Mercante, F.M. et al., 2002. 65 INTRODUÇÃO As bactérias do solo

Mercante, F.M. et al., 2002.
65
REVISÃO
IMPORTÂNCIA DOS COMPOSTOS FENÓLICOS NAS INTERAÇÕES
ENTRE ESPÉCIES LEGUMINOSAS E RIZÓBIO
FÁBIO MARTINS MERCANTE1
SÍLVIA REGINA GOI 2
AVÍLIO ANTONIO FRANCO3
ABSTRACT: MERCANTE, F. M., S. R. GOI & A. A. FRANCO. Importance of phenolics
compounds in the interactions between leguminous species and rhizobia. The
molecular signal exchange initiates with the exsudation of chemical compounds (flavonoids
and betaines) by the host plant, which induce the expression of the rhizobia nodulation
genes. In turn, the bacteria sinthetize compounds known as nodulation factors (Nod factors),
which consist of lipo-chitin oligosaccharides. The Nod factors are responsible for the initial
phenothypic alterations that occur in the roots of the host plant, such as root hair deformation
and proliferation leading to the nodule formation. This review article focus on the mechanisms
and factors envolved in molecular signals exchange in the early stages of the root nodule
morphogenesis with emphasis on the host plant signals.
KEY WORDS: Flavonoid; rhizobia; leguminous; nod genes; Nod factors.
INTRODUÇÃO
As bactérias do solo pertencentes aos
gêneros Rhizobium , Bradyrhizobium ,
Azorhizobium,
Sinorhizobium
e
Mesorhizobium , comumente referidas
como rizóbios, são capazes de associarse simbioticamente com espécies
leguminosas, formando estruturas
altamente especializadas, os nódulos
radiculares. No caso de Azorhizobium
spp., esses nódulos também podem ser
formados no caule. Estas bactérias
diferenciam-se em bacteróides nos
nódulos da planta hospedeira, fixando
nitrogênio pela redução do nitrogênio
atmosférico à amônia. Em troca, a planta
supre a bactéria com fontes de energia e
carbono para sua manutenção.
1
Autor correspondente. Pesquisador da EMBRAPA – Centro
de Pesquisa Agropecuária do Oeste (CPAO). Rodovia BR
163, Km 253, Caixa Postal 661, 79804-970, Dourados
(MS).
Fax:
++55-67-421-0811.
E-mail:
[email protected]
2
Professora do Instituto de Floresta da Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro. Km 47, 23851-970,
Seropédica (RJ).
3
Pesquisador da EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa
de Agrobiologia (CNPAB). Km 47, 23851-970, Seropédica
(RJ). Fax: ++55-21-682-1230.
Este processo de nodulação é
controlado, em grande parte, pela troca de
sinais entre a bactéria simbionte e a planta
hospedeira.
Nos estádios iniciais de formação dos
nódulos radiculares, a espécie hospedeira
libera sinais na sua rizosfera, identificados
como compostos fenólicos (flavonóides) e
betaínas, que são percebidos pela bactéria,
desencadeando a expressão coordenada de
uma série de genes da nodulação - nod /
nol /noe, referidos coletivamente como nod
(Long, 1989; Martínez et al., 1990; Krishnan
et al., 1995). Os genes da nodulação da
bactéria são essenciais para a infecção da
raiz do hospedeiro e estabelecimento do
nódulo (Stacey et al., 1995). Na maioria das
espécies de Rhizobium, os genes que
controlam a nodulação, a especificidade
hospedeira e a fixação de nitrogênio estão
localizados num plasmídeo grande,
chamado plasmídeo simbiótico - “pSym”
(Banfalvi et al., 1981; Hooykaas et al. ,
1981). Em Bradyrhizobium e Azorhizobium,
a informação genética para a simbiose
encontra-se no cromossoma (Noti et al. ,
1985; van den Eede et al., 1987; Long,
1989).
66
De modo geral, esta simbiose é uma
interação específica, em que cada espécie
de Rhizobium forma nódulos num número
específico e limitado de espécies de
leguminosa hospedeira (Mulligan & Long,
1985; van Rhijn & Vanderleyden, 1995).
A associação simbiótica entre estirpes
de rizóbio e espécies leguminosas é um
processo complexo, que envolve a
expressão de genes simbióticos da planta
hospedeira e do microssimbionte. Nesta
simbiose, a formação de nódulos
radiculares fixadores de nitrogênio abrange
diversas etapas de comunicação para
coordenar a expressão do gene e o
desenvolvimento entre macro e
microssimbionte. A troca inicial de sinais
envolve a ativação da expressão do gene
nod do rizóbio pelos compostos flavonóides
produzidos pelas plantas (Peters et al. ,
1986; Rossen et al., 1987; Zaat et al. ,
1989).
