Sanmile Cristina Nascimento de Holanda
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS SIMULTÂNEA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA CARGA VIRAL POR PCR EM TEMPO REAL (qRT-PCR) IN HOUSE E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DO VÍRUS DA HEPATITE B (VHB) EM AMOSTRAS PROCEDENTES DA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA SANMILE CRISTINA NASCIMENTO DE HOLANDA MANAUS 2012 II SANMILE CRISTINA NASCIMENTO DE HOLANDA SIMULTÂNEA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA CARGA VIRAL POR PCR EM TEMPO REAL (qRT-PCR) IN HOUSE E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DO VÍRUS DA HEPATITE B (VHB) EM AMOSTRAS PROCEDENTES DA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador: Prof. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira Co-orientador: Prof. Dr. Wornei Silva Miranda Braga MANAUS 2012 III Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central da UEA H673s Holanda, Sanmile Cristina Nascimento de Simultânea detecção e quantificação da carga viral por PCR em tempo real (QRT-PCR) In House e caracterização genotípica do vírus da Hepatite B (VHB) em mostras procedentes da Amazônia Ocidental Brasileira / Sanmile Cristina Nascimento de Holanda; orientadora Cintia Mara Costa de Oliveira; co-orientador Wornei Silva Miranda Braga. - Manaus : [s. n.], 2012. 70 f.; il.; 30 cm Dissertação (Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas) Universidade do Estado do Amazonas, 2012. Inclui bibliografia. 1. Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas - Dissertações 2. Hepatite B 3. Genótipo – PCR em tempo real 3. Quantificação I. Oliveira, Cintia Mara Costa de II. Braga, Wornei Silva Miranda III. Título. CDU(1997) 616.36-002(043) IV FOLHA DE JULGAMENTO SIMULTÂNEA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA CARGA VIRAL POR PCR EM TEMPO REAL (qRT-PCR) IN HOUSE E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DO VÍRUS DA HEPATITE B (VHB) EM AMOSTRAS PROCEDENTES DA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA SANMILE CRISTINA NASCIMENTO DE HOLANDA “Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado”. Banca Julgadora: ______________________________________ Presidente Profª. Dra. Cíntia Mara Costa de Oliveira ______________________________________ Prof. Dr. Carlos Gustavo Nunes da Silva Membro ______________________________________ Prof. Dr. Jorge Roberto Di Tommaso Leão Membro V Aos meus pais e minha irmã, pelo carinho, compreensão e por estarem sempre ao meu lado, me incentivando na realização deste trabalho. VI AGRADECIMENTOS Quero agradecer a todas as pessoas que se fizeram presentes, que se preocuparam, que foram solidárias e que torceram por mim: A Deus por ter me dado sabedoria para escolher os caminhos corretos, pelos momentos de alegria que tive durante esse período e por me rodear de pessoas maravilhosas que se empenharam em me ajudar a concluir esse trabalho. A minha querida orientadora Prof. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira por ter acreditado em mim, por me ensinar e me desafiar durante os dois últimos anos, contribuindo para minha formação. Agradeço também pela sua paciência, dedicação e amizade. Ao meu co-orientador Dr. Wornei Silva Miranda Braga pelo incentivo e apoio, principalmente com os pacientes, fundamentais para a realização deste trabalho. A minha querida colaboradora Márcia da Costa Castilho, que teve papel fundamental neste trabalho. A todos os participantes desse estudo pela disposição em ajudar no que deles dependesse para a conclusão da pesquisa. Aos meus pais, Miguel e Sônia, pela formação que me permitiram ter, pelo amor, carinho e apoio nas horas difíceis. Agradeço a cada instante da minha vida por Deus ter me dado pais tão maravilhosos e compreensíveis como vocês. A minha irmã Camila, parceira em todos os momentos, tanto os alegres como os tristes, agradeço pelo amor, compreensão e paciência, principalmente nesses dois últimos anos. A todos os colegas da Gerência de Virologia e demais setores da FMT-HVD pelo apoio e amizade. VII Aos meus colegas da turma de 2010 do PPGMT pela amizade. Ao Programa de Pós Graduação da UEA e todos os professores, pelos conhecimentos repassados, fundamentais para a minha formação. A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, pela parceria e pelo apoio técnico que possibilitou a realização deste estudo. Ao órgão financiador Agradeço VIII LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA ● A - adenina ● Anti-HBs – anticorpo contra o antígeno de superfície ● Anti-HBc – anticorpo contra o antígeno core ● Anti- HBc IgM – anticorpo da classe IgM contra o antígeno c ● Anti-HBe – anticorpo contra o antígeno e Anti-HDT – anticorpo contra o vírus da hepatite D ● ALT – Alanina amino transferase ● AST – Aspartato amino transferase ● cccDNA – Cadeia fechada de DNA com ligações covalentes ● CDC – Centers for Diseases Controls Ct - threshold cycle CV – coeficiente de variação ● DNA – Ácido desoxirribonucléico ● FMT-HVD – Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado ● FRET – Fluorencense Ressonance Energy Transfer ● G- guanina ● HBsAg- Antígeno de superfície ● HBcAg – Antígeno core ● HBeAg – Antígeno e HIV – Vírus da imunodeficiência humana ● HCC – Carcinoma hepatocelular ● Kb – Kilo base ● KD – Kilo Dalton Log - logaritmo ● MS – Ministério da Saúde ● min – minuto ● mL – Mililitro ng - nanograma ● nm – Nanômetro ● OMS – Organização Mundial de Saúde ● ORF’s – regiões abertas de leitura IX ● pb – Pares de base ● Pré-C – Pré-Core ● PCR – Reação em Cadeia da Polimerase ● pmol – Pico moles qRT-PCR- Quantificação por PCR em tempo real ● RNA – Ácido ribonucléico ● RPM – Rotação por Minuto ● Seg – segundo ● SUS – Sistema Único de Saúde ● SVS – Secretaria de Vigilância em Saúde ● VHB – Vírus da Hepatite B ● VHC – Vírus da hepatite C ● VHD – Vírus da hepatite D ou delta ● T- timina ● TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ● UI- Unidades Internacionais ● WHO – World Health Organization ● µg - Micrograma ● µL - Microlitro ● % - Por cento ● ºC – grau Celsius ● > - Maior ● < - Menor X RESUMO A hepatite B é uma doença infecciosa causada pelo vírus da hepatite B (VHB). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 2 bilhões de pessoas no mundo foram infectadas pelo VHB e cerca de 350 milhões vivem com a infecção crônica. Sua distribuição varia consideravelmente em diferentes áreas geográficas do mundo e a Amazônia Ocidental Brasileira é considerada área de alta endemicidade. Além da caracterização genotípica, a análise quantitativa do VHB é amplamente utilizada para monitorar a progressão da doença e o tratamento. Em locais com recursos escassos, métodos baratos para o monitoramento da carga viral são desejáveis e, em países em desenvolvimento, sua utilidade já foi demonstrada para outros vírus, como o da Hepatite C e HIV. Neste estudo desenvolvemos uma metodologia de quantificação da carga viral do DNA do vírus da hepatite B, através da PCR em tempo real e identificamos os genótipos, através do sequenciamento direto, nas amostras clínicas de pacientes oriundos da Amazônia Ocidental Brasileira. Neste trabalho aplicou-se a metodologia da PCR em tempo real para a detecção e quantificação do DNA-VHB. Utilizou-se a plataforma ABI 7500 Fast e sondas TaqMan-MGB® como base para o desenvolvimento deste teste. Foram analisadas 61 amostras pela PCR em tempo real. A sensibilidade analítica do teste foi estimada em 17,9 UI/mL; a média do coeficiente de variação (CV) inter-ensaio foi 3,72% e a faixa de quantificação abrangeu cerca de 7 log 10. A metodologia empregada foi capaz de detectar 62,2% das 61 amostras analisadas. Quando comparado com o método comercial COBAS® AmpliPrep-COBAS TaqMan® HBV Test, utilizado na rotina de diagnósticos, os testes demonstraram pouca correlação na análise de Pearson (r=0,22, p=0,235) e nenhuma concordância na análise de Bland-Altmann. Na caracterização genotípica comprovamos que das 35 amostras sequenciadas, o genótipo predominante na região é o A com 67,8%, seguido do genótipo F com 25% e do genótipo D com 7,14%. Palavras chave: hepatite B – genótipo – PCR em tempo real – quantificação XI ABSTRACT Hepatitis B is an infectious disease caused by hepatitis B virus (HBV). According to World Health Organization (WHO), about 2 billion people worldwide were infected with HBV and about 350 million live with chronic infection. Their distribution varies considerably in different geographic areas of the world and the Western Brazilian Amazon is considered a highly endemic area. In addition to the genotypic characterization, the quantitative analysis of HBV is widely used to monitor the progression of disease and treatment. Where resources are scarce, inexpensive methods for monitoring viral load are desirable and, in developing countries, its usefulness has been demonstrated for other viruses such as Hepatitis C and HIV. This study developed a method for quantification of DNA viral load of hepatitis B by real-time PCR and the genotypes identified through direct sequencing in clinical samples of patients from the Western Brazilian Amazon. In this work we applied the methodology of real-time PCR for detection and quantification of HBV DNA. We used the platform ABI 7500 Fast and TaqMan-MGB® probes the basis for the development of this test. 61 samples were analyzed by real time PCR. The analytical sensitivity of the test was estimated at 17.9 IU / mL, the mean coefficient of variation (CV) interassay was 3.72% and the quantification range covering about 7 log10. The methodology used was able to detect 62.2% of 61 samples analyzed. When compared with the commercial method COBAS ® AmpliPrep -COBAS TaqMan ® HBV Test, used in routine diagnostics, tests showed little correlation in the analysis of Pearson (r = 0.22, p = 0.235) and no agreement in the Bland-Altmann analysis. In genotypic characterization proved that the 35 samples sequenced, the genotype is predominant in the region A with 67.8%, followed by genotype F with 25% and genotype D with 7.14%. Keywords: hepatitis B - genotype - real-time PCR – quantification XII LISTA DE FIGURAS Figura 1. Países ou áreas de risco do VHB............................................................. 2 Figura 2. Estrutura do VHB....................................................................................... 7 Figura 3. Partícula viral do VHB (A) e Partes da estrutura genômica (B)................ 9 Figura 4. Replicação VHB........................................................................................ 10 Figura 5. Distribuição geográfica dos genótipos e subgenótipos do VHB.............. 13 Figura 6. Representação esquemática do mecanismo de ação da sonda TaqMan durante a PCR em tempo real................................................... 18 Figura 7. Curva de amplificação da PCR em tempo real. A amplificação mostra 3 fases distintas: (1) Linha de base ou linha basal: não houve produto da PCR para detectar a fluorescência. (2) Fase log: a quantidade de produto da PCR dobra a cada ciclo. (3) Fase platô: não há mais aumento no número de produtos.............................................................. 18 Figura 8. Representação esquemática das etapas para a clonagem em E.coli, utilizando plasmidio................................................................................... 19 Fluxograma das atividades realizadas...................................................... 25 Figura 10. Representação esquemática da posição dos iniciadores desenhados para a amplificação do gene S do VHB.................................................... 26 Figura 11. Fluxograma das etapas para a realização da clonagem......................... 29 Figura 12. Mapa do vetor pCR®4-TOPO®. Esse mapa mostra as características do vetor e as sequências que circundam o sítio de clonagem. O vetor possui 3956 pb e genes de resistência para a kanamicina e ampicilina................................................................................................. 31 Figura 9. Figura 13. Perfil eletroforético dos plasmídios após a digestão com enzima ECOR I. O clone de nº 4 foi selecionado para as diluições seriadas por ter a maior concentração de DNA. O produto amplificado corresponde a 220 pb. M= marcador de peso molecular Ladder de 1 kb............................. 39 Figura 14. (A) Curva padrão obtida a partir de duplicata das diluições seriadas do plasmídeo pCR4-TOPO®, variando de 101 a 107 cópias/mL. (B) Regressão linear da curva padrão (R2= 0,991). (C) curva padrão obtida e amostras positivas; (D) regressão linear da curva padrão com amostras positivas. Essas figuras foram geradas pelo ABI 7500 Fast (Applied Biosystem)................................................................................... 40 XIII Figura 15. Correlação entre número de cópias, em log/mL, da PCR em tempo real in-house X COBAS® AmpliPrep-COBAS TaqMan® HBV Test (Roche) Esse gráfico foi gerado pelo programa GraphPad Prism 5.0.................... 43 Figura 16. Concordância entre os testes através da metodologia de BlandAltmann. Esse gráfico foi gerado pelo programa GraphPad Prism 5.0..... 44 Figura 17. Árvore filogenética inferida pelo método Neighbor-Joining. O valor de bootstrap foi calculado a partir de 2000 réplicas. A análise envolveu 51 sequencias de nucleotídeos, sendo 31 de referência e um grupo externo (AF046996). As análises evolutivas foram realizadas no programa MEGA........................................................................................ 45 XIV LISTA DE TABELAS Tabela 1. Distribuição geográfica dos genótipos (A-J)............................................ 11 Tabela 2. Sequências dos iniciadores para a amplificação do gene....................... 27 Tabela 3. Sequências dos iniciadores para a amplificação do gene S na PCR em tempo real................................................................................................ 34 Tabela 4. Caracterização da população estudada quanto ao gênero e a procedência.............................................................................................. 37 Tabela 5. Naturalidade dos pacientes envolvidos na pesquisa............................... 38 Tabela 6. Valores de Ct gerados em seis corridas na PCR em tempo................... 40 Tabela 7. Avaliação da reprodutibilidade da curva padrão...................................... 