Trabalho de Conclusão de Curso - BDM

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE CEILÂNDIA
CURSO DE FARMÁCIA
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Análise de aspectos epidemiológicos e clínicos e caracterização de genes de
resistência das Enterobactérias produtoras de carbapenemases em um
hospital do Distrito Federal
CEILÂNDIA, DF
2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Análise de aspectos epidemiológicos e clínicos e caracterização de
genes de resistência das Enterobactérias produtoras de carbapenemases em
um hospital do Distrito Federal.
Monografia de Conclusão de Curso
apresentada como requisito parcial
para obtenção do grau de Bacharel
em Farmácia, na Universidade de
Brasília, Faculdade de Ceilândia.
Orientadora: Profa. Dra.Margô Gomes de Oliveira Karnikowski
Co-orientadora: Profa. Dra. Izabel Cristina Rodrigues da Silva
CEILÂNDIA, DF
2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Análise de aspectos epidemiológicos e clínicos e caracterização de
genes de resistência das Enterobactérias produtoras de carbapenemases em
um hospital do Distrito Federal.
Orientadora: Profa. Dr. Margô Gomes de Oliveira Karnikowski
(FCe/ Universidade de Brasília)
Co-orientadora: Profa. Dr. Izabel Cristina Rodrigues da Silva
(FCe/ Universidade de Brasília)
CEILÂNDIA, DF
2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Análise de aspectos epidemiológicos e clínicos e caracterização de
genes de resistência das Enterobactérias produtoras de carbapemases em um
hospital do Distrito Federal.
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Orientadora: Profa. Dr. Margô Gomes de Oliveira Karnikovski
(FCe/ Universidade de Brasília)
_______________________________________
Profa. MSc. Micheline Marie Milward de Azevedo Meiners
(FCe/ Universidade de Brasília)
_______________________________________
Prof. MSc Daniel Oliveira Freire
(LS/ Faculdade LS)
CEILÂNDIA, DF
2014
AGRADECIMENTOS
Primeiramente á Deus, autor da vida, que me concedeu a graça e a benção
de ter conquistado este sonho da graduação.
À minha amada família, principalmente meus pais Elias Amorim e Liliana
Correa; irmão, Thales Correa e avó, Herondina; por serem a minha base, meu
refúgio em todos os momentos, e acreditarem em mim.
À minha grande amiga de graduação Susan Suellen, por partilhar dos meus
medos, alegrias, vitórias, angustias e em todos os momentos ser meu braço direito.
Ao meu amor Robson Bastos, que mais que um noivo, foi meu amigo e
companheiro, me apoiando e me incentivando.
À minha querida orientadora Dra.Margô Gomes e querida co-orientadora, Dra.
Izabel Cristina, por acreditarem em mim, me dando a oportunidade de trabalhar com
elas. Além do apoio, ensino e dedicação.
À todos os professores (as) da Universidade de Brasília- Faculdade de
Ceilândia, pelo ensino e pela contribuição na minha formação acadêmica.
À MSc. Fabiana Cartaxo, pela ajuda e apoio, além da prontidão quando
solicitada a sua ajuda.
Ao professor mestre Daniel Oliveira e a técnica de laboratório Thais Mendes;
pela ajuda laboratorial, contribuindo para a realização de um bom trabalho.
RESUMO
Introdução: A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) é uma enzima
produzida por bactérias gram-negativas (enterobactérias), que confere resistência
aos antimicrobianos carbapenêmicos: meropenen, ertapenen, imipenen; classe
amplamente utilizada no tratamento de infecções envolvendo Enterobacteriaceae.
Esta resistência é uma das principais causas de falha terapêutica, devido à
produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por esta bactéria,
mecanismo de resistência mais comum aos antibióticos beta-lactâmicos de amplo
espectro. A identificação destas enterobactérias pode ser feita através de técnicas
de identificação molecular de patógenos, dentre elas a Reação em Cadeia de
Polimerase (PCR); que consiste na análise do padrão de amplificação de elementos
repetidos encontrados no genoma bacteriano, permitindo uma maior rapidez na
obtenção de resultados quando comparada com outros métodos, além de
apresentar alta reprodutibilidade, simples execução e implementação, dependendo
da aplicação da técnica não enfrenta problemas com a degradação do DNA.
Objetivo: Caracterizar genes de resistência das Enterobactérias produtoras de
carbapenemases e aspectos epidemiológicos e clínicos de pacientes internados em
um hospital público do Distrito Federal. Materiais e métodos: Estudo transversal
onde foi realizado o teste de susceptibilidade das Enterobactérias aos antibióticos
Carbapenêmicos, a partir dos materiais biológicos coletados dos pacientes
internados no Hospital Regional da Asa Norte (HRAN). Análise molecular dos genes
16S rRNA e blaKPC, utilizando PCR; além de análises estatísticas. Resultados e
discussão: Detectou-se a região ribossomal e o gene de resistência testado,
confirmando a resistência microbiana. Maior prevalência de pacientes do sexo
masculino (53%), desfecho clínico de óbito(59%), sítio de infecção de swab retal
(47%), Klebsiella pneumoniae foi microrganismo mais encontrado (82%). Não houve
diferença estatística entre as variáveis e o desfecho clínico (p foi > 0,05).
Conclusão: Através da caracterização molecular dos genes de resistência blaKPC
e Universal, confirmou-se a presença de Klebsiella pneumoniae, resistente aos
carbapenêmicos. Os valores de p não foram significativos (<0,05), sendo
assim,nenhuma das variavéis estudadas foram o principal motivo do desfecho
clínico (alta ou óbito).
Palavras chaves: Klebsiella pneumoniae carbapenemase; Resistência bacteriana a
antimicrobianos; β-lactamases de espectro estendido (ESBL); Reação em Cadeia de
Polimerase (PCR).
ABSTRACT
Introduction: Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) is an enzyme produced
by gram - negative bacteria (Enterobacteriaceae), which confers resistance to
carbapenem antibiotics: meropenen, ertapenen, imipenem; class widely used in the
treatment of infections involving Enterobacteriaceae. This resistance is a major
cause of treatment failure due to beta-lactamases production of extended spectrum
(ESBL) by this bacterium most commonly resistance to beta-lactam antibiotics of
wide spectrum engine. The identification of these Enterobacteriaceae can be made
by techniques of molecular identification of pathogens, among them the Polymerase
Chain Reaction (PCR); which consists in the analysis of the amplification pattern of
repeated elements found in the bacterial genome, allowing faster in getting results
when compared with other methods, in addition to presenting high reliability, simple
implementation and deployment, depending on the application of the technique has
no trouble with the degradation of DNA. Objective: To characterize the resistance
genes of Enterobacteriaceae producing carbapenemases and epidemiological and
clinical features of patients admitted to a public hospital in the Federal District
aspects. Materials and methods: Cross-sectional study where susceptibility testing
of Enterobacteriaceae to antibiotics Carbapenems, from biological materials collected
from patients admitted to the Hospital Regional da Asa Norte ( HRAN ) was
performed . Molecular analysis of 16S rRNA genes and blaKPC using PCR; in
addition to statistical analysis. Results and Discussion: Was detected region and
the ribosomal tested resistance gene, confirming the microbial resistance. Higher
prevalence of male patients (53 %), clinical outcome of death (59 %), site of infection
rectal swabs (47 %), Klebsiella pneumoniae was found more microorganism (82%).
There was no statistical difference between the variables and the clinical outcome (p
was > 0.05). Conclusion: Through molecular characterization of genes and the
Universal blaKPC resistance confirmed the presence of Klebsiella pneumoniae
resistant to carbapenems. P values were not significant (< 0,05), so none of the
variables studied were the main reason the clinical outcome (discharge or death).
Keywords: Klebsiella pneumoniae
Carbapenemase; Bacterial resistance to
antibiotics; Extended-Spectrumβ-lactamases (ESBL); Polimerase Chain Reaction
(PCR).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ação do ß-lactâmico sobre a bactéria gram-positiva e gram-negativa.
Figura 2: Divulgação internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
(KPC) produtoras de Enterobacteriaceae.
Figura 3: Mecanismos de resistência bacteriana.
Figura 4: Etapas da Reação de PCR.
Figura 5: Mecanismo de semeamento de material biológico oriundos de pacientes
com suspeita de infecção por KPC.
Figura 6: Interpretação resultado do Teste de Hodge Modificado.
Figura 7: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene blaKPC das amostras dos
17 pacientes estudados.
Figura 8: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene blaKPC da mostra A3
estudada.
Figura 9: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene 16S rRNA das amostras
dos 17 pacientes estudados.
Figura 10: Gel de agarose a 2% da digestão do amplicon do gene 16S rRNA das
amostras com a enzima HaeIII, evidenciando diversos fragmentos próximos a 200
pb.
Figura 11: Infecção por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no
HRAN, no período de 2010 á 2011.
