ic2009-0227

PIBIC-UFU, CNPq & FAPEMIG
Universidade Federal de Uberlândia
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação
DIRETORIA DE PESQUISA
INFLUÊNCIA DE Toxoplasma gondii NA MODULAÇÃO DA APOPTOSE
EM CÉLULAS TROFOBLÁSTICAS
ANDRESSA DA SILVA CASTRO1
Laboratório de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia.
Avenida Pará, Bairro Umuarama, Uberlândia – MG.
[email protected]
MARIANA BODINI ANGELONI2
Laboratório de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia.
Avenida Pará, Bairro Umuarama, Uberlândia – MG.
JOSÉ ROBERTO MINEO3
Laboratório de Imunoparasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia.
Avenida Pará, Bairro Umuarama, Uberlândia – MG.
ELOISA AMÁLIA VIEIRA FERRO 4
Laboratório de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia.
Avenida Pará, Bairro Umuarama, Uberlândia – MG.
Resumo: Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório, capaz de causar sérios
danos à saúde de pacientes imunocomprometidos e quando transmitido verticalmente.
Toxoplasma gondii possui estratégias de manipulação do sistema imune do hospedeiro,
superando as barreiras de defesa e é capaz de levar a quadros de infecção crônica. Existe 3
tipos diferentes de cepa de Toxoplasma gondii, determinadas segundo o grau de virulência,
sendo elas tipo I ou de alta virulência e tipo II e III, também conhecidas como cepas de baixa
virulência. Como o tipo de cepa interfere na modulação do sistema imune do hospedeiro, o
presente estudo analisou como células trofoblásticas, linhagem BeWo, reagiram à infecção
com cepas de alta virulência (RH) e de baixa virulência (ME49). Dois tempos de infecção
foram analisados: 24 e 36 horas, e observou-se que em células infectadas o índice de apoptose
foi maior do que naquelas não-infectadas, e que células infectadas com cepa de alta virulência
tiveram índice de apoptose mais elevado. Estes resultados demonstram que o parasito é capaz
de modular vias apoptóticas e que essa modulação varia entre os tipos de cepas e o tempo de
infecção.
Palavras-chave: apoptose, células trofoblásticas, Toxoplasma gondii
1. INTRODUÇÃO
Toxoplasma gondii é um protozoário parasito intracelular obrigatório, pertencente ao
Filo Apicomplexa (MONTOYA; LIESENFELD, 2004). É capaz de infectar um amplo espectro
1
Aluna de Iniciação Científica. [email protected]
Aluna do Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas.
3
Professor titular.
4
Professora titular e orientadora.
2
1
de hospedeiros, que incluem todos os animais de sangue quente e alguns invertebrados
(NEVES, 2002), sendo que possui os Felídeos como hospedeiros definitivos, e as demais
espécies de animais, inclusive o homem, como hospedeiros intermediários (MONTOYA;
LIESENFELD, 2004; PINARD; LESLIE; IRVINE, 2003).
A infecção por Toxoplasma gondii causa a toxoplasmose, uma protozoonose que
acomete cerca de um terço da população mundial (TENTER; HECKEROTH; WEISS, 2000).
A toxoplasmose é assintomática em indivíduos imunocompetentes, porém, é potencialmente
grave em dois casos: em pacientes imunocomprometidos, nos quais há reagudização da
infecção e em gestantes, quando há a transmissão vertical do parasito na primo infecção
materna (ROMAN et al., 2006).
A existência de cepas mais ou menos virulentas é um dos fatores que determina o
caráter patogênico das mesmas e interfere no curso da toxoplasmose (SUZUKI e al., 1989). Em
cepas de alta virulência a multiplicação extracelular de taquizoítas ocorre em ritmo acelerado e
a produção de cisto é lenta. Já no caso de cepas pouco virulentas, os taquizoítas se multiplicam
lentamente e a formação de cistos teciduais é mais rápida (REY, 1991).
Em indivíduos imunocompetentes, o principal mecanismo de defesa contra o
Toxoplasma gondii é mediado, principalmente, pela resposta imune celular (DENKERS;
GAZZINELLI, 1998). Nestes casos, os linfócitos TCD4 +, quando estimulados, induzem uma
resposta imune do tipo Th1, que por sua vez, secretam citocinas inflamatórias, responsáveis
pela resistência do hospedeiro ao parasito (FILISETTI; CANDOLFI, 2004).
