caracterização dos microrganismos presentes em vinhos tintos da

CARACTERIZAÇÃO DOS MICRORGANISMOS PRESENTES EM VINHOS TINTOS DA
REGIÃO DO DÃO EM PORTUGAL. IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
PRODUTORES DE FENÓIS VOLÁTEIS
DOUTORAMENTO EM MICROBIOLOGIA E GENÉTICA
Luís Manuel Lopes Rodrigues da Silva
Provas concluídas em 20 de Julho de 2004
RESUMO
A deterioração por fenóis voláteis é um dos principais problemas que afectam os vinhos
tintos, produzindo grandes perdas económicas a nível mundial. Na Região do Dão
(Portugal), a produção de vinhos de qualidade ocorre através de técnicas tradicionais,
com passagem dos vinhos por barricas de madeira para envelhecimento; estas barricas
podem ser as responsáveis pela presença de Dekkera bruxellensis no vinho. Esta
levedura é um dos microrganismos capazes de originar fenóis voláteis a partir de alguns
ácidos hidroxicinâmicos presentes nos vinhos.
Por isso, os objectivos deste trabalho consistiram na caracterização e identificação dos
microrganismos presentes em vinhos tintos deteriorados por fenóis voláteis procedentes
da Região do Dão, a identificação dos microrganismos produtores de fenóis voláteis e a
criação de um meio de cultura selectivo e diferencial para o isolamento de Dekkera
bruxellensis.
A caracterização e identificação dos microrganismos foram efectuadas com recurso a
métodos fenotípicos e moleculares, que revelaram a presença de seis espécies de
leveduras (Dekkera bruxellensis, Pichia fluxuum, Debaryomyces hansenii, Pichia
membranifaciens, Saccharomyces cerevisiae) e de cinco espécies de bactérias
(Acetobacter oeni sp. nov., Acetobacter pasteurianus, Gluconobacter oxydans,
Oenococcus oeni, Staphylococcus warneri) nos vinhos analisados. Para a identificação
de leveduras, efectuou-se um prévio agrupamento das mesmas, utilizando o tamanho
dos fragmentos de ITS juntamente com os perfis de RFLP utilizando a enzima de
restrição Hae III; seguidamente, utilizou-se a sequenciação tanto deste fragmento como
do domínio D1/D2 do gene ribossómico 18S. As bactérias agruparam-se utilizando os
perfis de TP-RAPD, classificaram-se em diferentes géneros através da sequência
completa do gene ribossómico 16S e identificaram-se utilizando os perfis
electroforéticos de LMW RNA. Num dos grupos obtidos analisou-se a hibridação do
DNA total para confirmar a existência de uma nova espécie bacteriana para a qual se
propôs o nome de Acetobacter oeni sp. nov.
Todas as estirpes isoladas neste estudo foram inoculadas em vinho, para estudar a
produção de fenóis voláteis, e os resultados obtidos mostraram que as únicas estirpes
capazes de produzir estes compostos pertenciam à espécie Dekkera bruxellensis.
Seguidamente, procedeu-se à criação de um meio de cultura selectivo e diferencial para
esta espécie que se denominou por DSM (Dekkera Selective Medium) que contém na
sua composição glucose como fonte de carbono, carbonato de cálcio como agente
tampão, cloranfenicol, cicloheximida e etanol como agentes inibidores de crescimento
de bactérias e leveduras que podem interferir no isolamento de Dekkera bruxellensis.