, só uma
pequena quantidade da energia da glicose é liberada pela conversão de piruvato a
lactato (Lehninger et al., 2002; Voet et al., 2002).
Em condições aeróbicas, o piruvato é transportado para dentro da mitocôndria
e sofre ação do complexo enzimático da piruvato desidrogenase, que forma acetil
coenzima A (acetil-CoA). A acetil-CoA inicia o ciclo de Krebs. É importante salientar
que a acetil-CoA pode ser formada também pela oxidação de ácidos graxos e
aminoácidos (Lehninger et al., 2002).
O ciclo de Krebs ocorre na matriz mitocondrial e consiste de uma seqüência
de reações onde, em cada volta do ciclo, são formadas três moléculas de NADH,
uma de flavina adenina dinucleotídio (FADH2), duas de CO2 e uma de guanosina
trifosfato (GTP). O NADH e FADH2 produzidos no ciclo de Krebs são carreadores de
elétrons e são utilizados na cadeia respiratória para a produção de ATP na
fosforilação oxidativa. Altos níveis de ATP inibem o ciclo de Krebs por mecanismos
complementares em vários locais do ciclo. Um dos pontos de controle é a conversão
de piruvato a acetil-CoA pela enzima piruvato desidrogenase, inibida por ATP, acetilCoA e NADH (Lehninger et al.; Voet et al., 2002).
A cadeia respiratória e a fosforilação oxidativa, assim como o ciclo de Krebs,
ocorrem nas mitocôndrias. A cadeia respiratória é formada por uma série de
complexos protéicos, onde ocorre a transferência de elétrons doados por NADH e
FADH2. A transferência de elétrons pela cadeia respiratória leva ao bombeamento
de prótons da matriz para o lado citosólico da membrana mitocondrial interna. O
gradiente de prótons é usado para impulsionar a síntese de ATP (Heales et al.,
1999; Lehninger et al., 2002).
A cadeia respiratória é composta de quatro complexos (I, II, III e IV). O
complexo I, também chamado de NADH: ubiquinona oxirredutase, realiza a
transferência de elétrons do NADH para a ubiquinona, formando ubiquinol. Essa
reação faz com que dois prótons sejam bombeados para o espaço intermembrana.
O complexo II, também denominado de succinato: ubiquinona oxirredutase, é
formado pela enzima succinato desidrogenase e três subunidades hidrofóbicas.
Esse complexo participa do ciclo de Krebs e transfere elétrons do succinato para a
ubiquinona e também forma ubiquinol. O complexo III, ou citocromo c oxirredutase,
transfere elétrons do ubiquinol para o citocromo c, reação que serve para o
bombeamento de mais quatro prótons. O complexo IV, mais conhecido como
citocromo c oxidase, transfere elétrons para do citocromo c para o oxigênio e forma
água. Nessa etapa os últimos dois prótons são bombeados (Voet et al., 2002).
O gradiente eletroquímico formado pelo bombeamento de prótons durante a
cadeia respiratória mitocondrial é utilizado como força-motriz para o complexo V, ou
ATP sintase, formar ATP (fosforilação oxidativa). O ATP é transportado para fora da
mitocôndria com o concomitante transporte de adenina difosfato (ADP) para dentro
da mitocôndria, através de um sistema antiporte (Heales et al., 1999; Lehninger et
al., 2002; Voet et al., 2002).
1.2 Perfil metabólico do cérebro
O cérebro humano representa somente 2% do peso corporal, mas o consumo
de energia por esse órgão é de aproximadamente 60% do total de utilização da
glicose pelo corpo. O maior gasto desta energia se dá para gerar, processar e
transmitir os impulsos, o que representa a principal função do sistema nervoso
central. O cérebro é extremamente dependente do metabolismo para manter sua
integridade
funcional
e
estrutural,
porém
suas
reservas
energéticas
são
extremamente pequenas em relação à sua demanda. Devido a esta dependência, o
cérebro necessita de um abastecimento contínuo e adequado de oxigênio e glicose.
Tanto o oxigênio quanto a glicose são enviados para todas as regiões do cérebro
através da circulação sangüínea e esta é regulada para que o fluxo sangüíneo
cerebral se mantenha constante em diversas situações (Berg et al., 2004; Gusatti,
2006).
A regulação do fornecimento de oxigênio e glicose pelo fluxo sangüíneo
cerebral é ajustada de acordo com as necessidades do tecido. O fornecimento
destes substratos é importante para a produção de ATP, principalmente pelo
metabolismo oxidativo (Gusatti, 2006).
A glicose é o principal combustível energético utilizado pelo cérebro e seu
transporte através da barreira sangue-cérebro ocorre por difusão facilitada mediada
por proteínas transportadoras (Murray, 2002; Gusatti, 2006).
O consumo diário de glicose do cérebro é de 120 gramas, correspondendo a
cerca de 60% da utilização de glicose por todo o organismo no estado de repouso.
Cerca de 60% a 70% é utilizada para impulsionar mecanismos de transporte que
mantém o potencial de sódio e potássio de membrana, necessária à transmissão
dos impulsos nervosos. O cérebro também tem de sintetizar neurotransmissores e
seus receptores para propagar os impulsos nervosos (Berg et al., 2004). A
concentração de glicose baixa resulta em disfunção cerebral, podendo levar o
individuo ao coma, dano irreversível e até a morte (Voet et al., 2002).
