resumo expandido 139/239 influência do crescimento bacteriano

RESUMO
19ªEXPANDIDO
RAIB
139/239 99
INFLUÊNCIA DO CRESCIMENTO BACTERIANO NAS CARACTERÍSTICAS DO LEITE
DE BOVINOS DA RAÇA JERSEY, CRIADOS NO ESTADO DE SÃO PAULO
J.S. Nogueira*, R.F.S. Raimondo, E.H. Birgel Junior
Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Clínica Médica, Centro de Pesquisa e Diagnóstico de Enfermidades de Ruminantes, Av. Prof. Dr. Orlando Marques de
Paiva, 87, CEP 05508-900, São Paulo, SP, Brasil. E-mail: [email protected]
RESUMO
Com a finalidade de estabelecer a influência do crescimento bacteriano nas características
físico-químicas e celulares do leite de bovinos da raça Jersey, criados no Estado de São Paulo,
examinaram-se 375 amostras de leite, sendo 236 amostras provenientes de quartos mamários
sadios sem crescimento bacteriano e 139 amostras obtidas de quartos mamários sadios com
crescimento bacteriano. O leite foi colhido assepticamente antes da ordenha e os seguintes
parâmetros avaliados: pH, eletrocondutividade, cloreto, lactose, índice cloretos/lactose, gordura, proteína, sólidos totais e contagem de células somáticas. Demonstrou-se a significativa
influência do isolamento bacteriano nos valores de pH, eletrocondutividade, cloretos, lactose,
índice cloreto/lactose e do número de células somáticas, sendo que a resposta orgânica era
dependente da patogenicidade do agente etiológico, pois bactérias do gênero Staphylococcus
não determinaram alterações significativas na composição físico-química do leite; bactérias do
gênero Corynebacterium determinaram alterações restritas à diminuição do valor da lactose e
aumento do indice cloretos/lactose, enquanto bactérias do gênero Streptococcus foram responsáveis pelo aumento dos valores do pH, da eletrocondutividade, do teor de cloretos e do índice
cloretos/lactose e diminuição do teor de lactose. O aumento do número de células somáticas
foi de menor magnitude nas amostras de leite nas quais foram isoladas bactérias do gênero
Staphylococcus e Corynebacterium e de maior expressão quando foram isoladas bactérias do
gênero Streptococcus.
PALAVRAS-CHAVE: Leite, características físico-químicas, células somáticas, bovinos, crescimento
bacteriano.
ABSTRACT
INFLUENCE OF BACTERIAL GROWTH ON CHARACTERISTICS OF MILK FROM JERSEY
COWS, RAISED IN THE STATE OF SÃO PAULO, BRAZIL. With the aim to determine the
influence of bacterial growth on the physico-chemical and cellular characteristics of milk from
jersey cows raised in the São Paulo State, Brazil, 375 milk samples were examined: 236 were
obtained from healthy mammary glands without bacterial growth and 139 were obtained
from healthy mammary glands with bacterial growth. Milk samples were collected aseptically
before milking and the following parameters were evaluated: pH, eletroconductivity, chlorate,
lactose, chlorate/lactose ratio, fat, proteins, total solids and somatic cell count. Significant
influences of the bacterial growth were demonstrated in pH values, eletroconductivity, lactose,
chlorate/lactose ratio, and the somatic cell count; the response from the body was different
according to the pathogenicity of the agent, since Staphylococcus did not determine significant
changes in the physico-chemical composition of the milk. Corynebacterium determined changes
restricted to the decrease of the lactose value and the increase of the chlorate/lactose ratio,
while Streptococcus were responsible for the increase of pH values, eletroconductivity, chlorate,
and the chlorate/lactose ratio and decrease of the lactose level. The increase of somatic cell
number was less in the milk samples with Staphylococcus and Corynebacterium, and higher
when Streptococcus was isolated.
KEY WORDS: Milk, physico-chemical characteristics, somatic cells, cattle, bacterial growth.
*Bolsista de Iniciação Científica da Fapesp Proc. Nº 04/06772-6.
