desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro

DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS
IN VITRO CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO
RAQUEL VARELLA SERAPIÃO
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
OUTUBRO/2007
DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS
IN VITRO CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO
RAQUEL VARELLA SERAPIÃO
Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologia Agropecuária da Universidade
Estadual do Norte Fluminense, como parte
das exigências para obtenção do título de
Doutor em Produção Animal.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Aloízio Fonseca
Co-Orientador: Dr. Wanderlei Ferreira de Sá
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
OUTUBRO/2007
DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS
IN VITRO CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO
RAQUEL VARELLA SERAPIÃO
Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense, como parte
das exigências para obtenção do título de
Doutor em Produção Animal.
Aprovada em 23 de outubro de 2007
Prof. Dr. Angelo José Burla Dias (D.S., Biociência) - UENF
Profª. Dra. Maria Clara Caldas Bussiere (D.S., Fisiologia Geral) - UENF
Dr. Luiz Sérgio de Almeida Camargo (D.S., Ciência Animal) - EMBRAPA
Dr. Wanderlei Ferreira de Sá (D.S., Protozoologia de Parasitos) – EMBRAPA
(Co-Orientador)
Prof. Dr. Francisco Aloízio Fonseca (PhD, Animal Science) – UENF
(Orientador)
“Caminante
son
tus
huellas
El camino y nada mas;
Caminante,
no
hay
camino Se hace camino
al andar Al andar se
hace camino Y al volver
la vista atras Se ve la
senda que nunca Se ha
de
volver a
pisar.
Caminante
no
hay
camino Sino estelas en la
mar..."
(Antonio Machado)
“Alguém me disse que
sou um homem de sorte,
mas toda vez que a sorte
me procura estou em meu
atelier trabalhando.”
(Leonardo da Vinci)
Dedico esta tese ao meu filho Lui
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pois sem ele não conseguiria concluir esta jornada.
Agradeço ao meu filho Lui, por ter sido um excelente companheiro com
seu amor incondicional, e ao meu marido João Carlos, pelo amor, paciência,
companheirismo e incentivo que foram de fundamental importância para a
conclusão do meu trabalho.
Agradeço aos meus pais Roberto e Edna, que estiveram presentes a
todo o momento me apoiando no que foi necessário.
Agradeço à minha irmã Marta pela torcida e amizade, e aos meus
sobrinhos Matheus, Caio e Luiza pelo grande carinho.
Agradeço à minha avó Nilza pelas orações, e a todos os meus tios, tias
e primos que se mostraram o tempo todo disponíveis para o que eu precisasse
e torceram tanto por mim.
Agradeço à Sandra pela amizade e o carinho, principalmente nos
momentos em que fraquejei.
Agradeço à minha sogra Neli (in memoriam) por sempre ter tido um
grande carinho por mim, e às minhas cunhadas Denise, Andréa e Márcia pela
amizade.
Agradeço à família Salomão por terem acolhido a mim e ao Lui em sua
casa como se fôssemos da família.
Agradeço às minhas grandes e eternas amigas Carlinha, Cris, Sílvia,
Alessandra, Isabella, Séfora Andréa, Juliana e Mariana, que estiveram sempre
presentes e companheiras durante toda esta caminhada.
Agradeço a todos os estagiários do laboratório pela colaboração em meu
experimento e pela amizade, em especial a Elisa, Ingrid, Carla, Nathalia,
Michele, Alessandra Vireque, Renata, Fabrício, Gaúcho, Everton, Luiz Gustavo,
Gustavo, Ríbrio e Sabine.
Agradeço aos funcionários do Laboratório, Bruno, Joel, Myro e Del pela
disponibilidade, amizade e colaboração, que foram fundamentais para a
conclusão do nosso trabalho.
Agradeço à UENF pela oportunidade de conquistar o título de Doutora e
pela bolsa concedida.
Agradeço à Embrapa Gado de Leite por permitir a realização deste
trabalho.
Agradeço à equipe do Laboratório de Genética Molecular da Embrapa
Gado de Leite e do Laboratório Agrogenética pela colaboração, apoio e
disponibilidade.
Agradeço ao Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das
Clínicas da USP, em Ribeirão Preto pela colaboração.
Agradeço ao Dr. Ademir de Moraes Ferreira pela amizade,
principalmente nos momentos em que buscávamos algum tipo de orientação.
Agradeço aos pesquisadores Dr. Luiz Sérgio de Almeida Camargo, João
Henrique Moreira Viana e Lilian Tamy Iguma pela amizade, orientação e
oportunidades.
Agradeço ao meu orientador Prof. Francisco Aloízio Fonseca que,
mesmo sem me conhecer, apostou na minha capacidade e sempre se mostrou
tão solícito e amigo.
Agradeço muito ao meu co-orientador, Dr. Wanderlei Ferreira de Sá, por
ter me dado mais esta oportunidade e me ensinado tanta coisa, sempre me
motivando a seguir em frente, independentemente do que acontecesse ao
redor.
Agradeço ao Prof. Alberto Magno pela amizade.
Agradeço a todos os companheiros da UENF, em especial ao Bruno, à
Kelen, à Amanda e à Liu.
Agradeço imensamente aos amigos Janaína, Jimmy e Zé Antônio pela
amizade e companheirismo nas exaustivas segundas-feiras do primeiro
semestre.
Agradeço aos professores da UENF pela compreensão e incentivo.
Agradeço à coordenação de pós-graduação pela disponibilidade e apoio.
Agradeço a todos que direta ou indiretamente foram de fundamental
importância para a conquista desta vitória.
BIOGRAFIA
RAQUEL VARELLA SERAPIÃO, filha de Edna Varella Serapião e Roberto
de Souza Serapião, nasceu em 11 de março de 1974, na cidade do Rio de
Janeiro – RJ. Em 1999, concluiu a graduação em Medicina Veterinária, pela
Universidade Federal Fluminense. Em março de 2000, iniciou no programa de
Pós-Graduação (Mestrado), da Universidade Federal Fluminense, tendo obtido
o título de Mestre em Patologia e Reprodução Animal em fevereiro de 2002,
sob a orientação do professor Luiz Altamiro Garcia Nogueira. No mês de maio
do ano de 2003, ingressou no curso de Doutorado em Produção Animal, do
Programa de Pós-Graduação da Universidade Estadual do norte Fluminense Darcy Ribeiro, submetendo-se à defesa de tese para a conclusão do curso em
outubro de 2007.
CONTEÚDO
RESUMO
ix
ABSTRACT
xi
1. INTRODUÇÃO
1
2. REVISÃO DE LITERATURA
4
2.1- Aspectos Gerais
4
2.2- Período pré-implantacional em embriões bovinos
5
2.3- Cinética de desenvolvimento embrionário
8
2.4- Cultivo in vitro de embriões bovinos
9
2.5- Soro fetal bovino (SFB) no cultivo in vitro de embriões
12
2.6- Knockout serum replacer (KSR) como substituto do SFB
13
2.7- Resposta embrionária a condições de estresse
14
2.8- Apoptose em embriões produzidos in vitro
15
2.9- Expressão gênica em embriões bovinos
16
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
20
4. TRABALHOS
30
DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS CULTIVADOS IN VITRO EM
MEIO SUPLEMENTADO COM SUBSTITUTO DO SORO FETAL BOVINO
RESUMO
31
ABSTRACT
32
INTRODUÇÃO
33
MATERIAL E MÉTODOS
35
Local do experimento
35
Produção in vitro de embriões
35
Avaliação da clivagem e produção de embriões
36
Desenvolvimento embrionário
36
Contagem de células
36
Análise estatística
37
RESULTADOS
37
DISCUSSÃO
40
CONCLUSÃO
44
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
44
EXPRESSÃO DOS TRANSCRITOS Hsp70.1 E Bax EM EMBRIÕES BOVINOS
CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO
RESUMO
50
ABSTRACT
52
INTRODUÇÃO
54
MATERIAL E MÉTODOS
56
Local do experimento
56
Produção de in vitro de embriões
57
Avaliação dos embriões
57
Extração de RNA e transcrição reversa
57
PCR em tempo real
58
Análise estatística
60
RESULTADOS
61
DISCUSSÃO
62
CONCLUSÃO
65
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
65
5. CONCLUSÕES GERAIS
69
RESUMO
SERAPIÃO Raquel Varella, D.S. Universidade Estadual do Norte Fluminense;
outubro de 2007; Desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro
cultivados em meio livre de soro; Orientador: Prof. Francisco Aloízio Fonseca.
Co-Orientador: Dr. Wanderlei Ferreira de Sá.
A exposição de embriões ao soro fetal bovino (SFB) durante o cultivo in vitro
pode alterar: a cinética de desenvolvimento, a morfologia, o metabolismo e a
expressão de transcritos específicos. Além disso, o soro pode ser uma fonte
em potencial de contaminações por patógenos para sistemas de cultivo in vitro.
O KnockoutTM Serum Replacer (Gibco Labs., Grand Island, NY) é um substituto
do soro, otimizado para estabelecer e manter linhagens de células tronco em
cultivo. Portanto, objetivou-se neste trabalho avaliar a capacidade do KSR em
substituir o soro fetal bovino no cultivo in vitro de embriões bovinos fertilizados
in vitro. No primeiro experimento, foram avaliados o desenvolvimento
embrionário, a produção de embriões e o número total de células. Os embriões
cultivados em presença de KSR apresentaram os mesmos padrões de
desenvolvimento e qualidade daqueles cultivados em presença de soro. No
segundo experimento, além das taxas de clivagem e produção de blastocistos,
também foi avaliada a expressão dos genes Hsp70.1 e Bax. Como observado
no primeiro experimento, o KSR apresentou taxas de clivagem e produção de
blastocistos similares ao SFB, assim como expressão dos genes citados. Os
resultados gerados nos dois experimentos sugerem que o KSR pode ser
utilizado como substituto do SFB no cultivo embriões bovinos produzidos in
vitro.
Palavras-chave: bovino, embrião, cultivo in vitro, Knockout serum replacer,
Hsp70.1, Bax.
ABSTRACT
SERAPIÃO Raquel Varella, D.S. Universidade Estadual do Norte Fluminense;
october 2007; Development in vitro produced bovine embryos cultured in
serum-free medium; Adviser: Prof. Francisco Aloízio Fonseca. Committee
members: Dr. Wanderlei Ferreira de Sá.
The exposition of embryos to fetal calf serum (FCS) during the culture may
alter: kinetics of development, morphology, metabolism and the expression of
specific transcripts. Yet, the serum may act as a source of contamination for in
vitro culture systems. KnockoutTM SR (Gibco Labs., Grand Island, NY) is a
serum replacer optimized in a manner to establish and keep stem cell lineage in
culture. Our aim with this work was to evaluate KSR capacity as a substitute for
FCS in vitro culture systems. During the first experiment, the embryo
development, embryo production and total number cells were evaluated. The
embryos cultured in KSR presence had the same patterns of development and
quality of those cultured in serum presence. In the second experiment we
evaluated the expression of genes Hsp70.1 and Bax. Cleavage and blastocyst
rates and the gene expression of Hsp70.1 and Bax were similar among groups.
The results of both experiments suggest that KSR may be used as substitute for
FCS in the culture of in vitro produced bovine embryos.
Key words: bovine, embryo, in vitro culture, Knockout serum replacer, Hsp70.1,
Bax
1. INTRODUÇÃO
A melhoria do manejo sanitário e nutricional aliada ao incremento no
potencial genético de animais de produção contribuirá para atender a demanda
de carne e leite para o futuro. O melhoramento genético deixou de ser, na
pecuária brasileira, um assunto puramente acadêmico para tornar-se um
importante agente de transformações, sendo necessário criar a consciência de
que existem ferramentas disponíveis para escolher, de forma objetiva, o
material genético que deve ser multiplicado, tendo como objetivo primordial a
maximização da produção de carne e leite no país (PINEDA, 2004). Dentro
desse contexto, o desempenho da pecuária nacional vem contribuindo de
forma determinante para que o Produto Interno Bruto (PIB) do agronegócio
cresça de forma substancial. Conseqüentemente, o aumento das exportações
gerado pela excelência na produção de bovinos projetou a pecuária brasileira
no mercado internacional. As biotecnologias da reprodução foram, e continuam
sendo, uma importante ferramenta para que o país atingisse essa posição de
destaque, proporcionando a obtenção de indivíduos geneticamente superiores.
Essas biotecnologias são vantajosas para programas de melhoramento
genético bovino, pois, ao explorarem racionalmente a fertilidade de animais
genotipicamente superiores e acelerarem o ganho genético entre gerações
(HASLER, 2003), maximizam o retorno econômico para o sistema de produção.