1.3 Creatina quinase
Em 1927 foi descoberta a fosfocreatina, sete anos mais tarde, em 1934,
descobriu-se a reação da creatina quinase. A partir destas descobertas as pesquisas
direcionaram-se principalmente nos aspectos bioquímicos, fisiológicos, e patológicos
da reação da creatina quinase e em seu envolvimento no metabolismo do “fosfato de
alta energia” das células e tecidos com altas demandas energéticas. Este sistema é
associado a funções importantes, principalmente no cérebro, tais como o
tamponamento energético (regenerando ATP) e a transferência do ATP dos sítios
produtivos para os de consumo (Wyss et al., 1992; Wyss e Kaddurah-Daouk, 2000).
A creatina quinase é uma enzima que possui um papel central no
metabolismo energético, principalmente para tecidos com alta demanda energética,
como cérebro, músculo cardíaco e esquelético, onde funciona como um efetivo
sistema de tampão para os níveis celulares de ATP, sendo assim é uma enzima
crucial para a homeostase energética, ou seja, atuando como um sistema auxiliar de
manutenção energética (Pilla et al., 2003).
A creatina quinase consiste de dois domínios, um pequeno domínio de
natureza a-helicoidal e um amplo domínio contendo uma lâmina ß antiparalela
produzida por oito intermitências franqueadas por sete a-hélices, o seu local ativo
está localizado entre os dois domínios e é coberto por resíduos que são
conservados dentro da família creatina quinase. Além disso, as isoenzimas da
creatina quinase possuem no seu local ativo um grupo sulfidril que é altamente
reativo, desta forma este grupo pode ser uma maneira tanto para inibir a ativação da
creatina quinase como proteger contra o dano irreversível durante períodos de
estresse oxidativo, entretanto as isoenzimas creatina quinase foram identificadas
como alvos primários da modificação e inativação irreversível pelas espécies
reativas de oxigênio (Wyss e Kaddurah-Daouk, 2000).
A reação da creatina quinase catalisa a transferência metabolicamente
reversível do grupamento N-fosforil da fosfocreatina para o ADP regenerando o ATP
(Wyss e Kaddurah-Daouk, 2000; Pilla et al., 2003; Berg et al., 2004).
A creatina quinase possui cinco formas diferentes de apresentação nas
células, sendo duas mitocondriais e três citoplasmáticas. No citosol encontramos
dímeros da creatina quinase e são denominados creatina quinase-BB, encontrada
predominantemente
no
cérebro,
creatina
quinase-MB,
encontrada
predominantemente no miocárdio e creatina quinase-MM, predominante do músculo
esquelético (Wyss e Kaddurah-Daouk, 2000; Lopes et al., 2005).
Neste sistema o grupo fosfato do ATP, sintetizado dentro da matriz
mitocondrial, é transferido pela creatina quinase mitocondrial no espaço entre as
membranas mitocondriais à creatina para produzir ADP mais fosfocreatina. O ADP
liberado pela reação creatina quinase mitocondrial pode ser transportado
diretamente de volta para a matriz onde é refosforilado à ATP. A fosfocreatina deixa
as mitocôndrias e se difunde através do citosol para os locais de consumo do ATP.
Lá, as isoenzimas citosólicas creatina quinase regeneram localmente o ATP e assim
garantem um alto potencial de fosforilação na vizinhança indicada das respectivas
ATPases. A creatina então liberada se difunde de volta às mitocôndrias, fechando
com isso o ciclo (Wyss e Kaddurah-Daouk, 2000).
Normalmente, a atividade isoenzimática detectada no soro humano é de 96%
para creatina quinase-MM e de 4% para a creatina quinase-MB. O dímero BB é
encontrado basicamente no cérebro, devendo estar ausente no sangue periférico de
indivíduos normais. Contudo, uma forma atípica de BB pode ser liberada pelo trato
gastrintestinal, próstata, bexiga, rins e útero, em casos de comprometimento maciço
desses órgãos (Camarozano e Henriques, 1996).
Em músculos esqueléticos de contração rápida um grande pool de
fosfocreatina está disponível para a regeneração imediata do ATP hidrolisado
durante curtos períodos de trabalho intenso, já os músculos esqueléticos de
contração lenta e o coração dependem de uma oferta mais contínua dos fosfatos de
alta energia nos locais de utilização do ATP (Wyss e Kaddurah-Daouk, 2000). Além
disso, o sistema creatina quinase desempenha um alto grau de flexibilidade e é
capaz de se adaptar aos requerimentos fisiológicos peculiares de um dado tecido
(Wyss e Kaddurah-Daouk, 2000; Pilla et al., 2003).
Estudos anteriores mostraram que a atividade total da creatina quinase e o
conteúdo de creatina são mais baixos no cérebro que no músculo esquelético ou
coração, e as concentrações de fosfocreatina e creatina total como também o fluxo
no decorrer da reação de creatina quinase estão significativamente mais altos na
massa cinza que na massa branca do cérebro humano (Wyss e Kaddurah-Daouk,
2000).
O
sistema
creatina
quinase/fosfocreatina
mostra
diferentes
funções
integradas em células cerebrais, isto é, proteção de energia temporária, capacidade
metabólica, transferência de energia e controle metabólico. Desta forma este
sistema é reconhecido como um regulador metabólico importante entre a saúde e a
doença (Pilla et al., 2003).
