Controle de Qualidade das Folhas de Ginkgo

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Revisado em Agosto 2013
Aceito em Outubro 2013
Controle de Qualidade das Folhas de Ginkgo biloba L.
Comercializadas para Decocção e Infusão
RomanitaC.Moschen1*,ChristianeC.Pereira1, JairoP.Oliveira2,AdilsonR.Prado3,4
1Departamento de Farmácia – UNESC, Colatina-ES.
2Departamento de Morfologia - CCS / UFES, Vitória - ES
3Pós-graduação em Engenharia Elétrica - Labtel - UFES
4Instituto Federal do Espírito Santo - IFES, Serra – ES
*[email protected]
Resumo
As plantas medicinais são amplamente conhecidas e utilizadas em todo o mundo. Ao contrário do que se pensa
e por ter um conhecimento empírico muito difundido, os produtos de origem vegetal podem sim trazer prejuízos
à saúde se usados indiscriminadamente. Desta forma, surge o controle de qualidade que busca a segurança e
a garantia da eficácia desses medicamentos. O controle de qualidade de fitoterápicos foi desenvolvido neste
trabalho utilizando-se três amostras de folhas secas de Ginkgo biloba L. adquiridas no comércio de Colatina e
Vitória – ES. Foram realizados testes de Cromatografia em Camada Delgada (CCD), para verificar a autenticidade
e a eficiência das substâncias nelas contidas, e, por se tratar de um método confiável e preciso, pôde auxiliar na
confirmação de substâncias que estão presentes nesta planta em comparação com o descrito na literatura. Foi
realizada também a análise macroscópica da amostra, o que mostrou não haverem outros componentes senão
as folhas de Ginkgo. Testes para o teor de umidade e de cinzas totais mostraram que as amostras encontravamse dentro da conformidade exigida pela Organização Mundial da Saúde (OMS), e os testes microbiológicos
constataram a ausência de microrganismos patogênicos e presença de microrganismos viáveis, porém dentro dos
limites aceitáveis pela legislação vigente.
Palavras-chave: Fitoterápicos, controle de qualidade, Ginkgo biloba L.
Introdução
O Ginkgo biloba é um dos mais famosos fitoterápicos do mercado mundial, seu processo de produção é extremamente
complexo e custoso, o que torna este extrato alvo comum de adulteração. Os extratos de Ginkgo biloba foram introduzidos
na medicina em 1965, através das pesquisas do médico-farmacêutico alemão Willmar Schwabe. Há uma quantidade
enorme de fontes bibliográficas que descrevem a investigação científica relacionada com o efeito do Ginkgo biloba e foram
documentadas várias atividades farmacológicas do extrato de suas folhas e/ou de seus componentes, que incluem seu
efeito sobre a conduta, o aprendizado, a memória, a atividade cardiovascular, e seu efeito sobre a circulação sanguínea e
sua atividade antioxidante.1
Os efeitos farmacológicos do extrato do Ginkgo biloba e seus componentes são amplamente descritos, dados
estes que comprovam evidências e apóiam o uso clínico moderno do extrato padronizado da folha de Ginkgo biloba.