Dentre as biotecnologias utilizadas atualmente, a produção in vitro de
embriões (PIVE) associada à punção folicular guiada por ultra-som tem
ocupado um papel de destaque, por permitir a obtenção de uma gestação por
vaca/semana, em média, podendo aumentar rapidamente o número de animais
geneticamente superiores, diminuir o intervalo entre gerações e aumentar a
intensidade de seleção de maneira mais acelerada do que outras técnicas,
como a transferência de embriões (DODE & RUMPF, 2002). Para que a PIVE
alcançasse sua aplicabilidade comercial na pecuária, várias equipes de
pesquisadores contribuíram para a melhoria dos sistemas de cultivo dos
embriões. Porém, existe uma variação na produção embrionária entre
laboratórios em função dos procedimentos adotados. Espera-se que,
aproximadamente, 30% dos oócitos maturados e fecundados in vitro atinjam o
estádio de blastocisto durante o cultivo embrionário (LONERGAN et al., 2003).
Em vista destes resultados, ou seja, pelo fato de a maior parte dos gametas
não atingirem os estádios de blastocistos, é factível considerar que a etapa do
desenvolvimento embrionário é limitante para a produção de maiores taxas de
embriões (SORIA, 2005).
Alterações morfológicas e moleculares causadas pelo cultivo in vitro
têm sido responsáveis pela menor qualidade e viabilidade após inovulação ou
criopreservação dos embriões (Mc EVOY, 2003). Entre as alterações em
embriões produzidos in vitro, estão o aumento do número de células
apoptóticas e diminuição do número total de células, alterações da densidade
(com acúmulo de lipídeos), do metabolismo (com aumento da produção de
lactato) e da expressão gênica (KHURANA & NIEMANN, 2000; GUTIERRÉZADAN et al., 2001; RIZOS et al., 2003; LONERGAN et al., 2006).
Apesar de geralmente aumentar o índice de produção de blastocistos,
o soro adicionado aos meios de cultivo embrionário tem sido apontado como
um dos principais agentes envolvidos nessas alterações embrionárias
(CROSIER et al., 2000, Mc EVOY et al., 2003, RIZOS et al., 2003), além de ser
uma fonte de contaminações por patógenos (LONERGAN et al., 2006).
Estudos vêm sendo desenvolvidos visando à exclusão do soro, utilizando
meios de cultivo quimicamente definidos (LANE et al., 2003).
O Knockout Serum Replacer (KSR) é um suplemento para meio de
cultivo utilizado como substituto do soro no cultivo de células tronco.
Entretanto, poucos são os relatos de seu efeito sobre o desenvolvimento
embrionário in vitro e características embrionárias, como número total de
células e expressão gênica.
Portanto, objetivou-se neste trabalho avaliar a capacidade do KSR em
substituir o soro no cultivo in vitro de embriões bovinos, avaliando-se a taxa de
produção e a qualidade dos embriões.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1- Aspectos gerais
O nascimento do primeiro bezerro produzido totalmente in vitro (LU et
al., 1988) despertou o interesse de vários laboratórios mundiais para a
produção in vitro de embriões (PIVE). Por meio desta biotecnologia, pode-se
obter uma produção média de uma gestação por vaca/semana (DODE &
RUMPF, 2002), o que permite uma rápida multiplicação de genótipos
superiores previamente selecionados, uma diminuição no intervalo de
gerações, propiciando uma maior intensidade de seleção, do que por outros
processos como a transferência de embriões (TE). Estima-se que a PIVE
possa aumentar o ganho genético anual acima de 10%, quando aplicada
apropriadamente, principalmente pela possibilidade de cruzamentos fatoriais,
diminuindo a taxa de consangüinidade, bem como pela utilização de fêmeas
pre-púberes. Além disso, com a PIVE pode-se ter uma produção maciça de
animais mestiços, possibilitando a manutenção de rebanhos com o grau de
sangue desejado, o que é impossível com o uso da monta natural e
inseminação artificial (ARENDONK & BIJMA, 2003).
Durante o processo de produção in vitro de embriões bovinos, cerca de
90% dos oócitos são capazes de atingir a maturação nuclear (progredindo de
prófase I a metáfase II) e aproximadamente 80% dos que são fertilizados
concluem pelo menos o segundo ciclo celular (GORDON, 1994). Do total de
oócitos fertilizados, apenas 30% a 40% dão origem a embriões que
eventualmente alcançam o estádio de blastocisto (LONERGAN et al., 2003),
sendo que o restante sofre algum tipo de bloqueio que leva à interrupção do
desenvolvimento.
Em geral, o potencial de desenvolvimento embrionário está associado
a características do oócito (folículo de origem, morfologia, estado de
poliadenilação), à cinética das primeiras clivagens (BREVINI et al., 2002;
LONERGAN et al., 2003; MEIRELLES et al., 2004) e a interações com os
sistemas de cultivo (NIEMANN & WRENZYCKI, 2000; WATSON et al., 2000;
NATALE et al., 2001; NIEMANN & WRENZYCKI, 2003; GUTIERRÉZ-ADAN et
al., 2004).
Diversas alterações encontradas nos embriões produzidos in vitro
podem estar relacionadas às condições adversas de cultivo, às quais os
embriões são expostos nesse sistema de produção, o que acaba influenciando
sua qualidade (KHURANA & NIEMANN, 2000).
2.2- Período pré-implantacional em embriões bovinos
No período de 24 a 36h após a fecundação, o zigoto contendo uma
célula divide-se em dois e, 24h mais tarde, o embrião já possui quatro células.
A divisão dos blastômeros pode ocorrer de forma assincrônica, razão pela qual
é possível observar em estádios iniciais um número ímpar de células. Ao
chegar ao estádio de 32 blastômeros, sua forma assemelha-se a uma amora,
razão pela qual é denominado mórula inicial, onde sua massa ocupa quase
todo o espaço perivitelínico (PALMA, 2001).
O estádio de mórula compacta (Mc), com aproximadamente 32-64
blastômeros, forma uma massa compacta que ocupa 60%-70% do espaço
perivitelínico. A compactação é considerada um dos sinais de diferenciação
embrionária. Ainda assim, os blastômeros continuam com sua capacidade
totipotente (SENGER, 2003). Os eventos celulares relacionados com a
compactação compreendem: o desenvolvimento da adesão celular dependente
de cálcio, o estabelecimento das junções gap mediadas pela comunicação
interblastomérica, a iniciação do contato celular induzido pela polarização das
células e o aparecimento de junções tight (WATSON & BARCROFT, 2001;
STANTON et al, 2003).
O
estádio
de
blastocisto
inicial
(Bi)
é
identificado
com
aproximadamente 100-200 células e caracteriza-se pelo começo do transporte
de fluido nas células trofoectodérmicas e pela formação de uma cavidade
(blastocele) no interior do embrião. O Bi ocupa cerca de 70%-80% do espaço
perivitelínico. Neste estádio já é possível diferenciar o trofoderma (TE) da
massa celular interna (MCI) (SENGER, 2003). O trofoderma é o primeiro tipo
celular a se diferenciar, formando a camada mais externa do blastocisto que
tem a função de, entre outras finalidades, iniciar o contato com o endométrio
materno, propiciando a implantação. Para tal é necessário que ocorra a
polarização celular caracterizada pelo estabelecimento de componentes da
superfície celular (microvilosidades apicais e receptores associados à lecitina);
pela distribuição assimétrica de proteínas de membranas; pelos componentes
específicos no citoplasma como agregação apical da actina e vesículas
endocíticas; e pela migração basal das mitocôndrias e vesículas lipídicas
(WATSON & BARCROFT, 2001).
A partir da polarização, o trofoderma adquire capacidade de iniciar e
regular os eventos de cavitação, pela expressão de produtos de genes que
facilitam o transporte e a retenção de fluido na cavidade blastocística nascente
(WATSON et al., 2004). Para a produção e acúmulo de fluido na blastocele são
necessários mecanismos de transporte de íons no trofoderma. O transporte
ativo é requerido para o movimento de íons contra seu gradiente de
concentração. O transporte de aminoácidos, como a glicina e a alanina, é feito
por um mecanismo dependente de sódio que se desenvolve no blastocisto. In
vitro, o transporte vetorial de Na+ e Cl- do meio é essencial para o início e
progressão da cavitação (WATSON & BARCROFT, 2001).
O estádio de blastocisto (Bl) possui um número de células semelhante
ao Bi, sendo que a blastocele já é bem visualizada e existe uma marcada
diferenciação entre as células trofoblásticas, formando uma camada que se
encontra aderida à zona pelúcida e a massa celular interna (SENGER, 2003).
Já o blastocisto expandido (Bx) apresenta-se com mais de 200 células.
Seu diâmetro aumenta consideravelmente (1,2 a 1,5 vezes), e, como
conseqüência, a zona pelúcida tem sua espessura diminuída a cerca de 1/3 da
espessura inicial. A pressão crescente do blastocisto em desenvolvimento
provoca a ruptura da zona pelúcida, começando assim o processo de eclosão.
Os blastocistos recuperados neste estádio podem se colabar temporariamente,
em decorrência de uma perda parcial ou total da blastocele (PALMA, 2001).
No estádio de blastocisto eclodido (Be), onde o número de células
pode variar de 200 a 800 células, os embriões já se encontram fora da zona
pelúcida, apresentando blastocele bem definida ou colabada (SENGER, 2003).
Um embrião capaz de eclodir não necessariamente implanta-se após a
transferência, caso haja um número insuficiente de células da MCI, que são
necessárias para garantir o desenvolvimento completo. Um pequeno
percentual dos embriões eclodidos quando avaliados podem ser considerados
como nada mais que vesículas trofoblásticas, uma vez que embriões com uma
MCI pequena ou ausente são capazes de eclodir, mas não se implantam
(SENGER, 2003).
Sabe-se que embriões produzidos in vitro apresentam significativas
diferenças em relação ao metabolismo, à morfologia, densidade, número de
células e características de zona pelúcida, apresentando qualidade inferior aos
produzidos in vivo. Os blastômeros são em geral mais escuros nos embriões
produzidos in vitro e as uniões celulares são anormais, razão pela qual a
compactação das mórulas, como passo prévio da blastulação, quase não se
observa (KHURANA & NIEMANN, 2000). A formação da blastocele em mórulas
produzidas in vitro normalmente ocorre de forma difusa e não localizada, como
in vivo. Este estádio pode ser caracterizado como mórula cavitacional, pela
presença de pequenas cavidades que darão origem à blastocele (PALMA,
2001). O número de células nos blastocistos produzidos in vitro pode ser menor
do que o encontrado em embriões produzidos in vivo, particularmente na MCI,
que pode se apresentar de forma desorganizada. In vivo, as células da MCI
estão presentes em uma proporção de 21%-27% dos blastocistos, enquanto in
vitro esta proporção corresponde a 12%-15%. O estabelecimento de uma
correlação da proporção de MCI:TE é considerado essencial para assegurar a
viabilidade embrionária. Embora ainda não se tenha determinado uma razão
ideal, tem-se adotado valores de 1:2 (AVELINO, 2004).
A fragmentação de blastômeros é mais difícil de ser graduada em
embriões produzidos in vitro, devido à falha na compactação, além de estar
associada com aberrações cromossômicas. Blastômeros anucleados têm sido
observados em embriões bovinos com morfologia de qualidade inferior. Ainda
não se sabe se os blastômeros anucleados representam citoplasma expelido
ou células estacionadas, em que o material nuclear foi totalmente fragmentado
(VAN SOOM et al., 1997). A incidência de anormalidades de cariótipo nos
embriões obtidos in vivo é de 2%-20%; entretanto, as mesmas são eliminadas
em grande parte por meio de seleção natural. Nos embriões produzidos in vitro
a freqüência de anormalidades é de 10%-45% e, como consequência do
cultivo, não são eliminadas. A maior parte das anormalidades apresenta-se no
trofoderma, em forma de mixploidias e poliplodias (VIUFF et al., 1999, 2000).
2.3 – Cinética de desenvolvimento embrionário
A razão pela qual clivagens mais rápidas acontecem em embriões com
maior capacidade de desenvolvimento ainda não é conhecida. A falha ou
atraso na primeira divisão da clivagem pode estar relacionada com a
competência citoplasmática, devido a uma falha das macromoléculas derivadas
do oócito, necessárias para iniciar a embriogênese (WATSON et al., 2000;
NATALE et al., 2001; NIEMANN e WRENZYCKI, 2003). Esta falha
citoplasmática também pode ser manifestada por uma falha na ativação do
genoma embrionário, podendo explicar uma relação entre as primeiras
clivagens e a competência de desenvolvimento (RIZOS et al., 2003).
Existem evidências de que a nova síntese de RNA, codificada pelo
genoma embrionário, é iniciada no estágio de duas a quatro células em
bovinos, sem um pico de transcrição diferenciada. Em embriões de duas
células com crescimento tardio, a síntese de RNA não tem sido evidenciada, o
que poderia ser explicado por sinais insuficientes no oócito necessários para
ativação do genoma embrionário (WARD et al., 2001).