A creatina quinase parece estar envolvida em certas condições patológicas
relacionadas com deficiência de energia cerebral (Whittingham e Lipton, 1981).
Considerando que a energia é crucial para manter o desenvolvimento e regulação
da
função
cerebral,
creatina/fosfocreatina
tem
sido
pode
ser
documentado
um
que
importante
alterações
passo
para
no
circuito
problemas
neurodegenerativos que conduzem a perda neuronal no cérebro (Pilla et al., 2003).
A deficiência congênita de creatina cerebral esta associada à disfunção
extrapiramidal, convulsões e fraqueza muscular (Stöckler et al., 1994).
1.4 Insuficiência renal aguda
A insuficiência renal aguda (IRA) é uma síndrome caracterizada por um dano
súbito da função renal, impossibilitando o rim de exercer suas funções básicas de
excreção e manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico e acido-básico (Riella e
Martins, 2001; Knobel, 2004; Cruz et al., 2006). Este dano acaba gerando um
acúmulo de marcadores comuns da função renal, como uréia e creatinina, e por
vezes diminui o volume urinário diário (Knobel, 2004).
Desta forma, a perda de funções, tais como as citadas anteriormente, além de
excreção de catabólitos e função reguladora hormonal, desencadeiam sérios
problemas para o paciente, como anemia, deficiência imunológica, tendência à
hemorragia, desordem no metabolismo de lipídios, carboidratos e proteínas e vários
distúrbios resultantes das toxinas presentes no plasma ou outros fluidos corporais
(Mafra et al., 1999).
A IRA é um distúrbio provocado por uma reunião de sinais e sintomas
ocorridos por um mesmo mecanismo, que pode ser causada por várias associações,
em vários contextos clínicos, caracterizando sub-síndromes. Entretanto, o termo é
mais comumente utilizado para caracterizar aquelas formas de dano renal devido à
isquemia, agente nefrotóxico ou multifatorial (Barros, 1999).
Apesar de a IRA ser classificada em pré-renal, renal e pós-renal esta também
pode ser classificada quanto à etiologia, como IRA isquêmica (quando pacientes
apresentavam condição hemodinâmica de baixo fluxo renal), nefrotóxica (quando a
piora da função renal esteve associada à presença de substâncias nefrotóxicas
exógenas ou endógenas) e multifatorial (quando presentes vários insultos renais,
dentre eles os quadros sépticos) (Balbi et al., 2005).
A IRA pré-renal é causada pela diminuição do fluxo sanguíneo renal levando
à diminuição da taxa de filtração glomerular, sendo reversível se corrigida a causa,
como, por exemplo, na desidratação, uso de diuréticos e insuficiência cardíaca. A
IRA pós-renal ocorre pela obstrução do trato urinário, como conseqüência de
hipertrofia prostática, câncer de próstata ou cervical, distúrbios retroperitoneais,
cálculo renal bilateral, carcinoma de bexiga, dentre outros. Esta pode ser reversível
dependendo do tempo de duração da obstrução (Knobel, 2004).
A IRA renal é causada por deficiências do próprio rim, que são classificadas
quanto ao local afetado, tais como: túbulos, interstícios, vasos ou glomérulos.
Freqüentemente o termo necrose tubular aguda (NTA) é utilizado como sinônimo de
IRA renal, causada por agressão isquêmica ou nefrotóxica, porém este caso
também pode ser de origem pré-renal (Knobel, 2004; Cruz et al., 2006). Na NTA
ocorre uma diminuição da filtração glomerular acompanhada de lesão das células
tubulares e geralmente com a retirada do agente causador da lesão os rins não
voltam ao normal imediatamente podendo levar horas ou até semanas para se
restabelecer (Barros, 1999).
Sabe-se que as conseqüências da isquemia, em diferentes tecidos,
dependem da sua duração, e que muitas das lesões são desenvolvidas durante o
estágio de reoxigenação, como resultado da reperfusão tecidual, podendo agravar
as lesões produzidas na fase isquêmica isolada (Silva et al., 2002).
Um dos acontecimentos iniciais resultantes da isquemia ou de uma
nefrotoxina é a redução dos níveis intracelulares de ATP e, portanto porções do
néfron que possuem alta taxa de reabsorção tubular com gasto de energia são
particularmente mais suscetíveis à isquemia (Knobel, 2004). As mitocôndrias são
alvos importantes dos danos provocados pelos processos de isquemia e reperfusão,
sendo que nelas ocorre a diminuição de NADH, do carreador ADP/ATP e da ATP
sintase (Silva et al., 2002).
A depleção de ATP leva à redução da atividade da ATP-ase da membrana
citoplasmática, edema celular e desequilíbrio nas concentrações de sódio, potássio
e cálcio. Esse distúrbio leva a uma série de acontecimentos, incluindo
desestruturação do citoesqueleto, perda de polaridade celular, perda de interação
célula-célula, produção de espécies reativas de oxigênio, alterações no pH
intracelular que podem culminar com a morte da célula (Knobel, 2004).