Figura 12:Isolado de KPC segundo desfecho clínico dos 17 pacientes investigados
no HRAN, no período de 2010 á 2011.
Figura 13: Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes
investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
Figura 14:Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes
investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Critérios Interpretativos para testes de sensibilidade.
Tabela 2: Número de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais.
Tabela 3: Reagentes utilizados para realização da reação de PCR do gene blaKPC.
Tabela 4: Reagentes utilizados para realização da reação de PCR do gene
universal.
Tabela 5: Reagentes utilizados para realização da digestão do gene universal.
Tabela 6 - Distribuição das variáveis estudadas: perfil genético, sexo, coleta,
tipificação de microrganismos e análise da resistência bacteriana segundo o
desfecho clínico. Brasília-DF, 2010 a 2012.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Cíclico
BRMD- Bactérias multirresistentes
CCIH- Comissão de Controle de Infecção Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentração Inibitória Mínima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Ácido Desoxirribonucléico
E. coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et. al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K. ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K. oxytoca- Klebsiella oxytoca,
K. planticola- Klebsiella planticola
K. pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K. terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Não Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
N/A- Não se aplica
Oligo- Oligonucleotídeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteínas de ligação à penicilina.
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
PFGE - "Pulsed-Field Gel Electrophoresis" (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimórfico amplificado
aleatoriamente)
RFLP’s - “Restriction Fragment Length Polymorphisms”( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restrição)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibióticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 15
1.1. Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) ...................... 15
1. 2. Resistência bacteriana ................................................................................ 20
1.3. Análise genética de microrganismos ............................................................ 27
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 30
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 31
3.1. Objetivo geral. .............................................................................................. 31
3.2. Objetivos Específicos: .................................................................................. 31
4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 32
4. 1.
Coleta e transporte das amostras biológicas ............................................ 32
4. 2. Procedimentos para confirmação de resistência bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC, 2004) ........................................................................ 32
4. 2. 1.
Interpretação dos Resultados ............................................................. 33
4. 3. Teste de susceptibilidade aos antibióticos ................................................... 34
4. 4.Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC, 2004) ............................ 35
4.4.1
4.4.2
Controle de qualidade (C.Q) ..................................................................... 35
Interpretação/Resultados ....................................................................... 35
4. 5. Extração de DNA bacteriano ........................................................................ 37
4. 6. Iniciadores e reação de PCR ....................................................................... 38
4. 7. Digestão ....................................................................................................... 41
4. 8. Eletroforese em gel de agarose ................................................................... 41
4. 9. Descarte de resíduos ................................................................................... 42
5.
4. 10.
Aspectos epidemiológicos e clínicos ......................................................... 42
4. 12.
Análises estatísticas ................................................................................. 42
4. 13.
Preceitos éticos......................................................................................... 43
RESULTADOS .................................................................................................. 44
5.1. Análise molecular ......................................................................................... 44
5. 1. 1. Gene blaKPC ......................................................................................... 44
5. 1. 2. Gene 16S rRNA ..................................................................................... 45
5. 2. Análises epidemiológicas ............................................................................. 46
5. 2. 1. Sexo ....................................................................................................... 46
5. 2. 2.
Desfecho clínico ................................................................................. 47
5. 2. 3.
Local da coleta ................................................................................... 48
5. 2. 4.
Microrganismo .................................................................................... 48
6.
DISCUSSÃO ...................................................................................................... 53
7.
CONCLUSÃO .................................................................................................... 57
15
1.
INTRODUÇÃO
1.1.
Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella
pneumoniae
pertence
á
família
Enterobacteriaceae,
encontrado em locais como água, solo, plantas e esgoto. São encontradas cinco
espécies, K. pneumoniae, K. oxytoca, K. planticola, K. terrigena e K. ornithinolytica.
O gênero Klebsiella é definido como contendo bacilos Gram-negativos, não móveis,
em
forma
de
bastão
e
geralmente
encapsuladas,
que
produzem
lisina
descarboxilase, mas não produzem ornitina descarboxilase. Provavelmente a
colonização em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais, podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias. Pessoas imunocomprometidas, a bactéria encontra um ambiente favorável
para seu crescimento, levando aos quadros de infecção (MOREIRA, et. al., 2014).
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) é uma enzima produzida por
enterobactérias gram-negativas, sendo um mecanismo de resistência aos antimicrobianos
carbapenêmicos
meropenen,
ertapenen
e/ou
imipenen;
classe
amplamente utilizada no tratamento de infecções envolvendo Enterobacteriaceae.
Ela também é capaz de inativar os agentes β-lactâmicos: cefalosporinas, penicilinas
e o aztreonam (COTRIM, et. al., 2012).
Devido à semelhança estrutural e estereoquímica, os antibióticos betalactâmicos possuem um mecanismo de ação comum ao grupo. Eles atuam inibindo
a síntese da parede celular bacteriana, através do mecanismo de bloqueio da
transpeptidação
responsável
pela
união
dos
componentes
individuais
do
peptidoglicano, conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI, et. al., 1999).
A ação destes antibióticos é através de ligações covalentes com as proteínas,
as Penicilim-Binding-Protein (proteína de ligação da penicilina- PBP ou PLP), que se
encontram presentes na membrana citoplasmática de todas as bactérias. Devido às
mutações, ocorre uma indução na alteração dessas proteínas, podendo determinar
uma diminuição da afinidade dos beta-lactâmicos às mesmas. A ação dos
carbapenêmicos é através da sua ligação às PBPs presentes na parede bacteriana,
especialmente as PBP1 e PBP2, provocando a lise osmótica da bactéria. Além
disso, eles têm uma facilidade na penetração da bactéria, por meio dos canais
porínicos presentes nas bactérias gram-negativas, induzindo um efeito pós-
16
antibiótico. Quando comparados com outros beta-lactâmicos, os carbapenêmicos
são mais resistentes à hidrólise pela maioria das beta-lactamases, tanto
cromossômicas como plasmídicas (LIVERMORE, 1995; LIVERMORE, et. al., 2000).
Figura 1: Ação do ß-lactâmico sobre a bactéria gram-positiva e gramnegativa.
Fonte:
<<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle
/opas_web/modulo3/gramn_lacta2.htm> (adaptado)
A bactéria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL, pode
expressar resistência a até 95% dos antimicrobianos existentes no âmbito
farmacêutico, sendo a produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bactéria, uma das principais causas de falha terapêutica. Existem outras
formas de resistência emergentes, de grande importância, como a produção de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato cíclico (AmpC), que hidrolizam
cefoxitina; as carbapenemases, como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA, et. al., 2014).
O mecanismo de resistência mais comum aos antibióticos beta-lactâmicos de
amplo espectro é a produção de ESBL por enterobactérias. A ação hidrolítica
apresentadas por estas enzimas pode conferir, clinicamente, resistência ao
aztreonam, cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON, et. al., 2005). As
ESBL são enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissíveis entre as
espécies). Os principais microrganismos produtores de ESBL são Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada), Escherichia coli e Proteus mirabilis, podendo ocorrer
em outros membros da família Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos não
entéricos, como Acinetobacter ssp (TURNER, 2005). A importância clínica médica
destes microrganismos portadores de ESBL é que, graças ás suas resistências a
muitas classes de antimicrobianos, o tratamento de infecções é difícil, gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH, et. al., 2004).
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos, no ano de 1996, em Klebsiella pneumoniae, dando então
este nome a enzima. Em pouco tempo ela disseminou por outras regiões e
recentemente, tornou-se uma das preocupações quanto à saúde pública mundial.
Os países de onde KPCs têm sido relatados desde 2001 são mostrados na figura 2,
apresentando como os organismos têm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA, et. al., 2011).
18
Figura 2: Divulgação internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et. al., 2011).
Este mapa apresenta países onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatórios publicados disponíveis a partir de 11 fevereiro de
2011. Os países não destacadas nesta figura também podem apresentar a presença
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC, porém, pode ter tido uma falta de
vigilância sistemática para estes organismos ( NEIL GUPTA, et. al., 2011).
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bactérias
produtoras de carbapenemases. Após 6 anos deste primeiro relato, elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso país. Em janeiro de 2011, foram notificados no
Distrito Federal/Brasil, 367 casos em um curto espaço de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011), com 26 óbitos. A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva – UTI (COTRIM, et. al., 2012).
O potencial de disseminação da KPC é alto, devido à grande capacidade de
transferência do seu material genético, e, por conseguinte, os genes de resistência.
O controle de epidemias é difícil devido a esta característica de fácil disseminação,
preocupando os profissionais da área de saúde, devido à dificuldade de tratamento,
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade. Apesar da maior
19
freqüência em Klebsiella pneumoniae, a KPC pode ser identificada em outras
bactérias, como a Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Salmonella spp., E. coli
e Pseudomonas spp. (DIENSTMANN, et. al., 2010).