GUTIERRÉZ-ADAN et al (2004) demonstraram claramente a relação
entre o momento da primeira clivagem pós-inseminação in vitro e a
competência de desenvolvimento dos zigotos clivados inicialmente. Estes
autores verificaram ainda que este momento da primeira clivagem está
relacionado com o estado de poliadenilação de vários genes transcritos
importantes. LONERGAN et al. (2003) relataram diferenças na expressão
gênica de embriões em estádio inicial, relacionadas à competência de
desenvolvimento entre zigotos de clivagem inicial, rápida e tardia.
Condições de cultivo podem influenciar na cinética de desenvolvimento
inicial, porém alguns fatores que controlam estes parâmetros são intrínsecos
ao oócito, ao espermatozóide ou a ambos (DE SOUSA et al., 1998). A
velocidade de desenvolvimento em estádio de clivagem inicial pode ser
manipulada pela adição de suplementos ao meio de cultivo, particularmente o
soro fetal (RIZOS et al., 2003). Estudos demonstraram que o ambiente pósfertilização altera significativamente os padrões de transcritos em embriões
bovinos, com algumas diferenças evidenciadas 10 horas após o início do
cultivo (LONERGAN et al., 2003).
2.4- Cultivo in vitro de embriões bovinos
A partir da década de 70, começaram a ser desenvolvidos os primeiros
meios de cultivo, com sucesso para embriões bovinos e ovinos. Entretanto,
neste período existiam relatos conflitantes a respeito dos requerimentos
necessários para se transpor o bloqueio do desenvolvimento embrionário entre
8-16 células (DE SOUSA et al., 1998). A partir de então, houve aumento
significativo na implementação de sistemas de co-cultivo com células
somáticas. Estas são responsáveis por secretarem fatores embriotróficos que
simulam in vitro o ambiente uterino (GANDOLFI & MOOR, 1987). Diversos
trabalhos mostram que vários tipos de células podem ser usados na co-cultura,
como células uterinas, da granulosa, do oviduto, do cumulus, Vero, Buffalo Rat
Liver (BRL), etc. (HASLER, 2000). Contudo, a utilização de células somáticas
em sistemas de cultivo pode levar à contaminação dos embriões por
patógenos. Além da preocupação com os riscos de contaminação, a
variabilidade biológica entre as células obtidas de animais diferentes pode
acrescentar maior variação nos resultados de produção de embriões (LANE et
al., 2003; HOSHI, 2003).
Uma das alternativas aos sistemas de co-cultivo foi à utilização de
fontes protéicas, pois estas aumentam a quantidade e qualidade das estruturas
que atingem o estádio de blastocisto (RORIE et al., 1994). Essa suplementação
parece reduzir a embriotoxicidade causada por produtos provenientes do
metabolismo embrionário. As fontes protéicas mais utilizadas em sistemas de
cultivo in vitro são o soro fetal bovino (SFB) e a albumina sérica bovina (BSA)
(LONERGAN et al, 1999). O soro apresenta-se como uma mistura complexa de
substâncias conhecidas e não definidas, e de fatores de crescimento que
desempenham papel importante no desenvolvimento embrionário (HOLM et al.,
1999). Por outro lado, apesar dos processos de extração e purificação, podem
estar adsorvidos ao BSA diferentes proteínas, substratos energéticos e fatores
de crescimento (BAVISTER, 1995; LONERGAN et al., 2006), corroborando
com os resultados de que as propriedades embriotróficas do BSA podem variar
entre fornecedores e partidas (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al., 2000).
O interesse em estudos utilizando meios livres de proteína estaria no
fato de evitar os riscos biológicos oferecidos pelo soro e/ou albumina,
principalmente nos países em que esses produtos não são considerados livres
de patógenos (KURAN et al., 2002), como no caso dos príons no Reino Unido.
HOLM et al. (1999) conseguiram sucesso na produção de blastocistos
na ausência de soro ou de BSA utilizando o chamado meio quimicamente
definido.
Esses
conhecidas
meios
como
são
constituídos
aminoácidos,
por
substâncias
macromoléculas
previamente
(polivinilalcool,
polivinilpirrolidona e ácido hialurônico), fatores de crescimento e suplementos
sintéticos (HOSHI, 2003), evitando os efeitos da variabilidade na composição
dos meios, bem como os riscos de contaminação dos embriões a serem
produzidos. O sucesso do sistema de cultivo semi-definido (com reduzida
quantidade de BSA) ou definido envolve tanto a utilização de concentrações
conhecidas de seus componentes, como a utilização de ambiente atmosférico
com menor concentração de O2 (5-7%) do que a utilizada em sistemas de
cultivo que fazem uso do soro, reduzindo a formação de radicais livres,
prejudiciais ao embrião.
Embora a tensão de oxigênio (O2) no oviduto e útero seja menor (3,5%
a 8,5%) do que no ar atmosférico (20%), a condição de O2 atmosférico é
utilizada rotineiramente no cultivo de embriões mamíferos (VAN SOON et al.,
2002). Em estudos onde a tensão de O2 foi reduzida de 20% para 5% foi
observada uma maior taxa de desenvolvimento embrionário em várias espécies
(YUAN et al., 2003; HOSHI, 2003; KITAGAWA et al, 2004). A baixa tensão de
O2 leva à diminuição da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS)
intracelular que induzem a apoptose, permitindo ainda que a atividade
metabólica desses embriões esteja mais próxima daqueles produzidos in vivo
(CORREA et al., 2007). Segundo PEREIRA et al. (2005), as células do cumulus
que são mantidas com os zigotos após a FIV removem as substâncias tóxicas
do meio de cultura. Conseqüentemente, o estresse oxidativo causado por uma
maior tensão de O2 seria minimizado pela presença destas células, de forma
que a produção de embriões seria similar em ambos os sistemas (FATEHI et
al, 2005).
A tensão de CO2 utilizada no cultivo embrionário varia entre 5%-7%, e
a manutenção desse nível também é importante para o sucesso de um sistema
de produção in vitro de embriões, uma vez que a queda dessa tensão aumenta
o pH intracelular e diminui o desenvolvimento embrionário (YUAN et al., 2003;
KITAGAWA et al., 2004).
Na contínua busca por embriões de melhor qualidade, surgiram os
sistemas de cultivo utilizando meios seqüenciais, que foram elaborados com o
intuito de suprir as diferentes necessidades do embrião de acordo com seu
estádio de desenvolvimento e as condições encontradas nos diversos pontos
do trato reprodutivo feminino (GARDNER & LANE, 2003). Atualmente, existem
meios seqüenciais comerciais disponíveis para o cultivo embrionário em
humanos como o G1.2/G2.2 e o M1/M2 (ZOLLNER et al., 2004). Em bovinos, o
uso de meios seqüenciais também parece promissor, principalmente na
substituição de meios com co-cultura e soro. LANE et al. (2003), usando o meio
G1.2/G2.2, obtiveram resultados de produção de embriões semelhantes aos de
co-cultura de BRL com 10% de SFB; porém, a proporção de embriões machos
e fêmeas não foi diferente no meio seqüencial, enquanto maior taxa de
embriões do sexo masculino foi observada na co-cultura com soro. A utilização
de meio KSOM com 0,1% de BSA até o dia quatro do cultivo, seguido do
cultivo em meio sintético de fluido do oviduto (SOF) com 5% de soro até o dia
nove, também proporcionou a produção de blastocistos de melhor qualidade
(NEDAMBALE et al., 2004). Atualmente existe a possibilidade de se cultivar
embriões em micro canais, utilizando um equipamento microfluídico, o que
permite o cultivo em um menor volume de meio, quando comparado com micro
gotas, e a mudança gradual do meio de cultivo sem a manipulação do embrião,
tornando o ambiente físico mais parecido com o do trato reprodutivo, com
maiores chances de proporcionar um melhor ambiente in vitro (QUINN, 2004).
Como citado anteriormente, embriões produzidos in vitro possuem
qualidade morfológica e fisiológica inferior aos produzidos in vivo. Por essas
razões as pesquisas envolvendo meios de cultivo embrionário são importantes
para melhorar a qualidade dos embriões in vitro a fim de que se possa
aproximá-la dos blastocistos produzidos in vivo.
2.5- Soro fetal bovino (SFB) no cultivo in vitro de embriões
O SFB pode fornecer vários fatores benéficos ao embrião, como
aminoácidos, vitaminas, fatores de crescimento, substratos energéticos, bem
como proteção contra radicais livres, mas também pode carrear fatores
embriotóxicos. A adição de soro em meios de cultivo geralmente melhora a
taxa de produção de blastocisto (GOMES & DIEZ, 2000) e seu efeito tem
caráter bifásico; ou seja, inibe as primeiras divisões celulares, mas estimula o
desenvolvimento embrionário posterior (CAMARGO et al., 2002). A adição de
soro acelera a cinética do desenvolvimento embrionário após as primeiras
divisões celulares, pois promove blastulação prematura e aumenta a
porcentagem total de blastocistos com maior número de células e taxa de
eclosão (LONERGAN et al., 1999). Embriões cultivados em presença de soro
apresentaram acúmulo de lipídeos citoplasmáticos, os quais são responsáveis
por uma maior sensibilidades desses embriões a processos de criopreservação
(ABE et al., 2002; RIZOS et al., 2003). O SFB pode aumentar a proporção de
embriões masculinos (GUTIERRÉZ-ADAN et al., 2001), causar alterações no
metabolismo (KHURANA & NIEMANN, 2000), diminuir a densidade de
organelas (CROSIER et al., 2000), alterar a estrutura mitocondrial (FARIN et
al., 2001) e aumentar a incidência de apoptose (KNIJN et al., 2003).
LONERGAN e seus colaboradores (2006) relataram o aumento da expressão
de genes ligados ao estresse, em embriões cultivados em presença de SFB. A
utilização do SFB no meio de cultivo tem sido apresentada como uma das
responsáveis pelo surgimento de diversas alterações fenotípicas observadas
durante a gestação e no recém-nascido, como distúrbios placentários e
excesso de peso ao nascimento, eventos estes relacionados à Síndrome do
Bezerro Grande (LOS - “Large Offspring Syndrome”) (Mc EVOY, 2003;
LONERGAN, et al., 2006). Diante dessas evidências, vários grupos de
pesquisa vêm buscando utilizar suplementos sintéticos livres de soro de forma
a minimizar ou eliminar os danos causados pelo soro.
2.6- Knockout Serum Replacer (KSR) como substituto do SFB
Os suplementos sintéticos, utilizados como substitutos de proteínas
animais para o crescimento in vitro de células indiferenciadas, representam
uma alternativa para produção in vitro de embriões bovinos. O Knockout Serum
Replacer (KSR) é um suplemento quimicamente definido que foi desenvolvido
para isolamento e manutenção de células tronco embrionárias, oriundas da
massa celular interna de blastocistos (GOLDSBOROUGH et al., 1998, BRYJA
et al, 2006). Além disso, também pode ser utilizado para estabelecimento de
linhagens celulares, seleção de drogas para células alvo, congelamento de
células e meios de manutenção para injeção de células tronco em blastocistos
(HORII et al, 2003). Por ser um produto patenteado, sua composição química
não é divulgada. No entanto, é comercializado como um suplemento livre de
soro que contém aminoácidos, glicose, insulina, transferrina, antioxidantes, sais
inorgânicos, oligoelementos e um mix de proteínas e vitaminas. Não contém
fatores
de
crescimento,
citocinas,
hormônios,
imunoglobulinas
ou
macromoléculas como PVA ou PVP. Sua formulação garante repetibilidade de
resultados, em comparação com a variabilidade de resultados obtidos com o
uso do soro (MOORE et al., 2007).
Corroborando com os achados de RODRIGUEZ-SALLABERRY et al
(2002), SORIA et al (2005) sugeriram que o KSR pode ser utilizado como
substituto do soro no cultivo de embriões produzidos in vitro. Entretanto, ainda
não existe muito embasamento na literatura a respeito dos efeitos que o KSR
pode causar na qualidade morfológica e nos níveis de expressão gênica de
embriões bovinos produzidos in vitro.
2.7- Resposta embrionária as condições de estresse
As modificações celulares associadas ao estresse são resultantes de
um processo multifatorial que envolve alterações no percentual de ácidos
graxos da membrana lipídica, bem como a inibição da síntese de substâncias
antioxidantes (ZERON et al., 2001; AL-KATANANI & HANSEN, 2002; PAULALOPES et al., 2003). Um desses fatores de grande importância, envolvido no
processo de resposta ao estresse, é a síntese de um grupo de proteínas
altamente especializadas denominadas proteínas do choque térmico (Hsp)
(BECKER & CRAIG, 1994).