Os flavonóides liberados pela planta
induzem a transcrição dos genes “comuns”
da nodulação, nodABC (Long, 1989). Este
processo é controlado pelo produto do gene
regulatório nodD (proteína NodD), que
interage com os flavonóides (Rossen et al.,
1985; Peters et al., 1986; Redmond et al.,
1986; Maxwell et al., 1989). Os genes
nodABC são encontrados em todas as
espécies de rizóbio e são requeridos para
a biossíntese das moléculas de
lipooligossacarídeos ou oligossacarídeos
lipoquitínicos, coletivamente chamados
“fatores Nod” (Lerouge et al., 1990; Göttfert,
1993; Schultze et al., 1994; López-Lara et
al., 1995). Estes metabólitos Nod
representam, assim, os sinais que a
bactéria envia para a planta, provocando o
encurvamento do pêlo radicular, o início da
divisão celular no córtex da raiz e a indução
do meristema do nódulo (Lerouge et al.,
1990; Spaink et al., 1991; Truchet et al.,
1991; Schultze et al., 1992).
De modo geral, poucos indutores são
liberados pela planta hospedeira, sendo
provável que a indução dos genes nod, em
resposta a flavonóides específicos, possa
© Univ. Fed. Rural do Rio de Janeiro
Importância dos compostos fenólicos
resultar de uma evolução adaptativa, que
dá ao rizóbio vantagens competitivas na
rizosfera da leguminosa hospedeira
(Redmond et al., 1986). Uma exceção ao
pequeno número de flavonóides
normalmente
exsudados
pelas
leguminosas foi observada por Hungria et
al. (1991a, b), que relataram vários
indutores liberados de sementes e raízes
de uma cultivar de feijão preto.
Contudo, estas descobertas recentes,
que buscam um melhor entendimento do
processo de troca de sinais nas interações
entre plantas e bactérias, conduzindo à
infecção e formação dos nódulos, podem
conduzir a resultados significativos de
aumento da nodulação e capacidade
competitiva das estirpes de bactéria. Esta
revisão visa, principalmente, enfocar os
mecanismos e fatores envolvidos na troca
de sinais moleculares nos estádios mais
iniciais de formação dos nódulos
radiculares, com ênfase nos sinais
(compostos fenólicos, coletivamente
designados flavonóides) liberados pelas
plantas hospedeiras.
EVENTOS INICIAIS DA INTERAÇÃO
RIZÓBIO-LEGUMINOSA
A infecção radicular por rizóbio é um
processo que envolve várias etapas,
iniciando-se pelos eventos de pré-infecção
na rizosfera. Nestes eventos iniciais, as
bactérias mostram “quimiotaxia”, ou seja,
reação a gradientes químicos, a diversas
substâncias exsudadas pelas plantas
hospedeiras. Entre estas substâncias
exsudadas incluem-se carboidratos,
aminoácidos, além de compostos fenólicos
(flavonóides), que servem não apenas como
indutores do gene da nodulação- “nod”,
mas também como quimioatraentes para
a bactéria, promovendo a colonização da
rizosfera (Aguilar et al., 1988; CaetanoAnollés et al., 1988; Peters & Verma, 1990;
Barbour et al., 1991).
A importância da quimiotaxia e
motilidade da bactéria na simbiose com
Revista. Universidade. Rural, Série. Ciências da Vida
Vol. 22, n.1, p.65-81, 2002.
Mercante, F.M. et al., 2002.
leguminosas tem conduzido a diversos
estudos, com diferentes espécies de
rizóbio. Neste contexto, a motilidade da
bactéria tem sido indicada como um
importante fator na competição entre
estirpes de Bradyrhizobium japonicum para
nodulação. Hunter & Fahring (1980)
observaram que mutantes incapazes de
mover-se formaram apenas 20% dos
nódulos em plantas inoculadas com o
mesmo número de bactérias que se
moviam.
O envolvimento da quimiotaxia do
rizóbio em direção aos flavonóides, no início
da formação dos nódulos radiculares, tem
sido sugerido como um possível efeito na
especificidade hospedeira (Aguilar et al. ,
1988). No entanto, outros autores, como
Gaworzewska & Carlile (1982), investigaram
os efeitos quimiotáticos de exsudatos
radiculares brutos e fracionados de plantas
hospedeiras e não hospedeiras, em
diferentes espécies de Rhizobium , e
nenhuma correlação direta entre o efeito
quimiotático e a nodulação específica foi
encontrada.