Os
pacientes
com
comorbidades
incluindo
pacientes transplantados,
neutropênicos, em ventilação mecânica, em Unidade de Terapia Intensiva (UTI),
com longos períodos de internação que apresentam risco aumentado de infecção ou
colonização para bactérias multirresistentes; são mais vulneráveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM, et. al., 2012).
Os sinais e sintomas apresentados por um indivíduo infectado por KPC são
febre ou hipotermia, taquicardia, piora do quadro respiratório e em casos mais
graves hipotensão, inchaço e sepse. Quanto ao sítio de infecção, a bactéria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada à ventilação mecânica,
infecção do trato urinário, infecção de corrente sanguínea, infecção de partes moles
e outros tipos de infecção (COTRIM, et. al., 2012)
Para desenvolver a infecção, a colonização é um pré-requisito, porém o
pacientes pode estar colonizado, ou seja, ser portadores de KPC, e não desenvolver
a infecção (ALVES, et. al., 2013).
A forma de transmissão é basicamente por
contato com secreção ou excreção de pacientes infectados ou colonizados, logo,
fora do ambiente hospitalar, a bactéria não representa perigo (COTRIM, et. al.,
2012).
As opções terapêuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae, é
dividida em: Terapia Empírica e Terapia após a determinação do perfil de
sensibilidade. A terapia empírica para infecções por enterobactérias multirresistentes
se baseia na utilização de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associação
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosídeos
(gentamicina ou amicacina), Carbapenêmicos (meropenem ou doripenem) e/ou
tigeciclina (ANVISA, 2013).
Recomenda-se usar sempre associações de dois ou três antimicrobianos,
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina). Deve-se evitar a
utilização de monoterapias pelo risco de rápido desenvolvimento de resistência. A
escolha do(s) fármaco(s) de associação com polimixina B ou E deve se basear,
preferencialmente,
no
perfil
de
susceptibilidade
esperado
aos
referidos
20
medicamentos das enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos detectadas no
hospital ou, na ausência de dados locais, na região. Deve-se considerar igualmente
o local de infecção e a penetração esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinação (ANVISA, 2013).
Após a liberação do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos. Sempre que possível, manter no mínimo 2 (dois) fármacos com
sensibilidade comprovada in vitro. Não havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas à polimixina B ou E), recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenêmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina, na tentativa de ocorrência de sinergismo entre elas
(ANVISA, 2013).
Sugere-se além da determinação das Concentrações Inibitórias Mínimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E), que também sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenêmicos (meropenem), bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissão de Controle de Infecção Hospitalar- CCIH) para a
determinação da terapia combinada com base na interpretação do antibiograma /
CIM e quadro clínico do paciente. No caso de resistência às polimixinas
(concentrações inibitórias mínimas [CIMs] > 2 mg/L), recomenda-se a associação de
dois ou três do antimicrobianos sugeridos para a combinação (ANVISA, 2013).
A antissepsia eficiente do ambiente, dos instrumentos cirúrgicos e das mãos
com o uso do álcool a 70%, é fundamental para a contenção de surtos. Além disto,
os pacientes contaminados devem permanecer isolados, até o controle da infecção,
para evitar a disseminação da bactéria (COTRIM, et. al., 2012).
1. 2. Resistência bacteriana
Hoje a disseminação e a proliferação das bactérias resistentes estão cada
dia mais presente. As bactérias multirresistentes (BRMD) poderão levar à
humanidade a uma era pós-antibiótica, resultando em uma ausência de qualquer
opção de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE, et. al., 2014).
Os fatores envolvidos na disseminação desses patógenos multirresistentes
são diversos, incluindo o uso irracional de antimicrobianos, procedimentos invasivos
21
(cirurgias, implantação de próteses médicas e outros) e a transferência de material
genético com a informação de resistência a antibióticos entre as bactérias
(DIENSTMANN, et. al., 2010; ENDIMIAMI, et. al., 2009; FONTANA, et. al., 2010).
Com
nosocomiais,
a
prática
os
da
antibioticoterapia,
mecanismos
de
resistência
principalmente
tornaram-se
em
ambientes
comuns.
Esses
mecanismos incluem: alteração na permeabilidade da membrana celular, que
impede a entrada do antibiótico na célula, bombeamento do antibiótico para fora da
mesma, pelo mecanismo de efluxo; mutação genética que altera de alguma forma o
alvo do antibiótico e, conseqüentemente, não afeta o funcionamento da bactéria,
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativação do
antibiótico (COTRIM, et. al., 2012). Estes mecanismos estão representados na figura
3.
Figura
3:
Mecanismos
de
resistência
bacteriana.
Fonte:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle/
opas_web/modulo3/pop_mecanismo.htm>.
Um dos mais importantes mecanismos de resistência é a alteração do localalvo onde atua determinado antimicrobiano, de modo a impedir a ocorrência de
qualquer efeito inibitório ou bactericida. As bactérias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos, substituindo o alvo original,
por exemplo, o Staphylococcus aureus resistente à oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossômico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactâmicos, denominada 2a ou 2', que é suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento, quando outras PBPs
essenciais são inativadas por antibimicrobianos β-lactâmicos. Como alternativa, um
gene recém-adquirido pode atuar para modificar um alvo, tomando-o menos
vulnerável a determinado antimicrobiano. Assim, um gene transportado por
plasmídeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligação dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA,
2007).
Em função da bomba de efluxo, pode variar a especificidade do antibiótico.
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para
o
extracelular,
gerando
uma
resistência
bacteriana
a
determinados
antimicrobianos, como é o caso da resistência às tetraciclinas codificada por
plasmídeos em Escherichia coli, devido à presença de proteínas integrantes da
membrana plasmática bacteriana (PIDDOCK, 2006).
O aumento da síntese de proteínas é o principal responsável pela resistência
antimicrobiana devido às várias mutações que ocorrem em seus repressores
transcricionais. Estas mutações também podem influenciar levando a um aumento
da eficiência do transporte dos antibióticos para o exterior da célula (HARBOTTLE,
et. al., 2006).
A resistência aos antibióticos é freqüentemente associada à alteração/
diminuição da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bactérias gramnegativas. O fluxo de moléculas para o interior da célula ocorre por características
peculiares como carga, estrutura e dimensão e através de proteínas de membrana,
as quais formam canais. Este percurso é utilizado pelos antibióticos para atingir o
interior da célula bacteriana ou o espaço periplasmático como é o caso dos
antibióticos β-lactâmicos. Portanto, a perda de função destas proteínas, pode
efetivamente causar a diminuição da susceptibilidade a vários antibióticos
(LIVERMORE, 2003).
23
Os mecanismos de resistência que podem impedir a ação de antimicrobianos
são vários. O fármaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicação
e sobrevivência da célula bacteriana, como a membrana citoplasmática e,
conseqüentemente, bloqueando a síntese protéica, de ácidos nucléicos e da parede
celular. A resistência bacteriana é um mecanismo natural de defesa. Sendo assim,
as bactérias estão em constante defesa, e para cada novo fármaco desenvolvido, as
bactérias irão desenvolver resistência em algum momento (POSSEBON, et. al.,
2003).
O grupo de antibióticos beta-lactâmicos são amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevância
clínica. No entanto, o seu uso tem sido restringido devido a vários mecanismos de
resistência. O desenvolvimento dos carbapenêmicos surgiu devido à proliferação de
beta-lactamases, mediadas por plasmídeos e cromossomos (POSSEBON, et. al.,
2003).
A bactéria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a característica de
resistência a quase todos os tipos de antimicrobianos, inclusive os carbapenêmicos,
específicos para o tratamento de infecções por bactérias multiresistentes e
emergências. Mesmo com no seu código genético a informação necessária para o
desenvolvimento da resistência, a resistência da bactéria só é desenvolvida caso a
bactéria entre em contato com o antibacteriano, desencadeando todo o processo,
nos casos de resistência induzida, comuns em KPC (MOREIRA, et. al., 2014).
A resistência bacteriana pode ser apresentada de forma intrínseca ou
adquirida. A resistência intrínseca faz parte das características fenotípicas/ naturais
do microrganismo, ou seja, faz parte de sua herança genética sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da característica. A presença ou ausência do alvo
para a ação da droga é o principal determinante deste tipo de resistência.
(MOREIRA, et. al., 2014). Essa resistência corresponde a uma característica de
espécie bacteriana, quando estes microrganismos são naturalmente resistentes a
certo tipo de antibiótico. Este processo é decorrente da ausência de estruturas de
atuação de antimicrobianos ou a impermeabilidade, por parte de estruturas
periféricas das bactérias (HENRIQUE, et. al., 2014).
24
A resistência adquirida aos antibióticos, por sua vez, ocorre quando há uma
da mutação de genes reguladores ou estruturais, aquisição de genes de resistência
veiculados por elementos genéticos móveis ou da combinação entre eles. Este
aparecimento de resistência em uma espécie bacteriana era anteriormente sensível
a droga, e devido a um destes fatores se torna resistente. O fenótipo resultante
desta resistência não estará presente nas células genitoras, e sim nos indivíduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptível. Os genes muitas
vezes são adquiridos por meio de elementos móveis, como plasmídeos e
transposons (MOREIRA, et. al., 2014).