41 Tabela 8. Relação entre os resultados obtidos pelos ensaios de qRT-PCR inhouse e o sistema COBAS® Ampliprep (Roche)...................................... 42 XV LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1. Gráfico 2. Gráfico 3. Taxa de detecção de hepatite B (por 100 mil habitantes) segundo UF de residência. Brasil, 2010.......................................................... 3 Taxa de detecção de hepatite B (por 100 mil habitantes) segundo região de residência por ano de notificação. Brasil, 1999 a 2010.... 3 Perfil da faixa etária dos indivíduos participantes do estudo........ 37 XVI LISTA DE QUADROS Quadro 1. Concentração e volume dos reagentes utilizados na primeira e na segunda reação da PCR convencional.............................................. Quadro 2. 27 Programa para amplificação das regiões S e préS1/S2.................................................................................................. 27 Quadro 3. Programa para amplificação do plasmídeo........................................ 33 Quadro 4. Concentração e volume dos reagentes utilizados............................. 35 Quadro 5. Programa para amplificação da PCR em tempo real......................... 35 XVII SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................... 1.1 Aspectos epidemiológicos da hepatite B...................................................... 1.1.1 Aspectos epidemiológicos da hepatite B no Brasil...................................... 1.1.2 Aspectos epidemiológicos da hepatite B no Amazonas.............................. 1.2 Estrutura genômica do vírus da hepatite B.................................................. 1.3 Replicação do VHB...................................................................................... 1.4 Genótipos, subtipos e sorotipos.................................................................. 1.5 Manifestações clínicas................................................................................ 1.6 Diagnósticos laboratoriais........................................................................... 1.6.1 Diagnóstico bioquímico............................................................................... 1.6.2 Diagnóstico sorológico................................................................................ 1.6.3 Diagnóstico histológico................................................................................ 1.6.4 Diagnóstico molecular................................................................................. 1 1.6.4.1 Detecção qualitativa do DNA........................................................................ 1.6.4.2 Detecção quantitativa do DNA...................................................................... 1.7 Clonagem...................................................................................................... 1.8 Curva Padrão................................................................................................ 1 1 2 5 6 9 10 13 14 14 14 15 15 15 16 18 19 2 JUSTIFICATIVA.......................................................................................................... 21 3 OBJETIVOS................................................................................................................ 22 3.1 Gerais.................................................................................................................. 22 3.2 Específicos......................................................................................................... 22 4 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 4.1 Tipo de estudo................................................................................................ 4.2 Local e população do estudo.......................................................................... 4.3 Comitê de ética................................................................................................ 4.4 Entrevista dos participantes............................................................................ 4.5 Tamanho da amostra...................................................................................... 4.6 Critérios de exclusão..................................................................................... 4.6.1 Critérios de inclusão...................................................................................... 4.7 Classificação sorológica dos participantes................................................. 4.8 Coleta de amostras clínicas........................................................................... 4.9 Extração do DNA a partir do plasma sanguíneo........................................... 4.9.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR)........................................................ 4.9.2 Análise do produto da PCR………………………………………………………. 4.9.3 Sequenciamento............................................................................................. 4.9.4 Análise filogenética......................................................................................... 5 Procedimentos para o desenvolvimento do ensaio de qRT-PCR............... 5.1 Desenvolvimento da curva padrão.................................................................. 5.1.2 Preparação de bactérias competentes............................................................ 5.1.3 Inserção em vetor de clonagem...................................................................... 5.1.4 Extração do DNA plasmidial (Miniprep)........................................................... 5.1.5 Reação de amplificação do plasmídeo............................................................ 5.1.6 Digestão do DNA plasmidial com enzimas de restrição EcoR I..................... 5.1.7 Purificação do fragmento digerido com enzima EcoR I................................. 5.1.8 Sequenciamento dos plasmídeos................................................................... 23 23 23 23 23 24 24 24 25 25 26 26 27 28 28 29 29 30 30 31 31 32 32 32 XVIII 5.2 5.2.1 5.3 5.3.1 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 Seleção dos clones para a construção da curva padrão................................. Avaliação da curva padrão.............................................................................. Desenho dos iniciadores e sondas para os ensaios da qRT-PCR................ Análise dos dados........................................................................................... Avaliação do desempenho do teste de qRT-PCR........................................... Sensibilidade analítica.................................................................................... Reprodutibilidade........................................................................................... Comparação do ensaio in-house frente ao kit comercial COBAS® Ampliprep-COBAS TaqMan® HBV Test (Roche)............................................ Análise estatística dos dados........................................................................ 33 33 34 35 35 35 36 36 36 6 RESULTADOS............................................................................................................ 37 7 DISCUSSÃO............................................................................................................... 46 8 CONCLUSÕES........................................................................................................... 55 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 56 10 ANEXOS................................................................................................................... 10.1 Participantes do projeto................................................................................... 10.2 Termo de consentimento................................................................................. 10.3 Questionário.................................................................................................... 10.4 Relatório de aprovação do projeto CEP.......................................................... 65 65 66 69 70 1 INTRODUÇÃO 1.1 Aspectos epidemiológicos da hepatite B A hepatite B é considerada a principal patologia hepática e é a décima causa de morte no mundo. A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) pode induzir a várias alterações hepáticas variando de infecções agudas e crônicas para cirrose hepática e carcinoma hepatocelular (HCC) (1). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 2 bilhões de pessoas no mundo estao infectadas pelo vírus e cerca de 350 milhões vivem com infecção crônica. Destes, ao menos 65 milhões vivem na África (2). Estima-se ainda que de 500 000 – 700 000 pessoas morrem a cada ano devido aos efeitos agudos ou crônicos da hepatite B (3). A prevalência da infecção pelo VHB varia consideravelmente em diferentes áreas geográficas do mundo, estando estas divididas em três categorias distintas: alta endemicidade (>8%); média endemicidade ou intermediária (2-8%) e baixa endemicidade (<2%) (Figura 1). A infecção pelo VHB é considerada alta quando a prevalência do antígeno de superfície (HBsAg) é superior a 7% ou quando 60% ou mais da população têm evidência sorológica de infecção prévia (4). Nas áreas que correspondem às regiões de alta endemicidade, como o Sudeste Asiático, África Sub-Sahariana, regiões do Pacífico Sul, Alasca e Amazônia Ocidental, a infecção se dá, geralmente, de mãe para filho (transmissão vertical), no momento do parto, assim como horizontalmente, entre crianças menores de cinco anos, com menor probabilidade, relacionado às características ambientais como a de transmissão por insetos hematófagos (5; 6) ou o mais provável, relacionado a hábitos culturais da população, que levem ao contato com o sangue de um indivíduo portador (7; 8). Alguns autores consideram que o contato interpessoal, como a relação entre irmãos, representa um maior risco de disseminação do VHB, do que a transmissão vertical (9). Nas áreas de média endemicidade, como em alguns países da Europa, Japão, América do Sul e parte do Oriente Médio, a transmissão também é vertical ou horizontalmente (1; 10-12). O uso inadequado de seringas também representa um problema de saúde pública nos países em desenvolvimento (13). Nas áreas de baixa endemicidade, como na América do Norte, norte e oeste da Europa e Austrália a maioria das infecções é adquirida no começo da vida adulta, por transmissão 2 horizontal, através do uso de drogas injetáveis, atividades sexuais sem proteção, infecção hospitalar ou emigração de pessoas das áreas endêmicas (7; 12). Figura 1: Países ou áreas de risco do VHB, adaptado. (14) 1.1.1 Aspectos epidemiológicos da hepatite B no Brasil Estimativas do Ministério da Saúde (MS) indicam que a hepatite B crônica atinge cerca de dois milhões de brasileiros, dos quais 95% não estão diagnosticados por falta de esclarecimento e de divulgação sobre a doença (15). Estudos realizados entre as décadas de 80 e 90 sugeriram uma tendência crescente do VHB em direção à região Norte e Sul. Assim, considerava-se que ocorriam três padrões de distribuição da hepatite B: áreas de alta endemicidade, com prevalência superior a 7%, representada pela região Amazônica, alguns locais do Espírito Santo e Santa Catarina; região de endemicidade intermediária, com prevalência entre 2 e 7%, nas regiões Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste e áreas de baixa endemicidade, com prevalência abaixo de 2% na região Sul do país (4;16) Em 2000, Clemens realizou um estudo de soroprevalência do anticorpo contra o antígeno do núcleocapsídeo viral (anti-HBc), nas quatro regiões do país, mostrando que na região Norte a taxa de portadores crônicos atingia 21,4% contra 7,6, 5,5 e 1,2% das regiões Sul, Sudeste e Nordeste, respectivamente (17). 3 Segundo dados do Ministério da Saúde, de 1999 a 2010, o total de casos de hepatite B confirmados foi 104.454 e a taxa de mortalidade 0,3 por 100 mil habitantes. As taxas de detecção por UF de residência, em 2010, podem ser observadas no gráfico 1. A maior taxa foi observada no estado do Acre (52,1) e, a menor, no Piauí (1). O Brasil registrou 6,1 casos de hepatite B por cada 100 mil habitantes (18). As taxas de detecção por região de residência, em 2010, podem ser obervada no Gráfico 2. Gráfico 1: Taxa de detecção de hepatite B (por 100 mil habitantes) segundo UF de residência. Brasil, 2010, adaptado (18) Gráfico 2: Taxa de detecção de hepatite B (por 100 mil habitantes) segundo região de residência por ano de notificação. Brasil, 1999 a 2010. (18) 4 Desde fevereiro de 2006, todo caso de hepatite B é de notificação obrigatória (19). De 1999 a 2011 foi notificado ao Ministério da Saúde um total de 120,3 mil casos. A região Sudeste concentra o maior número (36,3%), seguida da Sul, com 31,6% das notificações. (20). A vacina contra a hepatite B existe desde 1982 com índice de 95% de eficiência na prevenção da infecção pelo VHB. Desde então, mais de um bilhão de doses da vacina foram utilizadas mundialmente (21). Historicamente a vacina contra hepatite B foi desenvolvida a partir de plasma de doadores contendo o vírus B, sendo que o mesmo era inativado durante o processo de fabricação da vacina. Atualmente, por meio da engenharia genética, é possível fazer a identificação e a clonagem molecular do genoma do vírus (HBsAg), tornando possível a produção de uma nova vacina. A vacina, DNA recombinante, possui 20 µg de HBsAg por dose, sendo adsorvida em hidróxido de alumínio e devendo ser conservada em geladeira entre +2 e +8ºC. Estudos comparativos entre a vacina derivada de plasma e a vacina DNA recombinantes mostraram que a qualidade dos anticorpos produzidos tanto em relação à afinidade quanto a especificidade é semelhante. As vacinas não promovem infecção, pois não contêm DNA viral. Elas apenas induzem à produção do anti-HBs (22; 23). No Brasil, a vacinação contra o VHB foi introduzida em setembro de 1989, na cidade de Lábrea, logo se estendendo a mais de dez municípios nas margens dos rios Purus, Juruá e médio Solimões (24). Foram vacinadas crianças de até nove anos de idade e profissionais de saúde, com três doses de vacina DNA recombinantes, que passou a fazer parte do calendário de vacinação em todo o Estado do Amazonas a partir de 1992 (25). A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que a vacina seja dada em três ou quatro doses em áreas onde haja, geralmente, uma transmissão vertical, como em áreas de alta prevalência do VHB, com a primeira dose sendo administrada imediatamente dentro das primeiras 24 horas de vida (26). No Brasil, a 5 vacina para hepatite B passou a ser oferecida no Sistema Único de Saúde (SUS) na década de 90, primeiramente na região Norte. Em 2012, a faixa etária para a vacinação gratuita foi ampliada para pessoas que tenham até 29 anos ou que pertençam a grupos de maior vulnerabilidade, independentemente da idade (27). 