Diversos compostos flavonóides
exsudados de sementes e raízes de
leguminosas têm sido identificados como
substâncias indutoras do gene nod em
vários sistemas planta-rizóbio (Firmin et al.,
1986; Peters et al., 1986; Redmond et al.,
1986). Caetano-Anollés et al. (1988)
observaram uma estreita correlação entre
as habilidades indutoras dos genes nod de
R. meliloti e os efeitos quimiotáticos de
flavonóides. Para R. leguminosarum bv.
viciae, esta correlação entre a indução dos
genes nod e a quimiotaxia foi menos
pronunciada (Armitage et al., 1988). Os
resultados obtidos por Aguilar et al. (1988)
não indicaram uma correlação entre a
quimiotaxia de R. leguminosarum bv.
phaseoli em direção aos flavonóides e a
indução dos genes nod para estas
substâncias.
Após a colonização da rizosfera, as
bactérias aderem-se aos pêlos radiculares
das plantas, induzindo-lhes o encurvamento
67
e, posteriormente, o início da formação do
meristema do nódulo (Lerouge et al., 1990;
Truchet et al., 1991; Spaink et al., 1991).
Ocorre, então, a dissolução da parede
celular, permitindo a entrada da bactéria nas
raízes. Este processo dá início à formação
de um cordão de infecção, que se
desenvolve e estende-se até o córtex da
raiz, transportando a bactéria para o
meristema do nódulo (Bauer, 1981; Verma,
1992). Os processos de divisão das células
do córtex e indução do meristema nodular,
que se iniciaram antes da penetração das
bactérias, são incrementados, formando o
primórdio do nódulo. Os cordões de
infecção entram nas células desses
primórdios, em cujo citoplasma as bactérias
são liberadas envoltas em uma membrana
(Robertson & Lyttleton, 1982). As bactérias
continuam crescendo e, por último,
diferenciam-se em bacteróides capazes de
fixar N2 (Vincent, 1980; Hungria, 1994).
OS GENES DA NODULAÇÃO DE
RIZÓBIO- ÊNFASE NOS ESTUDOS DOS
GENES “NOD”
Os genes requeridos nos estádios mais
iniciais do processo de infecção são
classificados de acordo com suas
propriedades funcionais, quando
transferidos para outras espécies de rizóbio
ou para alguma bactéria relacionada, como
Agrobacterium tumefaciens.
Desta forma, os genes do rizóbio
“essenciais” à infecção e formação do
nódulo podem ser divididos em duas
classes. Uma classe inclui os genes
envolvidos na formação da superfície celular
da bactéria, tais como os genes
determinantes
da
síntese
de
exopolissacarídeos (genes “exo”),
lipopolissacarídeos (genes “lps”) e 1,2-bglucanos (genes “ndv”), ligados ao
desenvolvimento nodular. Mutações nestes
genes podem afetar o processo de infecção
de várias maneiras, como, por exemplo,
incapacitando a formação dos cordões de
infecção, que resultaria na formação de
nódulos vazios, não fixadores de N2 -
68
“fenótipo Nod+ Fix-” (Arnold et al., 1994).
Tem sido sugerido um possível envolvimento
dos genes exo e lps na determinação da
especificidade hospedeira, mas nenhuma
evidência mais clara mostrou que os
componentes da superfície celular do
rizóbio são os determinantes principais da
especificidade hospedeira (Gray & Rolfe,
1990; Reuber et al., 1991).
A segunda classe dos “genes
essenciais” consiste dos genes da
nodulação- “nod/ nol / noe” , que resultam
em alterações no processo de infecção,
quando mutados. A inativação dos genes
desta classe de genes da nodulação
podem resultar em diversos fenótipos na
planta, como ausência de nodulação
(Nod- ), nodulação tardia, porém, efetiva
(Nodd Fix+), ou uma mudança na faixa de
hospedeiro. O papel de cada gene nod é,
então, determinado pela alteração no
fenótipo da nodulação, causada pelo
mutante do rizóbio.
Alguns genes nod apresentam um grau
elevado de homologia, podendo ser
trocados entre diferentes espécies e
biovares de rizóbio, sem que percam suas
propriedades funcionais. Os genes nod
incluídos nesta categoria são designados
como “genes nod comuns” (Kondorosi et
al., 1989; Djordjevic et al., 1985). Por outro
lado, alguns genes nod estão envolvidos
na nodulação de um hospedeiro específico
e são, por isso, chamados de “genes nod
específicos do hospedeiro”- “hsn”
(Kondorosi et al., 1989). Estes genes não
apresentam homologia genética ou
funcional entre as espécies de rizóbio, não
podendo, assim, ser substituídos pelos
alelos de um rizóbio de outra espécie
(Kondorosi et al., 1989). Numa outra
categoria dos genes nod, estão incluídos
os genes classificados como “regulatórios”.