Então, a resistência adquirida ocorre por diversos mecanismos genéticos, tais
como: produção de enzimas inativadoras, interferência com a entrada e acúmulo de
droga na bactéria, alteração do receptor para ação da droga, via metabólica
alternativa. É originada por meio de uma alteração a nível genético da célula, de
natureza cromossômica pelos processos de mutação, transdução e transformação
ou extra cromossômica (plasmidial) (HENRIQUE, et. al., 2014).
Como todo antibiótico β-lactâmico,os carbapenêmicos tem como mecanismo
de ação a inibição da síntese protéica, através da ação de inibição da parede
microbiana, fazendo a ligação e inativação das proteínas ligadoras de penicilinas
(NETO, et al., 2007).
Imipenem
e
meropenem,
antibióticos
pertencentes
ao
grupo
dos
carbapenêmicos, possuem um amplo espectro de ação in vitro, incluindo atividade
contra cocos gram-positivos, bacilos gram-negativos e bactérias anaeróbias (MOHR,
2008). Já o ertapenem, possui um espectro de ação mais limitado que o os dois
antibióticos anteriormente citados, tendo uma eficiência limitada contra os bacilos
gram-negativos não fermentadores. Um novo antibiótico carbapenêmico ainda não
disponível no Brasil, doripenem, possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa, devido ao seu mecanismo de ação que combina os
espectros de ação de imipenem e meropenem (ZHANEL, et. al., 2007).
Devido as suas estabilidades, espectro de ação, poucos relatos de
resistência, boa tolerância pelos pacientes, com efeitos adversos mais comuns as
complicações no sítio da infusão e toxicidade gastrintestinal; estes antibióticos
carbapenêmicos têm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU, 2008). Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobactérias, o índice de resistência aos
carbapenêmicos tem aumentado nos últimos anos de forma proporcional ao seu
uso, limitando imensamente as opções terapêuticas para as infecções causadas por
estes microrganismos (FALAGAS, et. al., 2009).
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactâmico,
tornando este mecanismo de resistência o mais importante. Os dois grupos mais
preocupantes são o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases, que além de hidrolizar os carbapenêmicos, hidrolizam todas as
outras classes de betalactâmicos. Em enterobactérias, as carbapenemases mais
prevalentes são codificadas por genes dos grupos blaKpc, blaIMP, blaVIM, blaNdm
e blaOxa . A ocorrência de carbapenemases é mais frequentemente em bactérias
gram-negativas fermentadoras da glicose, conhecidas como enterobactérias,
predominantes
nos
gêneros
Klebsiella,
Serratia,
Citrobacter,
Enterobacter,
Escherichia, Samonella, Proteus, Morganella . Podem ser encontradas também em
bactérias gram-negativas não fermentadoras, como espécies de Acinetobacter, e de
Pseudomonas (ALVES, et. al., 2013).
Carbapenemases são enzimas plasmídio-mediados resistentes a todos
antibióticos betalactâmicos. As bactérias que possuem o gene blaKpC, responsável
pela codificação da produção de carbapenemases, apresentam resistência aos
antibióticos betalactâmicos, impedindo a ação destes antibióticos contra infecções
(ALVES, et. al., 2013).
A transmissão das carbapenemases a diferentes cepas de enterobactérias se
dá através de plasmídeos, que são pequenas moléculas circulares de DNA, com a
capacidade de se replicarem, independentemente do DNA cromossômico,
permitindo a troca de material genético entre gêneros e espécies diferentes de
enterobactérias. O rápido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares é
explicado por essa disseminação plasmidial (COTRIM, et. al., 2012).
De acordo com o critério de interpretação do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2009), a maioria das KPC isoladas não apresenta
resistência completa aos carbapenêmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 2-8 μg/mL) (COTRIM, et. al., 2012).
26
Os
mecanismos
de
resistência
capazes
de
impedir
a
ação
dos
carbapenêmicos são vários. Porém, a degradação de antibióticos por enzimas
principalmente as carbapenemases, constituem o principal mecanismo de
resistência aos antibióticos β-lactâmicos (DIAS, 2009). Devido a ampla atividade
hidrolítica à maioria dos antibióticos β-lactâmicos, estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM, et. al., 2007).
Existem
três
grandes
classes
moleculares
de
Ambler,
a
qual
as
carbapenemases pertencem denominadas: classe A (serino-carbapenemases, os
quais incluem membros designados SME, IMI, NMC, GES e a família das KPCs);
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases, similares as da classe A, e incluem as OXA e PSE) (DIAS, 2009).
Dentre estes, as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmídeos
de Klebsiella pneumoniae são as KPC (DIENSTMANN, et. al., 2010). Por meio de
estudos moleculares, a enzima KPC já foi documentada em diferentes bactérias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL, et. al., 2011). No ano de 2009, foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases: KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae; KPC-2 em K. pneumoniae, K. oxytoca, Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K. pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO, et. al., 2009). As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO, et. al., 2009).
Foi observada uma correção da seqüência KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 são idênticos. Três novas variantes blaKPC-3, blaKPC-4 e
blaKPC-5, são resultados de mutações do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER, et. al., 2008), apresentando diferentes perfis de hidrólise. As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiência em hidrolisar cefalotina, cefaloridina e
nitrocefin, porém possuem uma menor eficiência contra carbapenêmicos e
cefotaxima (ALBA, et. al., 2005). As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidrólise de carbapenêmicos é do que em KPC-2. Em contrapartida, possuem
melhor eficiência contra ceftazidima e uma maior inibição pelo ácido clavulânico
(WOLTER, et. al., 2008).
27
1.3.
Análise genética de microrganismos
É de extrema importância prática, não só no aspecto clínico, mas também na
fitopatologia, biotecnologia e estudos ambientais; a correta identificação e
classificação de microrganismos. Os métodos usados na diferenciação de gêneros,
espécies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em métodos fenotípicos
(baseados em fenômenos bioquímicos, fisiológicos e biológicos) e genotípicos
(detectam polimorfismos ao nível dos ácidos nucléicos, ou variação alélica ao nível
de enzimas) (ALVES, et. al., 2003).
Para este tipo de estudo, existem alguns métodos como o RFLP’s “Restriction Fragment Length Polymorphisms” (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restrição); rep-PCR (Método de tipagem baseado na amplificação via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos); análise
de seqüências nucleotídeas (discriminação e/ou identificação através de seqüências
de DNA); PFGE - "Pulsed-Field Gel Electrophoresis" (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S, et. al., 2003).
A diferenciação clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade, devem
ser características de qualquer método de tipagem genética. Porém, nem todos os
métodos moleculares de tipagem são igualmente eficazes. Sendo assim, de acordo
com a finalidade pretendida (identificação, diferenciação, custo, reprodutibilidade,
etc.), é feita a escolha do método a ser aplicado (A L V E S, et. al., 2003).
O processo de identificação fenotípica de KPC entre os membros da família
Enterobacteriaceae ainda é difícil, e os métodos para a sua identificação devem ser
revistos e ajustados. Mesmo com o avanço tecnológico, não existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecção destas enzimas. São
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC; como por exemplo, a
focalização isoelétrica, a técnica de disco-difusão, E-test, teste de Hodge
modificado, dentre outros. Além disso, a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os sistemas de automação
existentes, no entanto, podem não identificar com precisão os isolados KPC
positivos (COTRIM, et. al., 2012).
A identificação blaKPC pelo PCR é um método rápido, preciso, sensível e
altamente específico; no entanto, a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnóstico molecular, dificultando ainda a utilização dele na
rotina dos laboratórios de microbiologia (COTRIM, et. al., 2012).
Em estudo de infecções hospitalares, identificação molecular de patógenos
bacterianos é bastante utilizada. Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME, NMC-A-IMI, e GES; é necessário um exame molecular.
As identificações do microrganismo, juntamente com a triagem molecular, irão definir
um resultado mais específico, podendo ser usado para identificar o antibiótico mais
adequado para o tratamento. Porém, a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR, por exemplo, é que devido à sua limitada capacidade de
multiplexação, eles distinguem apenas algumas variações (MOREIRA, et. al., 2014).
Estão descritas para a identificação molecular de patógenos pertencentes à
família Enterobacteriaceae as técnicas de PFGE, RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus).
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) é considerada padrão ouro devido sua
alta capacidade de diferenciação, baseada na análise do perfil de restrição do DNA
genômico por meio de eletroforese. Como desvantagem, para a sua execução é
necessários vários dias, impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
à degradação do DNA, além do alto custo empregado (MOREIRA, et. al., 2014).