Biológico, São Paulo, v.68, Suplemento, p.99-103, 2006
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INTRODUÇÃO
A influência do crescimento bacteriano nos constituintes do leite foi inicialmente descrita por
VANLANDINGHAM et al. (1941). Esses autores verificaram que os valores médios de cloretos no leite de quartos sadios sem crescimento bacteriano (124 mg/dL)
eram menores do que os teores observados em animais com crescimento bacteriano (150 mg/dL) enquanto nos teores de lactose ocorria o inverso, ou seja,
no leite de quartos mamários infectados eram encontrados valores menores (4,36 ± 0,06 g/dL) do que os
observados no leite de quartos mamários sadios sem
crescimento bacteriano (4,79 ± 0,01 g/dL).
LEVAN et al. (1985) avaliaram o efeito da infecção
intramamária por Corynebacterium bovis no leite e não
observaram diferença significante nos teores de gordura e proteína, porém constataram uma significativa influência do crescimento bacteriano no número
de células somáticas, uma vez que os valores obtidos
em amostras com crescimento bacteriano (119.000
células/mL) foram maiores do que aqueles observados em amostras sem crescimento bacteriano (79.000
células/mL).
BERNIG & SHOOK (1992) verificaram, em amostras com
crescimento bacteriano, valores de lactose que variavam de acordo com o agente bacteriano isolado, obtendo para amostras com isolamento de Staphylococcus
coagulase positivos ou Streptococcus valores iguais a
4,75 ± 0,42 g/dL e para amostras com isolamento de
Staphylococcus coagulase negativos ou Corynebacterium
bovis valores iguais a 4,88 ± 0,35 g/dL.
ESTRELLA (2001) avaliando a influência do isolamento bacteriano observou que as alterações nas características físico-químicas e celulares estavam restritas aos valores do pH e do número de células
somáticas, pois em amostras de leite em que houve
crescimento bacteriano forma encontrados valores de
pH (6,64 ± 0,169) maiores do que os observados em
amostras de leite sem crescimento bacteriano (6,576 ±
0,155), enquanto o número de células somáticas em
amostras com isolamento bacteriano (283.400 células/mL) foi maior do que o observado em animais
sem isolamento bacteriano (45.000 células/mL).
Em amostras de leite obtidas de bovinos da raça
Girolando, MARQUES (2003) observou que os valores
médios de pH (6,82 ± 0,206), eletrocondutividade (5,83
± 0,94 mS/cm), cloretos (116,16 mg/dL), índice
cloretos/lactose (2,70 ± 0,930) e número de células
somáticas (638.263 células/mL) em amostras positivas no exame microbiológico eram estatisticamente
maiores do que os valores de pH (6,74 ± 0,121),
eletrocondutividade (5,30 ± 0,52 mS/cm), cloretos
(93,56 mg/dL), índice cloretos/lactose (2,08 ± 0,624)
e número de células somáticas (109.144 células/mL)
observados em animais negativos no exame
microbiológico. Afora essas alterações, MARQUES (2003)
observou também a diminuição nos valores de lactose
observado em amostras com crescimento bacteriano
(4,30 ± 0,08) em relação aos valores encontrados em
amostras negativas ao exame microbiológico (4,56 ±
0,30 g/dL).