Neste caso, a regulação da expressão dos
genes nod é controlada pelos genes nodD,
que estão presentes em todas as espécies
de rizóbio, em uma ou mais cópias
(Mulligan & Long, 1989).
© Univ. Fed. Rural do Rio de Janeiro
Importância dos compostos fenólicos
Os genes nod “comuns”
Os genes “comuns” nodA, nodB e nodC
estão presentes em todas as estirpes de
rizóbio e são chamados de “induzíveis”,
porque
não
são
expressos
constitutivamente, precisando, pois, de um
indutor (Mulligan & Long, 1985). A
transcrição dos genes nodA, nodB e nodC
é essencial aos estádios de pré-infecção,
especialmente, para divisão celular do
córtex da planta e deformação dos pêlos
radiculares (Kondorosi et al., 1989;
Djordjevic et al., 1985).
Na maioria das estirpes de rizóbio, os
genes nodA , nodB e nodC, que são
responsáveis pela síntese da estrutura Nod
básica, estão no mesmo operon- nodABC.
O plasmídeo simbiótico (pSym) de estirpes
tipo I de R. leguminosarum bv. phaseoli, os
biovares americanos que foram
recentemente reclassificados como R. etli
(Segovia et al., 1993), representa uma
exceção, já que o nodBC é separado do
nodA por 20 Kb (Girard et al., 1991;
Vázquez et al., 1991).
Contudo,
estudos
realizados
recentemente por Ritsema et al. (1996)
indicam que o conceito de nodA como um
“gene nod comum” deve ser revisado, uma
vez que nos sistema genético usados
nestes estudos, a troca do gene nodA de
R. leguminosarum bv. viciae pelo gene
nodA de Bradyrhizobium sp. (ANU289)
resultou no fenótipo Nod- em Vicia.
Genes nod “específicos do hospedeiro”hsn
Os genes nod específicos do hospedeiro
(hsn) são necessários para a nodulação de
uma planta hospedeira específica
(Kondorosi et al., 1989). Na maioria dos
casos, as mutações não podem ser
totalmente complementadas pela
introdução de genes correspondentes de
outra espécie de rizóbio. A maior parte das
mutações resulta em alterações ou
extensão na faixa de hospedeiro. Em R.
Revista. Universidade. Rural, Série. Ciências da Vida
Vol. 22, n.1, p.65-81, 2002.
Mercante, F.M. et al., 2002.
meliloti, por exemplo, mutantes nodH perderam a habilidade de nodular seu
hospedeiro homólogo (alfafa), e passaram
a nodular Vicia, um hospedeiro heterólogo.
Os mutantes nodQ-, por outro lado, foram
capazes de infectar alfafa e Vicia (Faucher
et al., 1989; Horvath et al., 1986).
Gene “regulatório” nodD
A expressão dos genes nod estruturais
do rizóbio requer a presença de um sinal
da planta, geralmente flavonóides, e a
presença de uma proteína regulatória
“NodD”. A proteína NodD se liga a
sequências de DNA que precedem os
genes nod a serem ativados (Kondorosi et
al., 1989). Estas sequências de
nucleotídeos, com 47 pares de base, são
semelhantes em diversas espécies de
rizóbio, e foram denominadas nod “boxes”
(Göttfert et al., 1986; Spaink et al., 1987;
Fisher et al., 1988). Na presença de
exsudatos (indutores) liberados pelas
sementes e raízes, a proteína NodD se liga
ao nod “box”, atuando como um ativador
transcricional (Fisher et al., 1988).
O sistema regulatório NodD está
presente em todas as estirpes de rizóbio
investigadas até o momento, havendo uma
variação entre as espécies, quanto ao
número de cópias presentes. Em R.
leguminosarum bv. viciae e R.
leguminosarum bv. trifolii há apenas uma
cópia do gene nodD (Innes et al., 1985;
Bassam et al., 1988; Schlaman et al. ,
1992); Outras espécies, incluindo R.
leguminosarum bv. phaseoli, R. tropici, R.
meliloti e R. fredii apresentam duas ou mais
cópias relacionadas do gene nodD (Göttfert
et al., 1989; van Rhijn et al., 1993). Na
estirpe CIAT899 (R. tropici) foram
identificados cinco alelos, sendo que o
nodD1 contribuiu com a maior parte da
atividade e, quando sofreu mutação, a
nodulação de L. leucocephala e M.
atropurpureum foi inibida completamente,
além de ter reduzido a nodulação em P.
vulgaris (van Rhijn et al., 1994).
69
O efeito de uma mutação nodD parece
ser específica para cada estirpe de rizóbio.
