producao de biodiesel - TCC On-line

PRODUÇÃO DE BIODIESEL UTILIZANDO LIPASES DE FUNGOS ENDOFÍTICOS
Autores:
VANIA
CAROLINE
SABINO
CASAGRANDE1,
2
MARIA
LUIZA
FERNANDES
3
RODRIGUES , CARLOS EDUARDO DELAY .
1- Acadêmica do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade
Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR);
2- Dra. em Química Orgânica, Profa. Co-Orientadora e Adjunto da Faculdade de Ciências
Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, Paraná, Brasil;
3- Dr. em Química Orgânica, Prof. Orientador e Adjunto da Faculdade de Ciências Biológicas
e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, Paraná, Brasil.
Endereço
eletrônico
para
correspondência:
Maria
Luiza
Fernandes
Rodrigues,
[email protected]
Endereço: Rua Alferes Poli, 271, apto 1505, centro, Curitiba-PR
CEP: 80230-090 Telefone: 41 9914-55-43
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RESUMO:
Fatores de ordem econômica e ambiental fizeram com que pesquisadores do mundo todo
voltassem sua atenção à produção de combustíveis alternativos ao uso do petróleo. O
biodiesel é um combustível obtido de fontes renováveis para geração de energia. Seu uso está
em ascensão tanto pela escassez do óleo diesel tradicional quanto pelos impactos negativos ao
meio ambiente, sendo este o fator determinante para o emprego do biodiesel. Uma das
maneiras de se obtê-lo é através da síntese de ésteres via processo enzimático, o qual se utiliza
de lipases para seu processo de produção, devido ao seu alto poder catalítico. As lípases são
enzimas que catalisam reações de esterificação e transesterificação em meio orgânico,
operando em condições suaves de temperatura e pressão com alta especificidade e
seletividade. O biodiesel provém da reação de transesterificação, principalmente de óleos
vegetais ou gordura animal. Essa reação ocorre reagindo-se um álcool, etanol ou metanol,
com óleo na presença de um catalisador para haver a formação de ésteres do biodiesel e
glicerina como subproduto. O objetivo deste trabalho foi testar a eficiência de catalisadores
biológicos (lipases) produzidos pelo fungo endofítico Penicillium sp., isolado das folhas da
erva mate (Ricinus communis L.) para a produção do biodiesel, utilizando o óleo de soja
utilizado em frituras como substrato. A reação de transesterificação foi acompanhada através
da cromatografia em camada delgada (CCD) com visualização em câmara de UV (254 nm) e
revelação em Iodo sublimado. A produção de ésteres do biodiesel foi observada a partir de 24
h de reação
Palavras-chave: Biodiesel, transesterificação e biocatalisadores.
ABSTRACT
Factors of economic and environmental researchers have made the world turn their attention
to the production of alternative fuels to the use of oil. Biodiesel is a fuel obtained from
renewable sources for power generation. Its use is on the rise because of shortages of both
traditional and diesel by the negative impacts to the environment, which is the determining
factor for the use of biodiesel. One of the ways to get it is through the synthesis of esters by
enzymatic process, which is used for lipase production process due to its high catalytic power.
The lipases are enzymes that catalyze esterification and transesterification reactions in organic
medium, operating in mild conditions of temperature and pressure with high specificity and
selectivity. The Biodiesel comes from the transesterification reaction, mainly from vegetable
oils or animal fat. This reaction occurs by reacting an alcohol, ethanol or methanol, with oil in
the presence of a catalyst to bring about the formation of esters of biodiesel and glycerin as
byproduct. The objective of this study was to test the efficiency of biocatalysts (lipases)
produced by endophytes fungus Penicillium sp., isolated from the leves of yerba mate (Ilex
paraguariensis St.Hill.) for production of biodiesel using soybean oil used for frying as a
substrate.The transesterification reaction was monitored by thin layer chromatography (TLC)
visualization chamber with UV (254 nm) and iodine sublime revelation. The production of
biodiesel esters was observed after 24 hours of reaction.
Keywords: Biodiesel, transesterification and biocatalysts.
1. INTRODUÇÃO
Durante muito tempo os fungos foram considerados como vegetais e, somente a partir
de 1969, passaram a ser classificado em um reino à parte denominado reino Fungi. Os fungos
são seres vivos eucarióticos, mononucleares ou multinucleares, uni ou pluricelulares,
heterotróficos, aclorofilados, nutrem-se através de matéria orgânica morta ou viva, sendo eles
fungos saprófitos ou parasitários, podendo ser também insetívoros, o qual libera uma
exoenzima ou helmintívoros cujo libera uma substância tranquilizante (Soares & Ribeiro,
2001).