O método baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a técnica de PFGE. Esta técnica consiste na análise do padrão de
amplificação de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano. Isto
permite uma maior rapidez na obtenção de resultados quando comparada com o
PFGE, além de alta reprodutibilidade, simples execução e implementação, baixo
custo e não sem problemas com a degradação do DNA (MOREIRA, et. al., 2014).
A PCR é considerada uma técnica de biologia molecular revolucionária, que
consiste na síntese enzimática de cópias de ácidos nucléicos. Ela permitiu o rápido
desenvolvimento do estudo de seqüências de ácidos nucléico. Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis, que ganhou o prêmio Nobel de química de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa técnica em abril de 1983 (CAMARGO, et. al., 2014).
Por meio de etapas de variação de temperatura, a técnica de PCR promove a
duplicação de cadeias de DNA in vitro. A reação de amplificação de DNA por PCR
envolve o emprego de seqüências iniciadoras (primers), quatro nucleotídeos
29
(dNTP’s) do DNA e uma DNA polimerase termoestável; podendo assim, obter-se a
partir de uma fita molde, muitas cópias de uma seqüência específica de ácido
nucléico. O princípio da PCR consiste na variação de temperatura por ciclo,
envolvendo três etapas básicas: desnaturação, pareamento e amplificação
(CAMARGO, et. al., 2014).
A desnaturação da fita molde de DNA é uma etapa com duração entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ºC a 96 ºC. Após isso, o pareamento de
dois iniciadores sintéticos de composições distintas, que funcionam como os
iniciadores da reação de polimerização, liga-se à região complementar da fita de
DNA alvo que sofrerá a duplicação. Esta etapa tem duração de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ºC e 65 ºC. Por último, a amplificação por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA, se dá a partir de cada um dos
iniciadores, utilizando os quatro dNTP’s como substrato da reação de polimerização.
Esta etapa possui duração entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ºC. Cada ciclo é
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificação da região alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sintéticos de DNA (CAMARGO,
et. al., 2014). Estas etapas estão demonstradas na figura 4.
Figura 4: Etapas da Reação de PCR.
30
2.
JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecção por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Saúde do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais públicos e particulares. Um desafio encontrado por ocasião do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reação da
Polimerase em Cadeia, sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz, no Rio de Janeiro.
Pesquisas que possam contribuir na elaboração de estratégias preventivas e
de intervenção para infecções causadas por enterobactérias, bem como, contribuir
para gerar uma integração benéfica entre a equipe acadêmica e os serviços de
saúde, devem ser estimuladas. Neste sentido, o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressão de carbapenemases presentes em espécies de
enterobactérias isoladas em ambiente hospitalar, visto que elucidar genes de
resistência de enterobactérias aos antibióticos carbapenêmicos é o primeiro passo
para garantir um controle epidemiológico efetivo para estes tipos de microorganismo,
assim como sua associação com surtos fatais, particularmente em pacientes com
baixa imunidade.
31
3.
OBJETIVOS
3.1.
Objetivo
geral:
Caracterizar
os
genes
de
resistência
das
Enterobactérias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemiológicos de
pacientes internados em um hospital público do Distrito Federal.
3.2.
Objetivos Específicos:
 Identificar
genotipicamente
a
enzima
KPC
(Klebsiella
pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae.
 Investigar
aspectos
epidemiológicos
dos
pacientes
portadores
de
Enterobactérias produtoras de carbapenemases.
 Identificar quais variáveis relativas à infecção bacteriana influenciaram para o
desfecho óbito ou alta.
 Avaliar
a
susceptibilidade
das
Enterobactérias
carbapenêmicos dos pacientes em ambiente hospitalar.
aos
antibióticos
32
4.
MATERIAIS E MÉTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobactérias aos antibióticos carbapenêmicos, a partir dos
materiais biológicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratório de Análises Clínicas da mesma Instituição.
Os materiais biológicos investigados foram sangue, aspirado traqueal ou brônquico,
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central. O HRAN é um
hospital público do Distrito Federal com 395 leitos, sendo as clínicas de internação:
Berçário, Cirurgia Geral, Cirurgia Plástica, Clínica Médica, Ginecologia, Maternidade,
Pediatria, Queimados, UTI; com atendimento a pacientes portadores de doenças de
caráter clínico e cirúrgico.
4. 1. Coleta e transporte das amostras biológicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecção por KPC. A identificação primária foi
realizada pelo Laboratório de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificação encontram-se descritos
abaixo.
4. 2. Procedimentos para confirmação de resistência bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC, 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bactéria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem, como forma de
triagem. Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuída em uma pequena área da placa de ágar MacConkey para após o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonização por enterobactérias resistentes
aos carbapenêmicos (Pesquisa de CRE). Procedeu-se a semeadura por técnica
semi-quantitativa/esgotamento com alça bacteriológica na diluição de 1:100. O disco
de Ertapenem foi colocado na superfície da placa de MacConkey na junção dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5. Incubou a placa
33
em estufa aeróbia a 35ºC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusão do
disco de Ertapenem na placa para proceder à leitura.
O teste deixou de ser obrigatório após a modificação dos critérios
interpretativos para carbapenêmicos para enterobactérias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U.
Figura 5: Mecanismo de semeamento de material biológico oriundos de
pacientes com suspeita de infecção por KPC. Fonte: adaptado CDC, 2004.
4. 2. 1.
Interpretação dos resultados
Na ausência de crescimento até 24 horas (MacConkey) ou halo de difusão
>27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas. Quando for
ausente o crescimento após 48 horas ou halo de difusão >27 mm na placa libera-se
como
enterobactérias
resistentes
a
carbapenêmicos
(KPCNEG).Havendo
crescimento de colônias na placa de MacConkey com halo < 27 mm (apenas para
colônias com crescimento dentro do halo), deve-se reisolar e realizar identificação e
antibiograma automatizado, teste de sensibilidade por disco-difusão e Teste de
Hodge Modificado (THM). Os isolados de enterobactérias cujos testes comprovarem
a resistência aos carbapanêmicos testados (KPCPOS), foram reportado a Comissão
de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH). Já osbacilos Gram-negativos não
fermentadores não foram reportados (KPCNEG). Para interpretaçãodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1.
Tabela 1. Critérios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTÉRIAS
Disco difusão (mm)
MIC (µg/ml)
34
Antibiótico
Sigla
S
I
R
S
I
R
Ertapenem 10
µg
ETP
22
1921
18
0.5
1
2
Meropenem 10
µg
MEM
23
2022
19
1
2
4
Fonte: Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI),
2013
Os resultados que apresentaram resistência ao antibiótico Ertapenem, foram
considerados como suspeitos de contaminação por KPC. Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibióticos (TSA) em aparelho automatizado; MicroScan Walk
Away 96sl, Dade Behring.
4. 3. Teste de susceptibilidade aos antibióticos (adaptado CDC, 2004)
A determinação da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibióticos (TSA), após cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliação da sua pureza e obtenção de colônias isoladas. Para
preparação de uma suspensão bacteriana com turvação aproximada de 0,5
McFarland (Dade Behring,MicroScan®Turbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colônias em 2ml de soro fisiológico estéril diluindo a 1:100 em soro fisiológico num
volume total de 10ml; em seguida, foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundação.
Os
discos
de
antibiótico
carbapenêmicos,
imipenem, meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxílio de um dispensador automático. A
susceptibilidade das Enterobactérias aos carbapenêmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011).
Para aquelas Enterobactérias que apresentaram resistência ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecção de Enterobactérias
Produtoras de Carbapenemases, conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC, 2004).
35
4. 4.Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC, 2004)
Preparou-se uma suspensão em salina estéril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padrão 0.5 de McFarland). Após isto, diluiu a suspensão 1:10 em
salina (0.5 ml da solução de E.coli ATCC 25922 + 4.5 ml salina).Foi então, semeado
na superfície de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensão diluída de E.coli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco, assegurando que houvesse uma
distribuição uniforme cobrindo toda a superfície do Agar. Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambiente.Colocou-se o disco de ertapenem 10µg no centro
da placa, e após isto, fez-se uma estria linear da cepa a ser testada, da borda do
disco até a borda da placa utilizando uma alça calibrada 10 µl ou um swab. Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeróbia a 35 ± 2ºC por 16 a 24 horas.
4.4.1 Controle de qualidade (C.Q)
Foi utilizado um C.Q todos os dias em que se realizou o teste, tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo; Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo.
4.4.2 Interpretação/Resultados
Após 16–24 horas de incubação, examinar as placas para verificar a presença
de uma distorção no halo de inibição do disco de ertapenem devido ao crescimento
realçado da cepa ATCC na intersecção do organismo teste e a E.coli ATCC 25922
dentro dos limites do halo. O THM positivo apresentará presença de distorção no
halo de inibição de ertapenem devido ao crescimento da cepa E.coli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibição. Já o THM
negativo, terá ausência de crescimento da cepa E.coli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibição do disco de ertapenem.
Este resultado está representado na figura 6.
36
Figura 6: Interpretação resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC, 2004). Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa; teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa.