R. leguminosarum bv. trifolii e,
provavelmente, Azorhizobium caulinodans,
apresentam somente uma cópia do gene
nodD, e mutantes nodD- não foram capazes
de nodular todas as plantas hospedeiras
(Innes et al., 1985). Em R. leguminosarum
bv. phaseoli, onde há pelo menos três
cópias do gene nodD, a eliminação destas
cópias impediu completamente a
nodulação, embora mutações em um dos
genes nodD não tenha inibido a nodulação
(Davis & Johnston, 1990 a,b).
Um maior detalhamento dos genes da
nodulação do rizóbio e suas funções
podem ser obtidos, consultando-se revisões
recentes, como as de Göttfert (1993),
Schultze et al. (1994), Hungria (1994) e van
Rhijn & Vanderleyden (1995).
SINAIS MOLECULARES LIBERADOS
EM EXSUDATOS DE PLANTAS
HOSPEDEIRAS
Evidências da troca de sinais entre
Rhizobium e suas respectivas plantas
hospedeiras
As estirpes de Rhizobium podem
sobreviver no solo por vários anos, sem
estar associadas à planta hospedeira
(Bottomley, 1992). O pré-requisito para que
o rizóbio esteja associado como um
microssimbionte, no entanto, é que a planta
seja capaz de se comunicar com ele.
Embora, há muitos anos atrás, já
houvesse especulação sobre esta
comunicação entre o Rhizobium e seu
hospedeiro, trocando sinais moleculares,
as moléculas que proporcionariam tal
comunicação só foram evidenciadas muito
recentemente. A existência de sinais
enviados da planta para a bactéria e viceversa foram deduzidos a partir de um
experimento realizado por van Brussel et
al. (1986), em que plantas de Vicia sativa
subsp. Nigra foram cultivadas sob
condições estéreis em meio líquido e, após
sete dias, inoculada com R. leguminosarum
70
bv. Viceae. Posteriormente, o sobrenadante
desta cultura foi esterilizado por filtragem
e utilizado como substrato para V. sativa,
também sob condições estéreis. Após sete
dias de crescimento, as raízes mostraram
respostas positivas quanto à deformação
dos pêlos radiculares (fenótipo “Had”- “hair
deformation”) e formação de raízes mais
curtas e grossas (fenótipo “Tsr”- thick and
short root”). Estes fenótipos radiculares
foram utilizados para avaliar a resposta do
hospedeiro ao microssimbionte específico
(Canter-Cremers et al., 1986; van Brussel
et al., 1986; Zaat et al., 1987a). Os
controles que incluíam plantas crescendo
em sobrenadantes de bactérias, que não
haviam sido expostas aos exsudatos das
plantas, e em exsudatos de plantas que
não haviam sido inoculadas com bactérias,
foram negativos para os fenótipos “Had” e
“Tsr”. Foi constatado, ainda, que “Tsr” e
“Had” estavam necessariamente ligados à
presença do plasmídeo simbiótico (pSym)
e dos genes nodABC da bactéria (van
Brussel et al., 1986). Resultados
semelhantes foram obtidos com R.
leguminosarum bv. Trifolii e plantas de
Trifolium repens (Canter-Cremers et al. ,
1986).
Detecção de sinais indutores dos genes
da nodulação do rizóbio
Inicialmente, os estudos dos sinais
liberados pelas plantas baseavam-se na
indução dos fenótipos Had- e Tsr, referentes
à deformação dos pêlos radiculares e à
formação de raízes mais curtas e grossas,
respectivamente (van Brussel et al., 1986).
Posteriormente, estas análises foram
substituídas por outra mais específica e
direta, baseada na indução dos genes nod
pelos sinais da planta presentes nos seus
exsudatos. Assim, tem-se utilizado
plasmídeos, nos quais fragmentos de DNA
da região nod são unidos, por um processo
denominado de “fusão de genes”, ao gene
estrutural lacZ (sem promotor), de
Escherichia coli. Com estas construções
© Univ. Fed. Rural do Rio de Janeiro
Importância dos compostos fenólicos
genéticas, denominadas de “plasmídeos
repórteres”, a expressão dos genes nod
pode ser monitorada pela atividade da
enzima b-galactosidase (Mulligan & Long,
1985; Rossen et al., 1985; Innes et al.,
1985; Zaat et al., 1987b).
Desta forma, este sistema que utiliza
um gene repórter pode ser usado para a
detecção de fatores derivados da planta
(indutores do gene nod), auxiliando na
identificação dos compostos responsáveis
pela ativação dos genes nod do rizóbio. A
expressão dos operons nod induzíveis está
sob o controle do produto do gene nod, que,
na forma ativada por exsudatos liberados
pelas plantas, inicia a transcrição destes
operons (Mulligan & Long, 1985; Innes et
al., 1985; Rossen et al., 1985; Zaat et al.,
1987a).