As Hsps podem ser classificadas em dois grupos principais, as formas
constitutivas e as induzidas. As Hsps sintetizadas de forma constante, sem
estímulo de estresse, são as constitutivas. As induzidas são sintetizadas
apenas sob estímulo de calor ou outro agente estressante (JU, 2005). No caso
do estresse térmico e em certos estados patológicos, ocorre ativação de
fatores de choque térmico (Hsfs) que penetram no núcleo celular e se ligam
aos elementos de choque térmico (Hses). Estes representam o sítio de ligação
no DNA para ativação e expressão dos genes de choque térmico e síntese das
Hsps (JU, 2005). Dentre as funções exercidas pelos genes de Hsps, estão
incluídas a modulação da atividade da proteína, a regulação da degradação da
proteína e o transporte das mesmas através das organelas, além de assegurar
a conformação correta das proteínas (TAKAYAMA et al., 2003).
O Hsp70.1 é um gene expresso em níveis semelhantes em todas as
células, ou seja, um gene constitutivo, e sua expressão é reflexo de estresse
celular (PEDERSEN et al., 2005). Evidências sugerem que a HSP70
desempenha um importante papel no processo de fertilização e no
desenvolvimento embrionário (WRENZYCKI et al., 2005). MATWEE et al.
(2000) observaram que a distribuição do Hsp70.1 em espermatozóides bovinos
está relacionada com a interação entre os gametas. Foi demonstrado que
embriões bovinos podem sofrer transcrição de Hsp70.1 em resposta ao choque
térmico já na fase de duas células (CHANDOLIA et al., 1999). Segundo
PEDERSEN et al. (2005), a expressão gênica embrionária pode ser modificada
em resposta a alterações do ambiente, o que provavelmente é uma tentativa do
embrião para estabilizar sua função celular. Corroborando com estes autores,
LONERGAN et al (2006) observaram o aumento da abundância relativa de
Hsp70.1 em embriões cultivados em condições adversas.
A exposição a situações de estresse ocasiona alterações ultraestruturais observadas em oócitos e embriões, dentre as quais estão a
redistribuição de organelas na região cortical e agregação citoplasmática,
vacuolização e rompimento da membrana e/ou matriz mitocondrial, culminando
num processo de apoptose e morte celular (LI et al. 2000). A habilidade em
regular a morte celular tem sido reconhecida como uma das funções das
Hsp70.1, podendo contribuir com seu efeito protetor nas células, mas esse
mecanismo ainda não foi esclarecido (MATWEE et al., 2000; PARK et al.,
2006).
2.8 - Apoptose em embriões produzidos in vitro
Apoptose é um processo usado por organismos multicelulares para
regular o número de células ou eliminar células que se tornaram
potencialmente prejudiciais ao organismo. Em nível celular, a apoptose é
caracterizada pela condensação da cromatina, fragmentação do DNA e
fagocitose,
fragmentação
citoplasmática
e
nuclear
(MAKAREVICH
&
MARKKULA, 2002). Durante as fases finais do processo apoptótico, extensões
da membrana plasmática circundam e delimitam os corpos apoptóticos que
podem ser fagocitados por células circunvizinhas, ou expulsos para o lúmen
adjacente (MATWEE et al., 2000). Os eventos moleculares envolvidos no
processo apoptótico são divididos em fase de indução (upstream) e fase de
execução (downstream). Essa segunda fase é caracterizada pela ativação das
caspazes citoplasmáticas, seguida pela fase de degradação celular (MATWEE
et al, 2000). Para tal, a proteína Bax (regulador de apoptose em Bos taurus
box-α) atua na membrana mitocondrial levando à liberação do citocromo c, que
é um ativador da cascata de caspazes, sendo estas responsáveis pela
degradação de proteínas nucleares e do citoesqueleto (DEPRAETERE &
GOLSTEIN, 1998).
Em embriões em estádio pré-implantacional, a apoptose pode ser
considerada
um
processo
normal
com
importante
papel
durante
o
desenvolvimento, funcionando inclusive como um indicador da qualidade do
embrião (BYRNE et al., 1999). Entretanto, quando o número ou razão de
células apoptóticas por células normais aumenta, esse evento torna-se
prejudicial ao desenvolvimento embrionário, interferindo em sua qualidade
(LEVY, 2001). A incidência de apoptose é maior em embriões produzidos in
vitro do que in vivo (KNINJ et al., 2003), provavelmente induzida pelo estresse
provocado pelo cultivo in vitro, envolvendo atraso no desenvolvimento
embrionário acompanhado de fragmentação celular (JURISICOVA & ACTON,
2004). O soro no cultivo in vitro de embriões pode ser um dos agentes
responsáveis pela maior incidência de embriões com alto índice de células
apoptóticas (BYRNE et al., 1999). Maior quantidade relativa de transcritos do
gene Bax, codificador da proteína pró-apoptótica, foi observada em embriões
bovinos cultivados na presença de soro (RIZOS et al., 2003). Em embriões
suínos cultivados in vitro, o soro aumentou a incidência de apoptoses e
expressão de alguns genes pró-apoptóticos (CUI et al., 2005). Portanto, a
eliminação do soro de meios de cultivo pode contribuir para aumentar a
viabilidade de embriões bovinos produzidos in vitro, por meio da redução da
incidência de apoptose.
2.9 - Expressão Gênica em embriões bovinos
O termo expressão gênica refere-se ao processo pelo qual a
informação genética contida num gene específico é traduzida em uma proteína
específica que exercerá sua função na célula ou fora dela (WILHELM, 2003).
Esse processo se dá por uma cascata de eventos, regulados por ligações de
proteínas a uma seqüência regulatória de DNA, que ativam sinais bioquímicos
em cadeia, resultando na ativação ou repressão de diversos genes. Estes
coordenam o ciclo celular através de fatores de crescimento, hormônios,
citocinas, fatores de transcrição e enzimas de controle de replicação do DNA
(LOURO, 2002). O genoma funcional que resulta deste conjunto de fatores é
responsável por explorar o papel de numerosos ligantes e receptores que
convergem sobre a regulação transcripcional (BUSTIN & NOLAN, 2004).
Os genes expressos podem ser constitutivos (housekeeping) ou
induzidos. Os constitutivos são expressos em todas as células e responsáveis
por funções comuns, como os genes de tRNA e rRNA, proteínas ribossômicas
ou proteínas próprias do metabolismo celular. Os induzidos correspondem
àqueles responsáveis por funções específicas, sendo expressos a partir de um
determinado estímulo (RAMALHO, 2000).
Uma das causas da baixa eficiência das biotecnias da reprodução é a
expressão desbalanceada de genes importantes para o desenvolvimento. Já
foram identificados vários genes com expressão alterada em embriões bovinos
produzidos in vitro, tais como genes ligados ao cromossomo X (G6PD e PGK;
WRENZYCKI et al., 2002), à apoptose e ao “stress” térmico e oxidativo
(Hsp70.1, Bax, SOD e SOX; OLIVEIRA et al., 2005; PEDERSEN et al., 2005;
BALASUBRAMANIAN et al., 2007; SAGIRKAYA et al., 2007), ao transporte de
glicose (Glut-3 e Glut- 4; KNIJN et al, 2005), à comunicação celular (Cx43 e
Cx31; RIZOS et al., 2002), à diferenciação (LIF, LR-β; LAZZARI et al., 2002;
RIZOS et al., 2002), a genes “imprinted” (MOORE & REIK, 1996; YOUNG &
FAIRBURN, 2000) e a DNA metiltransferases (RYCKE et al., 2002).
A quantificação de transcritos pode ser realizada por vários métodos,
dentre eles: Northern Blot, hibridização in situ e transcrição reversa associada
com reação em cadeia da enzima polimerase (RT-PCR). Os dois primeiros
métodos possuem grande limitação provocada pela baixa sensibilidade
(BUSTIN, 2000), exigindo grande quantidade de material inicial, o que restringe
seu uso para amostras pequenas ou com transcritos raros, além de consumir
mais tempo na sua execução e análise. O método de RT-PCR permite a
análise de diferentes amostras em um mesmo experimento, é mais sensível e
flexível, e pode ser usado para quantificar e caracterizar padrões de expressão
de RNA mensageiros (BUSTIN, 2000). Esse método também exige menos
tempo e, atualmente, é o mais utilizado para analisar níveis de RNAm em
diferentes populações (BUSTIN, 2002). Contudo, a quantificação por meio de
RT-PCR também possui limitações. A eficiência da transcrição reversa e da
amplificação durante o PCR sofre influência de diversos fatores, como
eficiência da enzima e dos oligonucleotídeos, concentração inicial da amostra,
de nucleotídeos e de outros componentes e, devido ao poder de amplificação
da reação de PCR, pequenas alterações na eficiência da amplificação podem
provocar grandes diferenças no produto final (LECHNIAK, 2002).
O Real Time – PCR é uma tecnologia que consiste no monitoramento
dos ciclos de amplificação em tempo real através de técnicas de fluorescência.
Essa tecnologia tem sido largamente utilizada para estimar os níveis de
expressão dos genes de interesse na neurociência, na biologia do
desenvolvimento e em diagnósticos médicos (BUSTIN, 2000; RAMAKERS et
al. 2003). As amostras são quantificadas utilizando-se o número de ciclos
necessários para que o acúmulo do produto de PCR, representado pela
fluorescência emitida, atinja determinado nível ou ponto considerado como
estatisticamente significante (linha limiar) (BONDIN, et al., 2005). Esse método
fornece também maior sensibilidade e precisão, podendo detectar poucas
cópias de DNA com baixo coeficiente de variação nas análises de PCR (KLEIN,
2002), além de não ser totalmente necessário realizar leitura do produto em gel
de eletroforese. Ao final da reação pode ser realizada curva de desnaturação
para identificar a presença de contaminantes, pela análise da temperatura de
desnaturação.
A quantificação do material analisado pode ser absoluta, obtendo-se o
número de moléculas de cDNA presente na amostra; ou relativa, onde a
quantidade de cDNA presente na amostra é comparada a uma amostra de
referência, denominada calibrador. Nesse caso, o resultado é obtido através da
análise do valor Ct (threshold cycle), que corresponde ao número de ciclos
necessários para a amostra emitir energia suficiente para alcançar um limiar,
na fase exponencial da amplificação, que é definido aleatoriamente
(SCHMITTGEN, 2000; BONDIN et al., 2005).
Os valores Ct do gene alvo e do controle endógeno são determinados
em cada amostra, e a diferença entre os valores Ct é denominada ∆Ct. Este é
subtraído do valor ∆Ct do calibrador (∆Ct
(calibrador)
- ∆Ct
(controle endógeno)).
A
diferença será o valor ∆∆Ct. A quantia do alvo é dada, normalizada ao controle
endógeno, e relativa ao calibrador, pela fórmula 2-∆∆Ct. Para que o método
comparativo ∆Ct seja validado, a eficiência de amplificação do alvo e do
controle endógeno deve ser igual. Para isso, diluições diferentes de cDNA são
preparadas e amplificadas (LEUTENEGGER, 2000; RAMAKERS, 2003).
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4. TRABALHOS
Os trabalhos a seguir foram elaborados segundo as normas do Periódico
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia com algumas
adaptações às normas para elaboração de tese do curso de Pós-Graduação
em Produção Animal da Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy
Ribeiro
(UENF).
DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS CULTIVADOS IN VITRO EM
MEIO SUPLEMENTADO COM SUBSTITUTO DO SORO FETAL BOVINO
RESUMO
Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito de um suplemento
quimicamente definido substituto do soro (KnockoutTM SR; Gibco Labs., Grand
Island, NY) na qualidade e no desenvolvimento de embriões bovinos
fertilizados in vitro. CCOs obtidos a partir de ovários coletados em matadouro
foram maturados e fertilizados in vitro. Os possíveis zigotos foram divididos
aleatoriamente em três grupos e cultivados em meio CR2aa suplementado
com: 10% soro fetal bovino (SFB); 10% Knockout SR (KSR), ou 3mg/ml de
polivinilalcool (PVA-controle). A taxa de clivagem foi determinada 72 horas pósfertilização (hpf) e a taxa de blastocistos (D7) 168 hpf. O número total de
células foi determinado 192 hpf (D8). O desenvolvimento foi avaliado pelas
taxas de embriões de 4-8 células, embriões ≥ 8 células, blastocistos iniciais
(Bi), blastocistos (Bl) e blastocistos expandidos (Bx). As taxas de clivagem e
blastocisto foram analisadas por Kruskal Wallis; o número total de células, por
ANOVA; e as médias comparadas, por Student Newman Keuls. A taxa de
clivagem não diferiu entre os grupos (P>0,05). No entanto, as taxas de
blastocistos e o número total de células foram semelhantes entre o KSR e o
SFB (P>0,05), sendo os dois superiores ao PVA (P<0,01). Não houve diferença
(P>0,05) na avaliação dos parâmetros de desenvolvimento entre os grupos,
exceto na taxa de Bx onde o PVA apresentou resultado inferior (P<0,05) aos
obtidos no SFB e no KSR. Os embriões cultivados em presença de KSR
apresentaram padrões de desenvolvimento e qualidade semelhantes aos
cultivados em presença de soro. Contudo, o KSR proporcionou uma maior taxa
de desenvolvimento e melhor qualidade de blastocisto do que o PVA. Concluise que o KSR pode sustentar o desenvolvimento de embriões bovinos
fertilizados in vitro quando meios de cultivo livres de soro forem recomendados.