Todas estas complicações levam ao organismo a retenção excessiva de
produtos do metabolismo das proteínas que podem danificar o néfron e reduzir a
excreção de uréia, creatinina e de outros produtos do metabolismo das proteínas
(Bruns et al., 2002). A insuficiência renal induzindo a uremia afeta quase todas as
funções corporais, mas a fisiologia do cérebro parece ser particularmente vulnerável
à toxicidade urêmica (Deguchi et al., 2006). A falha renal resulta no acúmulo de
numerosas substâncias orgânicas que podem agir como neurotoxinas urêmicas,
mas nenhum metabólito sozinho foi identificado como a única causa da
encefalopatia urêmica (Deguchi et al., 2006). Dessa forma, a encefalopatia urêmica
é caracterizada por alterações intelectuais e de memória e posteriormente a
alterações motoras, convulsões e coma, que representam os eventos terminais
graves e de risco clínico (Bruns et al., 2002; Knobel, 2004; Cruz et al., 2006).
Os mecanismos fisiopatológicos envolvidos nas alterações neuroquímicas da
encefalopatia urêmica são pouco conhecidos. Sabe-se que alterações cerebrais
importantes e diminuição da taxa metabólica cerebral são regularmente observadas
em pacientes com falha renal e coma urêmico. Estudos sugerem que a uremia pode
aumentar a permeabilidade da barreira hemato-encefálica e a osmolaridade do
cérebro. Outros trabalhos sugerem que o paratormônio e o alumínio, aumentados
em pacientes com falha renal aguda, estão relacionados com dano neurológico,
principalmente pela facilitação da entrada de cálcio nas células, facilitando a morte
neuronal. Portanto, as bases químicas dos distúrbios metabólicos e funcionais no
cérebro desses pacientes ainda são objeto de estudo; estresse oxidativo e
alterações no metabolismo cerebral podem estar envolvidos nesses processos
(Nash et al., 2002; Singri et al., 2003).
1.5 Defesas antioxidantes
O corpo humano apresenta sistemas naturais de defesa contra espécies
reativas de oxigênio que, além de defender, mantêm suas concentrações em níveis
compatíveis com a atividade biológica. Entretanto, os antioxidantes podem ser
adicionados ao organismo via alimentação, suplementação, ou ainda como recurso
terapêutico (Lancha-Jr, 2004).
Atualmente, empregam-se substâncias que, por inúmeros mecanismos de
ação, trabalham a favor da redução do dano celular, seja atuando com antioxidante
ou diminuindo a ação dos produtos decorrentes da fase isquêmica. Estas
substâncias atuam diminuindo a concentração ou neutralizando as espécies reativas
de oxigênio e nitrogênio, ou por inibirem a sua formação ou por facilitarem o seu
desaparecimento (Medeiros et al., 2005).
1.5.1 N-acetilcisteína
A n-acetilcisteína (NAC), devido ao seu conteúdo em tióis (Mórtola et al.,
2000), tem sido utilizada há aproximadamente meio século para tratar doenças
congestivas e obstrutivas dos pulmões (Rodrigues et al., 2004). Além disso, a NAC
tem sido utilizada na prática clínica em situações de instabilidade hemodinâmica,
com o intuito de proteger os tecidos, pulmonar, cardíaco, renal e hepático que são
comprometidos pelo fenômeno de isquemia seguida de reperfusão (Medeiros et al.,
2005).
Diversos estudos têm demonstrado o papel antioxidante da NAC, possuindo
ação direta sobre os radicais livres e, por ação indireta como substrato da glutationa
peroxidase, estimulando a síntese de glutationa (GSH), e assim prevenindo a
oxidação e degradação do óxido nítrico (Kayser et al., 2006). Desta forma, atua para
reduzir o estresse oxidativo, a quimiotaxia de neutrófilos e monócitos e a retirada de
peróxido de hidrogênio, superóxido e radicais hidroxil, por uma reação clássica de
oxidorredução com as espécies reativas de oxigênio produzidas na fase de
reperfusão (Medeiros et al., 2005)
Além disso, também participam da síntese de cisteína intracelular,
aumentando a produção da GSH por ser sua precursora (Pinho et al., 2005). A GSH,
em sua forma reduzida, tem um papel importante no mecanismo de defesa contra
radicais livres, por diminuir o conteúdo de peróxido de hidrogênio e alterar o
equilíbrio da capacidade oxidante-antioxidante pulmonar (Smith et al., 1994; Zhang
et al., 1999).
Muitos
estudos
têm
demonstrado
a
função
antioxidante
da
NAC,
principalmente no tratamento de doenças inflamatórias, por inibir o estresse
oxidativo e a quimiotaxia de neutrófilos e monócitos, entre outros efeitos. No entanto,
também foi demonstrado que a administração isolada de NAC pode produzir efeitos
pró-oxidantes, e que a combinação de NAC com DFX (deferoxamina; um quelante
de ferro) parece ser um tratamento mais efetivo para muitas doenças inflamatórias
(Pinho et al., 2005; Ritter et al., 2004a; Ritter et al., 2004b; Ritter et al., 2006).
1.5.2 Deferoxamina
É um quelante hexadentado com alta afinidade e seletividade pelo ferro. Uma
molécula de DFX se liga a um átomo de ferro, formando um complexo estável que é
excretado pela bile e pela urina. Utilizado clinicamente há cerca de 35 anos, é
altamente efetivo na profilaxia e tratamento da sobrecarga de ferro (Souto, 2006).