Contudo, as fusões do gene lacZ de E.
coli e os genes nod de rizóbio têm sido
usadas para monitorar a atividade indutora
de vários exsudatos e extratos de plantas,
uma vez que a expressão do gene nod está
diretamente relacionada à produção da
enzima b-galactosidase, que pode ser
medida facilmente por métodos
colorimétricos (Mulligan & Long, 1985;
Boivin et al., 1990; Lam et al., 1990).
Assim, a expressão dos genes nod na
presença de um sinal da planta (flavonóide)
induzem a produção da enzima bgalactosidase, desenvolvendo uma
coloração azul na presença de “X-gal” (5bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosida),
que é o substrato da enzima (Drahos et
al., 1986).
Outras construções genéticas utilizadas
nos estudos de expressão da atividade
indutora do gene nod, além desta utilizada
com o gene marcador lacZ, acima
exemplificada, têm sido obtidas
recentemente. O uso de outros genes
marcadores nos estudos das interações
planta-microrganismo, como o gene gusAcodificador da enzima b-glucuronidase, tem
se mostrado bastante apropriados às
análises de regulação da expressão de
genes (van den Eede et al., 1992; Wilson,
Revista. Universidade. Rural, Série. Ciências da Vida
Vol. 22, n.1, p.65-81, 2002.
Mercante, F.M. et al., 2002.
1995).
Tipos de sinais moleculares (indutores)
liberados pelas leguminosas.
A expressão dos genes nod, conforme
apresentado anteriormente, requer a
presença de sinais, identificados como
compostos fenólicos, na maioria dos casosflavonóides, que são exsudados pela planta
hospedeira.
Mulligan & Long (1985) conduziram um
trabalho pioneiro, utilizando uma construção
genética, em que o gene lacZ de E. coli foi
inserido após o nodC no plasmídeo de R.
meliloti. Desta forma, foi possível detectar
que o produto do gene regulatório nodD
interagia com um fator ainda desconhecido,
presentes em extratos brutos da
leguminosa hospedeira e, nesta forma
ativada, iniciava a transcrição do operon
nodABC (Mulligan & Long, 1985).
O primeiro indutor estudado foi isolado
de extratos de sementes de alfafa e
identificado como um composto fenólico,
denominado flavona “luteolina”, que é
derivado dos fenilpropanóides (Peters et al.,
1986). Após a identificação desse flavonóide
(luteolina), outros indutores presentes nas
sementes e raízes de outras leguminosas
hospedeiras
começaram
a
ser
investigados. A grande maioria dos
compostos investigados posteriormente
foram identificados como flavonóides, que
induziram a transcrição dos genes nodABC
em estirpes de R. meliloti (Maxwell et al.,
1989; Hartwig et al., 1990), Bradyrhizobium
japonicum, R. fredii (Kosslak et al., 1987;
Kape et al., 1992), R. leguminosarum bv.
Viceae (Firmin et al., 1986; Zaat et al. ,
1989), R. leguminosarum bv. Trifolii (Innes
et al., 1985; Redmond et al., 1986;
Djordjevic et al., 1987) e R. leguminosarum
bv. Phaseoli (Hungria et al., 1991a, b).
Os flavonóides pertencem a uma ampla
classe de metabólitos secundários, sendo
distribuídos por todo o reino vegetal e
sintetizados tanto na parte aérea quanto
nas raízes (Harborne, 1967).
71
Os diversos trabalhos que vêm sendo
desenvolvidos mostram que as plantas
hospedeiras liberam grupos diferentes de
flavonóides. Contudo, o espectro de
flavonóides é dependente da espécie de
planta (Rolfe, 1988) e do estádio de
desenvolvimento da planta (Hartwig et al.,
1990; Phillips, 1992). Os flavonóides
exsudados por sementes e raízes de uma
determinada leguminosa consiste de uma
mistura de indutores do gene nod fracos e
fortes, além de compostos inibidores e
ineficazes (Mulligan & Long, 1985; Firmin
et al., 1986; Peters et al., 1986; Redmond
et al., 1986; Hartwig et al., 1989, 1990;
Hungria et al., 1992). Além disso, a
exsudação radicular não é uniformemente
distribuída ao longo do eixo radicular. Em
alfafa, a zona de máxima capacidade
indutora do gene nod, a zona de emergência
dos pêlos radiculares, também corresponde
à zona mais susceptível para a infecção e
nodulação (Redmond et al., 1986).
O início da simbiose entre a leguminosa
e o rizóbio ocorre pelos efeitos indutores
dos exsudatos da planta em associação
com as proteínas NodD do rizóbio.