Palavras-chave: bovino, desenvolvimento embrionário, cultivo in vitro, sistema
semi-definido.
DEVELOPMENT OF BOVINE EMBRYOS IN VITRO CULTURED IN
SUPPLEMENTED MEDIUM WITH FETAL CALF SERUM REPLACEMENT
ABSTRACT
Our aim with this study was evaluate the effect of a defined supplement
as a serum replacer (KnockoutTM SR; Gibco Labs., Grand Island, NY) in the
quality and development grade of in vitro fertilized bovine embryos. COCs
collected in slaughterhouse were in vitro matured and fertilized. The
presumptive zygotes were randomly distributed in three groups of medium
culture CR2aa supplemented with 10% of fetal calf serum (FCS); 10% knockout
serum replacer (KSR),or 3 mg/ml of polyvinyl alcohol (PVA - control). Cleavage
rate was determined 72 hours post-fertilization, and blastocyst rate was
determined (D7) 168 hours post-fertilization. The total number cells were
determined 192 hpf (D8). Development was evaluated with 4-8 cells embryos
rate, ≥ 8 cells embryos, early blastocyst, blastocyst and expanded blastocyst.
Data of cleavage and blastocyst rate were analyzed by Kruskal Wallis and total
cell number by analyses of variance and means compared by Student Newman
Keuls. No significant difference on cleavage rate (P>0.05) was found among
groups. However, blastocyst rates and total number cells were similar between
KSR and FCS (P>0.05), and higher in both groups than in PVA (P<0.01). These
were no differences (P>0, 05) in evaluation of development parameters among
groups, except at expanded blastocyst rate, where PVA presented lower results
(P<0, 05) than FCS and KSR. In spite of supplementation with KSR in the
medium culture lead to a smaller blastocyst rate compared to FCS, total number
of cells and development kinetics were not affected. However, KSR lead to a
higher embryo development rate than PVA. In conclusion KSR may support the
development of in vitro produced bovine embryos when serum free medium is
recommended.
Keywords: bovine, embryo development, in vitro culture, semi-defined system
INTRODUÇÃO
O período pré-implantacional do embrião bovino representa uma fase
muito dinâmica da embriogênese, onde uma única célula quiescente
desenvolve-se, formando um grupo celular com intensa atividade metabólica.
Esse desenvolvimento é controlado pela expressão de famílias de genes
responsáveis por direcionar um número significativo de eventos, dentre os
quais estão incluídos o início e continuação da clivagem, ativação do genoma
embrionário (MEIRELES et al., 2004), agregação e compactação dos
blastômeros, diferenciação celular, formação e expansão da blastocele e
eclosão da zona pelúcida (WRENZYCKI et al., 2005). O embrião de mamíferos
possui uma grande capacidade em adaptar-se às condições ambientais
subótimas, o que lhe permite sobreviver em diferentes condições de cultivo, as
quais podem conferir aos embriões produzidos in vitro uma diminuição da
competência de desenvolvimento, da taxa de clivagem, do número total de
células, da quantidade e qualidade de ligações intercelulares, da transcrição de
genes relacionados ao crescimento e diferenciação celular; além de um
acréscimo na quantidade de lipídeos intracelulares (McEVOY et al., 2003;
LONERGAN et al., 2006).
Diversos fatores podem influenciar o ambiente de cultivo, como a
composição dos meios, a suplementação protéica, o número de embriões na
gota de cultivo e a atmosfera gasosa (NATALE et al., 2001; NIEMANN &
WRENZYCKI, 2003; GUTIÉRREZ-ADÁN et al. 2004).
Na tentativa de otimizar a eficácia dos sistemas de cultivo, os meios de
cultivo vêm sendo suplementados com uma variedade de antioxidantes, fatores
de crescimento e/ou macromoléculas. Nesse contexto, a Albumina Sérica
Bovina (BSA) e o Soro Fetal bovino (SFB) são as fontes protéicas mais
utilizadas. Contudo, a BSA e o SFB são misturas complexas e indefinidas de
proteínas, fatores de crescimento e peptídeos (LIM et al., 2007). THOMPSON
(2000) demonstrou claramente que a BSA exerce um papel nutricional
substancial durante o desenvolvimento embrionário, especialmente durante a
compactação. Provavelmente por ser esta a proteína em maior abundância no
trato reprodutivo feminino de mamíferos (OYAMADA et al., 2004).
A adição de soro em meios de cultivo geralmente melhora a taxa de
produção de blastocistos (GOMES & DIEZ, 2000) e seu efeito tem caráter
bifásico,
inibindo
as
primeiras
divisões
celulares
e
estimulando
o
desenvolvimento embrionário posterior (CAMARGO et al., 2002). Entretanto, o
soro também pode aumentar o acúmulo de lipídeos citoplasmáticos, reduzir a
criotolerância dos embriões (RIZOS et al., 2003) e aumentar a proporção de
embriões masculinos (GUTIERREZ-ADAN et al., 2001); bem como causar
alterações no metabolismo (KHURANA & NIEMANN, 2000), na estrutura
mitocondrial e na ultra-estrutura (FARIN et al., 2001). Em função de o soro ser
apontado como um dos principais agentes envolvidos nessas alterações
embrionárias (Mc EVOY et al., 2003; RIZOS et al., 2003), um grande número
de estudos vem sendo conduzido visando à exclusão do mesmo dos sistemas
de cultivo.
O KnockoutTM Serum Replacer (KSR) é um suplemento para meio de
cultivo, quimicamente definido, amplamente utilizado como substituto do soro
no cultivo de células tronco, podendo ser utilizado para estabelecimento de
linhagens celulares, congelamento de células e meios de manutenção para
injeção de células tronco em blastocistos (HORII et al, 2003). Sendo assim, o
presente estudo teve como objetivo avaliar as taxas de clivagem, de produção
de blastocistos, o desenvolvimento embrionário e o número total de células de
embriões bovinos produzidos in vitro e cultivados em presença de KSR.
MATERIAL E MÉTODOS
Local do Experimento
O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal da
Embrapa Gado de Leite, localizado em Juiz de Fora, MG. Os reagentes químicos
utilizados foram da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, a menos que indicado.
Produção de in vitro de embriões
Neste experimento, foi utilizado um total de 2556 possíveis zigotos,
obtidos em 23 repetições, distribuídos em três grupos. Os embriões foram
produzidos no período de janeiro a março dos anos de 2005 e 2006. Os oócitos
foram obtidos de ovários coletados de vacas abatidas em matadouro. Após o
abate e evisceração, os ovários foram coletados e colocados em garrafas térmicas
contendo solução fisiológica (0,9% NaCl) adicionada de antibiótico (0,05g/L de
sulfato
de
estreptomicina),
aquecida
a
31-34oC,
sendo
imediatamente
transportados para o laboratório.
Folículos com diâmetro entre 3 e 8 mm foram puncionados e o conteúdo
aspirado foi depositado em cálice cônico contendo meio TALP-Hepes (BAVISTER
et al., 1983a), previamente aquecido a 37oC. Foram selecionados os complexos
cumulus-oócitos (CCOs) apresentando citoplasma homogêneo com no mínimo
três camadas de células do cumulus compactas. Em seguida, os CCOs
selecionados foram lavados por mais duas vezes em meio TALP-Hepes e uma
vez em TCM-199 (Gibco). A maturação de 50 CCOs por poço de 400µl foi
realizada em TCM-199 (Gibco) acrescido de 10% de soro de vaca em cio (SVC) e
10µg/ml de FSH, por 24 horas. Após a maturação, 30 CCOs por gotas de 100µl de
meio Fert-Talp acrescido de heparina cobertas com óleo mineral foram
fecundados em uma concentração espermática de 2,0 x 106 espermatozóides/ml,
por um período de 18 a 22 horas. Após a fertilização, os possíveis zigotos foram
parcialmente desnudos e distribuídos aleatoriamente em três grupos na proporção
de 20 estruturas por gotas de 50 µl recobertas com óleo mineral. As estruturas
foram cultivadas em meio CR2aa suplementado com: 10% soro fetal bovino
(SFB); 10% Knockout SR (KSR), ou 3mg/ml de polivinilalcool (PVA-controle).
Todas as etapas foram realizadas em estufa incubadora, à temperatura de 38,5oC
e 95% de umidade, com 5% de CO2 em ar atmosférico.
Avaliação da clivagem e produção de embriões
Às 72 horas pós-fecundação (hpf), foi realizada a troca de 50% do volume
de cada gota do meio de cultivo. Em seguida, foi realizada a avaliação da taxa de
clivagem dos embriões dos três grupos. No sétimo dia de cultivo, foi avaliada a
formação de blastocisto.
Desenvolvimento embrionário
O desenvolvimento embrionário foi avaliado 72 hpf (D3) e 168 hpf (D7). No
D3, foram avaliadas as taxas de embriões que apresentavam 4-8 células e
embriões com mais de 8 células. Já no D7, foram avaliadas as taxas de
blastocistos iniciais, blastocistos e blastocistos expandidos em relação ao número
total de blastocistos (SENGER, 2003).
Contagem de células
Blastocistos de oito dias foram submetidos à coloração de Giemsa (Lim et
al. 1994) para determinação do número total de células. Os embriões foram
retirados da gota de cultivo, lavados duas vezes em PBS suplementado com 10%
SFB e transferidos para solução de citrato de sódio 0,9%, onde permaneceram por
um período de 10 a 20 minutos. Passada essa etapa, os embriões foram
transferidos um a um para uma solução fixadora [metanol (3): ácido acético (2):
água destilada (1)], onde permaneceram por um minuto. Em seguida, foram
transferidos para lâmina. Depois de seca, a lâmina foi corada com Giemsa, por 15
minutos. Passado esse período, a lâmina foi lavada, secada ao ar em temperatura
ambiente e, por fim, observada em microscópio óptico para realização da
contagem de células.
Análise Estatística
O efeito dos tratamentos sobre a qualidade e o desenvolvimento
embrionário foi expresso pelas taxas de clivagem (estruturas clivadas /zigotos),
blastocistos totais (blastocistos totais/zigotos), embriões de 4-8 células, embriões
≥ 8 células, blastocisto iniciais, blastocistos, blastocistos expandidos e número
total de células. As taxas de clivagem e blastocistos foram analisadas pelo teste
Kruskal Wallis, e o número total de células, por ANOVA. As diferenças entre
médias foram comparadas pelo teste de Student Newman Keuls através do
procedimento GLM do pacote estatístico SAS. Os valores foram apresentados
como médias ± erro padrão (EP).
RESULTADOS
A suplementação do meio CR2 com soro fetal bovino (SFB), Knockout SR
(KSR) ou polivinilalcool (PVA-controle) não afetou a taxa de clivagem (P>0,05). As
taxas de blastocistos (D7) e blastocistos relacionados a estruturas clivadas
(D7/CLIV), apresentadas pelo grupo cultivado em presença do substituto do soro
(Knockout SR), foram semelhantes às observadas nos embriões cultivados em
presença de soro (P>0,05); entretanto, as taxas observadas nos dois grupos
foram superiores (P<0,05) às encontradas no grupo controle (PVA) (Tabela 1).
Tabela 1: Efeito da suplementação com soro fetal bovino (SFB), Knockout SR
(KSR) ou polivinilalcool (PVA) em meio CR2aa nas taxas de clivagem e
produção de embriões bovinos produzidos in vitro.
Grupos
N
Clivagem (%)
Blastocisto (%)
SFB
848
57,8±4,6a
18,6±3,0a
a
KSR
880
62,2±4,5
12,2±2,1a
PVA (controle)
828
60,4±4,4a
4,2±1,0b
a, b, c
Letras diferentes em uma mesma coluna mostram diferença (P<0,05).
Os valores estão representados como média ± erro padrão.
Na Tabela 2, está demonstrado o número total de células referente aos
blastocistos dos três grupos (SFB, KSR e PVA). Não foram observadas diferenças
(P>0,05) entre a suplementação com o soro ou seu substituto sintético (Knockout
SR). Contudo, os embriões cultivados em presença de Polivinilalcool (PVA)
apresentaram um número inferior (P<0,01) de blastômeros quando comparados
aos outros dois grupos.
Tabela 2: Média do número total de células de blastocistos cultivados por 8 dias
(D8) em meio CR2aa suplementado com soro, Knockout SR ou
polivinilalcool.