No entanto, durante a gestação, há imunomodulação, e o perfil de resposta imune
predominante na placenta é do tipo 2, caracterizado pela secreção de citocinas regulatórias.
Dessa forma, o perfil o novo perfil de resposta favorece a transmissão placentária de
Toxoplasma gondii, já que as citocinas inflamatórias, importantes no controle da infecção, são
moduladas negativamente (PRIGIONE et al., 2006).
Além disso, um importante processo que atua na resposta imune contra patógenos
intracelulares refere-se a apoptose (LUDER; GROSS; LOPES, 2001). Trata-se de um
mecanismo controlado pela ação das caspases, que através da quebra de moléculas no sítio de
ácido aspártico, induzem o início do processo apoptótico (ABBAS; LICHTMAN, 2005).
A apoptose pode ocorrer segundo duas vias: intrínsecas e extrínsecas. A via intrínseca
está relacionada com a permeabilidade da membrana externa da mitocôndria, provocada pela
ação de proteínas pró-apoptóticas pertencentes à família Bcl-2. Já a via extrínseca da apoptose
está associada à ligação de alguns ligantes específicos aos seus receptores de morte
correspondentes, presentes na membrana celular (LUDER; GROSS; LOPES, 2001).
No entanto, protozoários, como Toxoplasma gondii, são capazes de interferir no
processo apoptótico, inibindo-o ou promovendo-o. Tais mecanismos dependem da interação do
parasito com os sinais pró ou anti-apoptóticos da célula hospedeira (DEBIERREGROCKIEGO et al., 2007).
Dessa forma, visando melhor conhecer possíveis interferências de T. gondii na
incidência da apoptose em células trofoblásticas, este trabalho objetivou analisar
morfologicamente células BeWo infectadas com Toxoplasma gondii, cepa RH e ME49 e
quantificar a incidência de apoptose com diferentes tipos de cepas e tempos de infecção.
Células BeWo foram utilizadas pelo fato de serem mantidas com facilidade, possuírem
características comuns às outras células trofoblásticas e por não serem capazes de produzir
IFN-γ biologicamente ativo, tornando-se, pois, mais susceptíveis à infecção por T. gondii
(ENTRICAN, 2002, OLIVEIRA et al., 2006). Assim, células trofoblásticas de linhagem BeWo
permitem dentre outras finalidades, o estudo detalhado da transmissão do Toxoplasma gondii
via transplacentária, e de suas conseqüências para as células infectadas.
2
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Manutenção das cepas RH e ME49 de Toxoplasma gondii
A cepa RH de Toxoplasma gondii foi mantida na cavidade peritoneal de camundongos
Swiss através de repiques. O exsudato peritoneal dos camundongos foi colhido e submetido a
duas lavagens em solução salina tamponada com fosfato 0,01M (PBS) estéril, pH: 7,2. Os
taquizoítas daí resultantes foram ressuspensos em meio RPMI (Roswell Park Memorial
Institute) 1640 (Sigma Chemical CO. St. Louis,USA) e contados em câmara hemocitométrica.
Em seguida, inoculados em camundongos não infectados.
Taquizoítas de Toxoplasma gondii da cepa ME49 foram mantidos em cultura de
fibroblasto humano – HFF (cedidos pelo laboratório). A medida que as células infectadas
encontravam-se lisadas pelos parasitos, o meio do frasco contendo taquizoítas livres foi
transferido para um tubo de 15ml, centrifugado a 500rpm, por um minuto em temperatura
ambiente. O sobrenadante contendo apenas taquizoítas foi distribuído em frascos contendo
células da linhagem BeWo e HeLa. O repique do parasito nessa linhagem celular foi realizado
como descrito anteriormente para taquizoítas da cepa RH de T. gondii.
2.2. Manutenção das células BeWo
Células BeWo, derivadas de coriocarcinoma humano, obtidas do American Type
Culture Collection/CCL-98 (ATCC, USA), cedidas pelo laboratório de Imunologia da
Universidade Federal de Uberlândia, foram mantidas em cultura no Laboratório de Imunologia
da Universidade.