Flavonóides que induzem os genes nod do
rizóbio têm sido identificados em exsudatos
de muitas leguminosas (Long, 1989). Entre
as diversas estruturas de flavonóides que
têm sido reportadas como indutores
naturais do gene nod para diversas
leguminosas, incluem-se as flavonas
(Peters et al., 1986; Redmond et al., 1986),
isoflavonas (Kosslak et al., 1987),
chalconas (Maxwell et al., 1989),
flavanonas (Zaat et al., 1989),
antocianidinas (Hungria et al., 1991a) e
flavonóis (Hungria et al., 1991b).
Recentemente, dois compostos não
pertencentes à família dos flavonóides, as
betaínas trigonelina e estaquidrina, foram
identificadas como substâncias indutoras
exsudadas pelas sementes de alfafa, que
interagem com a proteína NodD2 (Phillips
et al., 1992).
No caso do feijoeiro, o principal grupo
de compostos indutores liberados pelas
72
sementes foi identificado como
antocianinas (delfinidina, petunidina e
malvidina) e flavonóis (miricetina e canferol)
(Hungria et al., 1991a). Nos exsudatos
radiculares foram identificados eriodictiol,
naringenina e genisteína como os principais
indutores (Hungria et al., 1991b). BolanõsVásquez & Werner (1997) identificaram
outros compostos flavonóides indutores dos
genes nod em exsudatos radiculares de
feijoeiro, a chalcona isoliquiritigenina, e a
correspondente flavanona liquiritigenina,
que ainda não haviam sido identificadas nos
exsudatos radiculares do feijoeiro.
Os efeitos dos indutores podem ser
aditivos ou sinergísticos, mas os indutores
fracos em quantidades modestas podem
reduzir o efeito de indutores fortes (Hartwig
et al., 1989). Os indutores potentes podem
atuar em concentrações menores que 1mM
(Göttfert, 1993). Segundo Hartwig et al.
(1989), a presença de concentrações subótimas de diferentes indutores podem
resultar num aumento sinergístico na
expressão do gene. Os resultados
experimentais obtidos por estes autores
demonstraram que a leguminosa
hospedeira parece se beneficiar do efeito
sinergístico entre indutores da semente e
indutores da raiz, criando uma zona
altamente propícia à nodulação na coroa
da raiz. Do mesmo modo, foi observado um
aumento na transcrição dos genes nod de
R. leguminosarum bv. Phaseoli pela ação
sinergística entre a malvidina (3,5,7,4‘-tetrahidroxi-3‘,5‘-di-metoxi-flavilium), principal
indutor das sementes de feijão, e a
genisteína, indutor mais potente das raízes
(Hungria et al., 1992).
Contudo, as interações entre os
flavonóides da planta hospedeira e a
proteína NodD do microssimbionte parecem
muito mais complexas do que a simples
ativação dos genes nod.
Tem sido observado que os flavonóides
também podem atuar como repressores da
indução do gene nod (Firmin et al., 1986;
Djordjevic et al., 1987; Peters & Long, 1988;
Kosslak et al., 1990). A daidzeína e
© Univ. Fed. Rural do Rio de Janeiro
Importância dos compostos fenólicos
genisteína, por exemplo, que são fortes
indutores em B. japonicum, são potentes
inibidores da expressão do gene nod em
R. meliloti (Györgypal et al., 1991).
Diversos estudos têm mostrado, ainda,
que a transcrição dos genes pode ser
inibida por uma interação complexa entre
os próprios indutores liberados pela planta.
Djordjevic et al. (1987) verificaram que
um indutor forte poderia ser atenuado por
um indutor fraco do mesmo hospedeiro
inoculado com R. leguminosarum bv. Trifolii.
Do mesmo modo, a ação do principal
indutor (metoxi-chalcona) exsudado pelas
raízes de alfafa foi decrescida por dois
indutores fracos (hidroxi-flavona e hidroxiflavanona) liberados pelas raízes do mesmo
hospedeiro, inoculado com R. meliloti
(Hartwig et al., 1989).
De uma maneira geral, a síntese e a
liberação de flavonóides são controladas,
principalmente, pela planta. Contudo, as
bactérias presentes na rizosfera são
capazes de influenciar a síntese e/ou
exsudação de flavonóides indutores do
gene nod, alterando o metabolismo da
planta. Tem sido demonstrado que R.
leguminosarum bv. Viciae (van Brussel et
al., 1990), B. japonicum (Cho & Harper,
1991) e R. leguminosarum bv. Phaseoli
(Dakora et al., 1993), assim como fatores
Nod purificados (Spaink et al., 1991),
aumentaram a produção de flavonóides
indutores nas plantas hospedeiras. Assim,
tem sido sugerido que a exsudação destes
indutores em resposta aos fatores Nod
poderia representar um terceiro passo da
comunicação molecular entre a planta e o
microrganismo (Hungria, 1994).