1.1.2 Aspectos epidemiológicos da hepatite B no Amazonas A Amazônia Ocidental Brasileira, que inclui os estados do Amazonas, Acre, Rondônia e Roraima, é considerada região de alta endemicidade para o VHB. A prevalência dos portadores do antígeno de superfície (HBsAg) nessas áreas varia de 5% a 15% e, aproximadamente, 50% a 95% das pessoas apresentam evidência sorológica de infecção prévia pelo VHB (28). Em 2005, El Khouri et al realizaram um estudo na região de Monte Negro, no Estado de Rondônia, onde determinaram a presença do VHB em 61,8% dos casos, maior do que em outras partes do Brasil, que foi 7,9%, descrito por Tanak, J. (29; 30). A associação da hepatite B e da hepatite D (VHD) é a que prevalece na região (31). Essa associação é geralmente mais grave do que a infecção pelo VHB sozinho. O VHD é descrito na região, desde o final da década de 60, como Febre Negra de Lábrea - uma hepatoencefalopatia que apresenta características de uma hepatite fulminante (32-34). No estado do Amazonas, as calhas dos rios Juruá, Purus e médio Solimões, são as áreas de maior endemicidade da doença no estado (25; 35). Segundo dados do Ministério da Saúde, entre 1999 e 2011, houve 2.197 casos de hepatite D concentrados na região Norte (76,4%), sendo 37% no Amazonas e 29,3% no Acre (36). Em 2004, para estimar as taxas de prevalência do VHB e do VHD na cidade de Lábrea, Braga e colaboradores analisaram 605 amostras indivíduos HBsAg+ e concluíram que o VHD estava presente em 30% deles (37). Em Manaus, a Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado (FMTHVD), que funciona como Centro de Referência para pesquisas científicas e diagnósticos de doenças tropicais no estado do Amazonas, notificou, entre 2007 e 6 2012, 694 casos de infecção por hepatite B, 172 casos de co-infecção de hepatite B e D (delta) e 45 casos de co-infecção de hepatite B e C (38). 1.2 Estrutura genômica do vírus da hepatite B O vírus da hepatite B é classificado como membro da família Hepadnaviridae, gênero Orthohepadnavírus (39). O ser humano é o hospedeiro natural do VHB, contudo, há relatos na literatura, que vírus similares ao VHB foram isolados em animais como marmotas, patos, esquilos e outros tipos de pássaro (40). Historicamente, a descoberta do VHB data da década de 60, quando Blumberg descobriu o antígeno de superfície (HBsAg) e o denominou de antígeno Austrália (Au), devido ao soro dos primeiros estudos serem de um aborígene australiano (41). Em 1970, Dane conseguiu identificar as partículas do vírus da hepatite B (VHB) no soro de um paciente (42). Kaplan confirmou a natureza viral destas partículas, detectando um DNA endógeno dependente de uma DNA polimerase que se encontrava no seu interior (43). A descoberta desta polimerase permitiu a caracterização do genoma do VHB por Robinson (44). A partícula viral do VHB (Figura 2), também denominada de partícula de Dane, tem um diâmetro de aproximadamente 42 nm, composta de um envelope bi lipídico, que é formado por proteínas sintetizadas e moléculas lipídicas, derivadas do hospedeiro, onde fica a proteína s ou o antígeno de superfície (HBsAg). Dentro do envelope existe uma partícula central, o core (HBc), composto por proteínas do nucleocapsídeo, que serve para proteger o genoma viral e a DNA polimerase, importante para a replicação do vírus. O VHB também gera partículas esféricas ou filamentosas, de aproximadamente 22 nm, que são constituídas apenas por antígenos de superfície. Essas partículas por não conterem o genoma viral, não são infecciosas (45). 7 Figura 2: Estrutura do VHB, adaptado (45) O genoma do VHB possui um peso molecular de 3,2 kb e 3200 nucleotídeos. É formado por uma molécula circular incompleta de DNA dupla-hélice, sendo uma cadeia curta ou (+) e uma cadeia longa ou (-). A cadeia longa (negativa) é completa, com 3000 a 3200 nucleotídeos. A cadeia curta (positiva) é incompleta, variando de 50 a 70% da cadeia longa. Quando as duas cadeias se sobrepõem, a molécula adquire uma forma circular. Na cadeia positiva são encontradas quatro regiões abertas de leitura (ORF’s) (Figura 3), que são representadas pelos genes pré-S/S, pré-C/C, gene P e gene X, cuja função é codificar as proteínas estruturais (HBsAg e HBcAg), não-estruturais (HBeAg), as proteínas replicativas (polimerase e proteína X) e elementos reguladores (39; 46; 47). A primeira ORF é a região pré-S-S que incluem as regiões S, pré-S1 (28483204 nucleotídeos) e pré-S2 (3205-154 nucleotídeos) que codificam as glicoproteínas do envelope viral, através de três códons de inícios diferentes. Esse envelope é composto por três proteínas do HBsAg chamadas de grande, médio e pequeno (L, M, S), respectivamente. A proteína “L” é codificada pela pré-S1, pré-S2 e S. A “M” é codificada pela pré-S2 e S e a proteína “S” é codificada apenas pela região S. A proteína S é formada por 226 aminoácidos e as proteínas L e M são formadas pela extensão amino-terminal com 55 aminoácidos na região pré-S2 e 108-119 aminoácidos na região pré-S1 (39; 48). Dentre as três, a proteína S, conhecida como HBsAg, é a mais abundante, com 24 kD. A proteína pré-S1 está envolvida no reconhecimento do VHB pelos receptores do hepatócito e sua liberação 8 na célula infectada enquanto a região S codifica as glicoproteínas de superfície: grande, média e pequena, presentes na partícula vírica infecciosa (43;48). A segunda ORF é a região C, que codifica os antígenos do nucleocapsídeo viral, é formada por dois códons distintos: o pré-core (pré-C), região altamente conservada, e o core (C), que estão na mesma fase de leitura aberta e codificam duas proteínas, o antígeno e (HBeAg), que é secretado no sangue, e a proteína do core (HBcAg). Imunologicamente, estas proteínas funcionam como antígenos do nucleocapsídeo viral, sendo responsáveis pela indução e produção dos anticorpos anti-HBe e anti-HBc, quando ocorre a infecção pelo VHB. Porém, o papel do HBeAg ainda não é totalmente conhecido, pois não faz parte da estrutura da partícula viral e seu papel na replicação viral é desnecessário (45; 48). A cadeia codificadora da polimerase (região P) é a terceira ORF e produz uma proteína multifuncional que inclui: uma proteína terminal, uma região de ligação, uma região da DNA polimerase/transcriptase reversa e uma região correspondente a ribonuclease H. A polimerase vírica também funciona tanto como uma transcriptase reversa (que serve para a síntese da cadeia negativa do DNA a partir do RNA genômico) assim como uma DNA polimerase endógena. A DNA-polimerase, sendo responsável pela replicação do DNA do VHB na célula hospedeira, é a enzima que degrada o RNA, precursor da partícula viral, substituindo-o por DNA. Depois de formado, o DNA é incorporado ao genoma da célula hospedeira, permitindo que o DNA do VHB seja produzido a partir do RNA. O gene P sobrepõe-se à porção final do gene C, ao gene S completo e à porção inicial do gene X (49). A quarta ORF é denominada como proteína X devido à incerteza sobre sua função durante uma infecção natural. No entanto, já se sabe que o gene X codifica um polipeptídio de 154 aminoácidos, assim como codifica o antígeno X (HBxAg) que, segundo experimentos in vivo, parece agir como um ativador da transcrição, tendo uma função essencial na replicação e na hepatocarcinogênese (47; 50). 9 Figura 3: Partícula viral do VHB (A) e Partes da estrutura genômica (B). (47) 1.3 Replicação do VHB O ciclo replicativo do VHB (Figura 4) começa com a ligação da partícula viral, ou vírion, ao hepatócito do hospedeiro, mediada pela glicoproteína de superfície préS1. Uma vez dentro do hepatócito, ocorre à fusão da partícula com a membrana celular e dentro do citoplasma o genoma é liberado, dirigindo-se até o núcleo. Dentro do núcleo o DNA é reparado e se completa. O genoma do VHB se converte numa cadeia fechada de DNA com ligações covalentes (cccDNA), pela DNA polimerase vírica. (45; 51; 52). O cccDNA é o modelo que origina o RNA mensageiro (RNAm) para a síntese das proteínas virais e o RNA pré-genômico para a síntese do genoma vírico. Esse RNA-pré genômico é transportado para o citoplasma, incorporado no nucleocapsídeo e convertido na cadeia negativa do DNA pela transcriptase reversa. Nessa fase, forma-se um intermediário de RNA, com cerca de 3,4 kb, que fica no interior do vírus imaturo. Esse RNA representa o molde para a síntese da cadeia negativa do DNA. À medida que o RNA vai se transformando em DNA, ele vai sendo degradado através da atividade da RNAase H. Porém, essa degradação não é completa e o oligoribononucleotídeo terminal (que inclui a sequência DR1) é emparelhado com a região DR2, perto do terminal 5’ da mesma cadeia negativa, onde atua como iniciador da síntese da cadeia positiva. A síntese da cadeia positiva é iniciada e forma-se, novamente, o cccDNA (52). 10 Figura 4: Replicação VHB. (52) 1.4 Genótipos, subtipos e sorotipos Estudando os determinantes antigênicos localizados no gene de superfície do HBsAg, Le Bouvier, em 1972, classificou o vírus da hepatite B, em quatro subtipos: adr, adw, ayr e ayw, sendo o determinante “a” comum em todas as cepas. Esses subtipos podem ainda ser divididos em nove sorotipos: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+ e adrq -. Estudos epidemiológicos encontraram prevalência desses subtipos em diferentes partes do mundo (Tabela 1) (40; 53; 54). Analisando a seqüência nucleotídica de 18 cepas de VHB, Okamoto e colaboradores (1988) sugeriram que os subtipos já conhecidos poderiam ser classificados em subgrupos genéticos, já que, quando agrupadas em quatro grupos, de A - D foi encontrada uma divergência com mais de 8% do genoma completo entre as cepas analisadas (55). Logo após a descoberta de Okamoto, Norder et al (1992), através do seqüenciamento do gene S, descobriu dois novos genótipos, o E e o F (56). Utilizando o sequenciamento completo e a análise filogenética, Stuyver et al (2000) descobriu o genótipo G em soro de pacientes com infecção crônica pelo VHB (57). 11 Em 2002, Arauz-Ruiz et al. relatou o genótipo H, encontrado em cepas isoladas oriundas da Nicarágua, México e Califórnia. Através do seqüenciamento do genoma completo e posterior análise filogenética, perceberam que o genótipo F possuía certa similaridade com o genótipo H. O que difere ambos é a substituição da valina na posição 44 e a prolina na posição 45. Na região do gene da polimerase, as três cepas identificadas do genótipo H apresentaram uma região única de 16 aminoácidos bem conservada, enquanto no genótipo F estava ausente (58). Atualmente, 8 genótipos são reconhecidos (A-H), entretanto, existem estudos que sugerem a adição do genótipo I (59-61) e do genótipo J (62) Os genótipos do VHB têm distribuições variadas, em diferentes partes do mundo (Tabela 1). Tabela 1: Distribuição geográfica dos genótipos (A-J), adaptado (53) Genótipos A B C D E F G H I J Distribuição Noroeste Europeu, América do Norte, África Central. Sudoeste da Ásia, China, Japão. Sudoeste da Ásia, China, Japão. Sul da Europa,Oriente Médio, Índia África Nativos americanos, Polinésia, América Central e do Sul. Estados Unidos, França. América Central China Japão No Brasil, estudos têm demonstrado que os genótipos também estão divididos em diferentes regiões, devido à imensa variedade étnica da população brasileira (46; 63). Quase todos os genótipos foram encontrados no Brasil, entretanto, o genótipo A parece ser o mais prevalente, chegando a atingir média de 48,5% (62), seguido pelos genótipos D e F (64). 12 Entre pacientes paulistas, os genótipos A, D e F são encontrados, em maior quantidade, em indivíduos de ascendência ocidental, enquanto os portadores dos genótipos B e C, em indivíduos de origem asiática (63). No Rio Grande do Sul o genótipo D é o mais prevalente, seguido pelo genótipo A (46). O genótipo F ocorre, principalmente, entre a população indígena do norte do país, havendo relatos de prevalência acima dos 75% na Amazônia (46; 65). Em 2008, Oliveira, C.M. analisou um total de 80 amostras de pacientes portadores de hepatite B , sendo 60 procedentes de Manaus e 20 do município de Lábrea, AM. A análise filogenética identificou três genótipos: A, D e F, sendo o A o mais prevalente, seguido dos genótipos F e D. O genótipo A foi mais freqüente nas amostras de indivíduos naturais de Manaus, enquanto o genótipo F predominou nas amostras de indivíduos procedentes do interior do Amazonas (66). Em um estudo realizado em 2007 por Mello, F. e em 2012 por Dias, AL., foi demonstrado que o genótipo F não era tão prevalente na região norte do Brasil (67; 68). Metodologias como o sequenciamento parcial ou completo do genoma viral, o polimorfismo dos tamanhos dos fragmentos de restrição (RFLP) de DNA viral amplificado por PCR, a hibridização em membrana após a PCR e PCR com iniciadores específicos para cada genótipo, têm sido utilizadas para identificar os genótipos do VHB (46). Análises filogenéticas demonstram que os genótipos também podem ser divididos em subgenótipos, com exceção dos genótipos E e G. Nesse tipo de análise observa-se uma variabilidade genética que varia de 4 a 10 % entre os subgenótipos. Assim como os genótipos, os subgenótipos também estão distribuídos em várias regiões geográficas (Figura 5). O subgenótipo A1 é encontrado na África e América do Sul e o A2 na Europa. Os subgenótipos do B são encontrados em países asiáticos, sendo o B1 encontrado no Japão. Os subgenótipos do C também tem maior distribuição nos países asiáticos com exceção do C4, encontrado na Austrália. Recentemente novos subgenótipos do C foram encontrados na província da Indonésia, denominado C6 e nas Filipinas, denominado C7 (66). Os subgenótipos do D têm distribuição mundial e do F é encontrado na América do Sul e Central, onde o 13 F3 predomina na Bolívia e o F4 na Argentina. No Brasil, há um predomínio dos subgenótipos A1 e F2 (69; 70). Figura 5: Distribuição geográfica dos genótipos e subgenótipos do VHB (69) É importante que se conheça, em profundidade, os diferentes genótipos existentes, pois estudos evidenciaram a relação do genótipo com a progressão da doença (70) e até mesmo com seu tratamento (46). Fato esse observado na Ásia, onde os genótipos B e C são mais freqüentes, e que os portadores crônicos infectados com o genótipo C apresentaram complicações mais graves do que os portadores do genótipo B (46; 48; 69; 70). Pessoas infectadas com genótipo A, geralmente apresentam carga viral maior em relação aos outros genótipos, o que facilita a transmissão viral. O genótipo A também tem uma tendência de causar infecção crônica após a infecção aguda. Porém, comparando com o genótipo D, o genótipo A é mais sensível ao tratamento com interferon (48). 