Tendo positivo como resultado, o paciente era um provável contaminado por
KPC. As amostras então foram encaminhadas para a Fundação Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmação final. As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas clínicas do
hospital. Após a autorização do CEP, amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa térmica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratório de microbiologia clínica da universidade.
No laboratório da universidade, as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h. As colônias características
forão isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h. Após isto, foram
executadas as análises a seguir.
Os isolados de Enterobactérias produtoras de carbapenemases foram
submetidos à extração de DNA e posterior seqüenciamento para identificação dos
genes de resistência blaKPC de 1 a 13 e identificação do gene universal. Os
pacientes de onde os materiais biológicos contendo as Enterobactérias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemiológicos e clínicos.
37
4. 5. Extração de DNA bacteriano
A extração de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmid® (MN). Antes de iniciar a extração foi feito a preparação das soluções/
reagentes, materiais e amostras (vortexando), colocou-se em banho-maria à 50ºC o
tampão AW. Partiu-se de colônias isoladas cultivadas, que sofreram passagem em
meio LB líquido por 12h. Adicionou-se 1,5 mL da amostra no tubo eppendorf,
centrifugou por 5 minutos, descartou o sobrenadante (com cuidado para não
descartar o Pellet). Repetiu-se este procedimento por mais três vezes, completandose o volume de 6mL. Foram adicionados 250µL do tampão Resuspension Buffer A1,
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampão tem como função
separar a formação de grumos celulares). Após isso, homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs. Após isso, foram adicionados 250µL do tampão Lysis Buffer A2,
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa é importante para a lise
da parede e da membrana celulares, e liberação do conteúdo da célula).
Passado o tempo de descanso, foi adicionado 300µL do tampão
Neutralization Buffer A3, homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampão
irá retirar as proteínas que envolvem o DNA e voltará com o pH para próximo de 8,
impedindo que a solução de lise facilite a quebra das ligações covalentes do ácido
nucléico). Em seguida, enumeraram-se os tubos contendo filtros com sílica;
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos. Descartou-se
o que foi filtrado, adicionou 500µL do tampão AW (banho-maria); centrifugou por 2
minutos. Novamente, foi descartado o filtrado. Adicionou-se 600µL do tampão A4,
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampões AW e A4 contêm
isotiocianato de guanidina, em concentrações crescentes, para facilitar a adsorção
do DNA na sílica e retirada das outras biomoléculas da amostra). Foi feita outra
centrifugação com o tubo vazio. Após isto, o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo, onde foi adicionado 50µL do tampão Elution Buffer AE (este tampão
favorece a eluição do DNA), centrifugou por 2 minutos, descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ºC.
38
4. 6. Iniciadores e reação de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em seqüências conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT, et. al, 2001).
Baseado
(AF297554.1),
na
seqüência
o
para
o
oligonucleotídio
blakpc-1
depositada
no
GenBank
(oligo)
iniciador
direto
(5'-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3’) foi desenhado para reconhecer a seqüência
blaKPC
na
posição
(131..149),
enquanto
que
o
iniciador
reverso
(5'-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3’) foi reconhecido na posição (995..1012). As análises
baseadas em alinhamento de seqüências mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2.
Tabela 2: Número de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais.
Número
de
Microrganismo
Alvo
Klebsiella
blaKPC-1
Acesso GenBank
AF297554.1
pneumoniae
GU086225.1
Klebsiella
blaKPC-2
pneumoniae
HQ258934.1
Klebsiella
blaKPC-2-like
pneumoniae
AB557734.1
Klebsiella
blaKPC -3
pneumoniae
EU447304.1
Klebsiella
blaKPC-4
pneumoniae
EU400222.2
Pseudomonas
blaKPC-5
aeruginosa
EU555534.1
Klebsiella
blaKPC-6
pneumoniae
EU729727.1
Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
Klebsiella
FJ234412.1
blaKPC-8
pneumoniae
FJ624872
Escherichia coli
blaKPC-9
GQ140348.1
Acinetobacter
blaKPC-10
baumannii
Klebsiella
HM066995.1
blaKPC-11
pneumoniae
HQ342889.1
Enterobacter cloacae
blaKPC-12
HQ342890.1
Enterobacter cloacae
blaKPC-13
As reações de PCR para a detecção de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturação, em que foi 94ºC por 5 minutos; seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturação, anelamento e polimerização com os
respectivos comandos: 94 ºC por 60 s, 58 ºC por 60 s e 72 ºC por 90 s. Por último,
no processo de extensão, 78ºC por 8 minutos. Além das amostras, foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reação de 25 µL citados na tabela 3. A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb), o que corresponde ao plasmídeo.
Tabela 3: Reagentes utilizados para realização da reação de PCR do
gene blaKPC.
Reagente
Volume
DNA molde
4 µL
Tampão Taq
2,5 µL
MgCl2
0,75 µL
Mistura dos 4 nucleotídeos-
2 µL
Oligo F
1 µL
Oligo R
1 µL
Taq DNA polimerase
0,5 µL
Água MiliQ
13,35 µL
dNTP
40
Total (em cada ependorff)
25
µL *
* Todos exceto o Controle Negativo (CN).
Baseado na seqüência para o gene 16S rRNA, em que o oligonucleotídio
Universal
iniciador
direto/
foward
(5'-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3’)
foi
desenhado para reconhecer a seqüência universal na posição 1513, enquanto que o
iniciador reverso (5'-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3’) foi reconhecido na
posição 1491, foram realizadas PCR’s. As reações de PCR para a detecção deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos: separação, 94ºC por 10 minutos; 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturação, anelamento e polimerização com os
respectivos comandos: 94 ºC por 60 s, 55 ºC por 60 s e 72 ºC por 120 s. Por último,
no processo de extensão, 72ºC por 10 minutos.
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reação de 25µL, citados na tabela 4. A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb, correspondente á região ribossomal, capaz de amplificar todas
as espécies.
Tabela 4:Reagentes utilizados para realização da reação de PCR do gene
universal.
Reagente
(quantidade/
Volume
concentração do estoque)
DNA molde 10 ng
4 µL
Tampão Taq 10 x
2,5 µL
MgCl2 50mM
1,25 µL
Mistura dos 4 nucleotídeos-
1,25 µL
dNTP 2,5 mM
Oligo F 10µM
0,5 µL
Oligo R 10µM
0,5 µL
Taq DNA polimerase 5U/µL
0,4 µL
Água Miliq
14,6 µL
Total (em cada ependorff)
25
* Todos exceto o Controle Negativo (CN).
µL *
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER.
4. 7. Digestão
Para realização da digestão, foi utilizada a enzima BshF I (Hae III), EN- 1105;
tamanho 7000 units; concentração 10 units/µL; fonte Bacillus sphaericus, empresa
Jena bioscience.Utilizaram-se os componentes para o volume de 50µL da reação
citados na tabela 5.
Tabela 5: Reagentes utilizados para realização da digestão do gene
universal.
Reagente
Volume
Produto de PCR
10 µL
Enzima BshF I
0,1 µL
Tampão (10x)
5 µL
Água Miliq
34,9 µL
Total (em cada ependorff)
50 µL

Valores para 1 digestão
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ºC. Após
isso, fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificação do resultado.
(LU, et. al., 2000)
4. 8. Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA, PCR e digestão foram analisados em gel de agarose
2%. O tempo de corrida do gel é de aproximadamente 1hora e 30minutos, sendo
que no começo foi usada à voltagem de 50 V e após começar a correr o gel,
aumentou a voltagem para 100 v. Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases).
Foi adicionado 3µL de corante Bromophenol (que tem a função de fazer uma ligação
na amostra de DNA e permitir a visualização da corrida no gel de agarose) em 7µL
de amostra, tanto de DNA quanto de PCR. Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Ácido Bórico), agarose e brometo de etídio (sua função é de corante para o gel
e permitir a visualização do DNA, quando colocado à luz ultravioleta). Para o oligo
blaKPC, a banda da amplificação foi em 881ppb, correspondendo ao plasmídeo. Já
o oligo Universal foi em 996 pb.
4. 9. Descarte de resíduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso único e manipulados
em câmaras de segurança biológica classe II. Após o uso, foram colocados em
solução desinfetantes (hipoclorito a 1%), e em seguida, autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavação. Após a finalização do ciclo de
esterilização, os sacos contendo o material descartável foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsável pela coleta de materiais biológicos
produzidos no laboratório de microbiologia. Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 306/2004 sobre o descarte de resíduos de serviço de
saúde.
4. 10. Aspectos epidemiológicos e clínicos
Os aspectos clínicos e epidemiológicos foram investigados por meio de
prontuários
dos
pacientes
portadores
de
enterobactérias
produtoras
de
carbapenemases e envolveram topografia mais provável do foco infeccioso, a
enfermidade motivadora da internação, o desfecho clínico, a idade e o tempo de
internação.