A DFX, por apresentar-se como um potente quelante de ferro, mostra
propriedades antioxidantes em situações de apoptose e neurodegeneração (Zhang
et al., 2005; Freret et al., 2006). Devido a este fato que, emprega-se o seu uso em
conjunto com NAC, pois esta apresenta alta afinidade ao ferro, podendo contribuir
para a produção e liberação de outros mediadores oxidativos. O DFX, quando
administrado em conjunto com NAC, diminui os efeitos pró-oxidantes desta,
suavizando assim estes efeitos e encaminhando para o efeito esperado (Ritter et al.,
2004a).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a atividade da enzima creatina quinase em diferentes estruturas do
cérebro de ratos Wistar submetidos à insuficiência renal aguda (por isquemia e
reperfusão renal), tratados ou não com NAC e DFX.
2.2 Objetivos específicos
- Avaliar a atividade da enzima creatina quinase no cerebelo, córtex cerebral,
córtex pré-frontal, hipocampo e estriado de ratos Wistar 1, 6 e 12 horas após
insuficiência renal aguda por isquemia e reperfusão, tratados com NAC;
- Avaliar a atividade da enzima creatina quinase no cerebelo, córtex cerebral,
córtex pré-frontal, hipocampo e estriado de ratos Wistar 1, 6 e 12 horas após
insuficiência renal aguda por isquemia e reperfusão, tratados com DFX;
- Avaliar a atividade da enzima creatina quinase no cerebelo, córtex cerebral,
córtex pré-frontal, hipocampo e estriado de ratos Wistar 1, 6 e 12 horas após
insuficiência renal aguda por isquemia e reperfusão, tratados com a associação de
NAC e DFX.
3 MÉTODOS E RESULTADOS
Conforme resolução 01/2007 do PPGCS, apresentados na forma de artigo cientifico
submetido para publicação na revista Neuroscience Letters.
Inhibition of brain creatine kinase activity after renal ischemia is attenuated by
N-acetylcysteine and deferoxamine administration.
Márcia L. Dias, Priscila B. Di-Pietro, Giselli Scaini, Márcio Burigo, Larissa
Constantino, Roberta A. Machado, Felipe Dal-Pizzol, Emilio L. Streck.
Inhibition of brain creatine kinase activity after renal ischemia is
attenuated by N-acetylcysteine and deferoxamine
administration
Priscila B. Di-Pietro, Márcia L. Dias, Giselli Scaini, Márcio Burigo,
Larissa Constantino, Roberta A. Machado, Felipe Dal-Pizzol, Emilio L. Streck*
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-graduação em
Ciências da Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do
Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil
*Corresponding author: E-mail address: [email protected]
Running title: brain creatine kinase and renal failure
Abstract
Encephalopathy may accompany acute or chronic renal failure, and the mechanisms
responsible for neurological complications in patients with renal failure are poorly
known. Considering that creatine kinase (CK) is important for brain energy
homeostasis and is inhibited by free radicals, and that oxidative stress is probably
involved in the pathogenesis of uremic encephalopathy, we measured CK activity
(hippocampus, striatum, cerebellum, cerebral cortex and prefrontal cortex) in brain if
rats submitted to renal ischemia and the effect of administration of antioxidants (Nacetylcysteine, NAC and deferoxamine, DFX) on this enzyme. We verified that CK
activity was not altered in cerebellum and striatum of rats. CK activity was inhibited in
prefrontal cortex and hippocampus of rats 12 hours after renal ischemia. The
treatment with antioxidants prevented such effect. Cerebral cortex was also affected,
but in this area CK activity was inhibited 6 and 12 hours after renal ischemia.
Moreover, only NAC or NAC plus DFX were able to prevent the inhibition on the
enzyme. Although it is difficult to extrapolate our findings to the human condition, the
inhibition of brain CK activity after renal failure may be associated to neuronal loss
and may be involved in the pathogenesis of uremic encephalopathy.
Key words: renal failure; creatine kinase; N-acetylcysteine; deferoxamine.
Introduction
Acute renal failure (ARF) is defined by a loss of renal function over a period of
hours to days, resulting in accumulation of nitrogenous waste products and
unbalance in the maintenance of fluid and electrolyte homeostasis. The major causes
of ARF are i) decreased renal perfusion without cellular injury, ii) an ischemic, toxic,
or obstructive insult to the renal tubule, iii) a tubulointerstitial process with
inflammation and edema, iv) or a primary reduction in the filtering capacity of the
glomerulus (1,2). These patients often present signs and symptoms related to fluid
and electrolyte disturbances.
Altered mental status reflects the toxic effect of uremia in the brain, and
contributes largely to the morbidity and mortality in patients with renal failure (3).
Encephalopathy may accompany acute or chronic renal failure, but in patients with
ARF the symptoms are generally more pronounced and progress more rapidly. In
general, uremic encephalopathy presents with a symptom complex progressing from
mild sensorial clouding to delirium and coma (3,4). The pathophysiologic
mechanisms that underlie renal dysfunction have come to be understood over the
last decades (1,2), but the mechanisms responsible for neurological complications in
patients with ARF are still poorly known (3).