Essas células foram cultivadas separadamente em meio RPMI 1640, suplementado com
10% de soro fetal bovino (Sigma Chemical CO. St. Louis) contendo 0,37% de bicarbonato de
sódio, 1% de antibióticos – 10,000U/ml de penicilina e 10 mg/ml de estreptomicina, Lglutamina, aminoácidos essenciais, piruvato de sódio e 2-mercaptoetanol (Sigma Chemical
CO. St. Louis) em frascos de cultura em câmara úmida a 37ºC com 5% de CO2.
Os repiques foram realizados a cada três dias através da adição de solução de tripsina e
EDTA (0,25% de Tripsina e 0,02% de EDTA em solução salina tamponada com Hank’s) e o
excedente foi congelado em meio de congelamento (95% de meio de cultura e 5% de DMSO).
2.3. Infecção das células da linhagem BeWo por Toxoplasma gondii
Células BeWo foram retiradas dos frascos de cultura, centrifugadas, ressuspensas em 1
ml de meio e contadas em câmara de Newbauer. As células inviáveis foram excluídas pela
coloração com azul de trypan (Sigma Chemical CO., Brasil). Após o ajuste para uma
concentração de 5x104 cél/ml, as mesmas foram transferidas para uma placa de 24 orifícios
(Ciencor Scientific, Brasil) e cultivadas por 24 horas a 37ºC e 5% de CO2. Posteriormente, as
células foram lavadas com meio e, em seguida, parasitos das cepas RH e ME49 de T. gondii
foram adicionados separadamente à placas diferentes. Após 3 horas de interação, as células
foram lavadas com meio a 10% de SBF para a retirada de parasitos não aderentes e
permaneceram por mais 24 horas nas mesmas condições de cultura.
Para análise morfológica, células BeWo infectadas ou não foram fixadas em formol
10% em solução salina tamponada (PBS) por 2 horas e em seguida lavadas em PBS e coradas
por 5 minutos em solução de Azul de Toluidina (1%) em PBS.
2.4. Imunocitoquímica para detecção de apoptose
A análise de apoptose foi realizada através de reações imunocitoquímicas. Células
previamente fixadas foram incubadas por oito minutos em solução de ácido acético a 5 % para
bloqueio da fosfatase endógena, em seguida lavados em água corrente e em solução salina
tamponada com TRIS 0,05 M, pH 7,4, acrescida de 2,5 % de cloreto de Sódio (TBS) por 5
minutos. Para bloqueio de sítios inespecíficos de ligação, as lâminas foram incubadas com soro
3
normal de cabra a 2,5% em TBS por 20 minutos a 37º C; após este bloqueio, foi feita a
incubação das células com anticorpo primário M30, em TBS por 12 horas a 4º C. Após
sucessivas lavagens em TBS, as células foram incubadas com anticorpo secundário em TBS
por uma hora a 37º C. Novas lavagens foram realizadas e a reação foi amplificada pelo
complexo avidina/biotina (ABC) - fosfatase (Biomeda, Foster city, USA) na diluição de 1:100
em TBS, a 37º C por 30 minutos. Posteriormente, seguida de sucessivas lavagens, houve a
revelação da enzima fosfatase alcalina com fast red – naftol (Sigma, St. Louis, USA), em
tampão TRIS, lavagens em TBS e água corrente e contra – coloração com hematoxilina de
Meyer, por 8 minutos à temperatura ambiente. Após a diferenciação do corante em água
amoniacal, as lamínulas foram montadas em lâminas em glicerina e o material analisado e
fotografado em microscópio de luz Nikon, modelo Optiphot –2. Como controle da reação foi
feita a incubação de uma lâmina com soro normal de coelho como anticorpo primário.
2.5. Análise de incidência de apoptose
As células foram quantificadas quanto à porcentagem de células apoptóticas a cada 100
células examinadas, infectadas ou não (índice de apoptose). Analisou-se também a
porcentagem (índice) de células apoptóticas com parasitos intracelulares e de células saudáveis
com parasitos intracelulares a cada 100 células infectadas examinadas.
2.6. Análise Estatística
Em todos os experimentos quantitativos, os dados foram expressos como média 
desvio padrão (SD) e as diferenças estatísticas entre os grupos foram determinadas usando teste
ANOVA, pós teste de Bonferroni (Graph Pad Software, v. 4.0, San Diego, USA). Diferenças
foram consideradas estatisticamente significantes quando P  0,05.