1.5 Manifestações clínicas A hepatite B é a causa mais importante de infecção aguda ou crônica no fígado e seu período de incubação varia de um a seis meses (50). As manifestações clínicas e o prognóstico da infecção pelo VHB dependem da idade de aquisição da infecção, do nível de replicação do VHB e do estado imune do hospedeiro, podendo ser sintomáticas ou assintomáticas. Durante o período de incubação da doença os pacientes podem sentir-se indispostos, com náuseas, vômitos, diarréia, anorexia e 14 dores de cabeça. Podem tornar-se ictéricos e, às vezes, não apresentarem nenhum sintoma óbvio. A maioria dos adultos recupera-se da infecção, mas, aproximadamente 5 a 10% não conseguem eliminar o vírus e tornam-se portadores assintomáticos, ou então, desenvolvem uma hepatite crônica, resultando em cirrose ou hepatocarcinoma. Os casos assintomáticos podem ser identificados através de alterações bioquímicas ou sorológicas no sangue (71). 1.6 Diagnósticos laboratoriais Os diagnósticos para a detecção do VHB incluem os testes bioquímicos, sorológicos, histológicos e moleculares. 1.6.1 Diagnóstico bioquímico Avalia a função dos hepatócitos e são obtidos através da determinação dos níveis das enzimas alanina alaminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST). Uma vez detectado a infecção crônica, o paciente deve realizar, periodicamente, testes para avaliar os níveis de ALT, pois, uma elevação acima do limite de normalidade indica um agravamento da doença hepática (72). 1.6.2 Diagnóstico sorológico O vírus da hepatite B possui três antígenos principais: o HBsAg, o HBcAg e o HBeAg. O HBsAg é o primeiro marcador sorológico a ser detectado no soro e indica infecção recente pelo VHB (73). Pode ser detectado várias semanas antes do início dos sintomas e permanecer por cerca de seis meses ou mais no soro. Porém, sua permanência por mais de seis meses, indica a possibilidade de evolução para infecção crônica. O intervalo entre a eliminação do vírus e o aparecimento do anticorpo anti-HBs pode levar de semanas a alguns anos. Normalmente o anti-HBs persiste por toda a vida, conferindo imunidade contra novas infecções. O HBeAg aparece simultaneamente ou poucos dias após o HBsAg. É produzido em excesso e indica replicação viral ativa e alta infecciosidade do vírus. Está presente desde o 15 início da infecção até a cura e sua persistência indica progressão para doença crônica. O anti-HBe aparece no soro do paciente com infecção aguda no momento ou logo depois que o HBeAg torna-se negativo. Sua presença indica cura na doença aguda, mesmo que o HBsAg ainda esteja presente (72; 74; 75). O HBcAg, por ser um componente interno da partícula viral, só é detectável no núcleo dos hepatócitos de indivíduos com hepatite crônica ou aguda e é um indicador confiável da replicação viral. O anti-HBc, surge durante o curso da infecção. Na infecção aguda o anti-HBc é predominantemente IgM e é o primeiro anticorpo detectado. Surge aproximadamente 1 mês após a aparição do HBsAg e 1 a 2 semanas antes do aumento da ALT (76). É substituído pelo IgG que permanece por toda a vida. Sua presença indica exposição prévia ao vírus (74). 1.6.3 Diagnóstico histológico A biópsia hepática é um procedimento invasivo e requer um médico experiente. Normalmente é feita em pacientes já internados, mas pode também ser realizado em pacientes ambulatorialmente selecionados, quando existem dúvidas quanto ao seu quadro clínico (75; 77). 1.6.4 Diagnóstico molecular Cada vez mais as técnicas de biologia molecular têm sido utilizadas para contribuir ou substituir os testes tradicionais (78). As análises moleculares no estudo do VHB possibilitam tanto a manipulação dos genes quanto a detecção qualitativa e quantitativa do DNA viral, principalmente para a confirmação de viremia nos casos crônicos. A maior utilização da técnica é a determinação da carga viral, durante o monitoramento terapêutico e na caracterização genotípica do VHB (74). 1.6.4.1 Detecção qualitativa do DNA O teste qualitativo geralmente utilizado para detectar o DNA do VHB é a PCR (reação em cadeia da polimerase). 16 A PCR é uma técnica que permite a replicação in vitro do DNA, através de iniciadores (primers) específicos, de forma extremamente rápida. Mínimas quantidades do material genético podem ser detectadas e amplificadas milhões de vezes em poucas horas (79; 80). Uma PCR é considerada sensível, quando é capaz de detectar entre 10 e 100 cópias do vírus por mL de soro. Para que não haja resultados falso-positivos e falso-negativos, é necessário que seja feita uma padronização da técnica antes do emprego em análises de rotina (74). Uma das vantagens da utilização da PCR é que a mesma não necessita do cultivo do vírus, assim, é possível analisar um segmento específico do genoma viral. No VHB, os genes S e C geralmente são os mais utilizados nas amplificações por PCR, por conterem as regiões mais conservadas do genoma viral (80) e permitirem a genotipagem. Outro gene que atualmente vem sendo alvo de investigação é o gene da Polimerase P por permitir a análise de resistência viral aos antivirais. O desenvolvimento de kits comerciais de diagnóstico molecular do VHB difundiu a utilização da PCR nos laboratórios. Com isso, uma variedade de testes qualitativos e quantitativos está disponível comercialmente e são utilizados para determinar a presença da infecção ou para avaliar a resposta ao tratamento (81; 82). A PCR apresenta diversas variações que foram desenvolvidas para atender as necessidades específicas. Uma delas é a nested-PCR, que utiliza o produto da primeira amplificação em uma segunda amplificação, com um par de iniciadores localizados internamente à seqüência de nucleotídeos do fragmento amplificado. É considerada uma técnica com alto nível de detecção devido ao aumento do número de ciclos e especificidade, garantido pelo reconhecimento de um número maior de bases da seqüência alvo (83). 1.6.4.2 Detecção quantitativa do DNA VHB Os testes quantitativos têm capacidade de determinar a quantidade de DNA do VHB presente no soro ou plasma de pacientes infectados, através do exame de carga viral. Sua utilidade já foi comprovada em outros vírus como o da hepatite C e HIV. A determinação da carga viral, que pode ter o resultado relatado em números 17 absolutos, log 10, em cópias ou em unidades internacionais (UI) por mL (84), é muito útil no acompanhamento da progressão da doença. Pela sua importância, muitos esforços têm sido realizados para obtenção de melhores desempenhos deste teste. A detecção quantitativa é realizada pela metodologia de PCR em tempo real em equipamento automatizado com o mínimo de interferência nos procedimentos. Essa técnica representa um grande avanço nos métodos moleculares, pois a detecção dos amplicons (produtos de amplificação) é simultânea à quantificação (85). Permite avaliar um número de amostras simultaneamente, com maior praticidade, baixo risco de contaminação cruzada e menor tempo para obtenção do resultado (86; 87). Para a detecção do produto, o método utiliza um sistema fluorescente em plataforma, que pode ser SYBR™ Green ou sondas TaqMan™ (88; 89). Uma das desvantagens do SYBR™ Green é que, como não é específico, ele se liga em todo DNA fita dupla que surge durante a reação, o que pode superestimar a concentração do fragmento alvo (90). A TaqMan™, é uma sonda utilizada para detectar sequências específicas nos fragmentos de DNA alvo, caracterizar e quantificar ou determinar a carga viral alvo. Nas reações utilizando o sistema TaqMan™, as sondas são marcadas com um fluoróforo em uma extremidade e por uma molécula quencher, que aceita a energia do fluoróforo, na outra extremidade. Salientando que além do sistema TaqMan existem outros tipos de sondas como a Molecular Beacons e as sondas Fret. Durante a PCR em tempo real, a sonda hibridiza com a sequência da fita simples de DNA. Na amplificação a sonda é degradada, devido à atividade da Taq DNA polimerase, separando o quencher do fluoróforo durante a extensão. Essa separação resulta em um aumento da intensidade da fluorescência (Figura 6). À medida que os ciclos da reação de PCR vão ocorrendo, aumenta o número de fluoróforos livres e, consequentemente, a fluorescência gerada. Quando a fluorescência emitida pelo fluoróforo atinge um limiar significativamente acima da fluorescência basal da reação, o software do sistema correlaciona em qual ciclo isso ocorre e, com as informações da curva padrão, paralela a reação, o que permite a 18 quantificação do DNA da amostra. O ponto que detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial é denominado de Cycle Threshold (Ct) (Figura 7). Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescência(90; 91). . Figura 6: Representação esquemática do mecanismo de ação da sonda TaqMan durante a PCR em tempo real (91) Figura 7: Curva de amplificação da PCR em tempo real, mostrando 3 fases distintas: (1) Linha de base ou linha basal: não houve produto da PCR suficiente para ser detectado pela fluorescência. (2) Fase log: fase exponencial onde a quantidade de produto amplificado dobra a cada ciclo. (3) Fase platô: não há mais aumento no número de produtos. (90) adaptado. 1.7 Clonagem Na clonagem gênica obtêm-se múltiplas cópias de um gene para que se possa manipulá-lo quimicamente. Para isso, ocorrem dois estágios importantes. Primeiro, o 19 fragmento do DNA de interesse, chamado de inserto, é ligado a uma molécula de DNA circular, chamada de plasmídeo, para formar o DNA recombinante. Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida em uma célula hospedeira compatível, em um processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de célula transformada. Para que a região de interesse seja inserida no plasmídeo, ambos são cortados com a enzima de restrição e ligados através da DNA ligase. Feito isso, eles são introduzidos na célula hospedeira, geralmente a Escherichia coli, aonde vai ocorrer à multiplicação da molécula de DNA recombinante, formando várias cópias idênticas, em um processo conhecido como amplificação. Essa célula transformada sofre muitos ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante (Figura 8). (92; 93). Figura 8: Representação esquemática das etapas para a clonagem em E.coli, utilizando plasmídeo (92). 1.8 Curva padrão Existem dois tipos de curva padrão, a Relativa e a Absoluta. A relativa é usada em metodologias para quantificação de expressão gênica e a curva padrão absoluta geralmente é usada para quantificar e correlacionar o numero de cópias virais com o estado da doença. A quantidade absoluta dos padrões a serem usados deve ser previamente conhecida por algum método independente. 20 A determinação da carga viral pela PCR em Tempo Real é feita com base em uma curva padrão externa que consiste em alíquotas de concentrações conhecidas do alvo molecular objeto do estudo. A amplificação e detecção da curva padrão são realizadas interpolando a amplificação das amostras que se quer quantificar. Para obtenção desses padrões, depois que os clones são replicados, seleciona-se cerca de 5 a 10 colônias que apresentem o plasmídeo recombinante. Para confirmar o inserto, reações de PCR e sequenciamento são realizadas. Quando o inserto é confirmado, lineariza-se o clone, através de digestão com enzimas de restrição, purifica-se e quantifica-se. Por fim, diluições seriadas são realizadas e armazenadas em alíquotas à -70ºC (94). O objetivo de se usar uma curva padrão é obter uma relação gráfica entre os valores de absorbância e os de concentração. Assim, com base na análise gráfica é possível verificar a linearidade da reação e calcular um fator de conversão de valores de absorbância em concentração. 21 2 JUSTIFICATIVA Com o desenvolvimento das técnicas da biologia molecular, estudos foram conduzidos e contribuíram para o melhor conhecimento do VHB, bem como a sua variabilidade genética, o que também conduziram à revisão dos padrões sorológicos desta doença. O diagnóstico laboratorial da infecção pelo VHB é feito com base nas pesquisas dos marcadores sorológicos, presentes no soro dos pacientes infectados tanto na fase aguda quanto na crônica. Os testes de biologia molecular vieram para acrescentar um diagnóstico mais preciso e específico para os usuários. Atualmente, a técnica de PCR em tempo real representa um dos últimos avanços na tecnologia da PCR. Essa metodologia permite a amplificação, detecção e quantificação de DNA em uma única etapa, visando à rapidez dos resultados e diminuição dos riscos decorrentes de possíveis contaminações por manipulação da amostra. A possibilidade de monitorar, ao longo da reação, a quantidade de produto gerado a cada ciclo de amplificação e de quantificar este produto durante a fase ótima da reação, confere maior precisão e reprodutibilidade à técnica de PCR em tempo real quando comparada com a PCR convencional. Atualmente já existem kits comerciais utilizados para essa finalidade, porém, os custos ainda são elevados e seu uso na rotina de diagnóstico acarreta um ônus financeiro muito grande tanto na rede publica quanto privada. Uma maneira de utilizar a PCR em tempo real no diagnóstico de rotina é o desenvolvimento de uma metodologia própria, as chamadas in-house. Portanto, aproveitando a chamada do Ministério da Saúde por intermédio do CNPq/2009 e a grande demanda desse serviço no Estado, nos propomos a desenvolver esse ensaio com uma metodologia própria, pois sabemos que, clinicamente, a determinação ou quantificação da carga viral do VHB é muito útil tanto na fase de pré-tratamento como no monitoramento da resposta imunológica dos pacientes frente aos antivirais. A isto, soma-se a necessidade de capacitação de recursos humano para atuar no desenvolvimento de projeto de pesquisa de alta complexidade na região. 