Embora, popularmente os fungos sejam considerados prejudiciais tanto a saúde
vegetal quanto animal, são extremamente importantes para que processos biotecnológicos
ocorram, dentre eles a produção do biodiesel. O biodiesel nada mais é do que um combustível
renovável e biodegradável obtido a partir da reação química de lipídios, de origem animal
através de sebo bovino, suíno, de aves e de vegetais tais como mamona, soja, canola, palma,
girassol, amendoim entre outros. Também podem ser utilizados óleos de frituras (Urgel et al.,
2001).
Umas das vantagens desse combustível é que a queima do biodiesel não contribui para
o aumento de dióxido de carbono na atmosfera, proporcionando assim um equilíbrio entre a
emissão dos gases pelos automóveis e a absorção das plantas, e também possui propriedades
de combustão muito semelhantes as do óleo diesel de petróleo (Knothe et al., 2006).
Os fatores ambientais, geográficos e políticos juntamente com a elevação dos preços
do petróleo favorecem a expansão do mercado de produtos combustíveis derivados de
biomassa em âmbito mundial, predominando o etanol para uso em automóveis, e biodiesel
para caminhões, ônibus, tratores, transportes marítimos, aquaviários e em motores
estacionários para a produção de energia elétrica (Suarez & Meneghetti, 2007).
Esse movimento foi empreendido mais fortemente pela Europa, EUA e Brasil, que
apostaram em fontes renováveis para assegurar insumos energéticos com autonomia e
regularidade de fornecimento associados a menores custos. A introdução do Biodiesel no
Brasil iniciou-se timidamente em 2005, e se expande ao longo dos anos com previsão
otimista, desde que superados os desafios impostos para a consolidação do mercado
(SUAREZ & MENEGHETTI, 2007).
O objetivo deste trabalho é qualificar a produção dos ésteres de biodisel, tendo como
substratro o óleo de soja utilizado em frituras, produzidos através de reação de biocatálise
realizada pela atividade enzimática de fungos endofíticos.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no laboratório de fermentação da Universidade
Tuiuti do Paraná, na Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde – Campus Barigui.
2.1. Micro-organismos
O micro-organismo utilizado neste trabalho foi o fungo endofítico isolado das folhas
da erva-mate (Ilex paraguariensis St.Hill), caracterizado por microcultivo como Penicillium
sp., que foi gentilmente cedido pelas Professoras Pesquisadoras Msc. Roseli Mello e Dra.
Maria Luiza M. Fernandes, do laboratório de Microbiologia da Universidade Tuiuti do
Paraná.
2.2. Esterilização de meios e equipamentos
Para garantir o crescimento dos micro organismos em condições estéreis, os meios
sólidos de propagação do inóculo e de produção, assim como todos os materiais utilizados
foram esterilizados em autoclave a 121 ºC por um período de 15 min.
2.3. Estoque e manutenção de cepas
As cepas foram inoculadas em meio BDA e incubadas por 7 dias a 28 ºC, fazendo-se
repiques mensais, sendo após o crescimento mantidas sob refrigeração a temperatura de 4 ºC.
2.4. Fermentação no estado sólido
2.4.1. Preparação dos Substratos
Nestes estudos foram utilizados como substratos as sementes de girassol (Helianthus
nnuus L.) que possuem alto valor lipídico. Este substrato foi utilizado na FES para a produção
de lipases, cujo qual foi seco a temperatura de 55-60 ºC em estufa por 24h. Após a secagem
do substrato, foi moído, tamisado e embalado em sacos plásticos, sendo utilizadas as frações
do substrato com granulometria de 1mm de diâmetro para os estudos de FES.
Todos os experimentos de produção da enzima foram realizados pelos alunos de
graduação do 4º período do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia.
2.4.2. Condições de cultivo no meio sólido
Os experimentos foram realizados nas condições otimizadas previamente pela exaluna de graduação, da turma de 2010/02 do curso de Tecnologia em Bioprocessos e
Biotecnologia, Renata Amorim.
Os ensaios de FES foram realizados conforme metodologia descrita por Fernandes
(2006). Após crescimento do fungo em ágar BDA por 7 dias, os esporos foram suspensos em
solução de tween 80 (0,001% v/v) e submetidas a agitação, até a obtenção de uma solução
homogênea. A concentração de esporos foi determinada por contagem em câmara de
Neubauer.
A fermentação foi conduzida em frascos erlenmeyers de 125 mL, com 10 g de
substrato sólido e umidade de 60 %, mantida por tampão fosfato 0,1 M pH 7,0. Neste meio foi
inoculado assepticamente a solução de células na concentração de 107 esporos/gSS. Os
erlenmeyers foram incubados em shaker a 30 ºC e retirados após 72 horas de fermentação
(Fernandes, 2006).