3. RESULTADOS
3.1. Análise morfológica
Figura 1: Células BeWo infectadas com Toxoplasma gondii, cepa RH, na proporção 5:1 (5
parasitos por célula), contendo vacúolos parasitóforos com taquizoítas em seu interior (seta).
417X. Revelação com Fast-Red Naphtol, contracorado com hematoxilina de Meyer.
3.2. Ensaios para análise de apoptose
4
Figura 2: Imunomarcações de apoptose (*) em células BeWo não infectadas. 417X.
Revelação com Fast-Red Naphtol, contracorado com hematoxilina de Meyer.
Figura 3: Imunomarcações de apoptose (seta) em células BeWo infectadas com cepa RH (a)
e ME49 (b) de Toxoplasma gondii. 417X. Revelação com Fast-Red Naphtol, contracorado
com hematoxilina de Meyer.
10
Figura 4: Imunomarcações de apoptose (seta) em células BeWo infectadas com T. gondii por 24
horas (a) e 36 horas (b). Revelação com Fast-Red Naphtol, contracorado com hematoxilina de
Meyer.
Células BeWo infectadas com T. gondii
por 24 horas
Índice de apoptose (%)
50
Controle
Infectado

40
*
30
*
20
10
0
Cepa RH
Cepa ME49
Figura 5 : Gráfico representativo da variação do índice de apoptose (eixo y) segundo infecção
com diferentes tipos de cepa (eixo x) no tempo de 24 horas. Diferenças estatísticas entre grupos
controle e infectado ( ) e entre os dois grupos infectados - RH versus ME49 - (  ).
*
4
Células BeWo infectadas com T. gondii
por 36 horas
Índice de apoptose (%)
50
Controle
Infectado
40

30
*
*
20
10
0
Cepa RH
Cepa ME49
Índice de células apoptóticas com parasitos
intracelulares (%)
Figura 6 : Gráfico representativo da variação do índice de apoptose (eixo y) segundo
infecção com diferentes tipos de cepa (eixo x) no tempo de 36 horas. Diferenças
estatísticas entre grupos controle e infectado ( * ) e entre os dois grupos infectados - RH
versus ME49 - (  ).
Células BeWo infectadas com T. gondii
(5 parasitos por célula)
50
Cepa ME49
Cepa RH
40
30

20
*
*
10
0
24 horas
36 horas
Figura 7: Gráfico representativo do índice de células apoptóticas com parasitos intracelulares (eixo y)
segundo dois tempos de infecção - 24 e 36 horas (eixo x). Diferenças estatisticamente significativas
entre cepas ( * ) e entre a cepa ME49 em ambos os tempos (  )
.
6
4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
A partir da análise morfológica de células BeWo infectadas com Toxoplasma gondii,
foi possível observar a ocorrência de vacúolos parasitóforos no interior das mesmas. Os
taquizoítas, tanto da cepa RH quanto da cepa ME49, entram nas células hospedeiras por
penetração ativa e são mantidos dentro do vacúolo parasitóforo, o qual os protege contra
mecanismos de defesa da célula hospedeira (DUBEY, 2004).
Neste trabalho, também analisou-se a incidência de apoptose em células não infectadas
e infectadas por Toxoplasma gondii. Corroborando com os dados de Levy e Nelson (2000),
que observaram que a apoptose é um processo que se faz presente em células trofoblásticas,
objetivando a renovação das mesmas, o trabalho demonstrou que tanto em células BeWo
infectadas quanto não-infectadas, houve imunomarcações de células em apoptose.
Células BeWo infectadas tanto com cepa de baixa virulência ME49 quanto com cepa
RH de alta virulência apresentaram índices de apoptose mais elevados do que células não
infectadas, independente do tempo de infecção. Além disso, assim como demonstrado em
estudos in vivo, o trabalho mostrou que apesar de ambas as cepas (RH e ME49) possuírem
capacidade de induzir apoptose, o processo apoptótico ocorre com maior freqüência em
infecções pela cepa RH, fato este, que pode estar associado aos níveis de citocinas liberadas
após a infecção por cepas de alta virulência de Toxoplasma gondii (GAVRILESCU;
DENKERS, 2003).
Comparando os resultados do presente estudo com os dados demonstrados no trabalho
de Angeloni (2009) verifica-se que a cepa ME49 mantém o padrão de resposta nos tempos
que variam entre 2 e 36 horas. Como demonstrado em ambos os trabalhos, o índice de
apoptose em células infectadas com esse tipo de cepa foi maior do que nos grupos controle.