22 3 OBJETIVOS 3.1 Geral Desenvolver uma metodologia de quantificação da carga viral do DNA do vírus da hepatite B, utilizando a PCR em tempo real e identificar os genótipos, através do seqüenciamento direto, em amostras de pacientes procedentes da Amazônia Ocidental Brasileira. 3.2 Específicos Padronizar os ensaios da PCR em tempo real; Construir curvas padrões referentes a diferentes números de cópias virais; Estimar o número de cópias absolutas de partículas virais do VHB em amostras clínicas, junto às curvas padrões previamente estabelecidas. Caracterizar os genótipos do VHB na população de estudo. 23 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Tipo de estudo Este foi um estudo descritivo que visava o desenvolvimento de um ensaio de PCR em tempo real próprio para determinar a carga viral do VHB (qRT-PCR). 4.2 Local e população do estudo O estudo foi conduzido na cidade de Manaus, capital do estado do Amazonas, nas dependências da Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado (FMTHVD), Gerência de Virologia e laboratório de Pesquisa em Doenças Endêmicas (LPDE). Os pacientes foram recrutados através da demanda espontânea do ambulatório de Hepatites Virais da FMT-HVD, com diagnóstico clínico ou laboratorial de infecção pelo VHB independentes de estarem ou não co-infectados por outros vírus e do gênero e idade. Todos os pacientes atendidos foram conduzidos conforme as recomendações estabelecidas no Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas para o Tratamento da Hepatite Viral Crônica B e co-infecções (95). 4.3 Comitê de Ética Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) em 2010, CAAE 0010.0.114.000-10, CEP nº 959/2010 (ANEXO 10.4). 4.4 Entrevista dos participantes Após esclarecimentos sobre os objetivos da pesquisa e a concordância em participar do projeto, mediante a assinatura do TCLE (ANEXO 10.2), o paciente foi entrevistado e um questionário individual foi aplicado (ANEXO 10.3). 24 4.5 Tamanho da amostra A população de estudo foi composta de 61 amostras de sangue de pacientes HBsAg reativos. Coletadas no período de Agosto/2010 à Agosto/2011. 4.6 Critérios de inclusão Foram incluídos no estudo pacientes com as seguintes características: Indivíduos oriundos da Amazônia Ocidental Brasileira; Portador do VHB, independente do quadro clínico de infecção (cirrose hepática, hepatite aguda, hepatite crônica, portador assintomático e hepatocarcinoma); Pacientes sem uso de qualquer tratamento para hepatopatia crônica pelo VHB; Pacientes co-infectados por outros agentes virais. 4.6.1 Critérios de exclusão Foram excluídos do estudo pacientes com as seguintes características: Indivíduos oriundos de estados fora da Amazônia Ocidental Brasileira; Paciente soro reativo para o anticorpo Anti-HBs; Pacientes com história de uso de drogas potencialmente hepatóxicas (metildopa, metotrexato, isoniazida, rifampicina, pirazinamida, nitrofurantoína, vitamina A, fenilbutazona); Pacientes em tratamento ou que utilizaram qualquer tipo de tratamento antiviral para o VHB nos últimos 6 meses. 25 4.7 Classificação sorológica dos participantes Os pacientes incluídos no estudo foram previamente testados para os seguintes marcadores sorológicos: hepatites B (HBsAg, anti-HBc total, anti-HBc IgM, HBeAg e anti-HBe), anticorpos contra o vírus da hepatite A (VHA) (HAV- IgM), da hepatite C (anti-HCV) e da hepatite D (anti-HDV total) e infecção pelo HIV (anti-HIV). Estes exames foram realizados de acordo com o fluxo de rotina da Gerência de Diagnósticos da FMT-HVD. 4.8 Coleta de amostras clínicas No Laboratório de Análises Clínicas (LAC), da FMT-HVD, foi coletada, uma amostra de sangue por punção venosa de cada participante. Essa amostra foi dividida em dois tubos contendo EDTA K3, ambas com cinco mL, identificados por ordem numeral crescente e data da coleta. As amostras foram mantidas em temperatura ambiente e, após 10 minutos, foram centrifugadas a 3200 RPM, por 10 minutos, para a separação do plasma. No Laboratório, as amostras foram separadas em alíquotas e estocadas a -70ºC para posteriores análise. Tanto na coleta quanto no processamento e transporte das amostras, foram adotados medidas de biossegurança e conservação. Para melhor visualização da metodologia, segue na Figura 9 o fluxograma das atividades realizadas. Figura 9: Fluxograma das atividades realizadas 26 4.9 Extração do DNA-VHB a partir do plasma sanguíneo A extração do DNA- VHB foi realizada utilizando o kit Qiamp DNA Blood Mini kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA), modificado. O DNA foi extraído a partir de 200 µL de plasma e 20 µL de Proteinase K e incubado a 56ºC, por 12 horas. O DNA extraído foi eluído em 50 µL de tampão de eluição e armazenado em temperatura de - 70ºC, até o momento de sua utilização. 4.9.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR) O DNA viral foi amplificado pelo sistema semi-nested PCR. Na primeira reação foram utilizados os iniciadores 2821 e 783 que amplificam o gene “‘S” completo. A partir dessa primeira reação, foi feita uma semi-nested PCR, tendo como alvo as regiões “pré-S1/pré-S2”, utilizando os iniciadores 2821 e 241 (96). Quando essa região não amplificava, as amostras eram testadas com os iniciadores P1 e 783 (região pré-S2/HBsAg) (97). As sequências dos iniciadores e o tamanho do fragmento obtido estão descritos na Tabela 2. Na Figura 10, há uma ilustração do gene S do VHB mostrando a posição de cada iniciador. Todos os ensaios de PCR foram padronizados para um volume final de 25 μL, utilizando o Master Mix TopTaq (Qiagen). A concentração e os volumes dos reagentes em cada reação estão descritas no Quadro 1. Os ensaios de PCR foram processados em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient nas condições descritas no Quadro 2. Figura 10: Representação esquemática mostrando a posição dos iniciadores usados na amplificação do gene S do VHB. (Fonte: pessoal). 27 Tabela 2: Sequências dos iniciadores para a amplificação do gene S Nome Tamanho do amplicon Sequência Primeira reação 5’-GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’ 5’-CTC ACG ATG CTG TAC AGA CTT-3’ Segunda reação (nested-PCR) 5’-GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’ 5’-CAC CAC GAG TCT AGA CTC TGC T-3’ Segunda reação (nested-PCR) 5’-CTC ACG ATG CTG TAC AGA CTT-3’ 5’-TGC CTC TCA CAT CTC GTC AA 3’ 2821 783 2821 241 783 P1 1200 pb 680 pb 680 pb Quadro 1: Concentração e volume dos reagentes utilizados na primeira e na segunda reação da PCR convencional. Reagentes Mix 1ª reação Reagentes Mix 2ª reação TopTaq Master Mix 2x 12,5 µL TopTaq Master Mix 2x 12,5 µL Iniciador F (10 pmol) 1,0 µL Iniciador (10 pmol) 1,0 µL Iniciador R (10 pmol) 1,0 µL Iniciador R (10 pmol) 1,0 µL DNA 5,0 µL Amplicon 1,0 µL H2O (RNAse free) 5,5 µL H2O (RNAse free) 9,5 µL Vol. Final 25 µL Vol. Final 25 µL *F= Foward; R= Reverse Quadro 2: Programa para amplificação das regiões S e pré-S1/S2 Ciclo da 1ª reação (2821-783) Ciclos Temperaturas 1 94º C 94º C 35 57,1º C 72º C 1 72º C Tempo 5 minutos Ciclo da 2ª reação (2821-241) ou (P1-783) Ciclos Temperaturas 1 94º C 30 segundos 2 minutos 35 30 segundos 7 minutos 1 Tempo 2 minutos 94º C 30 segundos 60º C 30 segundos 72º C 1 minuto 72º C 5 minutos 4.9.2 Análise do produto da PCR Os produtos da PCR foram analisados em corrida eletroforética, utilizando gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídeo (1,0 µg/mL). No gel foi aplicado 5 28 µL do produto da PCR misturados com 2,0 µL de tampão de corrida. Como padrão de peso molecular, foi utilizado o DNA Ladder 100 bp (Invitrogen). Ao final da corrida eletroforética, o gel foi visualizado em luz ultravioleta e fotografado para documentação. 4.9.3 Sequenciamento As amostras positivas na PCR foram purificadas, utilizando o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Opcionalmente também foi usado kit Big Dye xTerminator Purification (Applied Biosystems), seguindo o protocolo do fabricante. Em seguida, foi realizada a reações de seqüenciamento utilizando os regentes do kit Big Dye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems). As reações de sequenciamento foram padronizadas para um volume final de 10 µL utilizando preferencialmente os iniciadores que amplificam 680 pb. As condições de temperatura foram: 96º - 1 min e 25 ciclos de 96º - 15 seg, 50º - 15 seg e 60º - 4 min. Processadas em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf). A leitura automática das bases nucleotídicas foi realizada no analisador de DNA ABI System 3130XL (Applied Biosystem). 4.9.4 Análise filogenética A edição e alinhamento das sequencias nucleotídicas obtidas foi feito no programa BioEdit (98). Para o alinhamento utilizou-se as seguintes sequencias de referência: genótipo A (HBU55220, JF784230, AY344107, JN604260, JN604261), genótipo B (AB562448, AB644290, AB644289), genótipo C (AB644300, AB644304, AB644296), genótipo D (AB644319), genótipo E (FN821488, HE616571), genótipo F (JF815629, JQ246021, JQ246023, X69798, DQ899144, DQ899148, FJ589067, EU366116, AY179734), (AB516394), genótipo genótipo G (AP007264, AB191378), I (EU833891, FJ023661, GU357844) e genótipo H genótipo J (AB486012). A árvore filogenética foi construída utilizando o programa MEGA v 5.05 (99) inferida pelo método Neighbor-Joining. O valor de bootstrap foi calculado com 2000 réplicas. A análise envolveu 51 sequencias de nucleotídeos, sendo 30 de referência e um grupo externo (AF046996). 29 5 Procedimentos para o desenvolvimento do ensaio de qRT-PCR Os ensaios laboratoriais foram realizados na Gerência de Virologia/FMT-HVD, com a consultoria do pesquisador Prof. Dr. Milton Ozório da UFRJ, associado à Fiocruz-RJ, participante do Programa Sênior da FAPEAM/FMT-HVD. 5.1 Desenvolvimento da curva padrão Para produção da curva padrão foi realizada a clonagem de um fragmento de 200 pb, em plasmídeo célula eletrocompetente pCR4-TOPOTM (kit TOPO TA® Cloning (Invitrogen). Para esse procedimento foi selecionada uma amostra clínica com alta carga viral. Foi realizado dois ensaios de clonagem, um no Laboratório de Virologia da FMT-HVD e outro no Laboratório de Virologia da Fiocruz/RJ. Para melhor visualização da metodologia de clonagem, segue na Figura 11 o fluxograma das etapas desenvolvidas. Figura 11: Fluxograma das etapas para a realização da clonagem 30 5.1.2 Preparação de bactérias competentes Bactérias E.coli TOP 10´F e BL 21 (DE3), estocadas a -70ºC foram semeadas em placas contendo LB/Agar a 1,5% e incubadas a 37ºC por 18 horas. Uma colônia foi inoculada em 5 mL de meio LB para crescimento durante 18-20 horas a 37ºC em agitação constante (250 rpm) e então 0,5 mL desta cultura foram inoculados em 50 mL de meio LB. As culturas foram coletadas em fase exponencial de crescimento determinada quando a absorbância a 600 nm estava entre 0,35 e 0,45. As bactérias foram sedimentadas por centrifugação a 4.000 rpm, por 10 minutos a 4ºC e logo suspensas em 0,5 volumes de uma solução de CaCl 2 50 mM. Após 2 horas de incubação em gelo, as bactérias foram centrifugadas e o precipitado suspenso em 0,8 vol. De tampão FSB (Acetato de potássio 10 mM pH 7,5; MnCl 2.4 H2O 45 mM; CaCl2.2H2O 10 mM; KCL 100 mM; Glicerol 10%). Para armazenamento foi adicionado DMSO a 10% e a preparação distribuída em alíquotas de 200 µL, congelada em nitrogênio líquido e posteriormente estocadas a -70ºC. 5.1.3 Inserção em vetor de clonagem O vetor de clonagem utilizado nesse trabalho foi o pCR4-TOPOTM (kit TOPO TA® Cloning (Invitrogen). Que é fornecido linearizado, contendo uma enzima topoisomerase de Vaccinia. Essa enzima cria um ponto de ataque nucleofílico e realiza a ligação do DNA, conforme a Figura 12. O mapa do vetor é mostrado na figura 12. Para a ligação, aproximadamente 100 ng (4 µL) do produto da PCR foram usados numa reação de 6 µL que continha 1 µL do tampão 10X e 1 µL do vetor TOPO TA®. A solução final foi misturada gentilmente e incubada por 30 minutos a temperatura ambiente. Após incubação, 2 µL da reação foi adicionado a 200 µL de células competentes (E.coli TOP 10´F) e incubado no gelo por 15 minutos. Após, as células foram incubadas a 42ºC por 60 segundos, retornou ao gelo por mais 15 minutos e em seguida adicionou-se 150 µL de meio de cultura SOC à solução, que foi submetida à agitação constante a 215 rpm, durante 30 minutos a 37ºC. Após agitação, 150 µL da reação foram aplicados em uma placa contendo meio sólido 31 LB/Agar e 100 µg/mL de ampicilina, IPTG/X-Gal e incubada a 37ºC por 16 horas. As colônias brancas nas placas LB/Agar foram processadas para o isolamento do DNA plasmidial. 5.1.4 Extração do DNA plasmidial (Miniprep) As colônias resultantes da transformação foram selecionadas com base na mudança de coloração. Seis colônias brancas foram escolhidas ao acaso nas placas LB/Agar/IPTG/Xgal, numeradas e processadas para isolamento de DNA plasmidial. Foram então cultivadas em 2 mL de meio LB/ampicilina a 37ºC por 18 horas, em agitação constante (280 rpm) e os plasmídeos foram extraídos usando o procedimento de mini-preparação, seguindo o protocolo do fabricante. Figura 12: Mapa do vetor pCR®4-TOPO (Invitrogen®). Esse mapa mostra as características do vetor e as sequências que circundam o sítio de clonagem. Possui 3956 pb e genes de resistência para a kanamicina e ampicilina, uteis para selecionar os clones desejados. 5.1.5 Reação de Amplificação do Plasmídeo A amplificação dos plasmídeos contendo inserto foi obtida utilizando os iniciadores 2821 e 783 e enzima Platinum Taq DNA Polymerase High-Fidelity (Invitrogen Life Technologies) em um volume final de 25 uL. As concentrações dos 32 demais reagentes são as mesmas descritas no Quadro 1. As condições de temperatura de amplificação estão descritas no quadro abaixo (Quadro 3). Quadro 3: Programa para amplificação do plasmídeo Ciclos Temperaturas Tempo 1 95º C 3 minutos 95º C 40 segundos 60º C 1:30 minutos 68º C 40 segundos 68º C 5 minutos 35 1 5.1.6 Digestão do DNA plasmidial com Enzima de Restrição EcoR I Para verificar a presença do inserto VHB no plasmídeo foi realizada digestão enzimática com EcoR I (Invitrogen). Foi utilizado 1 µL do produto da PCR pósMiniprep, 1,5 µL de tampão 10X, 1,5 µL de EcoR I e água q.s.p 15 µL. A mistura foi incubada a 37ºC por 2 horas. O produto da digestão foi analisado em gel de agarose a 0,8%, corado com brometo de etídio e visualizados em transluminador UV. 5.1.7 Purificação do fragmento digerido com enzima EcoR I A purificação dos fragmentos após corte com enzima de restrição foi realizada utilizando o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), conforme as instruções do fabricante. 