A produção de lipase foi acompanhada pela dosagem da atividade lipolítica no
material fermentado. A atividade lipolítica foi expressa como unidades de atividade
enzimática por grama de sólido fermentado (U/gSS).
2.4.3. Secagem do sólido fermentado
O sólido fermentado foi congelado a 0°C por 24 horas para interromper o crescimento
fúngico. Após a secagem do sólido em estufa a 30 ºC por 48 horas e acondicionado em sacos
plásticos, cujos quais foram armazenados em temperatura ambiente.
2.5. Biocatálise: Estudo da reação de síntese de ésteres de biodiesel
Os estudos de síntese foram realizados utilizando-se o sólido fermentado (adição
direta). A biocatálise ocorreu com o material fermentado contendo a enzima lipase. A
fermentação em estado sólido (FES) ocorreu a 30 ºC, mistura de 10 g de farelo de semente de
girassol, contendo 60% de umidade. No pico máximo de produção da enzima, que é relativo
ao período de 72 horas, a fermentação foi interrompida e o material fermentado foi seco em
estufa a 30 ºC. Estudos cinéticos foram realizados para a verificação de síntese dos ésteres de
biodiesel.
Ensaios foram realizados adicionando-se quantidade fixa do material fermentado e
seco (3 g), em 30 mL de n-hexano, a 30 ºC, com razão molar (álcool-óleo) 6:1 e da atividade.
2.5.1. Óleo de soja
O óleo de soja (Glycine max L. Merr.), utilizado para a realização da fritura de
alimentos, foi o substrato de escolha para os experimentos.
2.6. Adição Direta do Material Fermentado
Estudos cinéticos utilizando-se a lipase como catalisador da reação foram realizados
para a verificação de síntese dos ésteres de biocombustível.
O substrato utilizado foi o óleo de soja (70 mM) utilizado no processo de fritura de
alimentos e o álcool etílico (420 mM).
As reações foram realizadas em Shaker nas seguintes condições: 30°C, 180 rpm, em nhexano como solvente. O monitoramento da reação foi acompanhado durante 120 h, sendo
retiradas alíquotas do meio reacional nos intervalos de tempo zero até 120 h. A
transesterificação do óleo de soja para síntese de ésteres foi avaliada qualitativamente por
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) (AMORIM, 2010).
2.7. MÉTODOS ANALÍTICOS
2.7.1. Ensaio Enzimático
Método Titulométrico
Os ensaios de atividade frente à triacilgliceróis foram realizados utilizando-se o óleo
de oliva como substrato. A dosagem da atividade enzimática foi determinada pelo método
titulométrico descrito por Franken (2007), com adaptações. Para as dosagens foi preparada
uma emulsão contendo óleo de oliva (7,15 % m/v) emulsificada em goma arábica (10 % m/v)
em tampão fosfato pH 7,0.
O ensaio foi realizado em erlenmeyers de 125 mL, adicionando-se 20 mL da emulsão
e 3 g do sólido fermentado, obtido conforme item 2.4.2. As amostras foram incubadas em
Shaker, sob agitação, por 15 min a 30°C. A reação foi paralisada adicionando-se 15 mL de
solução de etanol/acetona (1:1 v/v). Os ácidos graxos liberados foram titulados em solução de
NaOH (0,05 N) até pH 10.
Os brancos reacionais foram preparados adicionando-se no início da reação, a solução
etanol/acetona (1:1 v/v) ao meio reacional contendo 3 g do material sólido fermentado.
Uma unidade de atividade lipolítica foi definida como a quantidade de enzima que
libera 1 mM de ácido graxo por minuto nas condições descritas acima, sendo o resultado
expresso em unidades por grama de substrato sólido (U/gSS).
2.7.2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Cada alíquota foi retirada do meio reacional nas reações de síntese de ésteres do
biodiesel, nos intervalos de zero até 120 h, a cada 24 h e aplicada em uma cromatoplaca
contendo fluoresceína (Merck), com auxílio de um tubo capilar. Após este processo, as
cromatoplacas foram transferidas para uma cuba de vidro hermeticamente fechada contendo
hexano, éter etílico e ácido acético na proporção 7:3:0,1 (v/v/v) respectivamente, como fase
móvel. As cromatoplacas foram retiradas da cuba de vidro e evaporadas a temperatura
ambiente para posterior visualização das manchas.