Tratamentos
Blastocistos (n)
N° total de células
SFB
24
109,4±6,1a
KSR
26
105,9±5,9a
PVA
13
79,6±8,4b
a, b, c
Valores com letras diferentes em uma mesma coluna diferem entre si
(P<0,01).
Na Figura 1, está representada a distribuição das estruturas clivadas de
acordo com o número de blastômeros observados 72 hpf. Os três grupos
apresentaram resultados semelhantes (P>0,05) tanto na taxas de embriões com
4-8 células (SFB=35,49±2,63; KSR=38,5±2,9; PVA=38,5±2,8) como na taxa de
embriões
com
mais
de
8
células
(SFB=22,14±1,86;
KSR=18,8±2,6;
PVA=16,8±2,5).
70,0
Taxa de Clivagem (%)
60,0
50,0
40,0
SFB
KSR
30,0
PVA
20,0
10,0
0,0
Total Cliv
4-8célls
>8célls
Figura 1: Distribuição de embriões clivados nos grupos SFB (n=848), KSR
(n=880) e PVA (n=828) 72 hpf (D3). As taxas foram avaliadas pelo teste
Kruskal Wallis (P>0,05).
A distribuição dos estádios de desenvolvimento embrionário nos grupos
SFB, KSR e PVA está demonstrada na Figura 2. Foi observado que a
suplementação do meio de cultivo com soro, Knockout SR ou PVA não interferiu
(P>0,05) nas proporções de blastocisto inicial (16,0±3,8; 13,8±3,5 e 5,9±3,1,
respectivamente) e blastocisto (33,8±3,9; 38,7±5,5 e 50,6±8,7, respectivamente).
Entretanto, a suplementação com soro (22,8±3,6) e Knockout SR (19,9±4,6)
proporcionou uma maior taxa de blastocistos expandidos do que o grupo controle
(7,9±4,4).
60,0
Taxa de Blastocisto (%)
50,0
40,0
SFB
KSR
30,0
PVA
20,0
*
10,0
0,0
Bi
Bl
Bx
Figura 2: Distribuição dos estádios de blastocisto inicial (Bi), blastocisto (Bl) e
blastocisto expandido (Bx) em relação ao número total de blastocistos,
em embriões cultivados por sete dias (D7) em presença de soro
(n=848), Knockout SR (n=880) e Polivinilalcool (n=828). Os valores
foram avaliados pelo teste de Kruskal Wallis. Barra com asterisco difere
significativamente (P<0,05).
DISCUSSÃO
Para que a produção in vitro de embriões alcance sua aplicabilidade
comercial na pecuária, equipes mundiais vêm contribuindo para a melhoria dos
sistemas desse tipo de cultivo. Porém, existe uma variação na produção
embrionária entre laboratórios em função dos procedimentos adotados. Espera-se
que, aproximadamente, 30% dos oócitos maturados e fecundados in vitro atinjam
o estádio de blastocistos durante o cultivo embrionário (HOLM, 1999; RIZOS et al.,
2002; LONERGAN et al., 2003; SORIA, 2005). Em vista desses resultados, é
factível considerar que a etapa do desenvolvimento embrionário é limitante para a
produção de maiores taxas de blastocistos.
A origem do oócito é fundamental para o sistema de produção in vitro de
embriões, pois determina a sustentabilidade do gameta em ser fecundado, sofrer
as clivagens iniciais e transpor o bloqueio em 8-16 células e, finalmente, atingir o
estádio de blastocisto (LONERGAN et al., 2006). Oócitos obtidos de ovários de
matadouro utilizados para produção in vitro apresentam qualidade e competência
embrionária heterogêneas. Possivelmente as alterações estão relacionadas ao
fato de existirem diferenças em relação ao estádio do ciclo estral e condições
reprodutivas (CHOHAN & HUNTER, 2003), idade do animal (PONDERATO et al.,
2002), estação do ano e estado nutricional dos animais abatidos (BOLAND et al.,
2001).
Outros fatores relevantes são as condições dos meios utilizados na
produção in vitro os quais, no presente experimento, também podem ter
influenciado os resultados. VANROOSE et al. (2001) relataram que a escolha dos
meios e seus suplementos têm impacto sobre o crescimento e a viabilidade
embrionária. Entretanto, o cultivo embrionário é considerado como o período
crítico da produção in vitro, pois pode alterar o padrão de expressão gênica e,
assim, comprometer a qualidade e a sobrevivência após transferência dos
embriões em estádio pré-implantacional (RIZOS et al., 2002; LONERGAN et al.,
2003).
A relação entre o momento da primeira clivagem pós-fertilização e a
competência de desenvolvimento embrionário tem sido demonstrada em algumas
espécies domésticas, como em bovinos (LONERGAN et al. 1999), macaco rhesus
(BAVISTER et al., 1983b), hamster (Mc KIERNAN & BAVISTER, 1994),
camundongos (WARNER et al., 1998), búfalo (TOTEY et al., 1996). Corroborando
com esses autores, LONERGAN et al. (2006) relataram que oócitos clivados
inicialmente atingem primeiro o estádio de blastocisto do que aqueles clivados
mais tardiamente.
No presente estudo, foi observado que a suplementação sintética (Knockout
SR) não interferiu na taxa de clivagem. Esses resultados corroboram com os
encontrados por LIM et al. (2007) e SAGIRKAYA et al. (2007), que também
testaram suplementos substitutos ao soro. Entretanto, GUTIERREZ-ADAN et al.
(2001) observaram menor número de estruturas clivadas em embriões cultivados
em presença de soro. Foi observado no presente estudo que as clivagens iniciais
ocorreram mesmo em ausência de proteína, sugerindo que as divisões celulares
iniciais foram sustentadas pela herança materna.
Durante a oogênese, o oócito acumula grande quantidade de RNAs e proteínas
capazes de regular e manter o desenvolvimento do embrião durante o período de
pré-implantação (BREVINI-GANDOLFI & GANDOLFI, 2001; MEIRELES et al.,
2003); dentre eles, fatores transcricionais que estão envolvidos na ativação do
genoma embrionário (AGE) (VIUFF et al., 1996; MEMILI et al., 1998). Entretanto,
sabe-se que, em embriões bovinos produzidos in vitro, as taxas de falhas no
desenvolvimento são altas e quase sempre associadas a fatores intrínsecos ao
oócito e que conduzem ao bloqueio e morte embrionária (LONERGAN et al., 2003;
MEIRELLES et al., 2003; 2004). Presume-se que a incapacidade de vencer o
ambiente de repressão transcricional gerado por fatores estruturais do genoma,
como, por exemplo, o empacotamento do DNA, a acetilação, a hiperacetilação e a
metilação, seja um dos fatores que determinam a incompetência do embrião em
ultrapassar os primeiros ciclos celulares (LAVOIR et al., 1997). A ativação da
transcrição embrionária também é um fator vital para que o embrião em
desenvolvimento seja capaz de passar pelas primeiras divisões celulares
(MEIRELES et al., 2004).
LEQUARRE et al. (2003) observaram que o quarto ciclo celular em bovinos
era o mais longo, variando de 9 a 40 horas. Dessa forma, no período de cultivo de
36 a 96 horas, seria possível encontrar embriões com 8 a 16 células. Observou-se
nesse experimento que, em 72 horas de cultivo, em presença ou não de proteína,
em torno de 20% das estruturas encontravam-se naquela fase. Esses achados
têm sua importância, pois embriões produzidos in vitro que atingirem
precocemente
o
estádio
de
8
células
possuem
maiores
chances
de
desenvolverem até blastocisto.
Em relação ao aspecto morfológico das divisões celulares, embriões do
grupo controle cultivados em presença de PVA apresentaram divisões
assimétricas e assincrônicas em sua maioria e blastômeros com aspecto
escurecido, corroborando com os achados de HOLM et al. (2002). As
características morfológicas (blastômeros escurecidos e com aspecto pulverizado)
observadas na clivagem do grupo controle podem estar associadas à baixa taxa
de produção embrionária. Por outro lado, em meio de cultivo adicionado de
suplemento sintético livre de soro (Knockout SR), as divisões celulares
apresentaram-se sincrônicas, simétricas e coesas. Além disso, os embriões desse
grupo apresentaram-se levemente mais claros do que aqueles produzidos em
presença de soro.
No presente estudo, foi demonstrado que a suplementação do meio de
cultivo com o substituto sintético do soro (Knockout SR) proporcionou taxa similar
de blastocistos quando comparada à suplementação com soro, corroborando com
os achados de RODRIGUEZ-SALLABERRY et al (2002). Entretanto, BASSO et al.
(2003), adicionando suplemento sintético livre de soro ao meio SOFaaci,
obtiveram menores taxas de blastocistos em relação ao meio suplementado com
fonte protéica. Vale salientar que a remoção do soro do meio de desenvolvimento
embrionário oferece maior segurança aos sistemas de cultivo, pois se elimina a
possibilidade de infecção dos embriões por patógenos (Manual da IETS). Além
disso, a utilização do suplemento sintético livre de soro pode ser uma promissora
alternativa para estudos envolvendo a criopreservação de embriões produzidos in
vitro.
Na distribuição dos estádios embrionários, foi observado que as estruturas
tanto do grupo SFB como do grupo KSR apresentaram uma maior velocidade de
desenvolvimento em função da maior proporção de blastocistos expandidos
comparados aos do grupo controle, suplementado apenas com PVA. Entretanto,
KURAN et al. (2002) consideraram que apenas a presença dos aminoácidos,
presentes no meio base, sustenta o desenvolvimento in vitro, já que estes ativam
alguns genes relacionados com a viabilidade embrionária.
No presente estudo, o meio de cultivo embrionário suplementado tanto com
soro como com o suplemento sintético livre de soro estimularam a velocidade de
crescimento in vitro. Como não houve diferença entre as taxas de blastocistos e
blastocistos expandidos nesses dois grupos, pode-se sugerir que o Knockout SR
acelera o processo de blastulação da mesma forma que o soro.
A melhor forma de verificar a qualidade embrionária seria através da
transferência dos embriões para receptoras e verificação do estabelecimento da
prenhez. Entretanto, alguns testes podem predizer parcialmente a qualidade
embrionária, como o número total de células, alterações do metabolismo celular,
modificações ultraestruturais ou integridade de membrana celular (DUQUE et al.,
2003). O número de células embrionárias tem sido extensivamente utilizado como
um indicador da qualidade do embrião (KHURANA & NIEMANN, 2000;
LEQUARRE et al., 2003; PEREIRA et al., 2005). No presente experimento, o
número total de células foi similar entre os grupos, sugerindo que a qualidade dos
embriões não foi afetada pela suplementação do meio de cultivo. SAGIRKAYA et
al. (2007), ao compararem o número de blastômeros de embriões cultivados em
presença de SFB ou de um substituto sintético do soro (SSS), também não
observaram diferença no número total de células.
CONCLUSÃO
A suplementação do meio CR2aa com Knockout SR é favorável ao
desenvolvimento embrionário, já que demonstrou valores semelhantes à
suplementação com SFB tanto na produção dos embriões como no número total
de células, sendo este último um parâmetro de qualidade embrionária.
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EXPRESSÃO DOS TRANSCRITOS Hsp70.1 E Bax EM EMBRIÕES BOVINOS
CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO
RESUMO
Este estudo teve como objetivo determinar a abundância relativa dos
transcritos Hsp70.1 e Bax em embriões bovinos fertilizados in vitro e cultivados em
presença de substituto sintético do soro. CCOs obtidos de ovários de matadouro
foram maturados e fertilizados in vitro. Os possíveis zigotos foram cultivados
aleatoriamente, com suas células do cumulus, em meio CR2aa suplementado com
10% de soro fetal bovino (grupo SFB), com 10% de KnockoutTM SR (grupo KSR),
ou 3 mg/ml álcool polivinílico (grupo PVA). A taxa de clivagem foi determinada 72
horas pós-fecundação (hpf) (D3) e a taxa de blastocisto 168 hpf (D7). Blastocistos
D8
(192
hpf)
foram
rapidamente
congelados
em
nitrogênio
líquido
e
subseqüentemente descongelados para extração de RNA. A extração total de
RNA foi realizada utilizando o Micro Kit Rneasy (Qiagen, Valencia, CA, USA), e a
síntese da primeira fita de DNA foi obtida com o Kit SuperscriptTM III First Strand
Synthesis (Invitrogen, Chicago, IL, USA). A quantificação relativa foi realizada em
duplicata utilizando o PCR Real Time (ABI Prism 7000 Applied Biosystem, Foster
City, CA, USA), sendo a mistura da reação composta de iTaqTM SYBR Green
Supermix, ROX (Bio-Rad, Waltham, MA, USA), cDNA equivalente a 0,8 embriões
e primers específicos para cada gene. A expressão do gene H2A foi utilizada
como referência endógena e, como calibrador, o valor do grupo PVA. As taxas de
clivagem e blastocisto foram analisadas por Kruskal Wallis e o número total de
células por ANOVA. A taxa de clivagem foi semelhante (P>0,05) entre os grupos,
porém o grupo PVA apresentou menores taxas de blastocistos (P<0,05), quando
comparado aos outros dois grupos. Não houve diferença (P>0,05) na abundância
relativa de Hsp70.1 (5.42±0.80, 3.46±1.62 e
1.85±0.85) e Bax (2.08±1.14,
0.92±0.15 e 1.82±0.82) para os grupos SFB, KSR e PVA. Esses resultados
mostram que embriões cultivados em meio suplementado com KSR apresentam o
mesmo padrão de expressão para Hsp70.1 e Bax, o que sugere condições
semelhantes de estresse e apoptose nos embriões de ambos os grupos.