BIRGEL JUNIOR (2006) ao avaliar a influência do crescimento bacteriano no pH do leite observou que os valores em amostras de leite sem isolamento bacteriano
(6,67 ± 0,15) eram menores do que as obtidas em amostras nas quais foram isoladas bactérias do gênero
Staphylococcus (6,80 ± 0,23) e do gênero Streptococcus (6,80
± 0,25), não encontrando diferença significante entre o
pH de amostras sem isolamento bacteriano em relação
àquelas em que foi isolado bactérias do gênero
Corynebacterium (6,74 ± 0,16). Os valores de
eletrocondutividade no leite de quartos sem isolamento bacteriano (5,45 ± 0,65 mS/cm) foram menores do
que aqueles encontrados em quartos nos quais a bactéria isolada foi do gênero do gênero Streptococcus (6,10 ±
0,90 mS/cm), porém não foram observadas diferenças
entre os valores obtidos no leite de quartos sem isolamento e com isolamento de bactérias do gênero
Staphylococcus (5,82 ± 0, 1,10 mS/cm) e do gênero
Corynebacterium (5,67 ± 0,73 mS/cm). Os teores de
cloretos obtidos no leite de quartos sem crescimento
bacteriano (101,66 ± 28,45 mg/dL) foram menores do
que os encontrados em quartos mamários no qual foi
isolada a bactéria do gênero Streptococcus (135,52 ± 45,56
mg/dL), contudo quando se comparou o grupo sem
crescimento bacteriano com os grupos nos quais foram
isoladas bactérias do gênero Staphylococcus (117,45 ±
44,78 mg/dL) e do gênero Corynebacterium (114,06 ±
30,79 mg/dL), não foram observadas diferenças estatisticamente significantes. Em relação aos valores de
lactose, observou-se que os menores valores foram obtidos em amostras de leite com isolamento de bactérias
do gênero Staphylococcus (4,33 ± 0,68 g/dL) e
Streptococcus (4,25 ± 0,71 g/dL), enquanto a comparação dos resultado naquelas amostras nas quais não
houve isolamento bacteriano (4,62 ± 0,43 g/dL) não
apresentavam diferença estatisticamente significante
com os valores obtidos em amostras com isolamento
de bactérias do gênero Corynebacterium (4,47 ± 0,46 g/
dL). Os teores de proteína de quartos mamários sadios
sem crescimento bacteriano (3,39 ± 0,59 g/dL) foram
menores do que amostras colhidas de quartos no qual
a bactéria isolada foi do gênero Streptococcus (3,78 ±
2,22 g/dL), porém, entre o grupo sem isolamento
bacteriano e os grupos nos quais foram isoladas bactérias do gênero Staphylococcus (3,46 ± 0,57 g/dL) e do
gênero Corynebacterium (3,38 ± 0,65 g/dL) não foram
observadas diferenças estatisticamente significantes.
O número de células somáticas do leite de quartos mamários sadios sem crescimento bacteriano (317.984 ±
1.083.602 520 células somáticas/mL) foi menor do que
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o número observado em quartos mamários sadios , nos
quais isolou-se bactérias do gênero Staphylococcus
(1.808.319 ± 2.430. 520 células somáticas/mL), do gênero Corynebacterium (739.471 ± 1.101.211 células
somáticas/mL) e do gênero Streptococcus (3.654.315 ±
3.770.209 células somáticas/mL).
MATERIAL E MÉTODOS
Com o propósito de se avaliar a influência do isolamento bacteriano nas características físico-químicas e celulares foram utilizadas 375 amostras de leite
colhidas de quartos mamários sadios de fêmeas bovinas da raça Jersey, das quais 236 eram provenientes
de quartos mamários sadios sem isolamento
bacteriano e 139 amostras provenientes de quartos
mamários sadios que apresentaram isolamento
bacteriano no exame microbiológico. Nestas amostras
com isolamento bacteriano verificou-se que em 91
amostras foram isoladas bactérias do gênero
Staphylococcus, em 30 amostras foram isoladas bactérias do gênero Corynebacterium e em 18 amostras foram isoladas bactérias do gênero Streptococcus.
As amostras utilizadas foram colhidas imediatamente antes da ordenha do animal, sendo a seleção
dos animais empregados nessa pesquisa baseada no
exame clínico dos animais e no histórico dos mesmos
(BIRGEL, 2004), não sendo utilizadas amostras provenientes de animais que apresentaram episódios recorrentes de mamite, que no momento da colheita
apresentaram alterações das características
macroscópicas do leite ou perceptíveis durante a
palpação da mama.
Após a anti-sepsia do orifício do teto, utilizando-se
algodão embebido em álcool 70%, foram desprezados
os primeiros jatos de leite, para então realizar a colheita de cerca de 3 mL de leite, em frascos estéreis, os quais
foram utilizados para o exame microbiológico. Em seguida, foram colhidas amostras para determinação dos
valores do pH e cloreto em frascos de plástico
descontaminados de íons, acondicionados em caixas
de isopor e mantidos refrigerados até o momento do
processamento. Na seqüência, para a contagem do
número de células somáticas e determinação dos valores de lactose, gordura, proteína e sólidos totais foram
colhidos cerca de 40 mL de leite em frascos de plástico
contendo 2 pastilhas do conservante bromopol (2bromo-2-nitro-propano-1,3-diol), os quais enviados
para a Clínica do Leite - Departamento de Produção
Animal da ESALQ - USP Piracicaba. Para a determinação dos valores de eletrocondutividade do leite, as
amostras de leite de cada glândula mamária forma colhidas e depositadas diretamente no receptáculo do
equipamento utilizado, sendo o exame efetuado na sala
de ordenha das propriedades.