4. 12. Análises eepidemiológicas
As análises foram realizadas com o pacote estatístico SPSS versão 20.0.
Para
verificar
quais
variáveis
referentes
aos
dados
epidemiológicos
e
microbiológicos influenciaram no desfecho, verificou- se a diferença média das
variáveis idade e tempo de internação em cada grupo. O teste estatístico utilizado foi
o teste t de Student, após se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Para
as variáveis sexo, perfil microbiológico das enterobactérias produtoras de
43
carbapenemases, foi avaliada a associação com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher. O nível de significância adotado foi de 5%.
4. 13. Preceitos éticos
Este projeto está inserido em um projeto maior denominado “Epidemiologia
clínica e caracterização molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Único de Saúde”,
que foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Saúde do Distrito Federal (SES/DF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nº
231/09 (anexo).
44
5.
RESULTADOS
5.1.
Análise molecular
Para a amplificação com o oligo blaKPC, foram amplificadas amostras,
que devolveram bandas de amplificação na altura de 881 pb, correspondente ao
plasmídeo. A análise da amplificação da região do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 não amplificou, isso demonstra que esta amostra não
possuía o gene de resistência.
5. 1. 1. Gene blaKPC
Figura 7: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados. A banda amplificada corresponde a
uma região de 881 pb . Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo
A amostra A3 não amplificou no primeiro momento, então, foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel, obtendo então, a amplificação da amostra, como
apresentado na figura 8.
45
Figura 8: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene blaKPC da
mostra A3 estudada. A banda amplificada corresponde a uma região de 881
pb. Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo.
5. 1. 2. Gene 16S rRNA
Para a amplificação do gene 16S rRNA, utilizou-se o oligo universal. Foram
amplificadas amostras, que devolveram bandas de amplificação na altura de 996 pb.
Figura 9: Gel de agarose a 2% da amplificação do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados. A banda amplificada corresponde a
uma região de 996 pb . Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestão com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb. No gel abaixo é
possível evidenciar que este perfil ocorreu, com o predomínio de bandas na altura
de 200pb.
Figura 10: Gel de agarose a 2% da digestão do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII, evidenciando diversos fragmentos
próximos a 200 pb. A banda amplificada corresponde a uma região ribossomal
de 996 pb . Marcador = Marcador de 100pb, CN= controle negativo.
5. 2. Análises epidemiológicas
5. 2. 1. Sexo
No
total,
foram
detectados
17
isolados
de
KPC
resistêntes
aos
carbapenêmicos, no período de 2010 á 2011, onde a maior a prevalência foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53%) do que no sexo
feminino (47%).
47
Figura 11: Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN, no período de 2010 á 2011.
5. 2. 2.
Desfecho clínico
Em 17 isolados de KPC resistêntes aos carbapenêmicos, no período
de 2010 á 2011, a porcentagem de pacientes que foram a óbito (59%) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41%).
Figura 12: Isolado de KPC segundo desfecho clínico dos 17 pacientes
investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
48
5. 2. 3.
Local da coleta
Dos 17 episódios detectados de infecção por KPC resistêntes aos
carbapenêmicos, no período de 2010 á 2011, a infecção em swab retalfoi mais
frequente (47%), seguida de ponta de catéter (18%) e secreção traqueal (12%).
Figura 13: Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
5. 2. 4.
Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82%),
seguida da Enterobacter clocae (12%) e Serratia marcescens (6%), dos 17 isolados
de KPC resistêntes aos carbapenêmicos, no período de 2010 á 2011. Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errônea á Klebsiella pneumoniae, visto
que, a evidência dela é maior em relação as outras cepas.
49
Figura 14: Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN, no período de 2010 á 2011.
5. 2. 5. Relações variáveis relativas à infecção bacteriana e desfecho
clínico
Tabela 6 – Distribuição do perfil genético, sexo, coleta, tipificação de
microrganismos e análise da resistência bacteriana segundo o desfecho
clínico. Brasília-DF, 2010 a 2011.
Desfecho
Alta
Variável
Gene 16S rRNA
Óbito
Resultado
Positivo
N
7
%
100,0
N
10
%
100,0
Positivo
6
85,7
10
100,0
Negativo
1
14,3
0
0,0
Feminino
2
28,6
6
60,0
Masculino
5
71,4
4
40,0
Fundo saco de
Douglas
1
14,3
0
0,0
Hemocultura
0
0,0
1
10,0
Ponta de cateter
1
14,3
2
20,0
Sec.
Traqueal/Brônquica
0
0,0
1
10,0
P
N/A
Gene blaKPC
Sexo
Local da coleta
0,218
0,201
0,463
50
Secreção traqueal
2
28,6
0
0,0
Swab retal
3
42,9
5
50,0
Urina
0
0,0
1
10,0
Enterobacter
cloacae (KPC)
1
14,3
1
10,0
Klebsiella
pneumoniae
6
85,7
8
80,0
Serratia
marcescens
0
0,0
1
10,0
Teste de Hodge
Hodge positivo
7
100,0
10
100,0
Amicacina
sem informação
4
57,1
5
50,0
intermediário
1
14,3
1
10,0
resistente
0
0,0
1
10,0
sensível
2
28,6
3
30,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
0
0,0
1
10,0
resistente
3
42,9
4
40,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
4
40,0
resistente
0
0,0
1
10,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
0
0,0
1
10,0
resistente
3
42,9
4
40,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
4
40,0
resistente
0
0,0
1
10,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
intermediário
1
14,3
0
0,0
não testado
0
0,0
1
10,0
resistente
2
28,6
4
40,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
4
40,0
resistente
0
0,0
1
10,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
Microrganismo
0,416
N/A
Amoxicilina/ Ácido
Clavulânico
Ampicilina /
Sulbactam
Ampicilina
Aztreonan
Cefazolina
Cefoperazona
Cefotaxima
Cefoxitina
Ceftazidima
Cetriaxona
Cefalotina
Ciprofloxacina
0,848
0,688
0,688
0,772
0,772
0,688
0,688
0,772
0,509
0,772
0,772
0,688
0,772
51
Claritromicina
Clindamicina
Eritromicina
Gentamicina
Imipenem
Nitrofurantoína
Norfloxacina
Oxacilina
Penicilina
Piperacilina
Rifampicina
Tetraciclina
Ticarcilina / Ácido
Clavulônico
Tobramicina
Trimetoprima /
Sulfametoxazol
Vancomicina
Tigeciclina
resistente
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
2
28,6
3
30,0
sensível
1
14,3
2
20,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
intermediário
0
0,0
2
20,0
Resistente
1
14,3
3
30,0
sensível
2
28,6
0
0,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
4
40,0
resistente
0
0,0
1
10,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
0
0,0
1
10,0
resistente
3
42,9
4
40,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
1
14,3
5
50,0
sensível
2
28,6
0
0,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
intermediario
0
0,0
1
10,0
não testado
1
14,3
4
40,0
resistente
2
28,6
0
0,0
0,772
0,772
0,772
0,942
0,193
0,688
0,772
0,772
0,772
0,772
0,772
0,772
0,688
0,772
0,112
0,772
0,211
52
Cefepime
Cefuroxima
Levofloxacina
Piperacilina /
Tazobactam
Ertapenem
Meropenem
Cefotetan
Gemifloxacina
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
3
42,9
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
1
14,3
0
0,0
resistente
2
28,6
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
2
28,6
5
50,0
sensível
1
14,3
0
0,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
intermediário
1
14,3
0
0,0
resistente
2
28,6
5
50,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
resistente
2
28,6
5
50,0
sensível
1
14,3
0
0,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
intermediário
1
14,3
0
0,0
resistente
1
14,3
5
50,0
sensível
1
14,3
0
0,0
sem informação
4
57,1
5
50,0
não testado
3
42,9
4
40,0
sensível
0
0,0
1
10,0
sem informação
4
57,1
7
70,0
não testado
3
42,9
3
30,0
Desfecho
Alta
Idade
Tempo Internação
(dias)
Óbito
Média
58
Erro
padrão
9
Média
59
Erro
padrão
5
p
0,991
50
13
46
12
0,571
n= 17; p(< 0,05); N/A: não se aplica.
0,772
0,381
0,381
0,381
0,381
0,223
0,688
0,585
53
6.
DISCUSSÃO
Nos
últimos anos houve
um
aumento na
incidência de bactérias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar, tornando isto, um
problema mundial de saúde pública (HULSCHER, et. al., 2010). Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos, a freqüência destas bactérias é ainda
maior em países da América Latina quando comparada a países desenvolvidos
(GALES, et.al., 2012).
De acordo com dados do “Meropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collection” (MYSTIC), ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K. pneumoniae nos últimos anos, graças a práticas de controle de disseminação
de amostras resistentes(RHOMBERG, P. R. et. al., 2009). O aumento crescente da
prevalência destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependência do
uso de antibióticos carbapenêmicos, considerados como a opção terapêutica para o
tratamento de infecções por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE,
2012). Isto afeta diretamente as opções de tratamento, sobrando poucas alternativas
para a terapêutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina, que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficácia. (LIVERMORE, et.
al., 2011). Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E, por
exemplo, são a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES, C. A. C. et. al.,2009 ).