Palavras-chave: embrião, cultivo in vitro, expressão gênica, Hsp70.1, Bax
EXPRESSION OF Hsp70.1 AND Bax TRANSCRIPTS IN BOVINE EMBRYOS
CULTURED IN SERUM-FREE MEDIUM
ABSTRACT
This study aimed to determine whether KnockoutTM SR or FCS in culture
medium alters the relative abundance of Hsp70.1 and Bax transcripts in vitrofertilized bovine embryos. COCs obtained from slaughterhouse ovaries were in
vitro matured and fertilized. Presumptive zygotes were randomly cultured with their
own cumulus cells in CR2aa medium supplemented with 10% fetal calf serum
(FCS group); 10% KnockoutTM SR (KSR group), or 3 mg/ml polyvinyl alcohol (PVA
group). All steps were performed at 38.5°C, under 5% CO2 in air and 95%
humidity. Blastocysts on day 8 post-fertilization were rapidly frozen in liquid
nitrogen and subsequently thawed for RNA extraction. Total RNA extraction was
performed using Rneasy Micro kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) and first strand
DNA synthesized using SuperscriptTM III First Strand Synthesis kit (Invitrogen,
Chicago, IL, USA). Relative quantification was performed in duplicate using Real
Time PCR (ABI Prism 7000 Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) and
reactions consisted of a mixture of iTaqTM SYBR Green Supermix with ROX (BioRad, Waltham, MA, USA) with cDNA equivalent to 0.8 embryos and gene specific
primers. Expression of H2A gene was used as endogenous reference and using
the value found in PVA group as calibrator. Rates all were evaluated by ANOVA.
Cleavage rate were similar among groups (P>0.05), however blastocyst rates were
lower in PVA (P<0.01) than others groups. There was no difference (P>0.05) on
expression of Hsp70.1 (5.42±0.80, 3.46±1.62 e 1.85±0.85) and Bax (2.08±1.14,
0.92±0.15 e 1.82±0.82) among FCS, KSR and PVA groups. This data shows that
bovine embryos cultured in medium supplemented with KSR has the same Hsp701 and Bax expression pattern as those in medium added with FCS, suggesting that
embryos in both groups are under the same stress and apoptosis conditions.
Keywords:
embryo,
in
vitro
culture,
gene
expression,
Hsp70.1,
Bax.
INTRODUÇÃO
Nos mamíferos, o período pré-implantação está compreendido entre a
formação do zigoto e o estádio de blastocisto. Esse período do desenvolvimento é
caracterizado por quatro etapas biológicas distintas, que ocorrem após a
fertilização do oócito e incluem (I) a primeira clivagem, (II) a transição maternozigótica (MZT) ou ativação do genoma embrionário (AGE), (III) a compactação e
conseqüente polarização do epitélio embrionário e (IV) a diferenciação de mórula
em blastocisto (SCHULTZ et al., 1999; WRENZYCKI et al., 2005), sendo que cada
uma dessas etapas é acompanhada por mudanças no padrão de expressão
gênica (WARNER & BRENNER, 2001).
Embriões bovinos pré-implantação são capazes de se adaptar a grande
variedade de ambientes, incluindo condições adversas e inadequadas de cultivo
(OLIVEIRA et al., 2005). Entretanto, a maioria dos embriões produzidos in vitro
não alcança o estádio de blastocisto, e aqueles que atingem esse estádio
apresentam qualidade inferior àqueles produzidos in vivo (PEDERSEN et al.,
2005). Vários estudos têm demonstrado que o microambiente no cultivo in vitro
pode ter efeito determinante nos padrões normais de expressão gênica (RIZOS et
al., 2003; GUTIERREZ-ADAN et al., 2004; LONERGAN et al., 2006). Mais
recentemente, foi estabelecido que a associação entre a avaliação da
competência de desenvolvimento (taxas de clivagem e blastocisto) e da qualidade
(criotolerância, expressão gênica e morfologia) pode fornecer visão mais completa
das conseqüências ocasionadas pela modificação da composição dos sistemas de
cultivo (AVERY & GREVE, 2004).
A influência da suplementação protéica representa ponto crucial na
eficiência de sistemas de cultivo embrionário in vitro. O soro fetal bovino (SFB) e a
albumina sérica bovina (BSA) são as fontes protéicas mais utilizadas em meios de
cultivo (BAVISTER, 1995; LONERGAN et al, 1999; VAN WAGTENDONK-DE
LEEUW et al., 2000). Contudo, por serem de origem biológica, possuem
quantidades indefinidas de hormônios, fatores de crescimento, vitaminas e vários
outros fatores desconhecidos, podendo, ainda, veicular patógenos (KURAN et al.,
2002). Esses fatores, ao não permitir o controle das condições de cultivo,
dificultam a repetibilidade de resultados.
Diante dessas evidências, vários grupos de pesquisa vêm buscando
utilizar suplementos sintéticos livres de soro, de forma a minimizar ou eliminar os
danos causados pelo soro. Os suplementos sintéticos, utilizados como substitutos
de proteínas animais para o crescimento in vitro de células indiferenciadas,
representam alternativa para a produção in vitro de embriões bovinos. O Knockout
Serum Replacer (KSR) é um suplemento quimicamente definido, desenvolvido
para manutenção do cultivo in vitro de células tronco (HORII et al., 2003).
Entretanto, ainda não existe embasamento na literatura a respeito de seus efeitos
sobre o desenvolvimento e a expressão gênica de embriões bovinos produzidos in
vitro.
Estudos recentes têm utilizado padrões de expressão de RNAm como
critério para predizer o potencial de desenvolvimento de embriões produzidos in
vivo (RIZOS et al., 2002; WRENZYCKI et al., 2004). Contudo, a abundância
relativa de diversos transcritos tem sido afetada tanto pela escolha dos meios de
cultivo, como pelo tipo de suplemento utilizado, e essa escolha representa ponto
crítico no desenvolvimento pré-implantacional in vitro (RIZOS et al., 2002;
WRENZYCKI et al., 1999, 2001, 2004; SAGIRKAYA et al., 2006).
GUTIERREZ-ADAN et al. (2004) demonstraram que genes induzidos pelo
estresse (sarcosina oxidase - SOX, magnésio superoxido desmutase - MnSOD,
regulador de apoptose em Bos taurus box-α – Bax e interferon tau - IF ) foram
altamente transcritos em embriões produzidos in vitro. Por outro lado, genes
relacionados ao metabolismo, crescimento e diferenciação (transportador de
glicose - Glut-5, conexina 43 – Cx43 e fator semelhante à insulina II - IGF-II) foram
detectados em maior quantidade em embriões produzidos in vivo. Esses padrões
de transcrição refletem a resposta embrionária às condições adversas de cultivo in
vitro e à plasticidade do desenvolvimento pré e pós-implantacional em condições
sub-ótimas (RIZOS et al., 2003; WRENZYCKI et al., 2003).
A expressão de genes associados à resposta ao estresse e apoptose,
como a proteína do choque térmico (Hsp70.1) e a proteína reguladora de
apoptose em Bos taurus (Bax), pode ser afetada pelas condições de cultivo in
vitro, sendo induzida por uma variedade de agentes estressores, incluindo os
componentes dos meios de cultivo (WRENZYCKI et al., 2001; RIZOS et al., 2002;
PEDERSEN et al., 2005).
Atualmente, os principais obstáculos para o estabelecimento, em larga
escala, de programas de produção in vitro de embriões bovinos têm sido as altas
taxas de mortalidade embrionária e fetal, assim como a ocorrência de anomalias
nos animais nascidos. Conseqüentemente, o estudo da expressão gênica pode
fornecer subsídios para a compreensão das falhas que ocorrem nos programas de
produção de embriões, além de melhorar sua eficiência.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a competência de desenvolvimento e
a expressão dos genes Hsp 70.1 e Bax em embriões bovinos fertilizados in vitro e
cultivados em presença de substituto sintético do soro.
MATERIAL E MÉTODOS
Local do Experimento
O experimento foi realizado nos Laboratórios de Reprodução Animal e
Genética Molecular da Embrapa Gado de Leite, localizados em Juiz de Fora, MG,
no Laboratório de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina da USP,
localizado em Ribeirão Preto, SP; e no Laboratório Agrogenética, localizado em
Viçosa, MG.
Produção de in vitro de embriões
Neste experimento, foi utilizado um total de 1175 possíveis zigotos,
obtidos em 11 repetições, distribuídos em três grupos. Os embriões foram
produzidos no período de outubro a novembro de 2006, a partir de oócitos obtidos
de ovários coletados de novilhas e vacas da raça nelore abatidas em matadouro.
A produção foi realizada como descrito anteriormente no capítulo 1.
Avaliação dos embriões
Às 72 horas após a fecundação (hpf), foi realizada a troca de 50% do
volume de cada gota do meio de cultivo. Em seguida, foi realizada a avaliação da
taxa de clivagem dos embriões dos três tratamentos. No sétimo e oitavo dias de
cultivo, foi avaliada a formação de blastocisto.
Extração do RNA e transcrição reversa
A expressão dos genes Hsp70.1 e Bax foi avaliada em 30 embriões do
grupo SFB, 30 embriões do grupo KSR e 20 embriões do grupo PVA. No oitavo
dia de cultivo (D8), embriões em estádio de blastocisto (Bl) e blastocisto
expandido (Bx), classificados em grau I e II de acordo com o manual da IETS,
foram retirados do cultivo e lavados em meio TALP-Hepes. Os blastocistos foram
agrupados em pools de 8 a 10, acondicionados em criotubos, congelados
rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a
-80°C.
Subseqüentemente, os embriões foram descongelados para extração de RNA,
sendo esta realizada por meio da utilização Micro Kit Rneasy (Qiagen, Valencia,
CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.
A síntese da primeira fita de DNA foi obtida com o Kit SuperscriptTM III First
Strand Synthesis (Invitrogen, Chicago, IL, USA). Adicionou-se à amostra (8µl) 1µl
de primers oligo-dT18 e 1µl de dNTPs; então, a amostra foi incubada em
termociclador para a produção da fita de cDNA por um período de 5 minutos, a
uma temperatura de 65ºC. Em seguida, a amostra foi resfriada e mantida no gelo.
Dando continuidade ao processo de transcrição, foi adicionado a cada amostra 2µl
de tampão RT, 4 µl de MgCl2, 2 µl de DTT, 1 µl de RNase OUT e 1 µl de
SuperScript III RT. A reação de síntese do cDNA foi conduzida por 50 minutos a
50ºC, seguidos de 5 minutos a 85ºC e resfriamento em gelo. Por fim, foi
adicionado à amostra 1 µl de RNase H e o conteúdo foi incubado por mais 20
minutos a 37ºC. Essa última etapa é realizada para degradação do RNAm e
purificação do cDNA, que foi armazenado a -80ºC até o momento da reação de
PCR em tempo real.
PCR em Tempo Real
A quantificação relativa foi realizada em duplicata utilizando o PCR Real
Time (ABI Prism 7000 Applied Biosystem, Foster City, CA, USA), sendo a mistura
da reação composta de iTaqTM SYBR Green Supermix, ROX (Bio-Rad, Waltham,
MA, USA), cDNA equivalente a 0,8 embriões e primers específicos para cada
gene, em um volume final de 25 µl por reação. A seqüência dos oligonucleotídeos,
a temperatura de anelamento, o tamanho do fragmento e o código de acesso do
Genebank estão apresentados na Tabela1.
Tabela 1: Sequência de primers e temperatura de anelamento específicas para
cada gene avaliado
Gene
Sequência (5’-3’)
Temperatura
Anelamento
(°C)
Tamanho
Fragmento
(pb)
N° Acesso
Genebank
5´ AACAAGATCACCATCACCAACG
59
275
NM174550
64
174
NM173894
52
176
NM174809
Hsp70.1
3´ TCCTTCTCCGCCAAGGTGTTG
Bax
5´ TTTTGCTTCAGGGTTTCATCCAGGA
3´ CAGCTGCGATCATCCTCTGCAG
H2A
5´ GCCATCCTGGCGTACCTCAC
3´ TGGATGTGTGGAATGACACC
As reações de PCR foram conduzidas a 95ºC por 2 minutos, seguido de
40 ciclos a 95ºC por 15 segundos, temperatura de anelamento específica para
cada primer por 30 segundos e elongação (extensão) a 72ºC por 30 segundos.