Os princípios ativos mais importantes do extrato de Ginkgo biloba incluem os glicosídeos de flavonóides e as lactonas
terpênicas. Foi descrito que ele realiza uma atividade polivalente, é provável que a atividade combinada de vários de
seus componentes seja responsável por seu efeito.1 Desde a aplicação de compressas das folhas, a ingestão de chás,
tinturas, extratos espessos e secos, até a incorporação de produtos otimizados na obtenção de formas farmacêuticas
sólidas, esse vegetal é um dos exemplos mais consistentes do aprimoramento do conceito de produto fitoterápico e
de estratégia terapêutica.2
Na comercialização de plantas medicinais, como é o caso do Ginkgo biloba, o conhecimento popular pode gerar
erros na identificação da planta e, ainda, não se pode descartar a possibilidade de adulterações, interações de plantas
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com medicamentos alopáticos e reações alérgicas e
tóxicas. Para a garantia da qualidade do produto final,
é essencial que se faça análise e controle de matériaprima, embalagem e formulação farmacêutica, além de
estudos de estabilidade.3,4
Comerciantes e usuários de plantas divulgam
seus usos medicinais muitas vezes sem nenhuma
comprovação de suas propriedades farmacológicas. Às
vezes o uso medicinal destas plantas é bem diferente
do uso popular.3 A qualidade dos produtos à base de
plantas medicinais, comercializados no Brasil, é cada vez
mais preocupante. Pesquisas científicas têm apontado a
presença de diversas irregularidades que comprometem
a eficácia do princípio ativo e põem em risco a saúde do
consumidor. Uma das justificativas seria a de as indústrias
responsáveis pela fabricação desses produtos serem
basicamente constituídas por empresas de pequeno
porte que funcionam de modo precário.5
Assim como os medicamentos sintéticos, a qualidade
da matéria prima vegetal é de extrema importância para
a qualidade do produto final. No caso dos fitoterápicos,
os insumos vegetais são geralmente de fácil análise, mas
os extratos e formas farmacêuticas derivadas requerem
análises mais apuradas, pois devem garantir que a ação
biológica e a segurança na utilização sejam constantes
e devem ter sua autenticidade comprovada através da
análise de sua composição química, aspectos botânicos,
fitoquímicos, farmacológicos e toxicológicos.6,7
O controle de qualidade na manipulação do
fitoterápico assegura que os produtos manipulados
estejam de acordo com as boas práticas de manipulação,
tendo em vista o aumento da procura e consumo dessa
espécie de medicamento. Fraudes e adulterações de
produtos vegetais são frequentes e ocorrem por diversos
fatores, como por exemplo, a falta de conhecimento dos
produtores, distribuidores e deficiência na fiscalização.
A finalidade desse estudo foi avaliar se a matéria-prima
vegetal encontrada em farmácias, lojas de produtos
naturais e mercados atendem às especificações de
qualidade descritos na literatura e demonstrar a
importância deste controle.
Material e Métodos
A escolha do material vegetal utilizado neste trabalho
se deu por uma pesquisa qualitativa e quantitativa
através de um questionário, que foi respondido pelos
farmacêuticos das farmácias de manipulação de ColatinaES. Com esse questionário, foi levantado os fitoterápicos
mais comercializados nas farmácias de manipulação na
cidade de Colatina e Vitória-ES. Através do resultado
do questionário, adquiriram-se amostras de 3 (três)
fabricantes de folhas de Ginkgo biloba L. em farmácia,
lojas de produtos naturais e mercados da cidade de
46
Colatina-ES, conforme pode ser observado na figura 1.
Em seguida, foram realizados testes de cromatografia em
camada delgada (CCD) com o objetivo de identificação
de constituintes químicos, teor de umidade e teor de
cinzas, detecção de falsificação e adulteração, além de
testes microbiológicos. Também foi feita uma análise das
informações contidas nas embalagens para verificação
se estavam de acordo com a Portaria nº 6/MS/SNVS, de
31 de janeiro de 1995,8 quanto às informações contidas
na rotulagem, embalagem e bulas.
Figura 1. Folhas secas de Ginkgo biloba L. na forma em
que são comercializadas.
Para a preparação da amostra a ser analisada,
reduziu-se o material vegetal em partículas de tamanho
homogêneo através de trituração. Para a obtenção
do extrato foi utilizada a amostra vegetal obtida como
descrito anteriormente. A preparação das amostras para
a CCD consistiu na pesagem de 1,0 g destas amostras
A, B e C, adicionou-se 10 ml de metanol e a mistura foi
deixada sob refluxo em Soxlet por 30 minutos a 65°C.
