português - Biota Neotropica

Construção de um plasmídio bifuncional contendo um sistema indutor de retrotransposição
para Saccharomyces cerevisiae
Odanir Guerra Garcia
Resumo
O emprego da retrotransformação como veículo para
inserção de informação genética nos cromossomos de
Saccharomyces cerevisiae foi inicialmente proposto
por BOEKE et al., 1985, que clonaram, em plasmídio
bi-funcional, a fusão do retrotransposon Ty1 ao
promotor GAL1. Na presença de galactose e em
condições de incubação que favorecem eventos de
retrotransposição, vários marcadores genéticos de
tamanhos variados, entre 40 pb e 2.700 pb,
introduzidos internamente neste Ty1 recombinante, são
inseridos,
no
genoma
da
levedura,
por
retrotransposição.
O presente trabalho teve como objetivo
principal a construção de um novo vetor de
transformação genética de S. cerevisiae que fosse
capaz de promover inserções de múltiplas cópias, no
genoma, através da retrotransposição, do cassete de
expressão da glicoamilase de Aspergillus awamori de
3,6 Kb, composto pelo seu cDNA (2,0 Kb) sob a
regulação do PPGK de S. cerevisiae sem o terminador
(1,6 Kb).
Para tanto, o cassete de expressão e excreção,
contendo seqüência sinal e estrutural da glicoamilase,
foi retirado do plasmídio YEpG1 e inserido no sitio de
restrição Bam HI do plasmídio pD123, originando o
vetor pGTy-Glico.
Este novo vetor foi empregado para
transformação genética de duas linhagens de S.
cerevisiae de coleções de cultura de laboratório: 1784
e GRF-167. Em cada evento de transformação, foram
obtidas, em média, 500 colônias de leveduras
transformantes (ura(-), glicoamilase(+)). Das colônias
recombinantes obtidas, foram selecionadas, ao acaso,
100 colônias de cada linhagem, que foram submetidas
a condições de cultivo nas quais a retrotransposição foi
induzida em dois períodos de tempo diferentes. Estes
procedimentos levaram à obtenção de 6 clones
retrotransformantes distintos ura(-), glicoamilase(+): 2
derivados da linhagem 1784 e 4 de GRF-167.
A presença do cDNA da glicoamilase nas
células retrotransformadas foi confirmada através da
amplificação, por PCR, de uma região interna ao gene.
E a confirmação de que o cDNA da glicoamilase havia
sido inserido no DNA cromossômico dos clones
retotransformantes foi obtida pela análise do padrão de
hibridização por “Southern-Blot” dos DNAs totais
submetidos à corrida em “PFGE”, empregando-se,
como sonda, um fragmento interno deste cDNA.
Verificou-se que todos os 6 clones retrotransformantes
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obtidos contêm inserções do cDNA da glicoamilase,
no genoma, em números variados.
A análise quantitativa da glicoamilase excretada pelos
clones
retrotranformantes
revelou
uma
correspondência deste fenótipo com o número de
cópias de cDNA de glicoamilase presente no genoma.
Após 76 gerações de cultivo, sem qualquer pressão
seletiva, todos os retrotransformantes glicoamilase(+)
apresentaram 100% de estabilidade da informação
genética inserida no genoma.
Palavras-chaves: Saccharomyces cerevisiae ,
Transformação de leveduras, Transposons, Elementos
Ty, Retrotransposição , Glicoamilase
FICHA CATALOGRÁFICA
Guerra-Garcia, Odanir.
Construção de um plasmídio bifuncional contendo
um sistema indutor de retrotransposição para
Saccharomyces cerevisiae / Odanir Guerra
Garcia. -- São Paulo, 2002.
Dissertação(Mestrado)— Programa de PósGraduação Interunidades em Biotecnologia
USP/Instituto Butantan/IPT.
Área de concentração: Biotecnologia.
Linha de pesquisa: Genética molecular e de
microrganismos.
Orientador: Vicente, José Elisabete.
Versão do título para o inglês: Construction of a
bifuntional plasmid containg a retronsposition
induction system for Saccharomyces cerevisiae.
Descritores: 1. Saccharomyces cerevisiae 2.
Transformação de leveduras
3. Transposons 4. Elementos Ty 5.
Retrotransposição 6. Glicoamilase
ICB/SBIB055/2002