Isto pode estar relacionado a algum mecanismo protetor que a cepa ME49 apresenta, visto que
estudos demonstraram que a indução de apoptose pelo parasito possa ter um efeito protetor
para o hospedeiro, pois o aumento nos índices de apoptose pode significar diminuição da
parasitemia e, consequentemente, dos níveis de citocinas pro-inflamatórias liberadas.
Comparando os resultados desse estudo com aqueles apresentados por Angeloni
(2009) verifica-se que o padrão de resposta referente à infecção com cepa virulenta RH foi
diferente no decorrer dos tempos de infecção. Nos tempos iniciais de infecção (2, 6 e 12
horas) verifica-se que o índice de apoptose nas células infectadas é significativamente menor
do que nos grupos controle, sugerindo que o parasito possui algum tipo de mecanismo capaz
de interferir na resposta imune de modo a bloquear o processo apoptótico. Já nos tempos de
infecção de 24 e 36 horas o índice de apoptose nas células infectadas é superior ao do grupo
controle, sugerindo que após certo tempo o parasito pode não ser mais capaz de promover
respostas que bloqueiam a apoptose.
O índice de apoptose em células infectadas com cepa virulenta RH diminui
significativamente no tempo de 36 horas quando comparado à 24 horas de infecção. Isto
demonstra que o padrão de resposta perante infecção com cepa virulenta de Toxoplasma
gondii é mais variável, visto que nas primeiras horas de infecção (2, 6 e 12 horas) o parasito é
capaz de promover respostas que inibem o processo apoptótico, e após altos níveis de
apoptose verificados no tempo de 24 horas de infecção ele volta a inibi-la, como pode ser
visto com 36 horas de infecção.
Assim, verifica-se que a ocorrência e a intensidade de apoptose está intimamente
ligada à virulência do parasito e com o tempo de infecção pelo mesmo, de modo que esse
processo de morte celular programada pode ser induzido ou bloqueado segunda a atuação de
Toxoplasma gondii, o que torna-se ainda mais determinante em casos de infecção congênita,
um sério problema de saúde pública.
8
5. AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerias (FAPEMIG) pela bolsa
de Iniciação Científica concedida a primeira autora.
6. REFERÊNCIAS
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Biomédicas da Universidade Federal de Uberlândia, 2009.
DEBIERRE-GROCKIEGO, F.; HIPPE, D.; SCHWARZ, R. T.; CARSTEN, G.; LUDER, K.
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MODULATION OF APOPTOSIS BY Toxoplasma gondii IN
TROFOBLASTIC CELLS
Andressa da Silva Castro
Laboratory of Histology and Embryology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade Federal de Uberlândia.
Avenue Pará, Umuarama, Uberlândia – MG.
[email protected]
Mariana Bodini Angeloni
Laboratory of Histology and Embryology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade Federal de Uberlândia.
Avenue Pará, Umuarama, Uberlândia – MG.
José Roberto Mineo
Laboratory of Imunoparasitology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade Federal de Uberlândia.
Avenue Pará, 1720 Umuarama, Uberlândia – MG.
Eloisa Amália Vieira Ferro
Laboratory of Histology and Embryology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade Federal de Uberlândia.
Avenue Pará, Umuarama, Uberlândia – MG.
Abstract: Toxoplasma. gondii is an obligatory intracellular parasite, that causes serious
damage to the health, mainly in those immunocompromised patients and in cases of
congenital toxoplasmosis. The parasite has strategies that manipulate the immune system of
the host in order to overcome his defense mechanisms that leads to chronic infection cases.
Exists in 3 different strains, determined by the virulence degree, which are type I or high
virulence and type II and III, also known as low-virulence strains. Since the type strain
interferes with the modulation of the immune system of the host, this study analised how
trophoblastic cells, BeWo line, reacted to infection with strains of high virulence (HR) and
low virulence (ME49). Two time points of infection were analyzed: 24 and 36 hours and it
was shown that in infected cells the index was higher than non-infected ones, and that cells
infected with the high virulence strain had higher rates of apoptosis. The work thus shows
that the parasite is able to modulate apoptotic pathways and this modulation varies between
types of strains, and time of infection.
Key-words: apoptosis, trophoblastic cells, Toxoplasma gondii
10