Obteve-se um líquido claro que foi evaporado em banhomaria a 60°C até secura e depois resuspendido em 2 ml
de metanol, utilizando-se, então, 10µL deste material
final para aplicação na CCD.9
Na CCD, a fase estacionária consistiu em placa de
vidro 10x10 cm com uma camada de 25 mm de sílica gel
60 com indicador fluorescente UV254 da marca alemã
Macherey-Nagel. Foram preparadas três placas para
a analise dos extratos, sendo usado três fases móveis
diferentes para a detecção dos vários flavonoides que
são encontrados no Ginkgo biloba L., sendo para cada
placa as seguintes fases móveis: Placa 1: a primeira
mistura composta de acetato de etila/ácido acético
glacial/ácido fórmico/água (100:11:11:26); Placa 2: a
segunda mistura composta por clorofórmio/acetona/
ácido fórmico (75:16,5:8,5); Placa 3: a terceira mistura
composta de tolueno/acetona (70:30). Em três cubas
de vidro previamente saturadas com as misturas citadas
anteriormente, foi feita a corrida para glicosídeos
flavonoides e visualizou-se sob luz UV de 365nm.9
A análise de perda por secagem consistiu na pesagem
de 1,0 g de cada uma das amostras pulverizadas em uma
placa de petri previamente seca e tarada, levou-se em
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estufa a 100-105 °C por 2h. A pesagem foi realizada e
então, o material foi novamente colocado em estufa,
sendo feitas mais duas pesagens, somando-se 3h e 4h a
partir do início do procedimento. É interessante ressaltar
que tal procedimento foi realizado em triplicata.10
A determinação do teor de cinzas consistiu no
aquecimento ao rubro de um cadinho de porcelana
durante 30 minutos em forno mufla. Esfriou-se
em dessecador e pesou-se. Acrescentou-se ao
cadinho 1,0 g da amostra pulverizada e foi feito
seu espalhamento uniformemente no fundo do
mesmo (procedimento realizado em triplicata).
Secou-se em estufa durante 1h a 100-105 ± 5 °C e
após este procedimento levou-se ao forno mufla
aumentando a temperatura gradativamente, sendo
30 minutos em 200 °C, 60 minutos a 400 °C e 90
minutos a 600 ± 25 °C. O material foi esfriado em
dessecador e pesado. O procedimento foi repetido
a 600 ± 25 °C até massa constante, deixando-se
esfriar em dessecador a cada incineração. 10
Para a pesquisa de bactérias aeróbias, foi
utilizado o meio de cultura Agar Contagem de
Placas (Agar métodos padrão), que é um meio de
cultura ótimo para crescimento de Escherichia coli,
Lactobacillus casei, Staphylococcus aureus entre
outros, mas infelizmente não inibe o crescimento de
fungos e leveduras. Por esse motivo, foi realizado o
método de semeadura por profundidade, para tentar
diminuir o crescimento destes microrganismos e
confirmar se a contagem feita havia sido somente
de bactérias ou se possivelmente havia fungos.
Resultados e Discussão
Na cromatografia em camada delgada (CCD) foram
detectadas nitidamente em todas as amostras
manchas reveladas em fonte luminosa UV de 365 nm
e foram calculados seus respectivos Rf’s (coeficiente de
retenção) para a identificação das mesmas. O agente
revelador utilizado foi o cloreto de alumínio a 1% em
etanol que é um agente revelador para flavonóides em
geral. Isso ajudou a destacar as manchas encontradas
nas amostras que foram corridas com três tipos de
fases móveis diferentes, o que indicou a presença dos
vários flavonóides que a literatura descreve conter no
Ginkgo biloba L., conforme mostrado na figura 2 abaixo.
De acordo com Hildebert, 9 uma mancha
amarelo-laranja com Rf superior a 0,75 indica
presença de agliconas flavonol e biflavonóides.9
Os Rf ’s das manchas reveladas para a placa 1
podem ser observados na Tabela 1.
47
Figura 2. Revelação em lâmpada de UV a 365 nm das Placas:
(A) Placa 1, (B) Placa 2 e (C) Placa 3, em todos os casos
contendo as amostras de estrato rotuladas por A, B e C.
A Tabelas 2 e 3 a seguir mostram os dados obtidos
para as demais placas, é interessante ressaltar que
para as outras placas foram calculados diferentes
valores de Rf, já que o processo de eluição com as
outras misturas foram mais eficientes. Desse modo é
possível verificar uma considerável variação de cores
ao logo de todo caminho da fase móvel.
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Tabela 1. Cálculos dos Rf’s das manchas reveladas na placa 1.
