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D10-PAPEL DO ÁCIDO FÓLICO NO DESENVOLVIMENTO DO
SISTEMA NERVOSO ENTÉRICO DE CAMUNDONGOS C57: UM ESTUDO
MORFOLÓGICO
MENDES¹, Diego dos Santos; HARADA1, Dérica Sayuri; ZAPATER2,
Mariana Cristina Vicente Umada; MALDONADO3, Estela; MARTÍNEZÁLVARES3, Concepción; HERNANDES4, Luzmarina
E-mail: [email protected]
1- Acadêmico do Curso de Medicina, Universidade Estadual de Maringá
(UEM), Maringá, PR
2- Mestranda do Programa de Biociências Aplicadas à Farmácia,
Universidade Estadual de Maringá (UEM), Maringá, PR
3- Departamento de Anatomía y Embriología Humana I, Facultad de
Odontología, Universidad Complutense (UCM), Madrid, Espanha
4- Doutora em Biologia Celular e Tecidual, Universidade Estadual de
Maringá (UEM), Maringá, PR
Resumo
Os neurônios do SNE derivam de células das cristas neurais que são
suscetíveis à deficiência de ácido fólico, uma vitamina essencial em períodos
de rápida divisão celular e crescimento, como ocorre no desenvolvimento
embrionário. As células das cristas neurais são suscetíveis à deficiência de
ácido fólico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do déficit de ácido
fólico no desenvolvimento dos neurônios mioentéricos em camundongos.
Cortes histológicos de camundongos C57 com 14,5 dias de gestação
corados com H&E e Azan foram avaliados. Não houve evidência morfológica
do desenvolvimento de gânglios mioentéricos neste período, o que pode ser
sugestivo de um atraso na colonização do intestino pelas células das cristas
neurais.
Palavras-chave: sistema nervoso entérico, ácido fólico, células das cristas
neurais.
Introdução
Todos os neurônios do sistema nervoso entérico (SNE) derivam de
células das cristas neurais que migram para o intestino em desenvolvimento
a partir dos níveis vagal, truncal rostral e sacral do eixo neural1.
As células das cristas neurais são consideradas células de natureza
ímpar por sua natureza intensamente migratória e porque apresentam a
habilidade de gerar uma progênie de ampla diversidade fenotípica, que vai
desde neurônios e células da glia, melanócitos, células endócrinas, até a
maioria do tecido conjuntivo, osso e cartilagem da cabeça2.
Em camundongos, o intestino anterior se torna precocemente
colonizado pelas células das cristas neurais em uma direção aboral
começando no dia 9 (E9) e o intestino posterior é colonizado logo depois.
Após se alojarem dentro da parede intestinal, estas células aumentam em
tamanho, sendo capazes de sintetizar proteínas específicas da linhagem
neuronal.
Contudo, no primeiro momento em que chegam ao intestino, as
células precursoras não expressam marcadores neuronais. A expressão
reconhecível de um fenótipo neuronal ocorre nos dias E9,5 -10. Embora
neste período as primeiras células que colonizaram o intestino apresentam
características neuronais como imunoreatividade para neurofilamentos e
também são catecolaminérgicas, ainda há um grupo de células migrando
para o intestino por uma via vagal. O fenótipo catecolaminérgico é perdido
quando as células das cristas neurais adquirem seus fenótipos
terminalmente diferenciados: colinérgico, serotoninérgico e peptidérgico3.
As células das cristas neurais são suscetíveis à deficiência de ácido
fólico. O ácido fólico (AF) também conhecido como vitamina B9, folacina e
folato é especialmente importante em períodos de rápida divisão celular e
crescimento, como no desenvolvimento embrionário.
O papel benéfico do ácido fólico durante a gestação de mamíferos
tem sido documentado através dos últimos anos e tem demonstrado
melhorar o peso ao nascimento e prevenir aproximadamente 70% dos
defeitos de tubo neural (DTNs) espinha bífida e anencefalia, no entanto o
mecanismo envolvido é desconhecido em mais de 80% dos casos. Muitas
células embrionárias/fetais apresentam maior velocidade no tempo de
duplicação, o que eleva a possibilidade de aquisição inadequada de folato
fetal pelo tubo neural e cristas neurais, que normalmente sofrem
exuberantes picos de proliferação durante períodos críticos da
embriogênese e desenvolvimento fetal explicando assim a ocorrência de
muitos casos de DTNs folato responsivas e neurocristopatias4.
Já é de conhecimento que a deficiência de ácido fólico influencia o
desenvolvimento das células das cristas neurais e sua suplementação
previne diversas má formações. Como, as células que colonizam o SNE
provêm de células das cristas neurais é possível que a deficiência de ácido
fólico exerça influência também no desenvolvimento deste sistema.