Creatine kinase (CK, E.C. 2.7.3.2) is a crucial enzyme for high energy
consuming tissues like the brain. This enzyme works as a buffering system of cellular
ATP levels, playing a central role in energy metabolism (5-7). It is also known that a
decrease in CK activity is associated with neurodegenerative pathways that result in
neuronal death in brain ischemia (8), neurodegenerative diseases (9,10), bipolar
disorder (unpublished results) and other pathological states (11-13).
Oxidative stress is an important event that has been related to the
pathogenesis
of
diseases
affecting
the
central
nervous
system.
This
is
understandable since this tissue is highly sensitive to oxidative stress due to its high
oxygen consumption, its high iron and lipid contents, especially polyunsaturated fatty
acids, and the low activity of antioxidant defenses (14). Moreover, the accumulation
of toxic metabolites in renal failure may lead to excessive production of free radicals
or depletion of antioxidant capacity (2,15,16). It is also known that CK is very
sensitive to free radicals, especially by the oxidation of thiol groups of its structure
(17). In this context, we believe that the administration of antioxidants may be
important for the treatment of neurological alteration in patients affected by ARF.
Considering that there is a lack of literature information regarding the
pathophysiological mechanisms underlying neurological complications in patients
with renal failure, that CK is important for brain energy homeostasis and is inhibited
by free radicals, and that oxidative stress is probably involved in the pathogenesis of
uremic encephalopathy, we measured brain CK activity (hippocampus, striatum,
cerebellum, cerebral cortex and prefrontal cortex) in an animal model of ARF
(ischemia) and the effect of administration of antioxidants (N-acetylcysteine, NAC
and deferoxamine, DFX) on this enzyme.
Materials and methods
Animals: Adult male Wistar rats (250-300 g) obtained from Central Animal House of
Universidade do Extremo Sul Catarinense were caged in groups of five with free
access to food and water and maintained on a 12-h light-dark cycle (lights on 7:00
am) at a temperature of 22oC
1oC. All experimental procedures were carried out in
accordance with the National Institutes of Health Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals and the Brazilian Society for Neuroscience and Behavior
(SBNeC) recommendations for animal care, with the approval of local Ethics
Committee.
Animal model of renal ischemia and treatment with antioxidants: Sixty-day old
rats were divided into the following groups: sham-operated group (control), or renal
ischemia treated with saline, NAC 20 mg/kg, DFX 20 mg/kg or both antioxidants.
Under anesthesia (ketamine 70 mg/kg and xylazine 15 mg/kg; i.p.) and aseptic
conditions, via a dorsal incision, ischemia/reperfusion injury was induced by clamping
both renal vascular pedicles for 45 minutes, and the kidney was subsequently
reperfused (18). NAC and DFX were administered in the abdominal aorta 10 minutes
before ischemia (19-21). Rats were killed 1, 6 or 12 hours after renal ischemia. The
brain was removed and hippocampus, striatum, cerebellum, cortex and prefrontal
cortex were isolated. Moreover, blood was collected for measurement of urea
nitrogen and creatinine.
Tissue and homogenate preparation: These brain areas were homogenized (1:10,
w/v) in SETH buffer, pH 7.4 (250 mM sucrose, 2 mM EDTA, 10 mM Trizma base, 50
IU/ml heparin). The homogenates were centrifuged at 800 x g for 10 min and the
supernatants kept at - 70oC until used for CK activity determination. The maximal
period between homogenate preparation and enzyme analysis was always less than
5 days. Protein content was determined by the method described by Lowry et al (22)
using bovine serum albumin as standard.
Creatine kinase (CK) activity assay: Creatine kinase activity was measured in brain
homogenates pre-treated with 0.625 mM lauryl maltoside. The reaction mixture
consisted of 60 mM Tris–HCl, pH 7.5, containing 7 mM phosphocreatine, 9 mM
MgSO4 and approximately 0.4–1.2 g protein in a final volume of 100 L. After 15
min of pre-incubation at 37 oC, the reaction was started by the addition of 0.3 mol of
ADP plus 0.08 mol of reduced glutathione. The reaction was stopped after 10 min
by the addition of 1 mol of p-hydroxymercuribenzoic acid. The creatine formed was
estimated according to the colorimetric method of Hughes (23). The color was
developed by the addition of 100 L 2%
-naphtol and 100 L 0.05% diacetyl in a
final volume of 1 mL and read spectrophotometrically after 20 min at 540 nm. Results
were expressed as units/min x mg protein.
Statistical analysis: Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA)
followed by the Tukey test when F was significant and are expressed as mean
standard deviation. All analyses were performed using the Statistical Package for the
Social Science (SPSS) software.
Results
In the present study we submitted rats to renal ischemia, with previous
treatment with NAC and DFX. After that, brain CK was measured. Our findings show
that the model used in our work caused renal injury, since blood urea nitrogen and
creatinine levels were increased in all groups submitted to renal ischemia, treated
with saline or antioxidants (Figure 1). Moreover, CK activity was inhibited in prefrontal
cortex and hippocampus of rats 12 hours after renal ischemia and the treatment with
NAC and DFX alone or in combination prevented such effect (Figure 2A and 2C).
Cerebral cortex was also affected, but in this area CK activity was inhibited 6 and 12
hours after renal ischemia. In this area, only NAC or NAC plus DFX were able to
prevent the inhibition on the enzyme (Figure 2B). Our results also show that CK
activity was not altered in cerebellum and striatum (Figure 3).