5.1.8 Sequenciamento dos plasmídeos Ainda para confirmação do inserto VHB nos plasmídeos foram selecionados 6 clones e sequenciados. A reação de sequenciamento foi padronizada para um volume de 10 µL, utilizando o iniciador M13 do kit Big Dye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), nas seguintes condições: um ciclo inicial de 96ºC por 1 min, seguido de 25 ciclos de 96ºC por 15 seg, 50ºC por 15 seg e 60ºC por 4 min. A reação de sequenciamento foi processada em termociclador Mastercycler 33 Gradient (Eppendorf). A reação de sequenciamento foi purificada com Big Dye xTerminator Purification Kit (Applied Biosystems), seguindo o protocolo do fabricante. O sequenciamento foi realizado no analisador genético automático ABI System 3130XL (Applied Biosystem). 5.2 Seleção dos clones para construção da curva padrão Na clonagem foi possível obter seis clones com diferentes concentrações de DNA. A quantificação do DNA desses clones foi feita utilizando o espectrofotômetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Após a quantificação, o clone com maior concentração de DNA foi utilizado para construção da curva padrão a partir da diluição seriada. 5.2.1 Avaliação da curva padrão Na metodologia de PCR em tempo real utiliza-se o parâmetro Threshold Cycle (Ct, value), ciclo aonde ocorre o primeiro aumento significativo na quantidade de amplificação é primeiramente detectado. Correlaciona-se com a quantidade inicial de amostra alvo. É, portanto, o parâmetro usado para quantificação de PCR. Neste estudo os valores de Ct avaliar o ponto inicial de amplificação da curva padrão e das amostras clínicas. A curva padrão é demonstrada em forma de gráfico contendo os valores de Ct de cada diluição e das amostras. O software SDS do equipamento calcula a regressão linear definindo o melhor ajuste entre os pontos da curva padrão. A fórmula para o cálculo da regressão linear é a seguinte: Ct=m[log(Qty)]+b, onde m é a inclinação da reta (slope), b é a interceptação da reta e Qty é a quantidade inicial de DNA. Os valores obtidos com a análise de regressão são assim interpretados: o R2 (coeficiente de correlação), que mede o quão próximo é o ajuste entre a regressão linear da curva padrão e o Ct das amostras, quanto mais perto de 1, mais perfeito é esse ajuste. O slope indica a eficiência da amplificação e um resultado de -3,3 do slope indicam 100% de eficiência. O Intercept indica o valor esperado de Ct para uma amostra com quantidade 1 ng/µL. Tanto o slope como o Yintercept são coeficientes de regressão. 34 5.3 Desenho dos iniciadores e sonda usados nos ensaios de PCR em tempo real Sequências de isolados de VHB referentes aos genótipos de A – H obtidas no GeneBank (National Library of Medicine, National Institute of Health), foram alinhadas e com auxilio do software Primer Express® (Applied Biosystems, Foster, CA USA), foi desenhado um par de iniciador, S56 e S264 e uma sonda marcada com Minor Groov Binder (MGB) na extremidade 5’ localizados em uma região conservada do gene S. Os iniciadores e sonda foram sintetizados pela Life Technologies (Applied Biosystems). A sequência da sonda e dos iniciadores e o tamanho do fragmento obtido estão descritos na Tabela 3. Todos os ensaios de PCR em tempo real foram padronizados para um volume final de 25 μL. A concentração e os volumes dos reagentes em cada reação estão descritas no Quadro 4. Todas as amostras, padrões e controle negativo, que foi preparado a partir de um mix contendo RNAse Free Water no lugar da amostra foram adicionadas na placa óptica em duplicatas. A placa óptica foi processada e lida no ABI 7500 Fast Real Time PCR Systems (Applied Biosystems), os ensaios da PCR em tempo real foram processados nas condições descritas no Quadro 5. Tabela 3: Sequências dos iniciadores para a amplificação do gene S na PCR em tempo real. Nome Sequência S56 5’-CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA-3’ S264 5’-GTC CAC CAC GAG TCT AGA CTC T-3’ Sonda 5’-FAM-CTG CTC CGA ATA TTG CCT CTC ACA-MGB NFQ-3’ Tamanho do amplicon 220 pb 35 Quadro 4: Concentração e volume dos reagentes utilizados Reagentes Mix TaqMan Universal Master Mix 1x 12,5 µL Iniciador F (10 pmol/µL) 1,0 µL Iniciador R (10 pmol/µL) 1,0 µL Sonda TaqMan (10 pmol/µL) 0,5 µL DNA 2,0 µL H2O (RNAse free) 8,0 µL Vol. Final 25 µL Quadro 5: Programa para amplificação da PCR em tempo real Ciclos Temperaturas Tempo 1 50º C 2 minutos 1 95º C 10 minutos 95º C 30 segundos 60º C 1 minuto 72º C 30 segundos 45 5.3.1 Análise dos dados Os resultados de amplificação das amostras (valores dos Cts) pela qPCR foram analisados no Sequence Detection Software (SDS) (Applied Biosystems). Os pontos dos Cts das amostras desconhecidas foram relacionados com os Cts da curva padrão, calculados por meio da equação de regressão linear da reta. 5.4 Avaliação do desempenho do teste de qRT-PCR 5.4.1 Sensibilidade analítica A sensibilidade analítica ou limite mínimo de detecção é definido como o número mínimo de cópias que podem ser medidas em um ensaio. Esta foi determinada através da última diluição possível de ser detectada pela PCR em tempo real. 36 5.4.2 Reprodutibilidade Para avaliar a reprodutibilidade da curva padrão desenvolvida, foi feita a análise da variação inter-ensaio, onde a curva foi testada em duplicata, durante três dias consecutivos, por três pessoas distintas. 5.4.3 Comparação entre o ensaio in-house e o comercial COBAS® AmpliPrep-COBAS TaqMan® HBV Test (Roche) Para avaliar a eficiência do sistema desenvolvido as mesmas amostras foram analisadas no sistema automatizado COBAS® AmpliPrep-COBAS TaqMan® HBV Test (Roche). Sistema utilizado na rotina da FMT-HVD. A concordância entre os resultados obtidos foram avaliados pelo coeficiente Pearson e análise de BlandAltaman. O limite mínimo de detecção do kit comercial é de 12,0 UI/mL (1,07 log10) e o limite máximo é 110.000.000 UI/mL (8,03 log 10). 5.4.4 Análise estatística dos dados Os dados foram registrados em planilha do programa Microsoft Office Excel 2007. A análise dos dados foi feita usando o teste de ANOVA, Pearson e BlandAltmann, com descrição estatística simples, intervalo de confiança (IC 95%), e testes de significância inferior a 0,05. Os gráficos foram desenhados no programa GraphPad Prism 5.0. 37 6 RESULTADOS 6.1 Caracterização da população estudada O estudo avaliou 61 amostras de pacientes HBsAg positivos, todos atendidos no ambulatório de hepatite da FMT-HVD. Dos 61 indivíduos, 14 (23%) eram coinfectados pelo VHD e 3 (5%) pelo HIV. O grupo total caracterizou-se por um predomínio do gênero masculino em relação ao feminino, tanto dos indivíduos procedentes de Manaus quanto dos procedentes do interior e de outro estado. O perfil da população estudada quanto ao gênero e a procedência estão representados na Tabela 45. Tabela 4: Caracterização da população estudada quanto ao gênero e a procedência Gênero Manaus Interior e outros estados Total Masculino 21 (51%) 13 (65%) 34 (55%) Feminino 20 (48%) 7 (35%) 27 (45%) Total 41 (100%) 20 (100%) 61 (100%) Em relação à faixa etária, predominou a faixa entre 21 e 30 anos, com um total de 20 indivíduos, seguida da faixa entre 41 e 50 anos com 18 indivíduos (Gráfico 3). Gráfico 3: Perfil da faixa etária dos indivíduos participantes do estudo 38 Quanto à naturalidade dos indivíduos, 41/61 são pacientes naturais de Manaus, 19 moram em município do interior do estado do Amazonas e vieram para Manaus apenas para realizar o tratamento da hepatite B e 1 do estado de Rondônia (Tabela 5) Tabela 5: Naturalidade dos pacientes envolvidos na pesquisa. Naturalidade % Manaus 41 (67,2) Tapauá 4 (6,55) Lábrea 3 (4,91) Altazes 2 (3,27) Coari 2 (3,27) Eirunepé 2 (3,27) Juruá 2 (3,27) Atalaia do Norte 1 (1,63) Codajás 1 (1,63) Maués 1 (1,63) Tefé 1 (1,63) Rondônia 1 (1,63) Total 61 (100) 6.2 Resultados referentes ao sistema qRT_PCR in-house 6.2.1 Confirmação do DNA-VHB no plasmídeo por digestão enzimática A Figura 13 mostra o resultado da digestão enzimática de seis clones contendo o inserto VHB em diferentes concentrações de DNA. A partir desse ensaio, por conter maior concentração de DNA, foi selecionado o clone de nº 4 e utilizado na produção das curvas de calibração. 39 Figura 13: Perfil eletroforético dos plasmídeos após a digestão com enzima EcoR I. Gel de agarose 0,8%. O clone de nº 4 foi selecionado para as diluições seriadas conter a maior concentração de DNA. O fragmento VHB amplificado corresponde a 1200 pb. M= marcador de peso molecular de 1kb. 6.2.2 Avaliação da curva padrão A curva padrão ou curva de calibração foi produzida a partir da diluição seriada do clone com maior concentração de DNA (4973,5 ng/µL). Os valores obtidos para as sete diluições foram: 10 (101), 100 (102), 1000 (103), 10000 (104), 100000(105), 1000000 (106) e 10000000 (107). Essas diluições foram incluídas em cada corrida do teste. Foram realizadas, ao todo, seis corridas para avaliação da curva padrão externa. Cada uma com as sete diluições seriadas, totalizando 42 reações. Os valores de Ct gerados em cada corrida estão descritos na Tabela 6. A reprodutibilidade do ensaio foi avaliada através do coeficiente de variação (CV) que variou de 1,3 a 2,7%. A média do coeficiente de variação foi de 2,64%. A especificidade do teste foi medida pela não obtenção de sinal nos controles negativos adicionadas em cada corrida. O valor estimado do slope foi de -3,47 e, conforme a fórmula eficiência= [(10(-1/slope)] –1)x100%], a eficiência da curva padrão foi equivalente 99,5%, indicando uma boa eficiência do ensaio. O coeficiente de correlação (R2) foi = 0,991 e o Intercept foi = 15,82. A Figura 14 mostra o perfil da curva padrão obtida relacionando a fluorescência com o número de ciclos em que o produto da PCR passou a ser detectado. 40 Tabela 6: Valores de Ct obtidos em seis corridas na PCR em tempo real. CURVA PADRÃO CÓPIA/ REAÇÃO Ct curva 1 Ct curva 2 Ct curva 3 Ct curva 4 Ct curva 5 Ct curva 6 Média DP CV 101 102 103 104 105 106 107 18.84 22.28 28.86 29.87 33.37 36.56 39.25 18.78 22.55 26.62 29.99 33.52 37.84 ND 18.90 22.69 26.48 29.91 33.22 37.67 40.11 18.78 22.55 28.62 29.99 33.52 42.97 ND 19.39 23.32 27.72 31.00 34.62 39.38 ND 19.31 23.29 27.79 30.68 34.58 37.38 41.47 19 22.78 27.68 30.24 33.80 38.63 40.27 0,26 0,42 0,98 0,47 0,61 2,31 1,11 1,3% 1,8% 3,5% 1,5% 1,8% 5,9% 2,7% Ct= threshold cycle; DP=Desvio Padrão; CV= Coeficiente de Variação; ND= Não detectado Figura 14: (A) Curva padrão obtida a partir de duplicata das diluições seriadas do plasmídeo pCR4-TOPO®, variando de 101 a 107 cópias/mL. (B) Regressão linear da curva padrão (R2= 0,991). (C) curva padrão obtida e amostras positivas; (D) regressão linear da curva padrão com amostras positivas. Gráficos gerados pelo ABI 7500 Fast (Applied Biosystem). 41 6.2.3 Avaliação da Sensibilidade analítica Inicialmente, foram feitas 10 diluições seriadas para a obtenção da curva padrão e analisadas no ABI 7500 Fast (Applied Biosystems). O limite mínimo de detecção obtido na diluição 107 correspondeu a 17,9 UI/mL (1,60 log10). 6.2.4 Reprodutibilidade Os testes de reprodutibilidade foram realizados em duplicata, em três dias consecutivos e por três pessoas distintas e estão descritos na Tabela 8, junto com os valores da média, desvio padrão e coeficientes de variação (%CV). Comparando a média do coeficiente de variação da curva padrão com a média do coeficiente de variação do inter-ensaio 2,64% e 3,72%, respectivamente (Tabelas 6 e 7) houve uma diferença significativa entre ambas, indicando que não houve boa reprodutibilidade da curva padrão, entretanto, pela análise ANOVA (valor P=0,9968) não ocorreu diferença significativa na reprodutibilidade do teste nos três dias analisados e os valores ficaram dentro do desvio padrão. Tabela 7: Avaliação da reprodutibilidade da curva padrão Diluições da curva padrão 101 102 103 104 105 106 107 X 1º dia 17,97 20,38 41,67 ND 32,55 33,38 32,50 20,30 20,82 43,48 ND 35,04 33,59 33,20 Y 2º dia 19,62 22,84 40,28 40,49 30,25 33,95 34,84 19,21 22,21 39,15 43,61 30,38 33,65 34,65 Z 3º dia 20,19 22,10 39,35 42,07 30,54 34,47 33,97 19,68 22,22 38,66 44,01 32,05 33,75 34,46 DP=Desvio Padrão; CV= Coeficiente de Variação; ND= Não detectado. Média 19,49 21,76 40,43 42,54 31,80 33,79 33,93 DP CV 0,84 0,94 1,83 1,60 1,84 0,37 0,91 4,3% 4,3% 4,5% 3,7% 5,7% 1% 2,6% 42 6.3 Especificidade da qRT-PCR in-house Para facilitar a análise, os valores absolutos das concentrações obtidas foram convertidos em valores logaritmos. Nas 61 amostras analisadas pelo método in house, em 38 foi possível determinar a carga viral. A Figura 14 (C) mostra as amostras positivas interpoladas à curva padrão. A Figura 14 (D) mostra a regressão linear das mesmas amostras junto com a curva. Após conversão os valores das concentrações de carga viral obtidas variaram de 1,19 log10 a 8,5 log10 por ml, abrangendo uma faixa de quantificação de cerca de 7 log. 6.4 Comparação entre o ensaio in-house e o comercial COBAS® AmpliPrep-COBAS TaqMan® HBV Test (Roche) Para comparar o método qRT-PCR in-house com o método comercial COBAS® AmpliPrep-COBAS TaqMan® HBV Test, 61 amostras foram testadas nos dois ensaios. A relação entre os resultados obtidos nos dois métodos são mostrados na Tabela 8. O percentual de concordância de positividade entre os dois métodos foi 50,8% e de negatividade foi = 18,0%. O percentual de discordância entre os dois sistemas foi = 31,1%. Para avaliar a correlação entre os resultados das cargas virais estimadas nas duas técnicas, foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson, onde o resultado foi 0,22 (p=0,235), indicando pouca correlação entre eles. Na Figura 15 é possível observar a correlação dos testes. Tabela 8: Relação entre os resultados obtidos nos ensaios de qRT-PCR in-house e o sistema COBAS® Ampliprep (Roche) Sistema qRT-PCR in-house Sistema COBAS@ Ampliprep (Roche) + ND Total + 31 7 38 ND= Não detectado; + = amostras positivas. ND 12 11 23 Total 43 18 61 43 Figura 15: Correlação entre número de cópias, em log/mL, da PCR em tempo real in-house X COBAS® AmpliPrep-COBAS TaqMan® HBV Test (Roche) Uma avaliação mais informativa da concordância dos testes foi obtida através da aplicação da metodologia descrita por Bland&Altmann (100). Pela análise de Bland-Altman, avalia-se a média das diferenças a qual estabelece quão importante clinicamente são as discrepâncias entre os dois equipamentos utilizados e quais limites de concordância determinam as diferenças entre os dois equipamentos situados no intervalo de confiança de 95%. Na Figura 16, há uma visualização dos resultados obtidos pelos dois métodos, onde no eixo Y, das ordenadas, aparece a diferença entre as duas variáveis e no eixo X, das abscissas, as médias das duas variáveis. O traço horizontal no centro do gráfico corresponde à média das diferenças das variáveis, que foi -2,83 e o traço superior e inferior aos desvios padrões foi 2,32, para mais e para menos. O limite de 95% de concordância encontrada ficou entre 1,72 e -7.398. Estes resultados mostram que os métodos estudados não concordam entre si, pois a diferença foi estatisticamente significativa. 