Amostra A (Rf)
Amostra B (Rf)
Amostra C (Rf)
Cálculo
Resultado
Cálculo
Resultado
Cálculo
Resultado
5,5/6,7
0,8
5,5/6,7
0,8
5,45/6,7
0,8
A tabelas 2 e 3 a seguir mostram os dados obtidos
para as demais placas, é interessante ressaltar que
para as outras placas foram calculados diferentes
valores de Rf, já que o processo de eluição com as
outras misturas foram mais eficientes. Desse modo
é possível verificar uma considerável variação de
cores ao logo de todo caminho da fase móvel.
Tabela 2. Cálculos dos Rf’s das manchas reveladas na placa 2.
Amostra A (Rf)
Cálculo
Amostra B (Rf)
Amostra C (Rf)
ResultaResultaResultaCálculo
Cálculo
do
do
do
1/6,8
0,14
1/6,8
0,14
1/6,8
0,14
1,3/6,8
0,19
1,3/6,8
0,19
1,3/6,8
0,19
2,5/6,8
0,36
2,4/6,8
0,35
2/6,8
0,29
3,4/6,8
0,5
3,3/6,8
0,48
2,5/6,8
0,36
4/6,8
0,58
3,8/6,8
0,55
3,9/6,8
0,57
4,4/6,8
0,64
4,2/6,8
0,61
4,1/6,8
0,60
5,2/6,8
0,76
5/6,8
0,73
4,6/6,8
0,67
5,8/6,8
0,85
5,7/6,8
0,83
5,4/6,8
0,79
6,1/6,8
0,98
6,1/6,8
0,98
5,9/6,8
0,86
-
-
-
-
6,2/6,8
0,91
Através dos Rf’s calculados, constatou-se a
presença de várias substâncias, de acordo com
Hildebert (1996). Estes autores afirmam que os Rf’s
entre 0,25 e 0,4, com manchas nas cores amareloverde/laranja, indicam presença de rutina, quercetina,
kaempferol
e
isorhamnetin-3-O-(2”-6”-di-O-L-rhamnopyranosyl)- -D-glucopyanoside. Os Rf’s
de 0,45 a 0,49, apresentando cores verde-amarelo,
indicam narcissin, isorhamntin-rutinoside. Rf’s na faixa
de 0,5, com coloração azul claro fluorescente, indicam
ácido 6-hydroxikynurenic kaempferol, quercentina3-O-(6”’-trans-p- coumaroyl-4”-glucosyl)- rhamnoside.
Os Rf’s de 0,6, de cor laranja-amarelo, indicam
quercitrina e os Rf’s acima de 0,6 e até 0,75, na cor
verde-amarelo, indicam isoquercitrina e astragalin,
dihydrokaempeferol-7-O-glucoseide. Já os Rf’s de 0,75
ou maiores, de coloração amarela-laranja, indicam
preseça de agliconas flavonol e biflavonóides.9
48
Tabela 3. Cálculos dos Rf’s das manchas reveladas em
luz UV na placa 3.
Amostra A (Rf)
Amostra B (Rf)
Amostra C (Rf)
Cálculo
Resultado
Cálculo
Resultado
Cálculo
Resultado
0,5/7,1
0,07
0,4/7,1
0,05
0,5/7,1
0,06
0,9/7,1
0,12
0,7/7,1
0,09
0,8/7,1
0,10
1,2/7,1
0,16
1,1/7,1
0,15
1,1/7,1
0,15
1,6/7,1
0,22
1,5/7,1
0,21
1,5/7,1
0,20
2,1/7,1
0,29
1,9/7,1
0,26
1,9/7,1
0,26
2,6/7,1
0,36
2,5/7,1
0,34
2,4/7,1
0,33
3,5/7,1
0,49
3,3/7,1
0,46
3,3/7,1
0,46
3,8/7,1
0,53
3,6/7,1
0,51
3,7/7,1
0,51
4,6/7,1
0,65
4,7/7,1
0,66
4,6/7,1
0,64
5,6/7,1
0,78
5,6/7,1
0,78
5,6/7,1
0,78
6,5/7,1
0,91
6,5/7,1
0,91
6,4/7,1
0,90
Não se quantifica compostos químicos pelo método
de CCD e, em se tratando de matéria-prima em forma de
folhas, possivelmente cada amostra apresentaria valores
diferentes, pois somente o extrato seco padronizado
EGb 761 contém uma quantidade conhecida de princípio
ativo, que a RDC 89/2004 diz que deve conter no mínimo
24% de ginkgoflavonóides e 6% de terpenóides 11.