Discussion
CK catalyzes the reversible transfer of the phosphoryl group from
phosphocreatine to ADP, regenerating ATP. This system is important for normal
energy homeostasis by exerting several integrated functions, such as temporary
energy buffering, metabolic capacity, energy transfer and metabolic control. The brain
of adult rats, like other tissues with high and variable rates of ATP metabolism,
presents high phosphocreatine concentration and CK activity. It is well described that
inhibition of this enzyme is implicated in the pathogenesis of a number of diseases,
especially in brain (24,25). In the present work, we showed that CK is affected in
prefrontal cortex, cerebral cortex and hippocampus of rats, 6 and 12 hours after renal
ischemia. Moreover, we showed that antioxidants were able to prevent the inhibition
of this enzyme.
In this model of ARF, the initial insult is caused by hypoxia to the tissue
followed by altered microcirculation. Inflammation and reactive oxygen species
formation are also involved in the progression of tubular injury. Moreover, there are
several similarities between this model and human ischemic acute tubular necrosis. A
number of studies have demonstrated the antioxidant role of NAC. Thus, NAC
supplementation was found to reduce oxidative stress by improving thiol redox status,
to inhibit oxidative metabolism and to scavenge superoxide, hydrogen peroxide and
hydroxyl radicals. It has been demonstrated that isolated administration of NAC could
produce pro-oxidant effects. The oxidative metabolism of NAC can generate thiyl free
radicals and NAC can reduce Fe+3 ions to participate in the generation of hydroxyl
radical via Fenton reaction. In this context, we have demonstrated that the
combination of NAC and DFX, but not their isolated use, is an effective treatment for
several inflammatory diseases (19-21,26).
Uremic encephalopathy is characterized by a mix of clinical features and is
often associated with headache, visual abnormalities, tremor, asterixis and seizures.
The pathophysiology of uremic encephalopathy is complex and still poorly
understood. The main contributing factors are accumulation of metabolites, hormonal
disturbance, disturbance of the intermediary metabolism and imbalance in excitatory
and inhibitory neurotransmitters. Besides the general symptom complex of
encephalopathy, focal motor signs and the “uremic twitchconvulsive” syndrome may
be present. Impaired cognitive has also been reported in these patients (3).
In
this
context,
it
has
also
been
demonstrated
that
the
creatine/phosphocreatine/CK circuit is involved in processes that involve habituation,
spatial learning and seizure susceptibility (27-29). In the present work we showed
that CK was inhibited in prefrontal cortex, cerebral cortex and hippocampus, brain
areas that are crucial for cognitive processes (30-32). So, we speculate that
diminished CK may be involved in the cognitive impairment reported in these
patients. Moreover, we showed that inhibition of CK was prevented by antioxidants.
In this context, we also speculate that oxidative stress may be involved in the
mechanism of CK activity inhibition. This hypothesis is reinforced by findings from
Sener et al (15), which show increased malondialdehyde and diminished glutathione
levels in brain of rats submitted to a model of chronic renal failure.
Although it is difficult to extrapolate our findings to the human condition, the
inhibition of brain CK activity after renal failure may be involved in the pathogenesis
of uremic encephalopathy. We also showed that antioxidants prevented the inhibition
of CK, and we believe that this protocol could be used as an adjuvant therapy for the
treatment of these neurological complications. Moreover, other important steps of
energy metabolism must also be studied.
Acknowledgements
This research was supported by grants from Programa de Pós-graduação em
Ciências da Saúde – Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC) and
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
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Figure 1. Effect of antioxidants on blood urea nitrogen (A) and creatinine (B)
levels after renal ischemia. Rats were sham-operated (control group) or submitted
to renal ischemia and treated with N-acetylcysteine (NAC), deferoxamine (DFX), both
or only saline, as described in Methods. Blood samples were collected 1, 6 and 12
hours after renal ischemia. Values are expressed as mean
independent experiments.
Different from control (sham group); *p<0.05 (One-way ANOVA followed by Tukey).
S.D. for five
Figure 2. Effect of antioxidants on creatine kinase activity in prefrontal cortex
(A), cerebral cortex (B) and hippocampus (C) of rats after renal ischemia. Rats
were sham-operated (control group) or submitted to renal ischemia and treated with
N-acetylcysteine (NAC), deferoxamine (DFX), both or only saline, as described in
Methods. Creatine kinase activity was assayed in brain of rats 1, 6 and 12 hours after
renal ischemia. Values are expressed as mean
experiments.
Different from control (sham group); *p<0.05 (One-way ANOVA followed by Tukey).
S.D. for five independent
Figure 3. Effect of antioxidants on creatine kinase activity in cerebellum (A) and
striatum (B) of rats after renal ischemia. Rats were sham-operated (control group)
or submitted to renal ischemia and treated with N-acetylcysteine (NAC),
deferoxamine (DFX), both or only saline, as described in Methods. Creatine kinase
activity was assayed in brain of rats 1, 6 and 12 hours after renal ischemia. Values
are expressed as mean
S.D. for five independent experiments.