A determinação do pH foi realizada utilizando-se
um medidor de pH modelo M20 da Digimed, a determinação dos valores de eletrocondutividade foi efetuada, utilizando-se o aparelho Milku Mastitron. A
determinação dos valores de cloretos foi realizada
utilizando-se o analisador de cloretos modelo 925 da
Corning, por titulação coulométrica. A determinação
dos valores de lactose, gordura, proteína e sólidos totais, foi realizada por radiação infravermelha. O índice cloretos/lactose foi obtido mediante a divisão do
valor de cloreto expresso em mg/dL pelo valor da
lactose expresso em mg/dL e multiplicado por 100. A
determinação dos número de células somáticas foi
realizada por citometria de fluxo. Para realização do
exame microbiológico as amostras, foram semeadas
em meio de ágar-sangue de carneiro e incubadas a
37° C, sendo realizadas leituras com 24, 48 e 72h de
incubação. Os exames bacterioscópicos foram realizados em lâminas coradas pelo Método de Gram, sendo os microorganismos isolados e identificados por
provas bioquímicas de acordo com as técnicas descritas por Lennette (1985), e classificados de acordo com
o Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology (KRIEG
& HOLT, 1984).
Para a avaliação da influência do crescimento
bacteriano sobre essas características físico-químicas
e celulares do leite foram, inicialmente, calculados os
valores da média, desvio padrão e a amplitude de
variação. Os resultados foram submetidos à análise
de variância, sendo o contraste das médias analisado
pelo Teste de Duncan; ambos os testes com níveis de
significância igual a 5 % (p £ 0,05), conforme recomendaram SAMPAIO (1998), utilizando-se o programa
de computador SAS - Statistical Analysis System.
RESULTADOS
A analise dos resultados desta pesquisa evidenciou que o isolamento de bactérias no leite é responsável por alterações na síntese de vários constituintes
do leite, entre os quais destaca-se a lactose. Em relação a este parâmetro, foi observada nas amostras de
leite nas quais isolou-se bactérias dos gêneros
Streptococcus e Corynebacterium valores obtidos respectivamente iguais a 3,93 ± 0,32 g/dL e 4,25 ± 0,74 g/
dL, os quais foram significativamente menores do que
aqueles observados em amostras sem crescimento
bacteriano (4,55 ± 0,49 g/dL).
Em continuação ao estudo da influência do isolamento bacteriano nas características físico-químicas
do leite, realizou-se a análise dos valores de pH, de
eletrocondutividade e dos teores de cloretos e de proteína total, procurando assim avaliar a ocorrência e a
intensidade das alterações na permeabilidade
vascular do parênquima da glândula mamária.
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Tabela 1 - Influência do isolamento bacteriano sobre características físico-químicas e celulares do leite de bovinos da
raça Jersey, criados no Estado de São Paulo. São Paulo, 2006.
Variáveis
Sem isolamento
bacteriano
Com isolamento
bacteriano
Staphyloccoccus
Nº de amostras
PH
Eletroc. (mS/cm)
Cloretos (mg/dL)
Lactose (g/dL)
Relação clor/lact
Gordura (g/dL)
Proteína (g/dL)
Sol.totais (g/dL)
CCS (cels/mL)
236
Corynebacterium
91
6,77 ± 0,12a
5,04 ± 0,60 a
97,07 ± 27,33 a
4,55 ± 0,49 a
2,24 ± 1,11 a
2,68 ± 1,50 a
3,83 ± 0,43 a
11,99 ± 1,51a
291.814 ± 851.399 a
Streptococcus
30
6,76 ± 0,12 a
5,27 ± 0,82 a
105,04 ± 35,97 a
4,45 ± 0,55 ab
2,51 ± 1,31 ab
2,62 ± 1,24 a
3,89 ± 0,42 a
11,89 ± 1,38 a
721.225 ± 1.438.484b
6,78 ± 0,112 a
5,24 ± 0,63 a
110,16 ± 33,53 ab
4,25 ± 0,74 b
2,82 ± 1,50 bc
2,85 ± 1,48 a
3,93 ± 0,62 a
11,95 ± 1,33 a
723.967 ± 1.713.008 b
18
6,88 ± 0,11 b
5,73 ± 0,59 b
121,39 ± 24,54 b
3,93 ± 0,32 c
3,15 ± 0,86 c
3,34 ± 0,92 a
3,80 ± 0,36 a
11,90 ± 1,28 a
2.332.111 ± 1.916.876c
a, b, c – letras não coincidentes indicam diferença estatística significante.