44 Figura 16: Concordância entre a PCR em tempo real in-house X COBAS® AmpliPrep-COBAS TaqMan® HBV Test (Roche), através da metodologia de BlandAltmann. Esse gráfico foi gerado pelo programa GraphPad Prism 5.0 6.5 Resultado da amplificação do gene S pela PCR convencional Das 61 amostras submetidas à amplificação do gene S pela PCR convencional, 35 (57,3%) foram DNA-VHB positivas e 26 (42,6%) foram DNA-VHB não detectável. Das amostras positivas, 6 (17,14%) foram anti-HDT+ e 1 (2,85%) HIV+. 6.6 Análise filogenética As 35 amostras amplificadas acima foram sequenciadas, obtendo-se um total de 28 sequencias nucleotídicas de boa qualidade para a análise. Utilizadas para genotipagem por análise filogenética. A análise filogenética identificou três grupos genotípicos: A, D e F. O genótipo A foi o mais prevalente, com 67,8% (19/28), seguido de 25% (7/28) do genótipo F e 7,14% (2/28) do genótipo D. A árvore filogenética (Figura 17) foi construída no programa Mega 5.0 (99), utilizando 18 sequências com o fragmento de 680 pb. Foram considerados os valores de bootstrap igual ou superior a 70%. As 10 amostras restantes foram genotipadas diretamente http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi. no link 45 A C D B F G J I H E Figura 17: Árvore filogenética inferida pelo método Neighbor-Joining. O valor de bootstrap foi calculado a partir de 2000 réplicas. A análise envolveu 51 sequencias de nucleotídeos, sendo 31 de referência e um grupo externo (AF046996). As análises evolutivas foram realizadas no programa MEGA v.5 (99) 46 7 DISCUSSÃO 7.1 Características da população estudada Analisando o grupo de 61 indivíduos que participaram do estudo, foi observado um predomínio do gênero masculino em relação ao feminino tanto nos indivíduos residentes em Manaus como em outros municípios. Esse perfil é tradicionalmente descrito na literatura (9; 18; 66; 101). Isso acontece, provavelmente, porque os homens estão mais expostos a situações de risco de infecção pelo VHB, seja pela maior exposição às atividades sexuais de risco ou maior número de parceiros sexuais ou pelo compartilhamento de objetos cortantes como lâminas de barbear. (1; 7; 18). Quando a população estudada foi estratificada por faixa etária, os resultados obtidos mostraram que a maioria dos portadores encontravam-se na faixa etária entre 21 a 30 anos, os chamados jovens adultos. Estudos realizados anteriormente (102) relatavam nessa faixa etária um maior de portadores da hepatite B. Entretanto, na última pesquisa realizada em 2010 pelo MS, observou uma mudança desse perfil, a faixa etária que agrega o maior percentual dos casos, atualmente, é a do grupo dos adultos de 40 a 49 anos (18). Isso provavelmente se deve a mudanças de comportamento sexual da população que tem acontecido nos últimos anos. Pois enquanto os jovens adultos parecem estar se conscientizando do risco de exposição às doenças sexualmente transmissíveis ou ainda porque foram corretamente vacinados na infância, os indivíduos adultos, que provavelmente não foram vacinados na infância e as mulheres que além de estarem mais independentes estão na fase da menopausa, sem o risco de gravidez e consequentemente, sem uso de preservativo. Em nosso estudo, esse grupo de 40 a 49 anos apareceu em segundo lugar. Quanto à naturalidade dos indivíduos participantes do estudo, verificou-se que 67,2% das 61 amostras coletadas no ambulatório de Hepatites Virais da FMT-HVD foram de indivíduos naturais de Manaus e 32,7% de indivíduos que moram em municípios do interior do Amazonas e do estado de Rondônia. Além de Manaus, os municípios que se destacaram foram Tapauá, com 4 indivíduos, e Lábrea, com 3 47 indivíduos, ambos na calha do Rio Purus. Estes resultados estão de acordo com a literatura, onde diversos autores caracterizam essas regiões como áreas de média e alta endemicidade da doença no Estado do Amazonas (32; 33; 66). 7.2 Avaliação do ensaio da qRT-PCR in-house O desenvolvimento da técnica de amplificação de seguimentos de DNA utilizando a PCR convencional abriu novas perspectivas não só para a análise de genes como na utilização em diagnóstico de agentes infecciosos, dentre estes o vírus da hepatite B. O constante avanço de novas tecnologias permitiu o desenvolvimento de uma versão ainda mais poderosa, a PCR em tempo real, técnica capaz de detectar e determinar em tempo real a carga viral de patógeno em amostras clínicas. A possibilidade de monitorar a carga viral dos agentes infecciosos em amostras clínicas revolucionou o diagnóstico de patógenos. Uma vez que já é possível tanto monitorar a eficiência do tratamento como o momento de iniciar a terapia. Dentre as vantagens dessa técnica estão à facilidade dos protocolos usados, maior sensibilidade, maior precisão, reprodutibilidade, menor risco de contaminação e velocidade de análise, inclusive com versões totalmente automatizadas. O ensaio para determinar a carga viral do VHB no soro humano é, atualmente, uma ferramenta importantíssima, sobretudo, na avaliação dos pacientes em tratamento. O monitoramento da carga viral pode prever a evolução da doença para uma cirrose ou carcinoma hepatocelular, bem como uma resposta rápida em relação à adesão ao tratamento. Neste estudo utilizou-se a PCR em tempo real para o desenvolvimento de um ensaio para quantificação absoluta do DNA-VHB em amostras clínicas interpolando os resultados aos de uma curva padrão externa. A confecção dessa curva foi realizada a partir de uma amostra com carga viral elevada inserida em vetor pCR®4TOPO TA Cloning e posterior diluições seriadas, salientando que existem algumas limitações para a obtenção da curva padrão em laboratório utilizando plasmídeos, uma vez que eles são altamente contaminantes. O uso de amostras com carga viral 48 elevada seria a melhor opção, no entanto, elas são de difícil obtenção. Outra opção seria o uso de painéis de carga viral comercial, porém, esses apresentam alto custo financeiro, pois a maioria é via importação. Uma vez que os atuais protocolos terapêuticos baseiam suas decisões de continuidade ou não de tratamento a partir dos resultados da carga viral, um teste quantitativo deve ter precisão suficiente para servir de referência segura a esta decisão. A curva padrão obtida, composta de 7 diluições logarítmicas de plasmídeo, apresentou um slope de -3,47, o que indica uma excelente eficiência e apresentou boa sensibilidade, possibilitando a obtenção de resultados quantitativos para uma ampla faixa de valores. Quando as médias do coeficiente de variação da curva padrão e do inter-ensaio foram comparadas, observamos que houve uma diferença significativa entre ambas, indicando que não houve boa reprodutibilidade da curva padrão, entretanto, pela análise ANOVA não ocorreu diferença significativa na repetibilidade do teste. Essa avaliação não invalida nossa curva padrão, pois, o frequente descongelamento da curva padrão para as realizações dos ensaios de qRT-PCR, pode ter influenciado no coeficiente de variação. Além do mais, as três pessoas escolhidas para realizar a análise inter-ensaio possuem técnicas de trabalho diferente, com pouca experiência com a técnica da PCR em tempo real, e, embora o protocolo para as três tenha sido o mesmo, isso também pode ter contribuído na variação do teste inter-ensaio. Com relação aos reagentes, optou-se pelo uso da sonda TaqMan-MGB, uma variação da TaqMan, por ser mais específica, sensível, precisa e ter uma boa reprodutibilidade. Em 2005, para avaliar a eficácia das sondas TaqMan-MGB, Zhao, JR. e colaboradores realizaram um estudo com 50 amostras HBeAg+ e 50 amostras HBsAg+ e concluíram que essas sondas possuíam uma excelente detecção para o DNA-VHB já que nas HBeAg+ a detecção foi possível em 100% das amostras e nas HBsAg+ em 72% (103). Em nosso estudo, das 61 amostras, a detecção com a sonda TaqMan-MGB foi possível em 62,2%, o que confirma o resultado obtido pelo outro pesquisador. 49 7.3 Comparação entre a PCR em tempo real in-house e o kit comercial COBAS® AmpliPrep/COBAS TaqMan® HBV Test Segundo Bland & Altmann, para a validação de um método, é necessário que este seja comparado com outro já existente. Estudos anteriores realizavam essa validação através da análise de correlação, porém, na visão de Bland & Altmann esse tipo de análise não avaliava a concordância entre os métodos e sim a associação, coisas que são bem diferentes. Então esses pesquisadores introduziram o método estatístico de Bland-Altmann que serve para validar duas variáveis, que meçam a mesma quantidade. Os resultados são apresentados em um gráfico de dispersão onde no eixo Y aparece a diferença entre os dois métodos e no eixo X aparece a média das diferenças (100). No nosso estudo as variáveis são os resultados obtidos pelo método in-house e pelo kit comercial Cobas. Há, portanto, dois parâmetros analisados: o primeiro é o eixo Y, cuja diferença de concordância entre os dois métodos foi igual a -5,67 e o eixo X, cuja média da diferença dos resultados obtidos foi igual a -2,83. Valores próximos à zero na média das diferenças significam perfeita concordância, e quanto menor for o valor, maior é a concordância. Na análise de correlação de Pearson, encontrou-se pouca correlação (r=0,22) entre a técnica de qRT-PCR in-house desenvolvida nesse estudo e o kit comercial COBAS® Ampliprep/COBAS TaqMan® HBV Test, utilizado na rotina da FMT-HVD. Na análise de concordância de Bland-Altmann os resultados obtidos mostraram que os métodos analisados não têm concordância um com o outro, pois a diferença é estatisticamente significativa. Esses resultados não invalidam a nossa metodologia, uma vez que ocorreram muitos fatores que acabaram prejudicando nosso método. Um dos fatores que podem ter contribuído fortemente para a pouca correlação e concordância, pode ser a qualidade das amostras utilizadas, decorrente do excesso de manipulação. Pois as amostras foram às mesmas utilizadas nas reações de PCR convencional e na PCR em tempo real. Isto é, foram constantemente congeladas e descongeladas, enquanto as amostras utilizadas no COBAS Ampliprep só foram descongeladas uma única vez, no momento do seu uso. Na literatura é descrito que o material extraído deve ser processado o mais rápido 50 possível e não deve passar por mais de quatro ciclos de congelamento e descongelamento (83), pois isso contribui para a degradação do DNA. Além do mais, diferentes lotes de sondas e reagentes foram utilizados em nossas reações. Outro fator que deve ser levado em conta é a quantidade de plasma utilizada na extração de DNA. Enquanto no método comercial utiliza-se 1 mL de plasma, no método in-house foi utilizado 200 µL, isto é, uma quantidade 5 vezes menor que a do método comercial. Este volume foi estabelecido de acordo com as recomendações do protocolo de extração do kit utilizado. Cabe reforçar que os resultados de concordância e correlação mostrados anteriormente não invalidam nosso método, pois, mesmo com a pouca quantidade de plasma utilizada em nossa extração, conseguimos positividade em 62,2% das 61 amostras analisadas na qRT-PCR. Em busca de dados que pudessem corroborar nossos achados e recomendações para a sua aplicação na rotina, verificamos na literatura que um método semelhante foi desenvolvido para a detecção do vírus da hepatite C (VHC) onde foram comparados vários métodos de quantificação do RNA do VHC. Os resultados deste estudo demonstraram que a discrepância dos valores de cargas virais apresentados entre os testes não permite que os mesmos sejam utilizados de maneira intercambiável, mesmo que a sensibilidade e especificidade dos métodos sejam boas, sugerindo-se que cada centro defina a metodologia que vai utilizar rotineiramente e, a partir de então, avalie as variações na carga viral dos pacientes somente com a metodologia definida (104). Isto posto, acredita-se que os valores de correlação e concordância entre as duas metodologias poderiam ter sido diferentes dos encontrados se tivessem sido realizadas simultaneamente. Isto é, prioritariamente analisadas pela PCR em tempo real e não pela PCR convencional, evitando assim a perda de material genético pelo processo de descongelamento. Outro fator que merece destaque foi mudança de lotes de sondas e reagentes TaqMan durante o desenvolvimento do ensaio, pois embora sejam do mesmo fabricante existe a descontinuidade e padronização dos novos regentes podendo interferir na qualidade do ensaio. 