4 DISCUSSÃO
A IRA é uma síndrome proveniente das mais variadas causas, podendo
ocorrer em diversas camadas da população (Garcia et al., 2005). Além disso, sua
mortalidade permaneceu elevada nas últimas décadas apesar dos avanços
diagnósticos e terapêuticos ocorridos (Balbi et al., 2005). A IRA é caracterizada pela
diminuição súbita da função renal que se mantém por períodos variáveis, impedindo
os rins de desempenhar suas funções normais de excreção e manutenção da
homeostasia hidroeletrolítica do organismo (Garcia et al., 2005).
O modelo de dano renal utilizado para se obter IRA nos animais nesse
trabalho foi causado inicialmente pela hipóxia tecidual seguido por alteração da
microcirculação. Esse modelo mostrou resultados satisfatórios, já que nas primeiras
horas após a indução da IRA os níveis de uréia e creatinina estavam elevados
quando comparados a animais que não foram submetidos à IRA. Como estes
metabólitos são considerados marcadores da função renal, já que são totalmente
excretados pelos rins, sua elevação é sinal de que o sistema renal está sendo
perturbado. A má filtração destes metabólitos e o conseqüente acúmulo dos
mesmos no organismo podem gerar complicações secundárias à doença renal em
si.
A encefalopatia urêmica pode acompanhar tanto a IRA quanto a insuficiência
renal crônica, mas os mecanismos responsáveis pelas complicações neurológicas
em pacientes com falência renal são pouco conhecidos. Sabe-se, porém, que em
pacientes com IRA os sintomas são geralmente mais pronunciados e sua
progressão é mais rápida (Burn e Bates, 1998; Brouns e De Deyn, 2004). Em geral,
os principais fatores que contribuem são o acúmulo de metabólitos, distúrbio
hormonal e do metabolismo intermediário e desequilíbrio na excitação e inibição de
neurotransmissores (Brouns e De Deyn, 2004). Os pacientes com encefalopatia
urêmica
geralmente
apresentam alterações cognitivas, alterações motoras,
convulsão e coma (Cruz et al., 2006; Knobel, 2004).
O cérebro de ratos adultos, semelhante a outros tecidos com alta e variável
taxa do metabolismo de ATP, apresenta alta concentração de fosfocreatina e
creatina quinase (Khuchua et al., 1998; Schlattner e Wallimann, 2000). Esta enzima
tem papel chave no metabolismo energético, visto que é responsável pelo
reabastecimento direto de ATP pela transferência de um grupamento fosforil da
fosfocreatina para o ADP, regenerando ATP e desta forma facilitando a transdução
de energia intracelular (Zonouzi et al., 2006). Esse sistema é importante para
manutenção da homeostase energética normal, pois, sabe-se que a inibição desta
enzima implica na patogênese de numerosas doenças, especialmente no cérebro
(Khuchua et al., 1998; Schlattner e Wallimann, 2000).
Os resultados mostraram que a atividade da creatina quinase foi inibida nas
regiões cerebrais do hipocampo e córtex pré-frontal 12 horas após a isquemia renal
e que no córtex cerebral a enzima foi inibida 6 e 12 horas após a indução, no grupo
de animais não tratados com antioxidantes (grupo salina). Quando observadas estas
mesmas regiões cerebrais, só que nos grupos tratados com antioxidantes,
percebeu-se que NAC, DFX e NAC + DFX preveniram a inibição da creatina quinase
no hipocampo e córtex pré-frontal; no córtex cerebral apenas NAC sozinha ou
combinada com DFX tiveram este mesmo efeito.
Baseado nestes resultados pode-se dizer que a IRA leva ao acúmulo de
metabólitos, estes por mecanismos ainda não conhecidos dirigem-se ao cérebro.
Neste órgão estes metabólitos em excesso podem levar a uma diminuição das
defesas antioxidantes provocando disfunção mitocondrial pelo acúmulo de espécies
reativas de oxigênio e culminando com o estresse oxidativo. A enzima creatina
quinase é muito sensível aos radicais livres, especialmente pela oxidação de
grupamentos tióis existente na sua estrutura (Wolosker et al., 1996). Através dos
resultados, considera-se que as espécies reativas de oxigênio estão envolvidas na
patogênese da encefalopatia urêmica, já que os antioxidantes preveniram a inibição
da creatina quinase; supondo que as espécies reativas de oxigênio sejam as
responsáveis pela inibição da creatina quinase no grupo salina.
Além disso, áreas como o córtex cerebral, córtex pré-frontal e hipocampo são
cruciais para o processo cognitivo (D’Esposito, 2007; Lou, 1996; Suzuki, 2007).
Tendo em vista que a creatina quinase mostrou-se inibida nessas áreas nesse
trabalho, pode-se especular que essa diminuição na atividade da creatina quinase
pode ocorrer em seres humanos com insuficiência renal aguda. Se isso ocorrer,
pode-se sugerir que o déficit cognitivo destes pacientes pode ser parcialmente
explicado pelos presentes resultados.
Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que a insuficiência
renal aguda levou a uma inibição da creatina quinase, por um mecanismo mediado
por radicais livres, já que, quando utilizado antioxidantes, houve prevenção na
inibição da atividade da enzima. A inibição da atividade da creatina quinase cerebral
após o dano renal pode estar associada à perda neuronal e pode estar envolvida na
patogênese da encefalopatia urêmica. Através destes resultados pode-se concluir
que este protocolo pode ser utilizado como adjuvante terapêutico nesses pacientes.
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