Este trabalho prevê a hipótese de que uma redução na
disponibilidade de ácido fólico para as células das cristas neurais poderia
predispor a alterações morfofuncionais em neurônios do sistema nervoso
entérico e que uma suplementação da dieta com AF previne as possíveis
alterações do SNE dos camundongos. Para isto, avaliamos a população de
neurônios mioentéricos do intestino de embriões (E14,5) de camundongos
selvagens, deficitários em AF cujas mães, heterozigotas receberam ou não
suplementação com AF durante a gestação. Uma vez que as células das
cristas neurais são vulneráveis à deficiência de folato resultando em diversas
malformações congênitas, dentre elas as DTNs, defeitos crânio faciais e
fissura palatina, levantamos a hipótese de que uma redução na
disponibilidade de ácido fólico para as células das cristas neurais poderia
predispor a alterações morfofuncionais nos neurônios do sistema nervoso
entérico.
Este trabalho está sendo desenvolvido em parceria com o Grupo
Complutense de Estudos em Fissura Palatina, da Universidade Complutense
de Madrid, Espanha.
Material e métodos
Animais
Todos os procedimentos envolvendo o uso de animais foram
aprovados pelo Comitê de Ética da Universidad Complutense de Madrid.
Foram utilizados camundongos C57 selvagens (Harlan) provenientes
do Biotério da Facultad de Medicina da Universidad Complutense de Madrid
(Espanha). Os animais foram mortos, fixados em paraformaldeído 4%,
incluídos em parafina e transferidos para o laboratório de Histotécnica
Animal da Universidade Estadual de Maringá onde foram estudados.
Atividade 1. Uma dieta deficiente em AF (0,05mg/kg, que equivale a
uma quantidade dez vezes menor do que as necessidades diárias
recomendadas, Harlan) foi administrada a camundongos selvagens durante
5 semanas. Em seguida as fêmeas foram acasaladas. As fêmeas gestantes
de 14,5 dias foram sacrificadas com 70% de CO2. Os fetos foram fixados em
paraformaldeído 4% e incluídos em parafina para estudo histológico.
Atividade 2. Estudo do Sistema Nervoso Entérico
a) Os embriões incluídos em parafina foram submetidos a microtomia
(5µm), e processados como segue:
1. Processamento histológico (1) coloração com H&E para o estudo
morfológico do intestino em desenvolvimento e (2) coloração pelos métodos
de Azan e picrosirius para demonstrar a formação da cápsula ganglionar
mioentérica.
Resultados e Discussão
As alterações mais evidentes detectadas na medula e gânglios
espinhais, após análise da morfologia geral dos embriões estão ilustradas na
Figura 1 (a, b e c). Nos demais órgãos, inclusive nos intestinos, não foram
observadas alterações morfológicas evidentes. Neste período os embriões
apresentaram hérnia umbilical fisiológica. Não houve evidência morfológica
do desenvolvimento de gânglios do sistema nervoso entérico no intestino
médio observado (Figura 1d). O intestino anterior se torna precocemente
colonizado pelas células das cristas neurais em uma direção aboral
começando no dia 9 (E9) de desenvolvimento embrionário e o intestino
posterior é colonizado logo depois. Os camundongos utilizados neste estudo
têm 14,5 dias de vida e neste período, em condições normais, o intestino
primitivo já teria sido colonizado pelas células das cristas neurais para
formar os gânglios do SNE.
Conclusões
Este resultado preliminar sugere um atraso na migração das células
das cristas neurais para colonizar o intestino médio. Esta hipótese deverá
ser verificada através de outras metodologias, como por exemplo,
imunocoloração específica para neurônios entéricos.
pa
pb
*
A
B
M
s
M
m
C
D
Figura 1 - Corte histológico de embrião de camundongo C57 (E14,5) cujas mães foram
submetidas a uma dieta com restrição de ácido fólico. (A) Medula espinhal com adelgaçamento da
substância branca na região dorsal (seta), ausência de organização da camada neuroepitelial (*) e
das regiões das placas alar (pa) e basal (pb); (B) foram ainda observados corpos apoptóticos na
substância cinzenta (seta); (C) Os gânglios da cadeia dorsal apresentaram citoplasma com intensa
bosofilia e núcleos irregulares e também muito basofílicos. Em (D) uma alça do intestino médio de
embrião de camundongo C57 (E14,5). (M) túnica muscular; (s) camada submucosa; (setas) fibras
colágenas em azul; (m) mucosa. Coloração: H&E em a, b e c e Azan em d. Objetivas de 10x em a,
e 100x em b, c e d.
Referências
1 BURNS, A. J; LE DOUARIN, N .M. Enteric nervous system development
analysis of the selective developmental potentialities of vagal and sacral
neural cells using quail-chick chimeras. The Anatomical Record. v. 262,
p.16-28 p, 2001.
2 LE DOUARIN, N. M. The neural Crest. Cambridge England. Cambridge
University Press. p. 259, 1982.
3 BAETGE, G.; GERSHON, M. D. Transient catecholaminergic (TC) cells in
the vagus nerves and bowel of fetal mice: relationship to the development of
enteric neurons. Developmental Biology. v. 132, p.189-211, 1989.
4 ANTONY, A. C.; HANSEN, D. K. Hypothesis: folate-responsive neural tube
defects neurocristophaties. Teratology. v. 62, p. 42-50, 2000.