As placas foram primeiramente visualizadas em câmera UV a 254 nm. Em seguida,
foram reveladas com iodo sublimado (I2). As manchas apareceram gradativamente em
decorrência da interação do iodo com os componentes das amostras.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. BIOCATÁLISE: REAÇÃO DA SÍNTESE DE ÉSTERES DE BIODIESEL
Estudos cinéticos foram realizados para a verificação de síntese dos ésteres de
biodiesel, como oleatos, palmitatos e linolenatos.
Ensaios foram realizados com proporções fixas do material fermentado e seco, em nhexano, a 30 ºC.
As lipases são enzimas que atuam na quebra de lipídeos e óleos, liberando ácidos
graxos, monoacilgliceróis, digliceróis e glicerol (MENONCIN et al, 2010).
A Transesterificação é um termo usado para descrever uma importante classe de
reações orgânicas onde um éster é transformado em outro através de uma reação química com
um álcool, e tendo como subproduto a glicerina (Figura 1). O álcool a ser utilizado geralmente
é escolhido pelo menor preço. A maioria dos países usa o metanol, porém, existem exceções
como o Brasil, que utiliza o etanol obtido pela fermentação da cana-de-açúcar (IEL, 2008).
Atualmente essa reação tem sido bastante estudada, pois o seu principal produto
(éster) possui características muito semelhantes ao diesel do petróleo, podendo então ser
utilizado puro ou misturado ao diesel fóssil, o comumente conhecido Biodiesel. Essa reação
também é conhecida como alcoolize.
Na transesterificação de óleos vegetais, um triacilglicerídeo reage com um álcool na
presença de uma base ou ácido forte, produzindo uma mistura de ésteres de ácidos graxos e
glicerol. O processo geral é uma seqüência de três reações consecutivas, na qual mono e
diacilglicerídeos são formados como intermediários (GERIS et al., 2007).
Os ésteres de cadeia longa são componentes de muitos produtos industriais como
cosméticos, lubrificantes e flavorizantes. Além disto, estes compostos são encontrados em
combustíveis fósseis e em atmosferas poluídas, e, portanto, desempenham uma função
importante nos estudos do meio ambiente. Fernandes et al. (2007) realizou reações de síntese
do éster oleato de etila (éster do biodiesel) e transesterificação de óleos vegetais (produção de
biodiesel) catalisadas por uma lipase bacteriana produzida por FES.
Durante o processo foram coletadas alíquotas nos seguintes tempos: 0, 24, 48, 72, 96 e
120 h. As reações de síntese foram acompanhadas por CCD.
Foi possível observar que a lipase catalisou as reações de síntese do éster do biodiesel,
a partir de 24 h de reação, conforme pode ser visualizado na Figura 02 e 03.
Os ésteres do biodiesel, sendo pouco polares, interagem mais com a fase móvel e
pouco com a fase estacionária (sílica). As manchas correspondentes aos ésteres podem ser
visualizadas no topo da cromatoplaca.
4. CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos nas cromatoplacas conclui-se qualitativamente que a
transesterificação do óleo de soja catalisada pela enzima do fungo endofítico Penicillium sp.
foi eficaz, havendo formação dos ésteres do biodiesel a partir das primeiras 24 horas de
reação. Os resultados obtidos foram significativos no que diz respeito à formação dos
produtos desejados devido à alta seletividade e especificidade dessa rota sintética.
Embora os dados obtidos em laboratório revelem uma grande versatilidade e potencial
de utilização deste sólido fermentado, contendo lipases, em reações de transesterificação,
sugere-se a continuidade dos experimentos, com intuito de quantificar os ésteres do Biodiesel.
Poderão ser realizados experimentos com cromatografia preparativa para isolar os
ésteres e em seguida quantificá-los por cromatografia de alta eficiência (CLAE) ou
cromatografia gasosa (CG).
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ANEXOS:
Figura 1. Reação de transesterificação de triglicerídeos com álcool. FONTE: LÔBO, 2009.
Figura 02: Manchas visualizadas em Câmara de UV. Condições experimentais: Razão molar
álcool/óleo 6:1,100 U (atividade enzimática), após 24 h de reação.
Figura 03: Manchas reveladas em Iodo sublimado (I2). Condições experimentais: Razão molar
álcool/óleo 6:1,100 U (atividade enzimática), após 24 h de reação.
Figura 04: Manchas visualizadas em Câmara de UV. Condições experimentais: Razão molar
álcool/óleo 6:1,100 U (atividade enzimática), após 120 h de reação.
Figura 05: Manchas reveladas em Iodo sublimado (I2). Condições experimentais: Razão molar
álcool/óleo 6:1,100 U (atividade enzimática), após 120 h de reação.