Resultados experimentais recentes têm
mostrado a possibilidade de se obter
incrementos na nodulação, por exemplo,
pelo fornecimento de sinais (flavonóides),
que poderiam ser adicionados aos
inoculantes. Hungria et al. (1993a, b)
observaram que entre duas linhagens de
feijão (uma parental e uma mutante
isogência para a síntese dos principais
indutores dos genes nod), a nodulação da
Revista. Universidade. Rural, Série. Ciências da Vida
Vol. 22, n.1, p.65-81, 2002.
Mercante, F.M. et al., 2002.
73
Tabela 1- Identificação dos principais flavonóides indutores dos genes nod, obtidos de
leguminosas (Hungria, 1994, modificado)
Hospedeiro x
Simbionte
Medicago sativa x R.
meliloti
Pisum sativum x
R. leguminosarum
bv. viceae
Vicia sativa x
R. leguminosarum
bv. viceae
Flavonóide
Nome comum
Fonte
Referência
extrato de semente
exsudato de semente
exsudato de semente
Peters et al. (1986)
Hartwig et al. (1990)
Hartwig et al. (1990)
liquiritigenina
metoxi-chalcona
exsudato de raiz
Maxwell et al. (1989)
5,7,4`-tri-hidroxi-flavona-7- Oglucosídeo
apigenina-7-Oglucosídeo
exsudato de semente e
raiz
Firmin et al. (1986)
5,7,3`,4`-tetra-hidroxiflavanona
eriodictiol
exsudato de raiz
Zaat et. al. (1989)
exsudato de raiz e
extrato de plântula
Redmond et al.
(1986)
extrato de semente e
de plântula
Kosslak et al. (1987)
5,7,3`,4`-tetra-hidroxi flavona
luteolina
3`-metoxi-5,7,4`-tri-hidroxiflavona
7,4`-di-hidroxi-flavanona
4,4`-di-hidroxi-2`-metoxichalcona
crisoeriol
3,5,7,3`-tetra-hidroxi-4`metoxi-flavanona
7,3`-di-hidroxi-4`-metoxiflavanona
Trifolium repens x
R. leguminosarum
bv. trifolii
7,4`-di-hidroxi-flavona
7,4`-di-hidroxi-3`-metoxiflavona
4`-hidroxi-7-metoxi-flavona
geraldona
Glycine max x
7,4`-di-hidroxi-isoflavona
daidzeína
B. japonicum x R.
fredii
x B japonicum
5,7,4`-tri-hidroxi-isoflavona
genisteína
4,2`,4`-tri-hidroxi-chalcona
isoliquiritigenina
exsudato de semente e
raiz
Kape et al. (1992)
Phaseolus
vulgaris x R.
leguminosarum
bv. phaseoli
3-O-glucosídeos de:
3,5,7,3`,4`,5`-hexahidroxi-flavilium
delfinidina
exsudato de
semente
Hungria et al.
(1991a)
3,5,7,4`,5`-pentahidroxi-flavil
3,5,7,4`-tetra-hidroxiflavil
3-O-glucosídeos de:
3,5,7,3`,4`,5`-hexahidroxi-flavona
3,5,7,3`,4`-pentahidroxi-flavona
3,5,7,4`-tetra-hidroxiflavona
5,4`-di-hidroxiisoflavona-7-Oglucosídeo
5,7,3`,4`-tetra-hidroxiflavanona
cianidina
genisteína-7-Oglucosídeo
exsudato de raiz
Hungria et al.
(1991b)
eriodictiol
exsudato de raiz
BolanõsVásquez &
Werner (1997)
5,7,4`-tri-hidroxiflavanona
2`,4`,4--tri-hidroxichalcona
4`,7-di-hidroxiflavanona
naringenina
malvidina
miricetina
quercetina
campeferol
isoliquiritigenina
liquiritigenina
Importância dos compostos fenólicos
74
mutante isogênica estava limitada pelo
baixo teor de indutores, recuperando a
nodulação quando os flavonóides foram
adicionados às sementes. Em outro
estudo, foi constatado que a adição de
flavonóides indutores às raízes de alfafa
inoculada aumentou a nodulação,
mostrando que, naquelas condições, os
flavonóides eram os fatores limitantes
(Kapulnik et al., 1987).
Enfim, diversos benefícios agronômicos,
como o aumento significativo da nodulação
de leguminosas e da capacidade
competitiva das estirpes de rizóbio, podem
ser alcançados pelo aumento quantitativo
e/ou qualitativo dos indutores exsudatos
pelo hospedeiro. Contudo, torna-se
necessário um melhor entendimento da
troca de sinais nas intrerações plantamicrorganismos.
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