Devido à resistência ser usualmente de natureza plasmidial e, portanto de
maior disseminação, especialmente quando carreadas por K. pneumoniae,
microrganismo com uma notória capacidade para acumular e transferir plasmídeos
com determinantes para resistência; o número de casos detectados pelo
fenótipo/genótipo blaKPC é bastante preocupante (MONTEIRO, et. al., 2009).
Comparada
com
outras
bactérias
hospitalares,
a
transmissão
de
clones
multirresistentes de K. pneumoniae é maior e podem não ser controladas pelos
métodos de controle de infecção hospitalar (PAAUW, et. al., 2007). A forma
plasmidial para transferência da resistência adicionada a este grande potencial para
disseminação de clones resistentes, é preocupante; visto que após surtos, muitas
vezes, pode se tornar endêmica. Já é uma realidade a disseminação desta bactéria
54
entre pacientes, hospitais, países e até mesmo continentes (WOODFORF, et. al.,
2010; ROGERS, et. al., 2011).
As chances de surtos são maiores em países com poucos recursos, devido à
maior carência de práticas de prevenção e controle de infecções hospitalares, e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empírica e inadequada (KUMARASAMY,
et. al., 2010). Até o momento, os mecanismos de resistência aos cabapenêmicos
geralmente encontrado eram a produção de ESBL (CTX-M) somada á perda de
porina (CARVALHAES, et. al., 2010). Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no número de K. pneumoniae produtoras de KPC-2, apresentando outra
forma de resistência (GALES, 2012).
Um estudo mostrou que, o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade, internado há mais de 1
semana no hospital. A mortalidade geral nos últimos anos ficou em torno de 7%,
sendo que dos 77 pacientes estudados, 32 (41,5%) pacientes evoluíram para óbito,
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES, A. P. et. al., 2013).
Em estudo com 2.316 pacientes avaliados, a população de sexo masculino foi
de 52,6%, idade média global de 53 anos (mediana de 55 anos), permanência média
de 5,8 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA, A. C. et. al., 2010). Outros trabalhos
apresentaram ausência de significância entre sexo/idade e o desenvolvimento de
infecções por microrganismos resistentes (PERES-BOTA, D. et. al., 2003; COLPAN,
A. et. al., 2005; COELLO, R. et. al., 1997).
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras, sendo elas isoladas de urina,
escarro, secreção pleural, ponta de cateter, aspirado traqueal e hemocultura. A mais
prevalente foi em urina (40%). Entre as 30 cepas analisadas, a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70%), Enterobacter sp (13,3%), Klebsiella
ozaenae
(10%),
Escherichia
coli
(3,33%)
e
Klebsiella
oxytoca
(3,33%)
(DIENSTMANN, R. et. al., 2010). Nos Estados Unidos a enzima KPC já se tornou
endêmica. Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York, onde
testaram 602 amostras e 45% apresentaram algum mecanismo de resistência,
sendo apenas 3,3% confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU. et.
al., 2005).
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japão apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa. Até o ano de 2000, ano em que foi publicado tal
estudo, este era o primeiro relatório no Japão para identificar derivados de ESBLs,
como tipo de SHV e TEM entre E. coli e K. pneumoniae. Em especial, o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior freqüência. Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs, que são diferentes em sua especificidade de substrato e origem
genética, coexistem no Japão. Isto mostra a importância de caracterizar genótipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendências de
ESBLs no Japão, além da necessidade de uma interpretação uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI, para relatar cepas produtoras de ESBL. Além da detecção de
ESBLs, são necessárias mais informações, tais como o perfil de sensibilidade
específica para diversas β-lactâmicos e o local da infecção. Esses fatores são
essenciais para a escolha adequada de antibióticos (YAGI, T. et. al., 2000).
No ano de 2004, uma pesquisa avaliou a produção de uma enzima de
hidrólise de carbapenêmicos; através da técnica de seqüenciamento, foi revelado
um novo membro da família KPC, designado KPC- 3. Pesquisadores encontraram
em um mutante de K. pneumoniae, uma substituição de um gene associado com
resistência a Imipenem, mas essa substituição foi considerada improvável na
contribuição da resistência aos carbapenêmicos da espécie estudada . Além da
resistência aos carbapenêmicos, estes isolados eram em sua maioria resistentes às
cefalosporinas, penicilinas e aminoglicosídeos. Usando estudos de transformação,
conjugação e hibridação, localizaram o alelo blaKPC em plasmídeo, além disso
mostraram que esse alelo também carregava uma resistência aos aminoglicosídeos.
A transferência das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro, tanto neste como em
outros estudos, pode ser que os plasmídeos que fazem esta transferência estavam
começando a se espalhar no ambiente clínico, resultando na multiresistência dessas
estirpes (WOODFORD, et. al., 2004).
O presente estudo apresentou um viés quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana. Observou-se que não foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras, o que não cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto às amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia. Porém, mesmo sem algumas amostras com este resultado disponível, foi
56
confirmada a presença da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistência aos
carbapenêmicos, por meio dos genes de resistência blaKPC e 16S rRNA, que as
amostras apresentaram em sua maioria, serem portadoras. Quanto aos resultados
estatísticos, nenhuma das variáveis apresentou significância estatística (p > 0,05),
mostrando assim, que estas variáveis isoladas não foram o fator determinante para
o desfecho clínico de alta ou óbito.
57
7.
CONCLUSÃO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados, confirmando a a
presença da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistência aos carbapenêmicos .
Houve uma maior prevalência da cepa K. pneumoniae, e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalência desta cepa em amostras com KPC.
Além disso, isso justifica a forma popular da K. pneumoniae ser chamada de KPC,
enquanto que na verdade, KPC é uma enzima, podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae, também apresentada no presente estudo. O
desfecho clínico de óbitos maior que 50%, é um possível indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste rápido para identificação de KPC, visando
iniciar o mais rápido possível o tratamento, afim de, diminuir a mortalidade por esta
infecção.
Nenhuma das variáveis isoladamente está relacionada ao desfecho clínico
óbito ou alta, pois não apresentaram relevância estatística. O presente estudo
mostrou que há presença da bactéria nas amostras de pacientes do hospital
estudado, podendo então, afirmar que este tipo de bactéria se encontra também
presente em ambiente hospitalar. O uso irracional de antimicrobiano é demonstrado
de forma indireta, quando foi apresentado através do Teste de Hodge Modificado,
uma resistência de 100% aos antibióticos carbapenêmicos. Isto também reflete na
terapêutica, sendo que, pacientes portadores de bactérias resistentes aos
antibióticos carabepêmicos tem uma escassa opção de tratamento, e as opções
apresentam problemas quanto à toxicidade e eficácia.
58
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67
ANEXOS
Seqüência do oligo blaKPC
Query
1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT
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Sbjct
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CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT
60
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AACAAGG
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540
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Sbjct
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ATTTGTT
540
Query
541
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GCGATAC
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Sbjct
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600
Query
601
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Sbjct
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660
Query
661
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Sbjct
661
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720
Query
721
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Sbjct
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780
72
Query
781
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840
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Sbjct
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GAACCTG
840
Query
841
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900
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Sbjct
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CACCTAT
900
Query
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73
Sbjct
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Query
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Sbjct
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Query
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Sbjct
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1080
Query
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74
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Query
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TCGGCTT
1320
Query
1321
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Sbjct
1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA
1377
LOCUS
DNA
linear
DEFINITION
AF297554
1377 bp
BCT 26-MAR-2001
Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene, complete cds.
ACCESSION
AF297554
VERSION
AF297554.1
GI:10121874
76
KEYWORDS
.
SOURCE
Klebsiella pneumoniae
ORGANISM
Klebsiella pneumoniae
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Enterobacteriales;
Enterobacteriaceae; Klebsiella.
REFERENCE
AUTHORS
1
(bases 1 to 1377)
Yigit,H., Queenan,A.M.,
Anderson,G.J., Domenech-Sanchez,A.,
Biddle,J.W., Steward,C.D.,
Alberti,S., Bush,K. and Tenover,F.C.
TITLE
Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase, KPC-1, from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL
Antimicrob. Agents Chemother. 45 (4),
1151-1161 (2001)
PUBMED
REFERENCE
AUTHORS
11257029
2
(bases 1 to 1377)
Yigit,H., Anderson,G.J. and
Tenover,F.C.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch,
Centers for Disease Control and
Prevention, 1600 Clifton Rd. MS
G08, Atlanta, GA 30333, USA
FEATURES
Location/Qualifiers
77
source
1..1377
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pneumoniae"
/mol_type="genomic DNA"
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1"
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KNALV
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DTTFR
78
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TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ"
ORIGIN
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79
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80