Após cada corrida de PCR, a análise da curva de desnaturação (melting curve) foi
realizada para cada amostra, para detectar dímeros de oligonucleotídeos e
produtos inespecíficos. O tamanho do fragmento foi confirmado por eletroforese
em gel com 2% de agarose (Figura 1), corado com brometo de etídio. Controles
negativos sem ácido nucléico também foram conduzidos simultaneamente.
L
H2A
Hsp70.1
Bax
Controle (-)
275 pb
176 pb
174 pb
S K P
S K P S K P
1 2 3
Figura 1: Padrão de bandas, em gel de agarose (2%) corado com brometo de
etídeo, do “ladder” de 100bp (L) e dos genes H2A (1), Hsp70.1 (2) e Bax
(3), nas amostras de embriões do grupo SFB (S), do grupo KSR (K) e do
grupo PVA (P).
Os sinais de fluorescência emitidos durante os primeiros 9 ciclos foram
utilizados para determinar a linha base de fluorescência, e o número de ciclos em
que a fluorescência é considerada significante (ciclo em que a fluorescência da
amostra atinge uma linha limiar); Ct foi estabelecido dentro da fase exponencial de
amplificação. Para corrigir variações entre amostras, o número do Ct de cada
gene foi normalizado com o Ct obtido com o gene H2A (gene de referência
endógena) para, então, fornecer o número de Ct normalizado para cada gene e
amostra. Como o valor de Ct é inversamente proporcional à quantidade de
material de DNA inicial, maiores valores de Ct normalizado significam menores
quantidades de transcritos e vice-versa.
A análise dos resultados do PCR quantitativo foi realizada utilizando-se o
método 2-∆∆Ct, sendo que os resultados foram expressos relativos a um grupo
referência ou calibrador. Neste experimento, o grupo referência foi o grupo PVA. O
Ct do gene alvo (Hsp70.1 e Bax) e do gene controle endógeno (Histona H2A)
foram determinados para cada amostra. A diferença entre o Ct do alvo e o Ct
endógeno, denominado ∆Ct, foi calculada para cada amostra no grupo referência
(PVA) e experimental (SFB e KSR), objetivando-se normalizar as diferenças nas
extrações de RNA e a eficiência das reações de transcrição reversa. O ∆Ct de
cada gene obtido em cada amostra do grupo experimental foi subtraído do ∆Ct
obtido no grupo referência; o resultado obtido é chamado de ∆∆Ct (∆∆Ct = ∆Ct Exp
–∆Ct Ref.). A quantidade do gene alvo no grupo experimental, já normalizada pelo
controle endógeno (gene Histona 2a) e pelo grupo referência (∆Ct do grupo
referência), foi calculada usando 2-∆∆Ct. Desse modo, os dados obtidos foram
expressos no grupo experimental como X vezes relativas ao grupo referência.
Análises Estatísticas
As taxas de clivagem e blastocistos foram analisadas pelo teste Kruskal
Wallis. A expressão relativa, caracterizada por 2-∆∆Ct, foi analisada por ANOVA, e
as diferenças entre médias foram comparadas pelo teste Student Newman Keuls,
através do procedimento GLM do pacote estatístico SAS. Os valores foram
apresentados como médias ± erro padrão (EP).
RESULTADOS
O número de zigotos e as taxas de clivagem e de blastocistos estão
sumarizados na Tabela 2. A suplementação do meio CR2 com soro fetal bovino
(SFB), substituto sintético do soro (Knockout SR), ou álcool polivinílico (PVAcontrole), não afetou a taxa de clivagem (P>0,05). As taxas de blastocistos (D7) e
blastocistos relacionados a estruturas clivadas (D7/CLIV), apresentadas pelo
grupo cultivado em presença do substituto do soro (Knockout SR), foram
semelhantes às observadas nos embriões cultivados em presença de soro
(P>0,05); entretanto, as taxas observadas nos dois grupos foram superiores
(P<0,05) às encontradas no grupo controle (PVA).
Tabela 2: Efeito da suplementação com soro fetal bovino (SFB), Knockout SR
(KSR) ou álcool polivinílico (PVA) em meio CR2aa nas taxas de
clivagem e produção de blastocistos em embriões bovinos produzidos
in vitro.
Taxas de blastocistos
Tratamentos
Zigotos (n)
Taxa de
clivagem
D7*
D8**
SFB
401
58,4±2,8a
24,5±2,2 a
27,5±2,7a
a
a
KSR
379
70,9±4,5
25,1±2,9
29,8±3,1a
a
b
PVA (controle)
395
65,7±4,6
14,7±3,1
17,6±3,0b
a, b
Médias, seguidas de letras diferentes, em uma mesma coluna, mostram
diferença (P<0,05).
Não foi detectada diferença significativa na abundância relativa entre
embriões dos grupos SFB, KSR e PVA para os genes Hsp70.1 e Bax (Tabela 3).
Tabela 3: Expressão da abundância relativa de transcritos específicos (média±EP)
em embriões bovinos em estádio de blastocisto e blastocisto expandido.
Genes
Tratamento
Hsp 70.1
Bax
a
SFB
5,42±0,80
2,08±1,14 a
KSR
3,46±1,62 a
0,92±0,15 a
a
PVA (controle)
1,85±0,85
1,82±0,82 a
a
Médias, seguidas de letras iguais, em uma mesma coluna, não representam
diferença (P>0,05).
DISCUSSÃO
Para alcançar a aplicabilidade comercial de embriões produzidos in vitro,
vários estudos têm sido realizados, contribuindo para a otimização de sistemas de
cultivo in vitro (FLEMING et al., 2004; LONERGAN et al., 2006). Entretanto,
alterações na morfologia, metabolismo e competência de desenvolvimento ainda
persistem em embriões bovinos fertilizados in vitro. O soro, que é amplamente
utilizado para cultivar embriões bovinos fertilizados in vitro, tem sido demonstrado
como um dos fatores envolvidos nessas alterações; por isso, alguns estudos têm
buscado meios livres de soro que proporcionem desenvolvimento embrionário
similar às taxas obtidas em meios suplementados com soro (DUQUE et al., 2003;
LIM et al., 2007; SAGIRKAYA et al., 2007). O presente estudo demonstrou que
embriões bovinos fertilizados in vitro podem ser co-cultivados com células do
cumulus em meio livre de soro, suplementado com um substituto comercial do
soro (KSR) em 5% CO2, sem afetar as taxas de blastocistos e a abundância
relativa de genes associados ao estresse quando comparados com sistemas de
cultivo convencionais contendo soro.
A composição do meio de cultivo tem uma relevante importância no
desenvolvimento
embrionário,
com
grande
impacto
na
sua
viabilidade
(VANROOSE et al. 2001). O cultivo embrionário também pode alterar os padrões
de expressão de genes e comprometer a sobrevivência e qualidade embrionárias
(RIZOS et al., 2002; LONERGAN et al., 2003). O soro e a BSA são suplementos
protéicos convencionais utilizados no cultivo de embriões bovinos, que possuem
efeito positivo no desenvolvimento de blastocistos. Contudo, o uso do soro tem
sido associado a várias anormalidades na morfologia embrionária, expressão
genética, gestação e recém nascidos (VANROOSE et al., 2001). Uma alternativa
para contornar os efeitos deletérios do soro é a sua substituição por
macromoléculas sintéticas como PVA ou PVP, que requerem baixa tensão do O2.
Apesar de proporcionar taxas de clivagem semelhantes, a produção de embriões
geralmente é menor do que em meios suplementados com soro (WRENZYCKI et
al., 2001; KURAN et al., 2002; ORSI & LEESE, 2004). Resultados semelhantes
foram obtidos no presente estudo, onde não foi demonstrada diferença nas taxas
de clivagem entre os grupos SFB e PVA, sendo a taxa de blastocisto maior no
grupo SFB. Por outro lado, a substituição do soro pelo KSR não afetou a clivagem
e a produção de blastocistos, sugerindo que esse suplemento pode proporcionar
condições
similares
para
embriões
bovinos
quando
comparado
com
a
suplementação com soro. Outros substitutos do soro têm sido testados com
resultados similares. DUQUE et al. (2003) avaliou o efeito de dois diferentes
substitutos comerciais do soro (CPSR-3® e Ultrocer G®) no desenvolvimento de
embriões bovinos fertilizados in vitro e observaram que o CPSR-3® proporcionou
taxas de desenvolvimento similares ao soro.
Uma das alterações causadas por sistemas de cultivo in vitro é o
desbalanceamento da expressão de importantes genes para o desenvolvimento
embrionário. De fato, embriões produzidos in vitro demonstram alterações na
expressão de alguns genes (WRENZYCKI et al., 2002; RIZOS et al., 2002; KNIJN
et al, 2005; CAMARGO et al., 2005). Alguns desses distúrbios na expressão de
genes podem ser associados com o uso do soro no meio de cultivo (WRENZYCKI
et al. 1999; RIZOS et al. 2003). A expressão de genes relacionados à resposta ao
estresse celular, como a proteína do choque térmico (Hsp) e o Bax, pode ser
alterada pelo cultivo embrionário (PEDERSEN et al., 2005; WARZYCH et al.,
2007). Além disso, a expressão de Hsp tem sido sugerida como um indicador de
estresse
no
ambiente,
causado
por
condições
subótimas
de
estresse
(WRENZYCKI et al., 2001). No presente estudo, embriões cultivados com (SFB)
ou sem soro (grupos KSR ou PVA) não demonstraram alterações significativas na
abundância relativa de Hsp 70.1, em concordância com outros estudos.
WRENZYCKI et al. (2001) não encontraram diferença na expressão relativa de
Hsp70.1 entre grupos cultivados com soro, BSA ou PVA, embora embriões
cultivados com soro tenham demonstrado maior expressão do que embriões
produzidos in vivo. OLIVEIRA et al., (2005) cultivaram embriões bovinos em
diferentes concentrações de soro (1 a 20%) ou com 0.4% BSA, e também não
encontraram diferença na expressão relativa de Hsp70.1 entre os tratamentos.
Esses resultados sugerem que alterações na expressão do gene Hsp70.1 não
podem ser associadas à utilização de soro no meio de cultivo, como observado no
presente estudo.
Em relação à expressão de Bax, não existiu diferença entre os embriões
cultivados com SFB, KSR ou PVA, o que também sugere que os níveis de
expressão desse gene não estão relacionados à presença do soro no meio de
cultivo. Por outro lado, a presença de soro durante o período de cultivo resulta em
um significante aumento nos níveis de expressão de Bax (RIZOS et al., 2003). O
Bax é uma proteína pro-apoptótica, mas seu papel está associado com a atividade
do Bcl-2, e a relação Bcl2:Bax predetermina a resposta celular ao estímulo à
apoptose (BASU & HALDAR, 1998). FOULADI-NASHTA et al. (2005) reportaram
que a suplementação com soro no meio de cultivo não aumentou a formação de
núcleos apoptóticos em blastocistos bovinos. A associação dos resultados dos
estudos anteriores com o presente estudo sugere que o soro pode não ser o único
agente estimulador da apoptose em embriões bovinos fertilizados in vitro.
O KnockoutTM SR é um suplemento definido, livre de soro, desenvolvido
para
o
crescimento
e
manutenção
de
células
tronco
indiferenciadas
(GOLDSBOROUGH et al., 1998, BRYJA et al, 2006). Esse suplemento livre de
soro não é recomendado para cultivo em placa de células como fibroblastos, pois
não possui fatores que permitam a adesão das células na placa. O presente
estudo demonstrou que as células do cumulus cultivadas com KSR não formaram
monocamada.
CONCLUSÃO
A utilização de Knockout SR em sistemas de cultivo sustenta o
desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro e pode ser uma
alternativa para substituir o soro no cultivo embrionário. Estudos complementares
devem ser realizados com o objetivo de relacionar a expressão gênica e o
potencial de desenvolvimento in vitro com o estabelecimento de prenhez e as
taxas de nascimento.
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5. CONCLUSÕES GERAIS
É possível estabelecer a produção de embriões bovinos em meio de cultivo
CR2aa, suplementado com suplemento sintético livre de soro (Knockout Serum
Replacer).
Nos sistemas de cultivo que receberam soro fetal bovino (SFB) ou
Knockout SR (KSR), tanto a qualidade quanto a quantidade dos blastocistos
bovinos são superiores em relação àqueles produzidos na presença de álcool
polivinílico (PVA).