51 7.4 Detecção do DNA-VHB A extração dos ácidos nucleicos é fundamental para a qualidade e confiabilidade de qualquer ensaio. A extração manual é mais trabalhosa e exige total atenção do profissional, passando por várias etapas de manuseio e centrifugação. Já a extração automatizada promove a uniformização das etapas do processo, minimizando variações de rendimento ou de pureza decorrentes do processo manual e reduz o risco de contaminação cruzada. Não exige atenção constante, o que permite ao profissional executar outras tarefas. No presente estudo, os DNA do VHB utilizados nas reações de PCR convencional e na qRT-PCR foram extraídos manualmente utilizando o kit comercial Qiamp DNA Blood Mini kit (Qiagen), amplamente utilizado por pesquisadores em todo mundo (62; 68; 105; 106). Depois de extraídas, as amostras foram quantificadas no espectrofotômetro e a concentração de DNA-VHB obtida variou de 0,9 a 134,9 ng/µL Para a amplificação do DNA-VHB por PCR, vários autores descrevem o método nested-PCR, como sendo o mais sensível e específico para determinar a sua presença (106). Neste estudo, utilizou-se a técnica semi-nested PCR, obtendose um percentual de DNA-VHB em 57,3%, das 61 amostras analisadas. Como todas as amostras coletadas eram de indivíduos HBsAg+, um dos fatores que pode ter contribuído para a não amplificação das amostras restantes foi, provavelmente, devido a baixa concentração de DNA-VHB. Verificando a literatura observou-se que em estudos anteriores com pacientes HBsAg+ também ocorreu esse mesmo problema. Santos e colaboradores, por exemplo, em um estudo de caracterização do VHB com 40 amostras de pacientes HBsAg+, de Rondônia (107) obteve a amplificação em 87,5% das amostras. Enquanto que Dias, em 2012, em um estudo de caracterização do VHB em uma população indígena, com 86 amostras HBsAg+ obteve a amplificação do DNA-VHB somente em 45,3% das amostras analisadas (68). Neste estudo não podemos inferir que a baixa concentração de DNA-VHB obtido na extração seja em decorrência de uma extração ineficiente, pois, essas mesmas amostras foram submetidas a extração do DNA VHB pelo sistema 52 automatizado (COBAS® AmpliPrep-COBAS TaqMan® HBV Test) obtendo-se na detecção um percentual de 49,1% das 61 amostras analisadas. Em análise mais profunda, verificou-se que 13 amostras apresentaram valores de carga viral abaixo do limite de detecção (12 UI/mL), corroborando assim, a hipótese de baixa carga viral nas amostras não detectadas. Outro fator que pode ter contribuído para a não amplificação do DNA VHB de certas amostras pode ser devido ao tamanho do fragmento amplificado que, ainda na nested PCR correspondeu a 680 pb. O que acarreta uma menor sensibilidade do método. Isso pôde ser observado quando utilizamos iniciadores que amplificam um fragmento de 220 pb, onde foram detectadas seis amostras não amplificadas pelo iniciador de 680 pb. Portanto, para detecção do DNA VHB na rotina, sugere-se que se utilizem iniciadores que obtenham fragmentos pequenos, porém, como um dos objetivos desse estudo era a caracterização genotípica, essa amplificação com o iniciador de 220 pb não foi realizada em todas as amostras pois não teríamos um fragmento ideal para analise filogenética. Além disso, alguns pacientes apresentavam co-infecção pelo HIV ou VHD, inclusive fazendo uso de tratamento com antiviral o que pode ter contribuído para a diminuição da carga viral do VHB. Assim, acreditamos que as amostras não amplificadas possuíssem baixa concentração de DNA viral e que, embora a semi-nested PCR seja uma técnica muito sensível amostras que possuem pouca concentração de DNA não são possíveis de amplificar. 7.5 Genotipagem do VHB A genotipagem do VHB, a partir do sequenciamento do seu genoma, é o método mais utilizado para a caracterização dos genótipos. Na literatura, é sugerido que seja feito o sequenciamento completo do genoma e posterior análise filogenética (101). Porém, esse método consome muito tempo, apresenta alto custo e requer programas altamente específicos para a interpretação dos resultados. Neste estudo, foram utilizados pares de iniciadores que permitem a amplificação do gene “S” completo do genoma VHB e a identificação dos genótipos de A-H. 53 No Brasil, estudos de genotipagem do VHB identificaram os genótipos A, D e F, respectivamente, como os mais prevalentes (63; 67; 108; 109). Em 2007, Mello e colaboradores estudaram amostras isoladas das cinco regiões geográficas brasileiras e demonstraram que das 82 amostras da região Norte, em 63,4% o genótipo A era o mais prevalente (67). No Amazonas, em 2001, Oliveira, CM estudou amostras isoladas de indivíduos de diferentes regiões da Amazônia Ocidental Brasileira e identificou o genótipo A em 93,1% das 44 amostras analisadas e em 2008, para um estudo de análise molecular do VHB em pacientes naturais do estado do Amazonas, Oliveira relatou que o genótipo A foi o mais prevalente em 78,4% das 51 amostras analisada (97; 66). Em 2012, um estudo realizado por Dias, AL com amostras da área urbana e de comunidades rurais e indígenas do município de Lábrea, encontrou predominância do genótipo A em 60% das 20 amostras analisadas (68). A prevalência dos genótipos D e F variam bastante em nossa região. Em alguns estudos (67; 110), o genótipo D aparece em segundo lugar, em outros (28; 33; 66), o genótipo F é que aparece em segundo lugar. Contudo, os resultados obtidos nesse estudo comprovam os obtidos por pesquisadores tanto em nível regional como nacional. No presente estudo, a análise filogenética mostrou que 67,8% das amostras pertencem ao genótipo A, 25% ao genótipo F e 7,14% ao D. A árvore filogenética foi construída a partir de 18 sequências que apresentavam fragmento de 680 pb. Nessa análise observou-se que uma sequência (51 VHB-AM) não se agrupou com nenhum grupo genotípico descrito (A-J), sugerindo que provavelmente trate-se de um novo genótipo do VHB, porém, para que isso seja confirmado, necessita-se de novas análises nessa sequência. Com relação à distribuição dos genótipos do VHB no estado do Amazonas, das 19 amostras pertencentes ao genótipo A, 14 eram procedentes do município de Manaus e 5 procediam dos municípios de Coari, Eirunepé, Maués e Tapauá com 2 e 1 indivíduo cada, respectivamente. O genótipo D foi detectado em um indivíduo procedente de Manaus e outro de Coari e o genótipo F, 5 eram procedentes de Manaus e 3 dos município de Lábrea, Tapauá e Tefé. Como a distribuição geográfica dos genótipos do VHB é muito diversa, a caracterização molecular em uma determinada região pode revelar os aspectos da origem do vírus. O genótipo A 54 encontrado nesta região é sugestivo de origem africana ou europeia enquanto o genótipo F sugere origem indígena (40). Alguns estudos evidenciam a relação entre o genótipo e a gravidade da doença (46; 65), porém, no presente estudo, não foi possível relacionar os aspectos evolutivos dos diferentes genótipos identificados com a evolução clínica dos envolvidos. 55 8 CONCLUSÕES Os resultados obtidos no presente estudo nos permitiram fazer as seguintes conclusões: 1. O ensaio de qRT-PCR in house foi padronizado, obtendo-se um sistema com bom desempenho para quantificação da carga viral do DNA VHB em amostras clínicas. Necessitando melhorar a sensibilidade do ensaio e aperfeiçoar o seu desempenhos; 2. A curva padrão obtida foi considerada satisfatória, com eficiência de 99,5% e ampla faixa linear, variando de 10 1 a 107. O limite minimo de detecção do sistema in house foi 17,9 UI/mL (1,60 log10) contra 12,0 UI/mL (1,07 log10) do sistema comercial; 3. O ensaio de qRT-PCR in house permitiu estimar o numero de cópias virais em 38 das 61 amostras analisas. Os valores das cargas virais obtidas variaram de 1,19 log10 a 8,5 log10/mL, abrangendo uma faixa de quantificação de cerca de 7 log; 4. Em relação a sensibilidade do método in house frente ao comercial, embora não tenha apresentado concordância e correlação, o método in house obteve uma boa performace detectando o DNA VHB em 38 amostras contra 43 do método comercial; 5. A detecção do DNA-VHB pela semi-nested PCR foi considerada boa, porém, a metodologia necessita ser melhorada para aumentar a eficiencia, sugerese o uso de iniciadores que amplifiquem fragmentos menor do genoma viral; 6. A análise filogenética mostrou que os genótipos que prevalecem em nossa região são A, D e F; o genótipo A foi o mais frequente, seguido do genótipo F e D. Uma sequência nucleotídica apresentou um perfil sugestivo de um novo genótipo do VHB, pois não se agrupou em nenhum dos grupos filogenéticos usados na análise. 56 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Lavanchy D. Hepatitis B virus epidemiology, disease burden, treatment, and current and emerging prevention and control measures. J Viral Hepat 2004 Mar;11(2):97-107. 2. Valente F, Lago BV, Castro CA, Almeida AJ, Gomes SA, Soares CC. Epidemiology and molecular characterization of hepatitis B virus in Luanda, Angola. Mem Inst Oswaldo Cruz 2010 Dec;105(8):970-7. 3. World Health Organization (US). Programmes and Projects. Immunization service delivery. New vaccines and technologies [acesso 31 mar 2011]. US; 2010. Disponível em < http://www.who.int/immunization_delivery/new_vaccines/hepb/en/index.html > 4. Chavez JH, Campana SG, Haas P. [An overview of hepatitis B in Brazil and in the state of Santa Catarina]. Rev Panam Salud Publica 2003 Aug;14(2):91-6. 5. Francis TI. 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Mestrado em Clínica Médica. 65 10 Anexos. 10.1 Participantes do projeto Sequência Nome Instituição Responsabilidade no projeto 01 Sanmile Cristina N. de Holanda FMT-HVD Mestranda 02 Cíntia Mara C. de Oliveira FMT-HVD Pesquisadora/Bióloga – Orientadora 03 Wornei Silva Miranda Braga 04 Milton Ozório Moraes 05 Márcia da Costa Castilho FMT-HVD UERJ/IOC/FIO CRUZ/FMT-AM FMT-HVD Médico/Pesquisador – Assessoria Clínica e Epidemiológica ColaboradorPesquisador Sênior: Assessoria TécnicaCientífica Pesquisadora/Bióloga 66 10.2 Termo de consentimento GOVERNO DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS GERÊNCIA DE VIROLOGIA TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Aprovação do Estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMTAM, em ___/___/____. O paciente abaixo assinado ou o seu parente próximo abaixo identificado, sob a responsabilidade do investigador ou médico que assina este documento, declara estar ciente após ter lido ou ouvido o presente Termo de Consentimento que lhe informa o seguinte: I. Que está participando de um estudo para o desenvolvimento de um método capaz de quantificar a carga viral (medir a quantidade do vírus que causa a sua doença) no sangue, utilizado no diagnóstico e resposta ao tratamento indicado pelo seu médico, conforme o que se é recomendado pelo Ministério da Saúde do Brasil, a partir dos achados clínicos e exames laboratoriais relacionados à sua doença; II. Que a participação neste estudo é voluntária, e que a recusa em participar não provocará qualquer tratamento diferenciado ou perda de benefícios a que o paciente tenha direito; III. Que, havendo concordância para a participação no estudo, se procederão as seguintes condutas: 1 - Preenchimento da ficha clínica (constando de dados relativos ao paciente e à doença); 2 - Coleta de sangue da veia do braço (5 mL), com uso de agulhas e seringas descartáveis, por profissional qualificado; IV. Após os primeiros teste de laboratório, se houver necessidade e consentimento do participante e/ou seu responsável, o paciente poderá ser contactado para proceder uma nova coleta de sangue; V. Que o médico assistente poderá pedir outros exames como sangue, fezes e urina, dependendo da necessidade e que não terão qualquer relação com a pesquisa; 67 VI. Que, participando do estudo, o paciente ou a família não obterão quaisquer benefícios adicionais além dos já citados (diagnóstico da infecção e/ou doença), podendo desta forma beneficiar outros indivíduos; VII. Que a participação nessa pesquisa é voluntária e o indivíduo receberá todos os cuidados quanto ao tratamento da sua doença. VIII. Uma vez que esse estudo incluirá pacientes que buscam espontaneamente a FMT-AM para assistência médica e todos os procedimentos a serem adotados fazem parte da rotina de investigação dessa instituição. Ao Participar desse projeto, o Sr(a) será assistido, pela Instituição executora, caso ocorra algo referente aos procedimentos do projeto que estará participando, além do direito à assistência integral, terá direito à indenização. IX. Que o material retirado do paciente se destina apenas a quantificação e genotipagem (tipo do vírus) que causa a doença e monitoramento da mesma. X. Que o projeto poderá ser encerrado caso haja discordância por parte do paciente ou que possam prejudicar o sujeito da pesquisa. XI. Que a participação neste estudo será confidencial e os registros ou resultados dos testes relacionados ao estudo serão mostrados apenas aos participantes e aos representantes da FMT-AM, bem como a autoridades normativas estaduais ou nacionais, com o objetivo de garantir informações de pesquisas clínicas ou para fins normativos. A identidade dos participantes permanecerá sempre em confiabilidade. XII. Que o participante e seus familiares têm direitos aos esclarecimentos que julgarem necessários a qualquer período do desenvolvimento deste estudo e será notificado sobre qualquer nova informação relacionada. A coordenadora da pesquisa é a bióloga Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira, e o médico Dr. Wornei Silva Miranda Braga, responsáveis por esta pesquisa, cujo número de telefone é 21273447, terão plena disponibilidade para atender e esclarecer possíveis dúvidas dos participantes; XIII. Que o participante tem o direito de se retirar deste estudo a qualquer momento, sem qualquer retaliação, e também o direito de manter em seu poder cópia assinada deste documento; XIV. Que, por estar devidamente esclarecido sobre o conteúdo deste termo, livremente expressa seu consentimento e/ou do seu responsável para inclusão como participante nesta pesquisa. Você autoriza que seu sangue seja guardado para outros estudos com vírus? ( ) Sim Data: ____/____/_____ ( ) Não ___________________________________________ Nome 68 Assinatura do paciente ou responsável legal: ____________________________________________________ Nome do entrevistador: ____________________________________________________ Assinatura do entrevistador: Impressão datiloscópica 69 10.3 Questionário FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS GERÊNCIA DE VIROLOGIA Questionário Projeto: Desenvolvimento de ensaio para a quantificação da carga viral do vírus da hepatite B, utilizando a PCR em tempo real e avaliação do custoefetivo do método, em uma unidade terciária de saúde no Estado do Amazonas 1- Nome................................................................................................................... 2- Endereço.............................................................................................................. 3- Idade................anos 4- Data do nascimento........./........../.......... 5- Sexo [ ] MAS 6- Local de nascimento................................................................. 7- Procedência .............................................................................. 8- Tempo em que vive neste local ................................................ [ ] FEM Razões para mudança: ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ASPECTOS SOCIO-ECONÔMICOS 70 10.4 Relatório de aprovação do projeto CEP