Nesta pesquisa observou-se que os valores do pH
do leite sofreram significativa influência do isolamento
bacteriano, pois os valores obtidos nas amostras nas
quais foi feito isolamento de bactérias do gênero
Streptococcus (6,88 ± 0,11) foram maiores do que aqueles observados em amostras sem isolamento
bacteriano (6,77 ± 0,12). Contudo, não foram observadas diferenças estatísticas significativas nos valores
encontrados em amostras nas quais isolou-se bactérias do gênero Staphylococcus (6,76 ± 0,12), do gênero
Corynebacterium (6,78 ± 0,11) e amostras sem isolamento bacteriano (6,77 ± 0,12).
Ao comparar-se os resultados obtidos para a
eletrocondutividade em quartos mamários sadios sem
isolamento bacteriano (5,04 ± 0,60 mS/cm) e em quartos mamários sadios com isolamento bacteriano, observou-se a existência de diferenças estatisticamente
significante para as bactérias do gênero Streptococcus
(5,73 ± 0,59 mS/cm), enquanto para bactérias do gênero Staphylococcus (5,27 ± 082 mS/cm) e
Corynebacterium (5,24 ± 0,63 mS/cm) não foram observadas diferenças significantes.
Relativo aos valores de cloretos obteve-se diferença estatisticamente significante entre os valores obtidos de amostras de leite sem isolamento bacteriano
(97,07 ± 27,33 mg/dL) e de amostras de leite no qual
houve isolamento de bactérias do gênero Streptococcus
(121,39 ± 24,54 mg/dL), não sendo observadas diferenças estatísticas entre amostras sem isolamento
bacteriano e aquelas nas quais isolou-se Staphylococcus
(105,04 ± 35,97 mg/dL) e Corynebacterium (110,16 ±
33,53 mg/dL).
Ao comparar-se os resultados observados para a
relação lactose/cloretos no leite observou-se que os
valores em quartos mamários sadios sem isolamento
bacteriano (2,24 ± 1,11) foram menores do que aque-
les obtidos em quartos mamários sadios com isolamento de bactérias do gênero Corynebacterium (2,82 ±
1,50) e do gênero Streptococcus (3,15 ± 0,86), enquanto
para bactérias do gênero Staphylococcus (2,51 ± 1,31)
não foram observadas diferenças estatisticamente
significantes.
Na presente pesquisa não foram observadas diferenças estatisticamente significante entre os valores
de proteína, gordura e sólidos totais entre as amostras de leite com e sem isolamento bacteriano.
Em relação ao número de células somáticas observou-se nesta pesquisa que independentemente do
gênero de bactéria isolada (Staphylococcus,
Corynebacterium ou Streptococcus ) o número de células
somáticas foi maior do que o observao em amostras
de leite de quartos mamários sadios sem isolamento
bacteriano (291.814 ± 851.399 células /mL). Entretanto
a magnitude dessa influência foi menor quando as
bactérias isoladas eram do gênero Staphylococcus
(721.225 ± 1.438.484 células/mL) ou do gênero
Corynebacterium (723.967 ± 1.713.008 células /mL) e
significativamente maior quando a bactéria isolada
era do gênero Streptococcus (2.332,111 ± 1.916.876 células /mL).