Em estudo feito por Bara,12 foi pesquisado o teor do
princípio ativo contido no extrato seco de várias matériasprimas vegetais e foi encontrada uma amostra de Ginkgo
biloba que possuía um teor de princípio ativo muito abaixo,
o que levou à dedução de que a amostra se tratava do pó
da planta e não do extrato. Isso mostrou a importância
do uso do extrato seco padronizado para que se tenha
um resultado eficiente e confiável, pois em outra forma
como, por exemplo, o pó das folhas desta planta poderia
conter ácido ginkgólico e por se tratar de uma substância
alergênica não tem o uso recomendado. Nos extratos
secos, sua concentração deve ser menor que 5 ppm.
Para a análise de perda por secagem, todas as amostras
mostraram-se dentro do ideal aceito que é de até 11%
de umidade pela recomendação da OMS, sendo que a
amostra A apresentou uma média de 6,43%, a amostra B
de 5,82% e a amostra C de 6,02%. Em material vegetal, o
baixo teor de umidade é importante, por se tratarem de
amostras de folhas secas que não passaram por nenhum
processo senão a secagem. A diminuição da atividade de
água diminui também a possibilidade do crescimento de
microrganismos e a deterioração a amostra.10
No ensaio para determinar o teor de cinzas, todas as
amostras apresentaram resultados satisfatórios dentro do
exigido pela OMS para folhas secas de Ginkgo biloba L. de
SAPIENTIA - PIO XII <em revista> n‘ 12 Novembro/2013
no máximo 11%. A amostra A apresentou uma média de
9,22%, a amostra B de 10,97% e a amostra C de 10,76%.
Este ensaio se fez importante pois através dele, seria
possível detectar contaminantes inorgânicos não voláteis
como pedras, cimento, pedaços de cerâmica e areia que
é o mais comum entre outros se estivessem presentes 10.
Na análise microbiológica, a monografia da OMS informa
os limites aceitos para os microrganismos pesquisados
na folha do Ginkgo biloba L. e foram obtidos os seguintes
resultados, conforme pode ser observado na Tabela 4.
Tabela 4. Resultados das análises microbiológicas.8
Microrganismos
*Limites
aceitáveis
Resultado
Amostra A
Resultado
Amostra B
Resultado
Amostra C
Bactérias
aeróbias
<107 UFC/g
15x10-3
UFC/g
3x10-2
UFC/g
7x10-3
UFC/g
Fungos
<105 UFC/g
<105 UFC/g
Ausente
<105 UFC/g
Escherichiacoli
<102 UFC/g
Ausente
Ausente
Ausente
Salmonella
Ausência
Ausente
Ausente
Ausente
A Tabela 4 apresenta os resultados das análises
microbiológicas das amostras A, B e C de Ginkgo biloba
L. e, como pode ser observado, todas as amostras
encontraram-se dentro da quantidade de colônias aceitas.
A amostra B trazia em sua embalagem a informação de
“produto esterilizado” e provavelmente por esse motivo o
crescimento de microrganismo foi praticamente nulo.
Estudos microbiológicos de fitoterápicos presentes
na literatura demonstram que a quantidade de
microrganismos encontrados nestes produtos raramente
ultrapassa os valores aceitos de contaminação, o que
está de acordo com os resultados encontrados no
presente estudo. Isso foi demonstrado nos estudos de
Andrade,13 em que foram feitas análises de matériasprimas e formulações farmacêuticas magistrais que
incluíam o Ginkgo biloba na forma de extrato seco,
cápsulas e folhas secas para chás. Porém, não se pode
descartar a possibilidade deste tipo de contaminação,
por se tratarem de materiais vegetais e seu cultivo,
coleta e manipulação nem sempre serem feitos de
forma higiênica, motivo pelo qual é necessário que seja
efetuado o controle microbiológico destes produtos.
