Sumário

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Os efeitos de radicias livres em células está geralmente associado a patologia e
morte celular. A patologia é derivada de um desequilíbrio entre a produção de
radicais livres e a capacidade antioxidante, associado à inaptidão da célula de
restabelecer o equilíbrio.
Gâmetas são células muito particulares, na fêmea o número de oócitos já está
estabelecido aquando do nascimento, enquanto que nos machos a produção de
esperma dá-se de forma continua durante a vida reprodutiva.
Durante a diferenciação e maturação, ambos esperma e oócito são alvo de
espécies reactivas de oxigénio e nitogénio (ROS e RNS, respectivamente) que
dentro de certos limites contribuem para a selecção das melhores células
germinais que terão a chance de prosseguir para o último estágio de maturação.
Para além disso, estudos têm demonstrado que dentro de determinadas
concentrações ROS e RNS podem ter um papel nas cascadas de sinalização que
conduzem o esperma à aquisição de capacidade fertilizadora e os oócitos na
progressão da maturação até ao estágio em que se encontram receptivos para
serem fertilizados pelo espermatozóide e consequentemente sairem da clausura
da metaphase da meiose II.
Os capítulos apresentados nesta tese descrevem primeiramente metodologias
usadas na detecção de danos em células espermáticas e secondariamente
estudos sobre detecção de peroxidação de determinados substratos moleculares e
efeitos do stress oxidativo na capacidade fertilizadora do esperma e subsequente
desenvolvimento embrionário.
No capítulo 1 são revistos extensivamente os aspectos da oxidação molecular e os
seus efeitos nos resultados reprodutivos de mamíferos. Aqui são descritos
mecanismos de oxidação de lípidos, proteinas, DNA e como estes podem afectar
as células germinais durante diferentes estágios de diferenciação e maturação.
No capítulo 2 são então descritas novas metodologias para detectar oxidação na
membrana plasmática da célula espermática, nomeadamente fosfolipidos
(fosfatidilcolina) e cholesterol antes e depois de congelamento-descongelamento.
Este último está inerente à criopreservação, o que parece agravar os padrões de
oxidação daquele determinado fosfolipido, reduzindo o potencial fertilizador do
esperma.
Para além dos lipidos, é descrito no capítulo 3 outros métodos para detectar danos
em células espermáticas. Por exemplo, em DNA e mitocondria, o primeiro devido à
sua importância no futuro conceptus, o segundo porque é um organelo
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responsável pela produção de energia que permite à célula espermática
movimentar-se dentro do aparelho reprodutivo feminino e fertilizar o oócito.
É também descrito como avaliar a integridade do acrosoma no semen fresco,
armazenado em forma liquida e criopreservado. Para além disso são também
descritos métodos de avaliação da organização dos lipidos na membrana
plasmática e a sua relação com os estados de capacitação e integridade do
acrosoma.
Nesta tese é também descrita detalhadamente a oxidação de cholesterol em
membranas de células espermáticas. Este foco de interesse é principalmente
devido ao papel estabilizador desta molécula nas membranas e ao papel
importante como precursor de várias hormonas implicadas na maturação de
células germinais. No capítulo 4 é concluido que a oxidação de cholesterol já está
presente em esperma ejaculado, e os níveis de oxiesterois ou COPs (produtos de
oxidação de colesterol) permanecem semelhantes após congelamentodescongelamento, contrariamente ao que se observou com a fosfatidilcolina.
Contudo, quando o esperma é exposto a pro-oxidantes as concentrações de
COPs aumentaram significativamente, mas a concentração do COP mais tóxico
(3,5,6-cholestanetriol) permaneceu inalterada. Isto sugere a presença de um
potencial mecanismo metabólico na célula espermática que retira este COP da
membrana.
Dados estes resultados prévios sobre a forma como os lipidos da membrana
podem ser afectados pelo congelamento-descongelamento e incubação com
agentes oxidativos stressantes, procuramos determinar a extensão em como os
pro-oxidantes podem afectar a fertilização e subsequente desenvolvimento
embrionário. Células espermáticas foram incubadas com pro-oxidantes antes de
se proceder a IVF e o desenvolvimento embrionário avaliado até ao dia 9 postfertilização. É demonstrado no capítulo 5 que o stress oxidativo imposto ao
esperma imita possíveis cenários que as células espermáticas pode encontrar
quer no aparelho reprodutivo masculino quer no feminino tanto em condições
fisiológicas como patológicas (inflamação).
Foi observado que os pro-oxidantes não impediram a fertilização de tomar lugar,
mas que a colheita de blastocistos foi maior para concentrações mais baixas de
oxidantes e esteve completamente ausente quando três tipos de oxidantes foram
usados simultâneamente (concentração mais elevada), apresionando o zigoto no
estágio de 2-células. Este bloqueio foi associado com divisão celular anormal,
disfunção da mitochodria e um aumento em peroxidação lipídica. Para a maior
concentração de H2O2 observou-se uma queda na percentagem de blastocistos no
dia 9, apesar de não ter sido significantemente diferente da concentração mais
baixa de H2O2. Apesar destes efeitos sugerirem que o DNA do esperma esteve
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sujeito à oxidação danificadora e por isso impediu o desenvolvimento embrionário
após a primeira clivagem, não foi encontrado forte correlação entre estes efeitos
através da avaliação da oxidação de DNA (detecção de 8-oxoguanine). Em
contraste, os niveis de peroxidação de lipidos esteve fortemente correlacionada
com o impedimento do desenvolvimento embrionário. Apesar de não termos uma
explicação para esta correlação, este resultado sugere que o oócito possue um
importante mecanismo de reparação do dano oxidativo transportado pelo
espermatozóide aquando da fertilização, sobretudo devido à sua capacidade
antioxidante.
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