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
O isolamento de cepas bacterianas determinou significativa influência dos resultados das características físico-químicas e celulares do leite, sendo que a
resposta orgânica era dependente da patogenicidade
do agente etiológico, pois:
-bactérias do gênero Staphylococcus não determinaram
alterações significativas na composição físico-química do leite; bactérias do gênero Corynebacterium deter-
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minaram alterações restritas à diminuição do valor
da lactose e aumento do incide cloretos/lactose, enquanto bactérias do gênero Streptococcus foram responsáveis pelo aumento dos valores do pH, da
eletrocondutividade, do teor de cloretos e do índice
cloretos/lactose e diminuição do teor de lactose;
-o aumento do número de células somáticas foi de
menor magnitude nas amostras de leite nas quais foram isoladas bactérias do gênero Staphylococcus e
Corynebacterium e de maior expressão quando foram
isoladas bactérias do gênero Streptococcus.
A avaliação dos resultados obtidos evidenciou que
bactérias do gênero Streptococcus foram responsáveis
por alterações de grande intensidade na composição
da secreção láctea, sendo que o isolamento deste gênero de bactéria foi acompanhada por alterações características físico-química e celular do leite similar
aquelas observadas em animais com mamite. Segundo Birgel Junior (2006) a presença do agente infeccioso na glândula poderia ser fugaz e passageira determinando reações orgânicas mínimas, contudo em
outros casos a colonização bacteriana nos tecidos
mamários poderia ser persistente e duradoura, determinando reações orgânicas mais severas e associadas a significativas alterações do parênquima glandular e evidenciadas alterações nas características
físico-químicas e celulares do leite. Esta seria uma
possível explicação para os diferentes resultados encontrados na bibliografia consultada (VANLANDINGHAM
et al., 1941; LEVAN et al., 1985; BERNIG & SHOOK, 1992;
ESTRELLA, 2001; MARQUES, 2003; BIRGEL JUNIOR, 2006).
REFERÊNCIAS
BERNING, L.M. & SHOOK, G.E. Prediction of mastitis
using milk somatic cell count, N-Acetyl-â-DGlucosaminidase, and lactose. Journal of Dairy
Science, v.75, n.7, p.1840-1848, 1992.
BIRGEL, E.H. Semiologia da glândula mamária de ruminantes. In: FEITOSA, F.L. (Ed.). Semiologia veteri-
nária: a arte do diagnóstico. São Paulo: Roca editora, 2004. p.353-399.
BIRGEL JUNIOR, E.H. Características físico-químicas, celulares e microbiológicas do leite de bovinos das raças
Holandesa, Gir e Girolando criados no Estado de São
Paulo. 2006. 335f. Tese (Livre Docência) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
ESTRELLA, S.L.G. Características físico-químicas e celulares do leite de bovinos da raça holandesa, criados no
estado de São Paulo. Influência da fase da lactação, dos
quartos mamários, do número de lactações e do isolamento bacteriano. 2001. 162 f. Dissertação
(Mestrado em Clínica Veterinária) - Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade
de São Paulo, São Paulo, 2001.
KRIEG, N.R. & HOLT, J.G. (Eds.). Bergey’s manual of
systematic bacteriology. Baltimore: Williams &
Williams, 1984. 964p.
LENNETTE, E.H. (Ed.). Manual of clinical microbiology.
4th ed. Washington, D.C.: American Society for
Microbiology, 1985. 1149p.
LEVAN P. L.; EBERHART R. J.; KESLER E.M. Effects of natural intramammary Corynebacterium bovis infection
on milk yield and composition. Journal of Dairy
Science, v.68, n.12, p.3329-3336, 1985.
MARQUES, R. S. Avaliação das características físico-químicas e celulares do leite de bovinos da raça girolando,
criados no estado de São Paulo. 2003. 167f. Dissertação (Mestrado em Clínica Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2003.
SAMPAIO, I.B.M. Estatística aplicada à experimentação animal. Belo horizonte: Fundação de Ensino e Pesquisa em Medicina Veterinária e Zootecnia. 1998.
221p.
VANLANDINGHAN, A.H.; CHAS, E.; WEAKLEY, J.R.; MOORE,
E.N.; HENDERSON, H.O. Mastitis. I. Relationship of
the development of mastitis to changes in the
chlorine, lactose and casein number of Milk.
Journal of Dairy Science, v.24, n.1, p.383-398, 1941.
Biológico, São Paulo, v.68, Suplemento, p.99-103, 2006
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