Vários estudos pesquisam a qualidade e quantidade dos
flavonóides encontrados no Ginkgo biloba L., mostrando
a importância deste componente para a ação terapêutica
desta planta, porém fica claro que o extrato seco deve ser a
matéria-prima utilizada nas formulações deste fitoterápico.
O grande problema de se consumir produtos como os chás
das folhas dos vegetais é que não se sabe a quantidade
do princípio ativo presente no produto, o que gera a
possibilidade de ocorrência de reações adversas, como
intoxicações, ou, ainda, o produto pode não apresentar o
resultado esperado. O ideal é que os pacientes consumam
produtos fitoterápicos que tenham seu extrato padronizado.
O objetivo do controle de qualidade é que o produto
49
atenda adequadamente o seu consumidor não gerando
riscos para sua saúde e, ao mesmo tempo, trazendo
benefícios para o mesmo, de acordo com as normas
disponíveis na literatura. Isso se aplica aos fitoterápicos,
sendo essas análises de extrema importância para
a garantia de que um produto bom e eficiente seja
colocado no mercado. Dessa forma, observou-se
através dos testes realizados neste trabalho que
as três amostras de Ginkgo biloba L. analizadas
encontravam-se dentro dos limites esperados para
os testes quantitativos. No caso da cromatografia em
camada delgada, apesar de o método ser qualitativo,
se mostrou importante por apresentar resultados que
indicaram a presença dos flavonóides característicos
do Ginkgo biloba L., de acordo com as descrições das
literaturas pesquisadas.
Referências
1.BarnesJ,AndersonLA,PhillipsonJD2005.Plantasmedicinales:
guía para los profesionales de la salud. Barcelona:Pharma Editores.
2. SIimões CMO et al 1999. Farmacognosia: da planta ao
medicamento. Florianópolis:UFSC; Porto Alegre: Ed. da UFRGS.
3. Veiga Junior VF, Pinto AC, Maciel MAM 2005. Plantas
medicinais: cura segura? Química Nova 28: 519-528.
4. Yunes RA, Pedrosa RC, Cechinel FV 2001. Fármacos
e fitoterápicos: a necessidade do desenvolvimento
da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil.
Química Nova 24:147-152.
5.MeloJG2010.Controledequalidadeeprioridadesdeconservação
de plantas medicinais comercializadas no Brasil. [http://www.pgb.ufrpe.
br/doctos/Dissertacao_Joabe_Gomes_de_melo.pdf].
6. Feltrin EP, Chorilli M 2010. Extratos secos
padronizados: Tendência atual em fitoterapia. Revista
Lusófona de Ciências e Tecnologia da Saúde 7:109-115.
7. Toledo ACO 2003. Fitoterápicos: uma abordagem
farmacotécnica. Revista Lecta 21:7-13.
8. World Health Organization 2011. Monographs on Selected
Medicinal Plants. Vol. 1, 1999 p.295. Folium Ginkgo [http://apps.
who.int/ medicinedocs/em /d/Js2200e/18.html#Js2200e.18].
9. Hildebert W, Bladt S 1996. Plant Drug Analysis: A
Thin Layer Chromatography Atlas. New York:Springer.
10. Portugal 2002. Ministerio Da Saude. Farmacopeia
Portuguesa VII. Lisboa:Infarmed, Lisboa: 1318p.
11. Bara MT, Cirilo HN, Oliveira V 2004. Determinação de
ginkgoflavonóides por Cromatografia líquida de alta eficiência em
matérias-primaseprodutosacabados.RevistaEletrônicadeFarmácia1.
12. Bara MTF, Ribeiro PAM, Arantes MCB, Amorim
LLSS, Paula JR 2006. Determinação do teor de princípios
ativos em matérias-primas vegetais. Revista Brasileira
de Farmacognosia 16:211-215.
13. Andrade FRO 2011. Análise microbiológica de
matérias primas e formulações farmacêuticas magistrais.
Revista Eletrônica de Farmácia 2 [www.revistas.ufg.br/
index.php/REF/article/ download/1960/1928].
SAPIENTIA - PIO XII <em revista> n‘ 12 Novembro/2013